JP6937821B2 - 生体組織から単離できる多能性幹細胞 - Google Patents
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Description
ている。一方、ヒトなどの高等生物においては、組織再生能はこれらの動物に比較してはるかに低い。胚盤胞の内部細胞塊(ICM: Inner cell mass)は、多能性細胞の集まりと認
識されており、外胚葉、中胚葉、内胚葉系の細胞に分化する能力を持つ。しかしながら、発生が進むと共にこのような多能性が制限されていき、組織に特化した細胞に分化していく。
否かは不明であった。
ことを見出した。初期の細胞塊の外見はES細胞に酷似していた。しかしながら、ES細胞とは異なり無限増殖をせずに、ある一定の期間である大きさに到達すると増殖が停止し、さらに毛、色素細胞などの種々の細胞を含む不均一な集団となった。また、この細胞塊について免疫細胞化学(immunocytochemistry)を行ったところ、外胚葉、中胚葉及び内胚葉マ
ーカーにそれぞれ陽性の細胞が細胞塊内に混在して検出された。本発明者らは、この結果より、無処理の通常に維持・培養されている(naive)ヒトMSC細胞画分中に多能性細胞に相当する細胞が存在する可能性を考え、さらに鋭意検討を行った。
培養、トータル3時間の間欠的短時間トリプシン培養、8時間若しくは16時間の長時間のトリプシン培養等)、生存している細胞を集め、メチルセルロース(MC)含有培地中で浮
遊培養(MC培養という)を行った。その結果、最大直径150μmまでの種々の大きさの胚様体様(embryoid body-like)細胞塊の形成が認められた。特に長時間のトリプシン処理を行ったヒト皮膚線維芽細胞画分及びヒトMSC画分において、最も多くの胚様体様細胞塊の
形成率が認められた。
胞などの多能性幹細胞とは異なる発現パターンを示すことを見出した。
れる多能性幹細胞であることを見出し、本発明を完成させるに至った。本発明者らは、該多能性幹細胞をMuse細胞(Multilineage-differentiating Stress Enduring cells)と名
付けた。
[1] 生体組織から単離できるSSEA-3陽性の多能性幹細胞。
該多能性幹細胞は、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞等の生体組織の培養物からも単離することができ、また単一細胞として単離することができる。
[2] CD105陽性の[1]の多能性幹細胞。
[4] CD117陰性、CD146陰性、NG2陰性、CD34陰性、vWF陰性及びCD271陰性の[1]又は[2]の多能性幹細胞。
[6] テロメラーゼ活性が低いか又は無い、[1]〜[5]のいずれかの多能性幹細胞。
本発明の多能性幹細胞は、in vitroの接着培養で三胚葉に分化する能力を有し、in vitroで誘導培養することにより、皮膚、肝、神経、筋、骨、脂肪等に分化し得る。また、in
vivoで精巣に移植した場合にも三胚葉に分化する能力を有する。さらに、静注により生
体に移植することで損傷を受けた臓器(皮膚、脊髄、肝、筋肉等)に生着し分化する能力を有する。
本発明の多能性幹細胞は、浮遊培養で増殖速度約1.3日で増殖するが10日間程度で増殖が止まるという性質を有し、さらに精巣に移植した場合少なくとも半年間は癌化しないという性質を有する。
本発明の多能性幹細胞は、浮遊培養と接着培養の操作を繰り返すことにより増殖させることができる。また、本発明の多能性幹細胞は他の体性幹細胞と同じく、非対称分裂をする。
[10] ストレス耐性である、[1]〜[9]のいずれかの多能性幹細胞。
[11] 貪食能が高い、[1]〜[10]のいずれかの多能性幹細胞。
olfactory receptor, family 8, subfamily G, member 2 (OR8G2);
olfactory receptor, family 7, subfamily G, member 3 (OR7G3);
olfactory receptor, family 4, subfamily D, member 5 (OR4D5);
olfactory receptor, family 5, subfamily AP, member 2 (OR5AP2);
olfactory receptor, family 10, subfamily H, member 4 (OR10H4);
olfactory receptor, family 10, subfamily T, member 2 (OR10T2);
olfactory receptor, family 2, subfamily M, member 2 (OR2M2);
olfactory receptor, family 2, subfamily T, member 5 (OR2T5);
olfactory receptor, family 7, subfamily D, member 4 (OR7D4);
olfactory receptor, family 1, subfamily L, member 3 (OR1L3);
olfactory receptor, family 4, subfamily N, member 4 (OR4N4);
olfactory receptor, family 2, subfamily A, member 7 (OR2A7);
guanine nucleotide binding protein (G protein), alpha activating activity polypeptide, olfactory type (GNAL);
olfactory receptor, family 6, subfamily A, member 2 (OR6A2);
olfactory receptor, family 2, subfamily B, member 6 (OR2B6);
olfactory receptor, family 2, subfamily C, member 1 (OR2C1);
olfactory receptor, family 52, subfamily A, member 1 (OR52A1);
olfactory receptor, family 10, subfamily H, member 3 (OR10H3);
olfactory receptor, family 10, subfamily H, member 2 (OR10H2);
olfactory receptor, family 51, subfamily E, member 2 (OR51E2);
olfactory receptor, family 5, subfamily P, member 2 (OR5P2);及び
olfactory receptor, family 10, subfamily P, member 1 (OR10P1)。
chemokine (C-C motif) receptor 5(CCR5);
chemokine (C-X-C motif) receptor 4(CXCR4);
chemokine (C-C motif) receptor 1(CCR1);
Duffy blood group, chemokine receptor(DARC);及び
chemokine (C-X-C motif) receptor 7(CXCR7)。
[15] [1]〜[14]のいずれかの多能性幹細胞を含む細胞塊または細胞画分。
幹細胞又は多能性細胞画分を単離する方法:
(i) SSEA-3陽性;
(ii) CD105陽性;
(iii) CD117陰性及びCD146陰性;
(iv) CD117陰性、CD146陰性、NG2陰性、CD34陰性、vWF陰性及びCD271陰性;
(v) CD34陰性、CD117陰性、CD146陰性、CD271陰性、NG2陰性、vWF陰性、Sox10陰性、Snail陰性、Slug陰性、Tyrp1陰性及びDct陰性;並びに
(vi) テロメラーゼ活性が低いか又は無い。
[18] 細胞ストレスが、プロテアーゼ処理、低酸素条件下での培養、低リン酸条件下での培養、血清飢餓状態での培養、糖飢餓状態での培養、放射線曝露下での培養、熱ショックへの曝露下での培養、有害物質存在下での培養、活性酸素存在下での培養、機械的刺激下での培養及び圧力処理下での培養から選択される、[17]の多能性幹細胞又は多能性細胞画分を単離する方法。
[19] 細胞ストレスが、トリプシン処理である、[18]の多能性幹細胞又は多能性細胞画分を単離する方法。
該派生細胞又は誘導細胞として、例えば、遺伝子の導入や、化合物を添加により誘導した細胞が挙げられる。また、本発明の幹細胞由来のiPS細胞が挙げられる。
[21] [1]〜[14]のいずれかの多能性幹細胞の派生細胞又は誘導細胞である分化した細胞。
[22] [1]〜[14]及び[20]のいずれかの多能性幹細胞を含む医薬組成物。
本明細書は本願の優先権の基礎である米国仮出願61/213,788号及び米国仮出願61/290,159号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。
本発明は、生体の生体組織から直接得ることができる多能性(pluripotent)幹細胞又は
多能性幹細胞画分及び該多能性幹細胞又は該多能性幹細胞画分を単離する方法、並びに該方法により得られた生体組織由来の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分である。本発明の多能性幹細胞をMuse細胞(multilineage differentiating stress enduring cells)とい
う。
(1) Nanog、Oct3/4、SSEA-3、PAR-4及びSox2等の多能性マーカー(Pluripotent marker)を発現する。
(2) 1細胞から増殖し、自己のクローンを作り続けるクローナリティー(Clonality
)を有する。
(3) 自己複製(セルフリニューアル)能を有する。
(4) 3胚葉系(内胚葉系、中胚葉系及び外胚葉系)へin vitro及びin vivoで分化し
得る。
(5) マウスの精巣や皮下に移植した場合、3胚葉系への分化を呈する。
(6) アルカリフォスファターゼ染色で陽性となる。
(i) 増殖速度が比較的緩やかで、分裂周期が1日以上、例えば1.2〜1.5日である。た
だし、ES細胞やiPS細胞が示すような無限増殖は示さない。
(ii) 免疫不全マウスに移植した場合に内胚葉系、中胚葉系及び外胚葉系への分化を示す。ES細胞やiPS細胞ではテラトーマが短期間で癌化するのに比べ、半年以上癌化しない
ことを特徴とする。
(iii) 浮遊培養により胚様体様細胞塊を形成する。
(iv) 浮遊培養にて胚様体様細胞塊を形成し、10日程度で増殖が停止する。その後、接
着培養に移動させることにより再増殖する。
(v) 増殖の際に非対称分裂を伴う。
(vii) テロメラーゼ活性が無いか又は低い。ここで、テロメラーゼ活性が無いか又は
低いとは、例えばTRAPEZE XL telomerase detection kit(Millipore社)を用いてテロメラーゼ活性を検出した場合に検出できないか又は低いことをいう。テロメラーゼ活性が低いとは、例えば、ヒト線維芽細胞と同程度のテロメラーゼ活性を有しているか、あるいはHela細胞に比べて1/5以下、好ましくは1/10以下のテロメラーゼ活性を有していることを
いう。
(viii) メチル化の状態については、Muse細胞から誘導したiPS細胞に関してはNanogおよびOct3/4のプロモータ領域のメチル化レベルが低い。
(ix) 貪食能が高い。
(x) 腫瘍性増殖を示さない。ここで、腫瘍性増殖を示さないとは、浮遊培養を行った
場合、一定の大きさの細胞塊(クラスター)に達すると増殖が止まり、無限増殖しないことをいう。また免疫不全マウスの精巣に移植しても奇形腫を形成しないことである。なお、上記(i)〜(iv)等も腫瘍性増殖を示さないことに関連する。
(A) 生体の中胚葉系組織又は間葉系組織等から得られる細胞であって、当該細胞内に
化学物質、外来遺伝子又は外来タンパク質を導入することなく直接得ることができる多能性幹細胞。
(B) 生体の中胚葉系組織又は間葉系組織等が、骨髄、皮膚、血液、臍帯、脂肪などか
らなる群から選択される上記(1)の特性を有する多能性幹細胞。
(C) リプログラミングまたは脱分化を誘導することなく得ることができる、上記(A)又は(B)の多能性幹細胞。
(D) 精巣へ移植した場合に、少なくとも半年間は癌化しない、上記(A)又は(B)の
多能性幹細胞。
(E) ES細胞、iPS細胞のように無限増殖を示さない、上記(A)又は(B)の多能性幹細胞。
(F) 生体の中胚葉系組織又は間葉系組織等由来の多能性幹細胞であって、生体の中胚
葉系組織又は間葉系組織等の細胞をプロテアーゼで処理したときに生き残る、プロテアー
ゼに耐性である多能性幹細胞。
くは0.1〜0.5%が例示される。例えば、10〜50万個の細胞を含む生体の中胚葉系組織又は間葉系組織等由来の細胞を上記濃度のトリプシン溶液5ml中でインキュベーションすることにより外的ストレスに曝すことができる。トリプシン処理時間は、5〜24時間、好ましくは5〜20時間程度である。本発明においては、8時間以上のトリプシン処理、例えば8
時間又は16時間の処理を長時間トリプシン処理という。
等でコートしておくことが望ましい。
幹細胞(Muse細胞)は、この外的ストレスに曝して生き残った細胞集団中に濃縮した状態で含まれる。この細胞集団を富Muse細胞画分(Muse enriched population)と呼ぶ。富Muse細胞画分中のMuse細胞の存在割合は、ストレス処理の方法により異なる。
織の分化した細胞に外来遺伝子導入等することによりリプログラミングした結果、多能性幹細胞に誘導された細胞といわれており、本発明の組織から直接得ることができ、すでに多能性幹細胞としての性質を有する細胞に外来遺伝子導入等の人為的な誘導操作を行い得られた細胞は、iPS細胞と区別される。
細胞も包含する。胚様体は、本発明の多能性幹細胞を浮遊培養することにより、細胞塊として形成される。この際、本発明においては、本発明の多能性幹細胞を培養することにより得られる胚様体をMuse細胞由来胚様体様細胞塊と呼ぶことがある(Mクラスター(M-cluster)と呼ぶこともある)。胚様体様細胞塊を形成するための浮遊培養の方法として、メチルセルロース等の水溶性ポリマーを含有した培地を用いた培養(Nakahata, T. et al.,
Blood 60, 352-361 (1982))やハンギングドロップ培養(Keller,J.Physiol.(Lond)168:131-139,1998)等が挙げられる。本発明は前記胚様体様細胞塊からセルフリニューアルして得られる胚様体様細胞塊及び胚様体様細胞塊に含まれる細胞及び多能性幹細胞も包含する。ここで、セルフリニューアルとは、胚様体様細胞塊に含まれる細胞を培養し、再度胚様体様細胞塊を形成させることをいう。セルフリニューアルは1〜複数回のサイクルを繰り返せばよい。また、本発明は前記いずれかの胚様体様細胞塊及び胚様体様細胞塊に含まれる細胞から分化した細胞及び組織も包含する。
リプシン処理(Long term trypsin incubation; LTT)等のストレス刺激を与えると、Muse細胞が濃縮されMuse細胞を多く含む細胞画分が得られ(富Muse細胞画分と呼ぶ)、該細胞画分中のMuse細胞を浮遊培養すると胚様体様細胞塊(Muse細胞由来胚様体様細胞塊)が得られる。胚様体様細胞塊をゼラチンでコートした培養皿で培養すると3胚葉の細胞に分化する。また、図1-1に示すように、SSEA-3陽性細胞を直接分離し、長時間のストレスを
かけることなく浮遊培養することによりMuse細胞由来の胚様体様細胞塊を得ることができる。
現しており、SSEA-3陽性であり、CD105陽性である。従って、SSEA-3及びCD105の両方の発現を指標に単離することができる。これらの細胞表面マーカーを利用することにより、本発明の多能性幹細胞を単一細胞として単離でき、単離した単一細胞を、培養により増殖させることができる。なお、本発明は、ヒト以外の哺乳動物の生体組織からSSEA-3に相当するマーカーによって単離できる多能性幹細胞をも含むものとする。
どうかはこれらの抗原に対する抗体であって、発色酵素、蛍光化合物等で標識した抗体を用いて細胞が染色されたか否かを顕微鏡観察等により決定することができる。例えば、これらの抗体を用いて細胞を免疫染色して、表面抗原の有無を決定することができ、また該抗体を結合させた磁性ビーズを用いても決定することができる。また、FACS又はフローサイトメーターを用いても表面抗原があるかどうか決定することができる。フローサイトメーターとしては例えばFACSAria(ベクトン・ディッキンソン社製)、FACS vantage(ベクト
ン・ディッキンソン社製)、FACS Calibur(ベクトン・ディッキンソン社製)等を用いるこ
とができる。
られないことをいい、これらの手法により検出できない程度発現していたとしても、本発明においては陰性とする。また、上記マーカーが陽性であることが公知の造血幹細胞等の細胞と同時に測定を行い、これらの陽性細胞と比較して、ほとんど検出されないか、あるいは有意に発現量が低い場合に陰性としてもよい。
本発明の細胞は、これらの細胞表面の抗原特性に基づいて単離することができる。
発現を指標に単離することができるが、さらに、NG2、CD34、vWF(フォンビルブランド因子)、c-kit(CD117)、CD146、CD271(NGFR)、Sox10、Snai1、Slug、Tyrp1及びDctからなる群から選択される11個のマーカーのうち少なくとも1個、例えば、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個又は11個のマーカーの非発現を指標に単離することができる。例えば、CD117及びCD146の非発現を指標に単離することができ、さらに、CD117、CD146、NG2、CD34、vWF及びCD271の非発現を指標に単離することができ、さら
に、上記の11個のマーカーの非発現を指標に単離することができる。
細胞塊が得られる。Muse細胞、無処理細胞、Muse由来胚様体様細胞塊及びヒトES細胞において発現している因子を比較検討することにより、Muse細胞で高発現している因子がわかる。ここで、因子とは遺伝子転写産物、タンパク質、脂質、糖を含む。
特に以下の18個の因子の比が高い。
(i) SSEA-3
(ii) v-fos FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog
(iii) solute carrier family 16, member 6 (monocarboxylic acid transporter 7)
(iv) tyrosinase-related protein 1
(v) Calcium channel, voltage-dependent, P/Q type, alpha 1A subunit
(vi) chromosome 16 open reading frame 81
(vii) chitinase 3-like 1 (cartilage glycoprotein-39)
(viii) protease, serine, 35
(ix) kynureninase (L-kynurenine hydrolase)
(x) solute carrier family 16, member 6 (monocarboxylic acid transporter 7)
(xi) apolipoprotein E
(xii) synaptotagmin-like 5
(xiii) chitinase 3-like 1 (cartilage glycoprotein-39)
(xiv) ATP-binding cassette, sub-family A (ABC1), member 13
(xv) angiopoietin-like 4
(xvi) prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (prostaglandin G/H synthase and cycl
ooxygenase)
(xvii) stanniocalcin 1
(xviii) coiled-coil domain containing 102B
特に以下の20個の因子の比が高い。
(a)matrix metallopeptidase 1 (interstitial collagenase)
(b)epiregulin
(c)chitinase 3-like 1 (cartilage glycoprotein-39)
(d)Transcribed locus
(e)chitinase 3-like 1 (cartilage glycoprotein-39)
(f)serglycin
(g)MRNA full length insert cDNA clone EUROIMAGE 1913076
(h) Ras and Rab interactor 2
(i) lumican
(j) CLCA family member 2, chloride channel regulator
(k) interleukin 8
(l) Similar to LOC166075
(m) dermatopontin
(n) EGF, latrophilin and seven transmembrane domain containing 1
(o) insulin-like growth factor binding protein 1
(p) solute carrier family 16, member 4 (monocarboxylic acid transporter 5)
(q) serglycin
(r) gremlin 2, cysteine knot superfamily, homolog (Xenopus laevis)
(s) insulin-like growth factor binding protein 5
(t) sulfide quinone reductase-like (yeast)
カイン(chemokine)受容体群の因子を発現していること、すなわち特定のオドラント受
容体やケモカイン受容体陽性であることを特徴とする。
olfactory receptor, family 8, subfamily G, member 2 (OR8G2);
olfactory receptor, family 7, subfamily G, member 3 (OR7G3);
olfactory receptor, family 4, subfamily D, member 5 (OR4D5);
olfactory receptor, family 5, subfamily AP, member 2 (OR5AP2);
olfactory receptor, family 10, subfamily H, member 4 (OR10H4);
olfactory receptor, family 10, subfamily T, member 2 (OR10T2);
olfactory receptor, family 2, subfamily M, member 2 (OR2M2);
olfactory receptor, family 2, subfamily T, member 5 (OR2T5);
olfactory receptor, family 7, subfamily D, member 4 (OR7D4);
olfactory receptor, family 1, subfamily L, member 3 (OR1L3);
olfactory receptor, family 4, subfamily N, member 4 (OR4N4);
olfactory receptor, family 2, subfamily A, member 7 (OR2A7);
guanine nucleotide binding protein (G protein), alpha activating activity polypeptide, olfactory type (GNAL);
olfactory receptor, family 6, subfamily A, member 2 (OR6A2);
olfactory receptor, family 2, subfamily B, member 6 (OR2B6);
olfactory receptor, family 2, subfamily C, member 1 (OR2C1);
olfactory receptor, family 52, subfamily A, member 1 (OR52A1);
olfactory receptor, family 10, subfamily H, member 3 (OR10H3);
olfactory receptor, family 10, subfamily H, member 2 (OR10H2);
olfactory receptor, family 51, subfamily E, member 2 (OR51E2);
olfactory receptor, family 5, subfamily P, member 2 (OR5P2);及び
olfactory receptor, family 10, subfamily P, member 1 (OR10P1)
chemokine (C-C motif) receptor 5(CCR5);
chemokine (C-X-C motif) receptor 4(CXCR4);
chemokine (C-C motif) receptor 1(CCR1);
Duffy blood group, chemokine receptor(DARC);及び
chemokine (C-X-C motif) receptor 7(CXCR7)
本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分は、上記の嗅覚受容体の少なくとも1個を発現しており、あるいは、上記のケモカイン受容体の少なくとも1個を発現している。
し、増殖させ、あるいは分化させて体内に戻せばよく、例えば、多能性幹細胞を特定の組織の細胞に分化させ、該細胞を治療しようとする組織に移植すればよい。また、細胞の移植により、in situ 細胞治療を行うこともできる。この場合、対象細胞の例として、肝臓細胞、神経細胞やグリア細胞などの神経系細胞、皮膚細胞、骨格筋細胞などの筋肉細胞が挙げられ、本発明の多能性幹細胞をこれらの細胞に分化させ、移植し、in situで治療を
行うことができる。該治療により、例えば、パーキンソン病、脳梗塞、脊髄損傷、筋変性疾患などを治療することができる。本発明の多能性幹細胞は、腫瘍化しないので、このような治療に用いても癌化の可能性が低く安全である。
球、白血球、血小板等が挙げられる。このようにして形成させた血液や血液成分を、自家輸血や他家輸血に用いることができる。
(FGF4)、肝細胞成長因子(HGF)等が挙げられる。本発明は、本発明の多能性幹細胞か
ら分化した細胞も包含する。
を構築することで、上記のMuse細胞利用場面における細胞を必要に応じて提供できる体制を実現でき、例えば、上記に挙げた目的の他、緊急に要する細胞移植治療のための拒絶反応の無い(少ない)細胞提供、などを行うことができる。すなわち、本発明は種々の遺伝子特性を有するMuse細胞を単離し、集めることにより、異なる遺伝子特性を有するMuse細胞のライブラリー、すなわちMuse細胞バンクを作製する方法を包含する。また、Muse細胞だけでなく、Muse細胞からできた胚様体様細胞塊、及びMuse細胞や前記胚様体様細胞塊から分化させて得られた細胞若しくは組織・器官を得てライブラリーやバンクを構築するこ
ともできる。本発明においては、これらのMuse細胞からできた胚様体様細胞塊、及びMuse細胞や前記胚様体様細胞塊から分化させて得られた細胞若しくは組織・器官を得てライブラリーやバンクも細胞ライブラリー又は細胞バンクと称する。本発明は、このようにして作製した細胞ライブラリー又は細胞バンクを包含する。該細胞ライブラリー又は細胞バンクは例えば、異なる遺伝的特性を有する細胞等が収納された複数のチューブ等の容器からなり、該細胞は凍結されていてもよい。例えば、被験体において、組織や器官を移植し、あるいは再生する必要が生じた場合に、上記細胞ライブラリー又は細胞バンクから、前記被験体に遺伝的背景等に関して適合した細胞を選択し、該細胞を用いて移植や再生治療を行うことができる。
。Muse細胞をソースとしたiPS細胞の作製効率は他の細胞(例えば、SSEA-3発現を指標に
分画していない皮膚線維芽細胞)をソースとした場合に比べ、はるかに(少なくとも25倍以上)高い。
ログラミングや癌化を含み、現在知られている方法、あるいは将来的に確立されるあらゆる方法を用いることができる。
記載に従って、Muse細胞からiPS細胞を確立することができる。また、図27に記載の方
法以外に、化学物質、外来遺伝子又は外来タンパク質を導入して、iPS細胞を樹立するこ
とが可能であるといえる。Muse細胞からのiPS細胞の確立は、例えば後述の実施例に記載
の方法で行うことができる。
ことがあり、本発明は該Muse由来iPS細胞をも包含する。Muse由来iPS細胞は、Muse細胞由来の増殖性を有する多能性幹細胞ということができる。
実施例1 富Muse細胞画分及びMuse細胞由来胚様体様細胞塊の調製並びに特性分析
材料及び方法
本実施例において、以下の細胞を用いた。
(HDFA)、ScienCell社より入手)を用いた。ヒトMSC画分としては、H-MSC-1、H-MSC-2、H
-MSC-3及びH-MSC-4をLonza社及びALLCELLS社より入手して用いた。ヒトMSC画分について
は、Pittenger, M. F. et al. Science 284, 143-147 (1999);Dezawa, M. et al. J Clin Invest 113, 1701-1710 (2004);Dezawa, M. et al. Science 309, 314-317 (2005)に
詳細に記載されている。
継代し、4〜10代継代したものを用いた。
マウスES細胞(TT2細胞)及びヒトES細胞(KhES-1)はC57BL/6マウスの12.5日胚より確
立したマウス由来フィーダー細胞存在下で維持した。
1.間葉系細胞のストレス刺激
ストレス刺激として低栄養条件での培養、低血清濃度での培養、低酸素濃度での培養、繰返しトリプシン処理、長時間トリプシン処理を行うため以下の培養条件を採用した。
(1)無血清培地(STEMPRO MSC SFM(Invitrogen社)を用いた2日間の培養(無血清)
(2)Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)バッファー(Invitrogen社)を用いた2日間の培養(HBSS)
(3)10%FBS含有α-MEMを用いての低酸素濃度(1%)での2日間の培養(10%FBS+LowO2)
(4)トリプシン中(0.25%トリプシン-HBSS)での1時間インキュベーション3回の処
理(トータル3時間のトリプシン処理)(Try 3× 1hr)
(5)トリプシン中での8時間インキュベーション(LTT 8hr)
(6)トリプシン中での16時間インキュベーション(LTT 16hr)
陰性対照として、ヒト末梢血単核細胞画分を用いた。
ルテックスミキサー(IKA Works社)を用いて1800〜2200rpm/minで3分間ボルテックス処理を行った。その後、2000rpmで15分間遠心分離を行い、上清を除去した。生細胞の回収
率は約70〜80%であった。
本実施例においては、細胞をメチルセルロース含有培地中で浮遊培養した。メチルセルロース含有培地中での培養をMC培養と呼ぶ。MC培養については、Nakahata, T. et al., Blood 60, 352-361 (1982)に記載されている。
終濃度2%で懸濁した。ゲル状のMC培地中の細胞濃度は細胞同士の凝集を抑える十分な細胞間距離を確保できる8000細胞/mlとした。細胞とMC培地を穏やかなピペッティングによ
り十分混合し、poly-HEMAコートした培養ディッシュに移した。乾燥を防ぐために、10%FBS含有α-MEMを3日毎に最初のMC培養の容積の1/10量、ゆっくりと添加した。
収した細胞ペレットを10μlの0.01M含有トリパンブルー溶液に懸濁し、スライドガラスに載せ位相差顕微鏡を用いて写真を撮った。直径25μmより大きい、ヒトES細胞と外観が似
ているトリパンブルー陰性細胞塊のみをMuse細胞由来胚様体様細胞塊として数えた。Muse細胞由来胚様体様細胞塊の形成率は細胞塊の数/すべての生細胞数(すべてのトリパンブ
ルー陰性細胞)により算出した。細胞計数の際、細胞塊はその大きさにかかわらず1細胞として数えた。これは、Muse細胞由来胚様体様細胞塊中に含まれる細胞の数の正確な計測は困難だからである。
96ウェルディッシュを上記の方法でpoly-HEMAでコートし、10%FBS含有α-MEMを用いて限界希釈法にて、単一細胞をそれぞれのウェルに播き、位相差顕微鏡にてウェル中の実際の細胞数を計数し、細胞が入っていないウェル、あるいは複数入っているウェルは計測から除外した。培養10日目に胚様体(EB)(Muse細胞由来胚様体様細胞塊)形成を計数した
。それぞれの細胞株に対して3回の実験を行い、一回の実験では最低250ウェル以上の観
察を行った。
H-fibroblast画分及びH-MSC画分由来のMuse細胞由来胚様体様細胞塊を集め生理食塩水
で数回洗浄し、Leukocyte Alkaline Phosphatase kit(sigma社)を用いて染色した。
MC培養又は単一細胞浮遊培養の7〜10日後、H-fibroblast画分及びH-MSC画分由来の胚
様体様細胞塊をガラスマイクロピペットにより採取し、ゼラチンコート培養ディッシュ又はカバーガラス上に移しさらに7日間培養すると細胞塊から細胞が広がる。かかる細胞における分化の有無を免疫組織化学分析及びRT-PCR分析に供した。
細胞を0.01M PBS中4%パラホルムアルデヒドで固定し、H-fibroblast画分及びH-MSC画分由来の富Muse細胞画分又はMuse細胞由来胚様体様細胞塊を遠心分離により集め、OCTコ
ンパウンド中に埋め込み8μmの凍結切片を作製した。細胞塊は、ゼラチンコートスライ
ドガラス上で固定し、免疫組織化学分析に供した。
α-フェトプロテイン(1:100, DAKO社)、マウスNumblike (1:500, カリフォルニア大学サ
ンフランシスコ校のDr. Yuh-Nung Janより入手)及びtype 1コラーゲン(1:20, Southern Biotech社)に対する抗体を用いた。2次抗体として、Alexa 488又は568とコンジュゲート
した抗ウサギIgG、抗マウスIgG又は抗マウスIgM抗体(Molecular Probes社)を用いて、免
疫組織化学分析を行った。
H-fibroblast画分及びH-MSC画分由来のMuse細胞由来胚様体様細胞塊(Muse細胞由来胚
様体様細胞塊から単一細胞を取り再度Muse細胞由来胚様体様細胞塊を形成させることを1〜3回繰り返したもの)からの増殖細胞(clonally expanded cells)の核型をquinacrine-Hoechst染色により決定した。
無処理細胞画分、並びにH-fibroblast画分及びH-MSC画分由来の富Muse細胞画分及びMuse細胞由来胚様体様細胞塊を用いた。富Muse細胞画分の場合、長時間トリプシン処理後血
清を添加し、0.01M PBSで3回洗浄した。Muse細胞由来胚様体様細胞塊もMC培養から採取
後に同PBSで3回洗浄した。1×105個の細胞をPBSに浮遊し、NOGマウス(登録商標)(NOD/Shi-scid, IL-2RγKO Jic、8週齢、財団法人 実験動物中央研究所より入手)の精巣
にガラスマイクロチューブを用いて注入した。Muse細胞由来胚様体様細胞塊を用いた場合、レーザ共焦点顕微鏡の3Dグラフィック分析手法を用いて、50個のMuse細胞由来胚様体
様細胞塊を取り、Muse細胞由来胚様体様細胞塊のトータル体積を測定し核の数で除することにより、それぞれの構成細胞の平均体積を測定した。測定の結果、1.5×105細胞/μlであることが算定され、この算定にしたがって上記数の細胞を集め、NOGマウス精巣に注入
した。マウスは注入6ヵ月後に実験に供した。
マウス胚性フィーダー細胞)(陰性対照)をSCIDマウス精巣に注入し、注入後8週後に実験に供した。
H-fibroblast画分及びH-MSC画分由来の富Muse細胞画分及びMuse細胞由来胚様体様細胞
塊について、安定な高解像度光学顕微鏡を用いてヒトMSC、線維芽細胞及び神経細胞など
の細胞タイプの観察を行った。
Muse細胞由来胚様体様細胞塊、H-fibroblast画分及びH-MSC画分由来のSSEA-3陽性細胞
及びSSEA-3陰性細胞、並びにヒトES細胞の細胞塊を遠心分離により集め、100mMリン酸バ
ッファー(pH7.2)中2.5%グルタルアルデヒドで30分間固定し、1%寒天中に包埋し、1mm3に切り、PBSで洗浄後、100mMリン酸バッファー(pH7.2)中2%OsO4で4℃で10分間染色した。サンプルを蒸留水で洗浄後、5滴の2%酢酸ウラニルで4℃で20分間染色した。蒸留水で洗浄後、染色サンプルを50%、70%又は90%エタノールを用いて4℃で10分間脱水し、次いで100%エタノールを3回交換することにより完全に脱水した。得られたサンプル
を酸化プロピレンで5分間置換し、酸化プロピレン中50%エポキシレジン中に60分間包埋した。これを純粋なエポキシレジンに包埋し、60℃オーバーナイトで硬化させた。超薄切片は70〜80nmの厚さで作製し、CCDカメラ付きの100kV 電子顕微鏡で観察した。
H-fibroblast画分及びH-MSC画分由来のMuse細胞由来胚様体様細胞塊について細胞群の
倍化時間を測定するために、それぞれのMuse細胞由来胚様体様細胞塊をひとつずつ96ウェルプレートに移し、15分間のトリプシン処理を行った後にガラスマイクロピペットを用いてピペッティングを行った。細胞の数を計測し、所定の時間後ごとに少なくとも20〜30個のMuse細胞由来胚様体様細胞塊について分析した。
無処理細胞画分(24ウェルスケール中の約10,000細胞)及びH-fibroblast画分及びH-MSC画分(24ウェルスケール中の約10,000細胞)由来のin vitroで単一Muse細胞由来胚様体
様細胞塊から分化した細胞(1〜3サイクル)を用いた。トータルRNAを、NucleoSpin RNA XS(Macherey-Nagel社)を用いて抽出、精製し、第1鎖cDNAをSuperScript VILO cDNA Synthesis Kit (Invitrogen)を用いて調製した。PCR反応は適切なプライマーを設計し、Ex
Taq DNA polymerase (タカラバイオ社)を用いて行った。用いたプライマーは以下のと
おりであった。
陽性対照としては、α-フェトプロテインプライマーについてはヒト胎児肝臓(Clonetech社)を用い、それ以外はヒト完全胚(Clonetech社)を用いた。
無処理細胞画分、H-fibroblast-1、H-fibroblast-2、H-MSC-1及びH-MSC-2由来の富Muse細胞画分及びMuse細胞由来胚様体様細胞塊からのトータルRNAをRneasy Mini Kit(Qiagen
GmbH社)により集め、cDNAをRT2 First Strand Kit(SA Biosciences社)を用いて合成した。プライマーはSA Biosciences社より特注し、7300 real time PCRシステム(Applied Biosystems社)を用いて定量的PCRを行った。得られたデータはΔΔCT方法(Livak KJ et al., Methods 25: 402-408, 2001)により解析した。
無処理細胞画分、H-fibroblast-1、H-fibroblast-2、H-MSC-1及びH-MSC-2由来の富Muse細胞画分及びMuse細胞由来胚様体様細胞塊、並びに4名の健常者由来ヒト末梢血単核細胞画分混合物を用いた。totalRNAをRneasy Mini Kit(Qiagen GmbH社)により集め、DNAマ
イクロアレイにより分析した(タカラバイオ社)。アレイシグナルは、Affimetrix Expression Console V1.1ソフトウェア)により処理しノーマライズした。Pathway Studio 6.0(Ariadne genomics社)を用いて発現変動が認められた遺伝子を遺伝子オントロジーの機
能的カテゴリーに割り当てた。階層的クラスタリングは、MeV4による群平均クラスタリングの手法を用いて、遺伝子の発現変動に基づいてユークリッド距離を用いて行った(Saeed AI et al., Biotechniques 34(2):374-378, 2003)。
H-fibroblast画分及びH-MSC画分由来の富Muse細胞画分、Muse細胞由来胚様体様細胞塊
及びHela細胞を用いた。テロメラーゼ活性は、TRAPEZE XL telomerase detection kit(Millipore社)とEx Taqポリメラーゼ(タカラバイオ社)を用いて検出した。蛍光強度はマイクロプレートリーダー(TECAN社)を用いて測定した。
無処理細胞画分、H-fibroblast画分及びH-MSC画分由来の富Muse細胞画分及びMuse細胞
由来胚様体様細胞塊由来の1μgのゲノムDNAをCpGenome DNA modification kit(chemicon社)で処理した。DNAをQIAquick column(Qiagen社)で精製した。ヒトOct3/4及びNanog遺伝子のプロモータ領域をPCRにより増幅し、PCR産物をpCR2.1-TOPO中にサブクローニング
しそれぞれのサンプルについて10クローンまでをM13ユニバーサルプライマーを用いて配
列決定し、プロモータ領域のメチル化の状態を調べた。PCR増幅には、Shimazaki T et al., EMBO J, 12:4489-4498, 1993に記載のプライマーを用いた。
3人の健常人からのヒト骨髄穿刺液(ALLCELLS社より入手)から単核細胞画分をLymphoprep Tube(Axis-Shield PoC AS社)を用いて集め、8時間の長時間トリプシン処理を行
った後にMC培養を行った。またトリプシン処理をせずに直接そのままでMC培養にも持って行った。7日目に細胞数を測定した。
3人の健常人からのヒト骨髄穿刺液(ALLCELLS社より入手)由来の単核細胞画分を抗CD105抗体とマイクロビーズのコンジュゲートと反応させ、MSカラム(Miltenyi Biotech社
)を用いてソーティングした。CD105陽性細胞をフラクション1(間葉系細胞群)として
集め、さらにCD105陰性細胞を抗CD34抗体及び抗CD117抗体の混合物とマイクロビーズのコンジュゲートとインキュベートし、再度ソーティングし、CD34陽性・CD117陽性細胞(フ
ラクション2;造血幹細胞群にあたる)及びCD105陰性・CD34陰性・CD117陰性細胞(フラクション3)を得た(図4)。集めたサンプルを8時間の長時間トリプシン処理を行った後にMuse細胞由来胚様体様細胞塊の形成を測定した。
マウス精巣を0.02MPBS中4%パラホルムアルデヒドを用いて固定した。切片は凍結切片として10μmの厚さで作製した。サンプルを0.02MPBSで洗浄し、20%BlockAce(雪印社)
含有バッファーを用いてブロッキングした後に免疫組織化学分析用の1次抗体とインキュベートした。用いた1次抗体は、抗平滑筋アクチン抗体(1:200、Lab Vision社)、抗MAP-2抗体(1:200、Biogenesis社)及び抗α-フェトプロテイン抗体(1:10、DAKO社)であった。
合した抗マウスIgG抗体を用い、DAPI存在下で反応させた。サンプルはニコン共焦点顕微
鏡システムC1si(ニコン)を用いて観察した。
細胞をフィコエリトリン標識抗CD11c抗体、抗CD29抗体、抗CD34抗体、抗CD44抗体、抗CD45抗体、抗CD49f抗体、抗CD54抗体、抗CD71抗体、抗CD90抗体、抗CD105抗体、抗CD166抗体、抗CD271抗体又は抗vWF抗体(Beckton Dickinson社)又は抗SSEA-3抗体(Millipore社)とインキュベートした。抗SSEA-3抗体を用いる場合、細胞をさらにFITC結合抗ラットIgM抗体と反応させた。2mM EDTA及び0.5%ウシ血清アルブミンを添加したカルシウム及び
マグネシウムを含まない0.02M PBSをFACS抗体希釈液として用いた。FACSCalibur(Becton
Dickinson)によりCellQuestソフトウェア又はFACSAriaによりDIAソフトウェアを用いて
データ解析を行った。細胞をFACS抗体希釈液中で抗SSEA-3抗体とインキュベートしFACSAria(Becton Dickinson)により低流速及び4 way purityソーティングモードでソーティン
グし、細胞のソーティングを行った。
データは、平均±SEMで表す。データは、Bonferroni法による一対比較によりANOVAを用いて比較した。
A.H-fibroblast画分及びH-MSC画分のストレス刺激
H-fibroblast画分とH-MSC画分のストレス刺激の結果の一例を表1に示す。
トリプシン処理が最も効率的な刺激であった。2株のH-fibroblast画分及び4株のH-MSC
画分を用いて繰返しこの実験を行ったところ、同様の傾向が認められた。陰性対照(ヒト末梢血単核細胞画分)においては、Muse細胞由来胚様体様細胞塊は認められなかった。代表的な観察値を表1に示す。
れた。16時間又は8時間トリプシン処理、1800〜2000rpm/minでの3分間のボルテックス
及び2000rpm15分間の遠心分離の一連の操作をMuse細胞の濃縮のための長時間トリプシ
ン処理(LTT)と名付けた。ボルテックス処理後の細胞の回収率は約70〜80%であった(図5)。
本実施例において、Muse細胞由来胚様体様細胞塊の判定基準を設けた。H-fibroblast画
分及びH-MSC画分由来の富Muse細胞画分中の単一細胞の平均直径は10〜13μmであった(図6a)。これらの細胞をMC培養すると、細胞は分裂を開始した。分裂するとそれぞれの細胞のサイズは小さくなり、8〜10μmの細胞から構成される多細胞塊が徐々に形成された(
図7e及び7f)。それぞれの細胞のサイズと外観は、MC培養したヒトES細胞に類似してい
た(図6b及び6c)。7日目に、ほとんどの多細胞塊は25μmより大きくなり、直径100〜150μmになった。該細胞塊はES細胞と類似した外観を有していた。Φ25μmのフィルターを用いることにより、25μmより大きい塊を回収した(図6b)。H-fibroblast画分及びH-MSC画分の100個のMuse細胞由来胚様体様細胞塊までの免疫細胞化学によりほとんどのMuse細胞由来胚様体様細胞塊は多能性マーカーNanog、Oct3/4、Sox2、PAR4及びSSEA-3が陽性で
あることがわかり、アルカリフォスファターゼ染色でも陽性であった(図6e-g)。25μm
より小さい細胞塊の場合、マーカーは検出される場合とされない場合があり、また多能性マーカーの局在はこれらのマーカーに典型的なパターンを示さない場合もあった。さらに、細胞の外観はむしろ富Muse細胞画分に類似している場合があった。
上記結果より、直径25μを超える多細胞塊を、Muse細胞由来胚様体様細胞塊とした。
生体がストレスに曝されたり、傷害を受けると休眠状態の組織幹細胞が活性化されることが知られている。本実施例において、H-MSC画分及びH-fibroblast画分に種々の方法で
ストレスをかけ(無血清処理、Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)による処理、低酸
素処理、トータル3時間、8時間若しくは16時間のトリプシン処理等)、生存した細胞を集め、その後メチルセルロース(MC)含有培地中で浮遊培養(MC培養という)を行い、さ
らに8000細胞/mLの密度で7日間MC培養を行った(図7-1d)。その結果、最大で約直径150μmまでの種々の大きさの細胞塊の生成が認められた(図7-1e及びf)。図7-1cはH-fibroblast-1画分のMC培養の0日目の状態を、図7-1dは7日目の状態を示す。16時間のトリプシン処理を行ったH-fibroblast画分及び8時間のトリプシン処理を行ったH-MSC画
分において、最も多くの細胞塊の形成が認められた。図7-1e及びfにH-fibroblast-1画
分から形成された細胞塊(Muse細胞由来胚様体様細胞塊)の状態を示す。図7-1eはMC培養7日目の状態であり、図7-1fは単一細胞の浮遊培養10日目の状態である。細胞塊をサイズごとにフィルターを用いて分画し、免疫細胞化学分析を行った。直径25μmを超える
細胞塊中に、Nanog、Oct3/4、SSEA-3、PAR-4及びSox2の多能性幹細胞マーカーが陽性であり(図7-2g-l)、さらにアルカリフォスファターゼ染色で陽性の細胞(図7-3m-o)が検
出された。これらの細胞について電子顕微鏡を用いて観察したところ、H-fibroblast画分及びH-MSC画分から形成した細胞塊において、ES細胞と同様の核/細胞質比、細胞内器官
の減少、核中の1つ若しくは2つの巨大な核小体の存在という特徴が認められた(図7-
4p-r)。
ファターゼ染色陽性を示す細胞塊を浮遊培養で形成し得る細胞を見出した。本発明者らは、これらの細胞をMuse細胞(multilineage differentiating stress enduring cells)と名付けた。16時間のトリプシン処理を行ったH-fibroblast画分及び8時間のトリプシン処理を行ったH-MSC画分から形成した細胞集団を「富Muse細胞画分(Muse-enriched population)」と呼び、該集団から得た単一細胞を浮遊培養したところ、富Muse細胞画分の9〜10
%において、細胞塊の形成(Muse細胞由来細胞塊:Muse細胞由来胚様体様細胞塊)が認められた。このことは、富Muse細胞画分には約9〜10%のMuse細胞が含まれることを示している。
一細胞とし、単一浮遊培養を行ったところ、細胞は生存したが、増殖速度は分裂周期が5〜7日と非常に低いままであり、細胞によっては細胞増殖の停止も観察された(図8-1
の(1))。このことは、これらの細胞塊の増殖が制限され、一旦速度が低下すると、浮遊培養において、増殖速度は再上昇しにくいことを示す。しかしながら、単一のMuse細胞由来胚様体様細胞塊を接着培養に移すと、増殖を再開した。5〜7日後、比較的小規模の増殖細胞群(3000〜5000細胞)を5分のトリプシン処理でばらばらにし、MC培養すると、約40%の効率で細胞塊の形成が認められた(図8-1の(2))。細胞群のスケールをさ
らに上げて約5〜10×104に達したところで、トリプシンで長時間処理すると、再びMuse
細胞(2nd cycle)を生成し、約10%の率でMuse細胞由来胚様体様細胞塊を形成した(図
8-1)。トリプシンでの長時間処理-浮遊培養-接着培養を5回繰り返したところ、それ
ぞれの世代において、同様の特性及びMuse細胞由来胚様体様細胞塊形成率を示した。5cycle目のMuse細胞由来胚様体様細胞塊においても、多能性マーカー及びアルカリフォスフ
ァターゼは陽性であった。
においては多くは正常な核型を有し、染色体の異常は認められなかった(図8-3)。このことにより正常な細胞による現象であることを示す。
分化能を確かめるため、単一のMuse細胞由来胚様体様細胞塊をゼラチンでコートしたディッシュに移し分化させた。7日目にα平滑筋アクチン(中胚葉マーカー)、デスミン(中胚葉マーカー)、神経フィラメント-M(外胚葉マーカー)、αフェトプロテイン(内胚葉マーカー)及びサイトケラチン7(内胚葉マーカー)が検出された(図9-1a-c)。RT-PCRにより、1から3サイクルの培養を行ったMuse細胞由来胚様体様細胞塊(第1から3cycle)はαフェトプロテイン及びGATA6(内胚葉マーカー)、微小管結合タンパク質2:MAP-2(中胚葉マーカー)及びNkx2.5(中胚葉マーカー)を発現していることが確認されたが、無処理のH-fibroblast又はMSC群はゼラチンコートしたディッシュ上での培養でも分
化が認められなかった(図9-2)。
ー(平滑筋アクチン)を発現することが確認された(図9-3f-i)。
体様細胞塊はin vitroでも in vivoでも3胚様に分化し得ることを示している。
多能性及び分化状態に関連したマーカーの発現を図10に示す。Nanogの発現は、富Muse細胞画分及び細胞クラスターにおいては、無処理細胞に比べそれほど高くなかった。多
能性幹細胞の幾つかにおいては、Nanogはそれほど発現しない(Chou YF et al., Cell 135, 449-461 (2008); Bui HT et al., Development. 135(23):3935-3945 (2008))。Nanogと同様に、Q-PCRでのOct-4はマウスES細胞に比較するとリプログラミング体細胞において低い(Bui HT et al., Development. 135(23):3935-3945 (2008))。従って、Nanog及び他の多能性(pluripotency)マーカーの発現量はpluripotencyにとってそれほど重要ではな
い。
定量PCRにより多能性及び非分化状態に関連するいくつかのマーカーが富Muse細胞画分
及びMuse細胞由来胚様体様細胞塊でアップレギュレートされていることが示された。富Muse細胞画分は上記のように9〜10%のMuse細胞を含んでいるに過ぎないが、Rex1(ZFP42)、Sox2、KLF-4、c-Myc、DPPA2(developmental pluripotency associated 2)、ERAS、GRB7(Growth factor receptor-bound protein 7)、SPAG9(Sperm associated antigen)、TDGF1(teratocarucinoma-derived growth factor1が、無処理細胞画分に比べて高度に又は適度にアップレギュレートされていた。Muse細胞由来胚様体様細胞塊においては、DAZL(azoospermia-like)、DDX4(VASA)、DPPA4(developmental pluripotency associated 4
)、Stella、Hoxb1、PRDM1及びSPRY2(sprouty homolog2)が無処理細胞に比べてアップレギュレートされていた(図10a)。
胞由来胚様体様細胞塊の全体的な遺伝子発現を、ヒト末梢血単核細胞画分をコントロールとして比較したところ、無処理細胞画分、富Muse細胞画分及びMuse細胞由来胚様体様細胞塊の間で幾つかの遺伝子において発現パターンの変化が認められた(図10a)。
108プローブのピアソン相関分析を、ヒト末梢血単核細胞(陰性対照)、無処理細胞画
分、H-fibroblast画分及びH-MSC画分由来の富Muse細胞画分及びMuse細胞由来胚様体様細
胞塊について行った(図11)。
また、DNAマイクロアレイにより、発現しているオドラント受容体及びケモカイン受容
体をピックアップした。
上記に示した検討は、安定な培養細胞を用いて行った。細胞を成体から取り出して培養した場合、生体内とは異なる特性を持ち得るので、Muse細胞やMuse細胞由来胚様体様細胞塊がアーティファクトな産物である可能性は否定できない。そこで、ヒト生体すなわちヒト骨髄細胞から培養を経ないで直接Muse細胞由来胚様体様細胞塊を得ることを試みた。ヒト骨髄穿刺液から単核細胞画分を単離し、直接MC培養に供するか(naive hBM-MC)、ある
いは8時間のトリプシン処理を行った後にMC培養に供した(8hr-hBM-MC、トリプシン処理後の単核細胞画分の生存率は約3.5%であった)。7日後、Muse細胞由来胚様体様細胞塊
の形成が無処理のnaive hBM-MCでは約0.004%の効率で認められ、8hr-hBM-MCでは約0.3%すなわち約75倍の効率であった(図12a)。これらのMuse細胞由来胚様体様細胞塊はア
ルカリフォスファターゼ染色陽性であった(図12b)。無処理のnaive hBM-MC及び8hr-hBM-MC由来の単一Muse細胞由来胚様体様細胞塊からクローン増殖した細胞のRT-PCRにより、α-フェトプロテイン、GATA6、MAP-2及びNkx2.5の発現が認められた(図13)。これ
らの結果は、ヒト骨髄中にin vivoにおいてもMuse細胞が存在し、8時間のトリプシン処
理で富化しMuse細胞由来胚様体様細胞塊を形成させることができることを示している。さらに、骨髄の多くのタイプの細胞中で、Muse細胞がCD105陽性間葉系細胞画分に属してい
ることが確認された。
るため、安定的な培養を行っている細胞は、骨髄から単離した無処理単核球とは異なるMuse細胞由来胚様体様細胞塊形成傾向を示すと考えられる。これを確認するため、次いで、ヒト骨髄穿刺液を培養し、初代MSCを回収しMC培養を行ったところ、約0.2%のMuse細胞由来胚様体様細胞塊形成が認められた。これらの初代MSCをさらに2回又は5回継代培養し
たところ、Muse細胞由来胚様体様細胞塊形成効率は無処理細胞画分に対して約0.5%〜1.0%それぞれ上昇した。無処理のH-fibroblast画分及びヒトMSC画分の約1.2%がMuse細胞由来胚様体様細胞塊を形成する。これらの結果は、Muse細胞のようなストレス耐性を有する細胞は継代培養等のin vitro培養環境で残り、このため安定な継代培養細胞画分が骨髄穿刺液から直接単離した単核細胞画分よりもより高いMuse細胞由来胚様体様細胞塊形成効率を示したことを示唆する。
を含むかを調べるために、ヒト骨髄穿刺液から単離した単核細胞画分を、CD34、CD117(
いずれも造血幹細胞マーカー)及びCD105(間葉系細胞のマーカー)に対する抗体を用い
て直接MACSソーティングに供し、各々の画分を8時間トリプシン処理し、7日間MC培養を行った。CD34陽性、CD117陽性画分にはMuse細胞由来胚様体様細胞塊はほとんど検出され
なかったが、CD34陰性、CD117陰性、CD105陽性画分にはCD34陰性、CD117陰性、CD105陰性画分の50倍のクラスターの形成が認められた。この結果は、Muse細胞は主にCD105陽性間
葉系細胞画分中に存在することを示唆している。
骨髄単核細胞画分からのそれぞれのフラクションの収率は、フラクション1(CD105陽
性フラクション)で1.8%、フラクション2(CD34陽性・CD117陽性フラクション)で8.5
%、フラクション3(CD34陰性・CD117陰性・CD105陰性フラクション)で89.7%であった。フラクション1、2及び3の細胞塊形成率は、それぞれ0.5%、0%及び0.01%であっ
た。従って、フラクション1の細胞塊形成率はフラクション3の約50倍であった。
一例として、SSEA-3をマーカーとしてFACSソーティングを行った。
H-fibroblast及びHMSCの両方について、SSEA-3陽性細胞及びSSEA-3陰性細胞をFACSソーティングにより分離し、単一細胞懸濁培養に供した。SSEA-3陽性細胞の約50〜60%がMuse細胞由来胚様体様細胞塊を形成した。一方、SSEA-3陰性細胞ではMuse細胞由来胚様体様細胞塊を形成しなかった。
FACS分析により、無処理H-fibroblast画分及びH-MSC画分は間葉系細胞に発現するCD44
、CD49f、CD54、CD90、CD105陽性の画分を含むことがわかった。しかし、CD11c、CD34、CD45、CD71、CD166、CD271及びフォンビルブランド(vWF)因子は陰性であった。富Muse細
胞画分においては、CD44及びCD54が陰性となったSSEA-3陽性画分は約0.7〜1.9%であった(図14)。
分中のMuse細胞由来胚様体様細胞塊形成率(約1.2%)及び富Muse細胞画分での形成率(
9〜10%)は、それぞれのSSEA-3の陽性率(無処理細胞画分は約0.7〜0.9%、富Muse細胞画分では7〜8.3%)に似ていた。SSEA-3の陽性率は、Muse細胞のある状態を示している
可能性がある。免疫組織化学によると、無処理のH-fibroblast画分及びH-MSC画分中のSSEA-3陽性細胞の数は1%未満であった。そこで、H-fibroblast画分及びH-MSC画分由来の富Muse細胞画分からSSEA-3陽性細胞をソーティングし、単一浮遊培養を行った。その結果、SSEA-3陽性細胞の50〜60%がMuse細胞由来胚様体様細胞塊を形成した。これは富Muse細胞画分のMuse細胞由来胚様体様細胞塊形成の約6〜7倍、無処理細胞画分のMuse細胞由来胚様体様細胞塊形成の約60倍である。一方SSEA-3陰性の細胞画分からはMuse細胞由来胚様
体様細胞塊の形成は認められなかった。FACSによるソーティングにより得られたSSEA-3陽性細胞画分由来の単一細胞塊からクローン増殖により得られた細胞(3,000〜5,000細胞)のSSEA-3陽性率は約45%であった(図15-1a)。このことは、Muse細胞由来胚様体様細胞塊の形成過程において、非対称性分裂が関与しており、単一Muse細胞由来胚様体様細胞塊のクローン増殖においても同様であることを示唆している。実際、非対称性分裂に関与していることが知られているNumblikeは、2つの細胞への分裂の過程で1つの細胞中にのみ存在する(図15-2b)。これらの結果は、非対称性細胞分裂がMuse細胞の増殖に関与していることを示唆する。
が障害を受けていることが示された。しかし、SSEA-3陰性細胞と陽性細胞の間で明らかな形態的な差は認められなかった(図15-3c及びd)。
めて少なかった(図15-4f)。この結果は、SSEA-3がMuse細胞の良いマーカーとなり得ることを示している。一方、Muse細胞由来胚様体様細胞塊の細胞においては、Oct3/4及びSox2は核中に主に局在していた(図7-2h及びl)。この2つのマーカーの細胞内局在の
差異は細胞状態の差異を反映している可能性がある。
来単核球中に0.025%〜0.05%存在し、それを長時間のトリプシン処理なしに、直接単一
細胞浮遊培養に供した。7日後、11.4±1.2%の細胞(単核球の0.003〜0.005%に相当す
る)が、Muse細胞由来胚様体様細胞塊を形成し、アルカリフォスファターゼ陽性であった。次いで、単一Muse細胞由来胚様体様細胞塊を接着培養により3,000細胞まで増殖させ、
単一浮遊培養に供した。これらの細胞中、33.5±3.1%の細胞が第2世代のMuse細胞由来
胚様体様細胞塊を形成した。また、単一Muse細胞由来胚様体様細胞塊からゼラチンでコートした培養ディッシュで増殖させた細胞についてRT-PCRを行ったところ、α-フェトプロ
テイン、GATA6、MAP-2及びNkx2.5の発現が認められた。これは、ヒト成体骨髄中にMuse細胞の特性を有する細胞が存在することを示唆する。
スファターゼ染色陽性であり、外胚葉、中胚葉及び内胚葉系細胞に分化し得るMuse細胞由来胚様体様細胞塊を形成した。また、増殖速度の測定において腫瘍形成性増殖に関する特徴を有しておらず、テロメラーゼ活性も有していなかった。このことは、Muse細胞は爆発的増殖を防ぐための多重のセキュリティーシステムを有していることを示している。Muse細胞の非腫瘍形成性特性はMuse細胞をマウス精巣に注入する実験においても認められた。この特性は生体機能のバランスを維持する上で都合がよく、この特性がなければ、異常増殖や異形成により生体は破壊され、腫瘍形成やテラトーマ形成をもたらす。
通常、Muse細胞は不活性休眠状態にあり生体が、危機的状態に陥ったり、あるいは重篤な傷害を被り、又は飢餓若しくは虚血状態等のストレス過多状態が維持されるとある種のシグナルが伝達されて活性化すると考えられる。その後、Muse細胞は組織再生に貢献し、細胞間相互作用や組織化に貢献する。
実施例1の検討において、FACSにより得たSSEA-3陽性細胞画分が多能性幹細胞の特性を有していること、すなわちMuse細胞であることが判明したが(上記J、K等)、さらに、単離したSSEA-3陽性細胞を用いて、in vitroでの分化能及びin vivoでの分化能を検討し、
さらにMuse由来iPS細胞の確立を行った。
GFP(緑色蛍光タンパク質)-レンチウイルスで標識したSSEA-3陽性Muse細胞を単離し、脊髄(圧迫損傷)、肝臓(CCl4を腹腔内注射、劇症肝炎モデル)又は腓腹筋(cardiotoxin注射)に損傷を与えた免疫不全マウス(NOGマウス)に静脈注射により移植した。ヒト皮膚細胞由来のMuse細胞をGFP(緑色蛍光タンパク質)-レンチウイルスで標識し(Hayase M
et al., J Cereb Blood Flow Metab. 29(8): 1409-20, 2009)、Muse細胞由来胚様体様
細胞塊が標識細胞由来であることをGFPにより確認した。脊髄損傷はNOGマウスに対してレベルTh9で行い(Farooque M et al., Acta Neuropathol., 100; 13-22, 2000)、NOGマウスの腓腹筋にcardiotoxinを投与し筋肉変性を誘発し、四塩化炭素をNOGマウスに腹腔内投与し、肝臓変性を誘発した。筋肉及び肝臓については2日後、脊髄については7日後に1×105のMuse細胞を静脈注射により移植した(各6頭のマウスを使用)。コントロールと
して、GFP標識MEC集団を静脈注射したマウスを用いた。移植の3又は4週間後に、マウスをパラホルムアルデヒドで固定し、免疫組織化学及び共焦点レーザ顕微鏡観察に供した。
成していた。(図16-1N及びO)。また、4週間後、再生している肝臓において、GFP及
びヒトゴルジ複合体陽性細胞がヒトアルブミンを発現していた(図16-1P)。RT-PCRの結果によりMuse細胞を移植したNOGマウス肝臓においてヒトアルブミンの形成が示された(図16-2)。GFP陽性細胞を再生している筋肉に注射した場合、3週間でヒトジストロフ
ィンを発現した(図16-3)。一方、SSEA-3陰性ヒト皮膚線維芽細胞画分を移植した場合
、細胞のインテグレートは顕著に少なく、組織マーカーが陽性の細胞はほとんど認められなかった。これらの結果は、Muse細胞が損傷組織に統合され、それぞれ、in vivoで外胚
葉、中胚葉及び内胚葉に分化し得ることを示す。
Muse細胞の分化調節に誘導システムが有効かどうかを検討した。単一SSEA-3陽性Muse細胞由来のMuse細胞由来胚様体様細胞塊を接着培養に供し、増殖させた。単一Muse細胞由来の増殖細胞を回収し、4つの群に分け、それぞれの群に対して、神経、骨細胞、脂肪細胞及び幹細胞への分化誘導を行った(n=5)。
密度でB-27 supplementを含むNEUROBASAI培地(Gibco社)中で7日間培養し、sphere(球状の細胞塊)を形成させた。分化させるためにsphereをポリ-L-リシンでコートしたガラ
ス上に移し、25ng/ml FGF及び25ng/ml BDNFを含む2% FBS中で10日間培養した。
した。
培養した。
サメタゾン及び100ng/ml HGFを含む10×ITS(GIBOCO社)、50ng/ml FGF4を含む)を用い
てコラーゲンコートしたディッシュ上で14日間培養した。
培養細胞を培養したり、Muse細胞由来胚様体様細胞塊を形成させることなく、ヒト成人皮膚から直接Muse細胞を単離することを試みた。
織を除き真皮を得、真皮を10% FBSを含むα-MEM中コラゲナーゼ/ジスパーゼと共に37℃
で36時間インキュベートした。濾過により消化された皮膚細胞を回収し、1500rpmで20分
間遠心分離し、α-MEMで洗浄し、0.25%トリプシン-HBSSで5分間インキュベートした。
細胞をさらにFACSバッファーで洗浄し、SSEA-3とインキュベートし、FACSを用いてSSEA-3陽性細胞をソーティングした。約7cm2の皮膚組織から1.3±0.3×104の単一細胞を回収することができた。SSEA-3陽性細胞は、回収した単一細胞の1.7±0.2%であった。
由来胚様体様細胞塊を形成した。Muse細胞由来胚様体様細胞塊はALP陽性であり、単一のMuse細胞由来胚様体様細胞塊からゼラチンでコートしたディッシュを用いて増殖させた細
胞について、RT-PCRで確認したところ、MAP-2、Brachyury、Nkx2.5、GATA6及びα-フェトプロテインを発現していた。この結果は、Muse細胞と同じ性質を有する細胞が上述の成人ヒト骨髄液と同様に、成人ヒト皮膚にも存在することを示している。
(MB)、血管周囲細胞(PC)、内皮前駆細胞(EP)、脂肪由来幹細胞(ADSC)等の種々のタイプの幹細胞や前駆細胞を含んでいる。Muse細胞がこれらの幹細胞等と同じである可能性を
排除するために、Muse細胞におけるSnai1(SKPのマーカー)、Slug(SKPのマーカー)、Sox10(NCSCのマーカー)、CD271(NCSCのマーカー)、Tyrp1(MBのマーカー)、Dct(MB
のマーカー)、CD117(c-Kit)(MBのマーカー)、CD146(PC及びADSCのマーカー)、NG2(PCのマーカー)、CD34(EP及びADSCのマーカー)及びフォンビルブランド因子(EPのマーカー)の発現を分析した。これらのマーカーのいずれもSSEA-3陽性細胞において、FACS分析又はRT-PCRで認められなかった(図18-1及び図18-2)。この結果は、Muse細胞はヒト成人皮膚に存在することが公知である幹細胞や前駆細胞と異なる細胞であることを示している。
iPS細胞は、Oct3/4遺伝子、Sox2遺伝子、Klf4遺伝子、c-Myc遺伝子、Nanog遺伝子、Lin28遺伝子等を導入し作製されている。Muse細胞は、多能性(pluripotency)マーカーを発現し、外胚葉、内胚葉及び中胚葉系細胞に分化し得るという点で、iPS細胞と類似した特性
を有している。そこで、Muse細胞がiPS細胞のよい材料となり得るかを検討した。
H-fibroblast画分由来のSSEA-3陽性細胞及び陰性細胞に、Takahashi et al., Cell, 131, 861-872(2007)の記載に従って、レトロウイルスベクターを用いて、Nanog、Oct3/4、KLF4及びc-Mycの4つの因子を導入し、培養した。以下に、方法の詳細を示す。
pMXsレトロウイルスベクター(Cell Biolabs)にヒトOct3/4、Sox2、Klf4、c-Mycのopen reading frameを組み込んだ。
PLAT-A細胞を100mm dishに5×106細胞の密度でまき、一晩培養した。次の日に、Fugene
HDを用いてトランスフェクションをを行った。トランスフェクションから24時間後、新
しい培地に交換した。3日後に上清を回収し、0.45μmのフィルターに通し、4μg/mlのポ
リブレンを加えた。60mm dishに1×105細胞の密度でまいたNHDF(皮膚線維芽細胞)にウ
イルス溶液を感染させた。24時間後、ウイルスの入っていない新しい培地に交換した。ウイルス感染から4日後にトリプシンにより剥がした細胞を、MEF(フィーダー細胞)の上に3×104細胞の密度でまいた。翌日、培地を4ng/ml bFGFを加えたPrimate ES mediumに交換した。その後2日に1回培地交換を行い、30日後、コロニーをピックアップし、24ウェルプレートにまいた。
RNeasy mini kit(QIAGEN)によりRNAを精製した。500ngのRNAをSuperScriptIIを用いて
逆転写した。内因性のOct、Sox2、Klf4、Myc、NanogのプライマーとPCRの条件等はakahashi et al., Cell, 131, 861-872(2007)に記載の通りで行った。
コラゲナーゼによりiPS細胞を採取した。細胞の塊をPoly-HEMAでコーティングしたdishに、20% Knockout serum replacement(Invitrogen)、2mM L-Glutamine、1×10-4M nonessential amino acid、1×10-4M 2-mercaptoethanol(Nacalai)、0.5%Penicillin/Streptomycinを含むDMEM/F12培地にて培養した。培地は2日に一回交換した。7日後、EBをゼラチ
ンコートしたdishにまき、同じ培地で一週間培養した。
60mm dishのiPS細胞をRock inhibitorにより処理し、Accutase(登録商標)により採取しチューブに集めて遠心後、PBSに浮遊させた。これをNOG mouse(登録商標)(財団法人
実験動物中央研究所)の精巣に注射した。12週後に4%パラホルムアルデヒドにより固定した。パラフィン切片はHE(Hematoxylin & Eosin)染色を行った。
H-fibroblast画分由来のSSEA-3陽性細胞及び陰性細胞に、Takahashi et al., Cell, 131, 861-872(2007)の記載に従って、レトロウイルスベクターを用いて、Nanog、Oct3/4、KLF4及びc-Mycの4つの因子を導入し、5日後にMEF上に再度まきなおし、培養した。colony pickupを行う直前、すなわちMEF上での培養30日目においては、SSEA-3陰性細胞中
で形成されたコロニーは非ES細胞様コロニーであり、ES細胞のマーカーであるTra-1-80陽性のコロニーはまったく見られなかった。一方、多くのSSEA-3陽性細胞においては陰性の細胞群の約7倍ほどの数のコロニーを形成し、それらはTra-1-80は陽性であった。注目すべきは、SSEA-3陰性細胞(コロニーやコロニーを形成していない細胞すべてを回収)では、RT-PCRで測定したところ、MEF上30日目のcolony pick up直前でもNonog、Sox2な
どの多能性に密接に関連した重要な遺伝子は陰性であった。一方、SSEA-3陽性細胞において、内因性のOct3/4、KLF4及びRex1がアップレギュレーションされており、さらにNanog
、Sox2が発現していた。予測されていたとおり、SSEA-3陽性細胞をcolony pickupし、新
たなMEF(フィーダー細胞)上に移した場合、無処理H-fibroblast画分細胞を用いた場合
よりも30倍ほど高い効率でiPSを作製することができた。これらのiPS細胞において、免疫細胞化学、RT-PCR及びQ-PCRにより、Tra-1-60、Tra-a-80、Rex1、UTF-1、テロメラーゼ逆転写酵素(TERT)及びヒトES細胞において発現している因子がアップレギュレーション
しており、あるいは新たに発現していた(図19、21)。また、得られたMuse細胞由来iPS細胞において、Nanog、Oct3/4、Sox2及びTRA-1-81が発現していた(図19)。RT-PCR
により、Muse細胞由来iPS細胞ではNanog、Oct3/4及びSox2が発現しているが、SSEA-3陰性細胞由来コロニーでは発現していないことがわかった(図21)。
細胞上でディッシュ当たり1×105の密度で培養した。両方の各群でコロニーを形成した
が、SSEA-3陰性細胞画分から形成されたコロニー数は、SSEA-3陽性細胞画分の7分の1程度であった。さらに、SSEA-3陽性細胞画分と異なり、SSEA-3陰性細胞画分では、ヒト多能性幹細胞マーカーであるTRA-1-81陽性コロニーは、コロニーを採取する直前の培養30日後でも認められなかった(図22-1)。RT-PCRにより、内因性Sox2及びNanogはSSEA-3陽性細胞由来画分のみで発現しており、SSEA-3陰性細胞画分では発現していなかった(図22-2)。
代後、ヒトES細胞様の形態(平らなコロニー)を示したそれぞれのコロニー(図22-3C及びC1)についてRT-PCRを行い、内因性oct3/4、Sox2及びNanogを発現しているコロニーをiPSコロニーとしてカウントした。その結果、iPS細胞は、SSEA-3陽性細胞由来コロニーのみから形成され、効率は0.03%であった。SSEA-3陰性細胞由来コロニーからは形成されなかった(図22-3D及びD1)。
、マウス精巣にてテラトーマを形成した(図23-1〜23-3)。
成しないことと対応している。もし、Muse細胞が皮膚や骨髄等のヒト成人組織において維持されている場合、その増殖は厳密に調節されているはずであり、そうでなければ、Muse細胞は生体のすべての部分で腫瘍を形成してしまうであろうことを考えても妥当である。さらに、ある条件下で培養した杯盤葉上層(epiblast)幹細胞がマウス精巣中でテラトーマを形成しないことが示されていることを考慮すると(Chou et al., Cell, 135, 449-461(2008))、多能性細胞が常にテラトーマを形成するとは言えない。Muse細胞は、最初から多能性マーカーの発現や分化能等において多能性細胞の特性を示すので、Muse細胞は単独でiPS細胞になり、増殖活性が上昇し、マウス精巣中でテラトーマを形成するようになる
ことが予測される。iPSの誘導メカニズムは解明されていないが、間葉系細胞中のMuse細
胞における腫瘍性増殖性の獲得の可能性がある。
胞からのiPS細胞作製効率は、無処理線維芽細胞に対して30倍高かった。このことは、iPS細胞の形成に主にMuse細胞が寄与していることを示唆している。
葉(ニューロフィラメント及びMAP-2)、中胚葉(SMA、Brachyury及びNkx2.5)、及び内
胚葉細胞(α-フェトプロテイン及びGATA-6)に分化することがわかった。さらに、免疫
不全マウス精巣にMuse由来iPS細胞を投与したところ、テラトーマの形成が観察された。
一方、Muse細胞由来胚様体様細胞塊を精巣に注射した場合、6ヶ月後においてもテラトーマの形成は認められず、MEFを注射したコントロールと比べて大きさもそれほど大きくな
らなかった。しかし、ヒトミトコンドリア並びにSMA、α-フェトプロテイン及びニューロフィラメントが陽性の細胞が同定された。この結果は、Muse由来iPS細胞と異なり、元々
のMuse細胞はテラトーマを形成しないが、免疫不全マウス中で外胚葉、中胚葉及び内胚葉に分化し得ることを示す。
結果を図25及び26に示す。細胞周期調節に関連した遺伝子の発現パターンは、大きく異なっていた。細胞周期進行に関連した遺伝子のほとんどは、Muse細胞由来胚様体様細胞塊ではダウンレギュレートされていたが、Muse由来iPS細胞ではアップレギュレートされ
ていた。一方、Muse細胞由来胚様体様細胞塊とMuse由来iPS細胞において、多能性及び未
分化状態に関与した遺伝子の発現は同様の傾向を示した。ただし、Muse細胞由来胚様体様細胞塊におけるNanog、Oct3/4及びSox2の発現レベルはMuse由来iPS細胞よりはるかに低かった。Nanog遺伝子及びOct3/4遺伝子のプロモータ領域のシトシン・グアニンジヌクレオ
チド(CpG)はMuse由来iPS細胞でMuse細胞由来胚様体様細胞塊に比べてメチル化の程度は
小さかった。なお、Nanog遺伝子のプロモータ領域のCpGのメチル化はSSEA-3陰性無処理細胞画分に比べて、Muse細胞由来胚様体様細胞塊で低かった(図24)。この結果は、Muse
細胞とMuse由来iPS細胞の間の多能性マーカーの発現レベルの差を説明する。
Claims (11)
- 生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞からSSEA-3の発現が陽性であることを指標に得られる、以下の性質のすべてを有する、SSEA-3陽性及びCD105陽性の多能性幹細胞の培養工程又は誘導操作工程を含む派生細胞又は誘導細胞の製造方法:
(i) SSEA-3陽性;
(ii) CD105陽性;
(iii) テロメラーゼ活性が低いか又は無い;
(iv) 三胚葉に分化する能力を持つ;
(v) 腫瘍性増殖を示さない;及び
(vi) セルフリニューアル能を持つ。 - 生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞からSSEA-3の発現が陽性であること及び胚様体様細胞塊の形成を指標に得られる、以下の性質のすべてを有する、請求項1記載のSSEA-3陽性及びCD105陽性の多能性幹細胞の培養工程又は誘導操作工程を含む派生細胞又は誘導細胞の製造方法:
(i) SSEA-3陽性;
(ii) CD105陽性;
(iii) テロメラーゼ活性が低いか又は無い;
(iv) 三胚葉に分化する能力を持つ;
(v) 腫瘍性増殖を示さない;
(vi) セルフリニューアル能を持つ;及び
(vii) 胚様体様細胞塊を形成する。 - 多能性幹細胞がCD117陰性及びCD146陰性である、請求項1又は2に記載の多能性幹細胞の培養工程又は誘導操作工程を含む派生細胞又は誘導細胞の製造方法。
- 多能性幹細胞がCD117陰性、CD146陰性、NG2陰性、CD34陰性、vWF陰性及びCD271陰性である、請求項1又は2に記載の多能性幹細胞の培養工程又は誘導操作工程を含む派生細胞又は誘導細胞の製造方法。
- 多能性幹細胞がCD34陰性、CD117陰性、CD146陰性、CD271陰性、NG2陰性、vWF陰性、Sox10陰性、Snail陰性、Slug陰性、Tyrp1陰性及びDct陰性である、請求項1又は2に記載の多能性幹細胞の培養工程又は誘導操作工程を含む派生細胞又は誘導細胞の製造方法。
- 生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞からSSEA-3の発現が陽性であることを指標に得られる、以下の性質のすべてを有する、SSEA-3陽性及びCD105陽性の多能性幹細胞の分化誘導工程を含む、分化した細胞又は組織の製造方法:
(i) SSEA-3陽性;
(ii) CD105陽性;
(iii) テロメラーゼ活性が低いか又は無い;
(iv) 三胚葉に分化する能力を持つ;
(v) 腫瘍性増殖を示さない;及び
(vi) セルフリニューアル能を持つ。 - 生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞からSSEA-3の発現が陽性であること及び胚様体様細胞塊の形成を指標に得られる、以下の性質のすべてを有する、請求項6に記載のSSEA-3陽性及びCD105陽性の多能性幹細胞の分化誘導工程を含む、分化した細胞又は組織の製造方法:
(i) SSEA-3陽性;
(ii) CD105陽性;
(iii) テロメラーゼ活性が低いか又は無い;
(iv) 三胚葉に分化する能力を持つ;
(v) 腫瘍性増殖を示さない;
(vi) セルフリニューアル能を持つ;及び
(vii) 胚様体様細胞塊を形成する。 - 多能性幹細胞がCD117陰性及びCD146陰性である、請求項6又は7に記載の多能性幹細胞の分化誘導工程を含む、分化した細胞又は組織の製造方法。
- 多能性幹細胞がCD117陰性、CD146陰性、NG2陰性、CD34陰性、vWF陰性及びCD271陰性である、請求項6又は7に記載の多能性幹細胞の分化誘導工程を含む、分化した細胞又は組織の製造方法。
- 多能性幹細胞がCD34陰性、CD117陰性、CD146陰性、CD271陰性、NG2陰性、vWF陰性、Sox10陰性、Snail陰性、Slug陰性、Tyrp1陰性及びDct陰性である、請求項6又は7に記載の多能性幹細胞の分化誘導工程を含む、分化した細胞又は組織の製造方法。
- 分化した細胞又は組織が、骨髄、脊髄、血液、脾臓、肝臓、肺、腸管、眼、脳、免疫系、循環系、骨、結合組織、筋、心臓、血管、膵臓、中枢神経系、末梢神経系、腎臓、膀胱、皮膚、上皮付属器、乳房−乳腺、脂肪組織、並びに口、食道、膣、肛門を含む粘膜からなる群から選択される、請求項6〜10のいずれか1項に記載の分化した細胞又は組織の製造方法。
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