CN107012117B

CN107012117B - 可从机体组织分离的多能干细胞

Info

Publication number: CN107012117B
Application number: CN201611060144.1A
Authority: CN
Inventors: 出泽真理; 藤吉好则; 锅岛阳一; 若尾昌平
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2009-07-15
Filing date: 2010-07-15
Publication date: 2020-10-23
Anticipated expiration: 2030-07-15
Also published as: AU2010271722B8; EP2455452A1; PL3214170T3; KR20170089959A; JP5852503B2; EP3214170A1; JP2018203780A; KR101764080B1; KR20120069663A; EP2455452B2; ES2647360T5; EP3680323A1; KR101945343B1; JP6416298B2; EP2455452B1; ES2647360T3; DK3214170T3; NO2455452T3; SG177705A1; CN102858951B

Abstract

本发明的目的是提供从机体组织直接获得多能干细胞的方法及由此得到的多能干细胞。本发明涉及可从机体组织分离的SSEA‑3(+)多能干细胞。

Description

可从机体组织分离的多能干细胞

本申请为分案申请，原申请的申请日为2010年7月15日，申请号为201080041908.7，发明名称为“可从机体组织分离的多能干细胞”。

发明背景

发明领域

本发明涉及机体组织来源的多能干细胞。

背景技术

涡虫和蝾螈即使在其身体被切割后也可再生出完整的身体。这种高再生能力有赖于间充质组织中存在的多能干细胞的存在情况。然而，在高级生物(例如人)的情况下，组织再生能力远低于这些动物的再生能力。哺乳动物胚泡中的内细胞团(或ICM：内细胞群)被公认为是能够分化成外胚层、中胚层和内胚层细胞谱系的细胞的多能干细胞集合体。然而，这种多能性随着发育进行而受到限制，随后进行特化性细胞分化，产生各种组织类型。

近年来，可促进组织再生的成体干细胞或组织干细胞引起了关注。然而，尚不清楚多能干细胞是否像在涡虫或蝾螈的情况一样也存在于成熟哺乳动物机体中。

据报道，具有分化成骨、软骨、脂肪细胞、神经元细胞、骨骼肌等的能力的骨髓基质细胞(MSC)部分为从成体获得的具有分化潜能的细胞(参见非专利文献1和2)。然而，骨髓基质细胞(MSC)由各种类型的细胞群组成。MSC群的分化潜能是变化的，但尚未清楚了解其主体。此外，其需要用特定化合物刺激、基因转移等以分化成特定细胞。准确地讲，需要构建用于诱导分化的系统。

此外，据报道，iPS细胞(诱导多能干细胞)(参见专利文献1、专利文献2、非专利文献3等)为成体来源的多能干细胞。然而，iPS细胞的建立需要使用特殊物质进行诱导操作，例如将特定基因导入作为间充质细胞群的皮肤成纤维细胞部分(dermal fibroblast)或将特定化合物导入体细胞。

专利文献1日本专利号4183742

专利文献2日本专利公布(Kokai)号2008-307007A

非专利文献1M.DEZAWA等，The Journal of Clinical Investigation，113，12，第1701-1710页，(2004)

非专利文献2M.DEZAWA等，SCIENCE，2005年7月8日，309，第314-317页，(2005)

非专利文献3Okita K.等SCIENCE，2008年11月7日，322(5903)，第949-953页

发明概述

本发明的目的是提供从机体组织直接获得多能干细胞的方法，以及提供通过所述方法获得的多能干细胞。

本发明人发现在涉及骨髓基质细胞(MSC：bone marrow stromal cell)部分的研究过程中，以极低频率由未处理的(naive)人MSC细胞形成特有的细胞团。最初细胞团的外观酷似ES细胞的外观。然而，与ES细胞不同，细胞团不进行无限生长。当它们在一定时间内达到某一大小便停止生长，然后形成含有毛细胞和色素细胞等各种细胞的非均质群。另外，对这些细胞团进行免疫细胞化学分析，分别从细胞团中检出对外胚层、内胚层和中胚层标记呈阳性的不同细胞。本发明人从该结果中考虑在通常保持和培养的未处理(naive)人MSC细胞部分中相当于多能性/多能细胞的细胞存在的可能性。因此，本发明人对该问题进行了进一步的深入研究。

已知当机体暴露于应激或伤害时，休眠状态的组织干细胞被激活，以促进组织再生。本发明人在按照各种方法(例如无血清培养、使用Hank平衡盐溶液(HBSS)培养、低氧培养、共3小时的间歇短时间胰蛋白酶培养和8小时或16小时的长时间胰蛋白酶培养)培养骨髓基质细胞(MSC)部分和皮肤成纤维细胞部分等间充质细胞时，向间充质细胞提供刺激应激，收集存活细胞，然后在含甲基纤维素(MC)培养基中进行悬浮培养(称为“MC培养”)。结果，证实了各种大小的胚状体样(embryoid body-like)细胞团(最大直径高达150μm)的形成。特别证实了在经历长期胰蛋白酶培养的人皮肤成纤维细胞部分和人MSC部分中胚状体样细胞团形成频率最高。

本发明人分析了在如此获得的胚状体样细胞团中的细胞性质，因此发现这类细胞具有多能干细胞的性质。本发明人还发现，所获得的胚状体样细胞团中的细胞具有以往已报道的多能性/多能干细胞不具备的性质。本发明人进一步分析了由所获得的细胞团中的细胞表达的蛋白质，因此发现细胞进行的表达模式不同于以往报道的ES细胞和iPS细胞等多能干细胞进行的表达模式。

本发明人还发现，SSEA-3作为上述多能干细胞的表面抗原表达，并且还可使用SSEA-3表达作为标记从机体组织中分离上述多能干细胞。

本发明人还发现，上述多能干细胞是不同于以往已报道的ES细胞和iPS细胞等多能干细胞的新的多能干细胞类型。准确地讲，本发明人发现，可在不需要任何诱导操作的情况下从机体组织直接获得多能干细胞。因此，本发明人完成了本发明。本发明称之为多能干细胞Muse细胞(Multilineage-differentiating Stress Enduring细胞(多谱系分化应激持久细胞))。

本发明如下。

[1] 可从机体组织中分离的SSEA-3-阳性多能干细胞。

多能干细胞可从培养的成纤维细胞和髓样干细胞等机体组织培养物中分离，而且也可以单一细胞形式分离。

[2] [1]的多能干细胞，其为CD105阳性的。

[3] [1]或[2]的CD117(c-Kit)阴性和CD146阴性的多能干细胞。

[4] [1]或[2]的多能干细胞，其为CD117阴性、CD146阴性、NG2阴性、CD34阴性、vWF阴性和CD271阴性的。

[5] [1]或[2]的多能干细胞，其为CD34阴性、CD117阴性、CD146阴性、CD271阴性、NG2阴性、vWF阴性、Sox10阴性、Snail阴性、Slug阴性、Tyrp1阴性和Dct阴性的。

[6] [1]-[5]中任一项的多能干细胞，其具有低端粒酶活性或无端粒酶活性。

[7] [1]-[6]中任一项的多能干细胞，其能够分化成三胚层。

本发明的多能干细胞能够通过体外贴壁培养分化成三胚层。准确地讲，通过体外诱导培养，多能干细胞可分化成皮肤、肝、神经、肌肉、骨、脂肪等三胚层的代表性细胞。另外，多能干细胞当体内移植到睾丸时能够分化成三胚层特有的细胞。此外，当通过静脉内注射到活体而移植到受损器官时，多能干细胞能够存活并分化成器官(例如皮肤、脊髓、肝和肌肉)。

[8] [1]-[7]中任一项的多能干细胞，其不会进行肿瘤性增殖。

本发明的多能干细胞具有通过悬浮培养以约1.3天/细胞分裂的生长速度生长但在约10天内停止生长的性质，并且还具有当移植入睾丸时至少半年不癌化的性质。

[9] [1]-[8]中任一项的多能干细胞，其具有自我更新能力。

本发明的多能干细胞可通过重复悬浮培养和贴壁培养而生长。此外，本发明的多能干细胞像其它体干细胞的情况一样经历不对称分裂。

[10] [1]-[9]中任一项的多能干细胞，其对应激有抗性。

[11] [1]-[10]中任一项的多能干细胞，其具有高吞噬能力。

[12] [1]-[11]中任一项的多能干细胞，其对下列22种气味受体的至少一种呈阳性：

嗅觉受体，家族8，亚家族G，成员2(OR8G2)；

嗅觉受体，家族7，亚家族G，成员3(OR7G3)；

嗅觉受体，家族4，亚家族D，成员5(OR4D5)；

嗅觉受体，家族5，亚家族AP，成员2(OR5AP2)；

嗅觉受体，家族10，亚家族H，成员4(OR10H4)；

嗅觉受体，家族10，亚家族T，成员2(OR10T2)；

嗅觉受体，家族2，亚家族M，成员2(OR2M2)；

嗅觉受体，家族2，亚家族T，成员5(OR2T5)；

嗅觉受体，家族7，亚家族D，成员4(OR7D4)；

嗅觉受体，家族1，亚家族L，成员3(OR1L3)；

嗅觉受体，家族4，亚家族N，成员4(OR4N4)；

嗅觉受体，家族2，亚家族A，成员7(OR2A7)；

鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)，α激活活性多肽，嗅觉型(GNAL)；

嗅觉受体，家族6，亚家族A，成员2(OR6A2)；

嗅觉受体，家族2，亚家族B，成员6(OR2B6)；

嗅觉受体，家族2，亚家族C，成员1(OR2C1)；

嗅觉受体，家族52，亚家族A，成员1(OR52A1)；

嗅觉受体，家族10，亚家族H，成员3(OR10H3)；

嗅觉受体，家族10，亚家族H，成员2(OR10H2)；

嗅觉受体，家族51，亚家族E，成员2(OR51E2)；

嗅觉受体，家族5，亚家族P，成员2(OR5P2)；和

嗅觉受体，家族10，亚家族P，成员1(OR10P1)。

[13] [1]-[12]中任一项的多能干细胞，其对下列5种趋化因子受体的至少一种呈阳性：

趋化因子(C-C基序)受体5(CCR5)；

趋化因子(C-X-C基序)受体4(CXCR4)；

趋化因子(C-C基序)受体1(CCR1)；

达菲血型，趋化因子受体(DARC)；和

趋化因子(C-X-C基序)受体7(CXCR7)。

[14] [1]-[13]中任一项的多能干细胞，其来源于中胚层组织或间充质组织。

[15] 细胞团或细胞部分，其含有[1]-[14]中任一项的多能干细胞。

[16] 用于从机体组织分离多能干细胞或多能细胞部分的方法，所述方法使用下列性质(i)-(vi)中的至少一种作为指标：

(i)SSEA-3阳性；

(ii)CD105阳性；

(iii)CD117阴性和CD146阴性；

(iv)CD117阴性、CD146阴性、NG2阴性、CD34阴性、vWF阴性和CD271阴性；

(v)CD34阴性、CD117阴性、CD146阴性、CD271阴性、NG2阴性、vWF阴性、Sox10阴性、Snail阴性、Slug阴性、Tyrp1阴性和Dct阴性；和

(vi)端粒酶活性低或无端粒酶活性。

[17] 用于分离多能干细胞或多能细胞部分的方法，所述方法包括将机体组织来源的细胞暴露于细胞应激中，然后收集存活细胞。

[18] [17]的分离多能干细胞或多能细胞部分的方法，其中细胞应激选自蛋白酶处理、低氧条件下培养、低磷酸盐(phosphate)条件下培养、血清饥饿条件下培养、糖饥饿状态下培养、辐射暴露下培养、热激暴露下培养、有毒物质存在下培养、活性氧存在下培养、机械刺激下培养和压力处理下培养。

[19] [18]的分离多能干细胞或多能细胞部分的方法，其中细胞应激是胰蛋白酶培养。

[20] 多能干细胞，其是从[1]-[14]中任一项的多能干细胞衍生或诱导的细胞。

衍生细胞或诱导细胞的实例包括通过基因转移或添加化合物诱导的细胞。其另一个实例是来自本发明干细胞的iPS细胞。

[21] 分化细胞，其是由[1]-[14]中任一项的多能干细胞衍生或诱导的细胞。

[22] 药物组合物，其包含[1]-[14]和[20]中任一项的多能干细胞。

[23] 药物组合物，其包含[21]的分化细胞。

本说明书包括美国临时申请号61/213,788和美国临时申请号61/290,159的说明书和/或附图中公开的部分或全部内容，其是本申请的优先权文献。

附图简述

图1-1表示间充质细胞部分、Muse细胞和M团(Muse细胞来源的胚状体样细胞团)之间的关系。如图1所示，直接分离出SSEA-3阳性细胞，然后将其通过在不暴露于长期应激情况下的悬浮培养来培养，便可获得M团。

图1-2表示使Muse细胞大量生长的方法。

图2表示这样的因子：其在M团中的表达水平与未处理细胞部分中的表达水平之比高。

图3表示这样的因子：其在M团中的表达水平与人ES细胞中的表达水平之比高。

图4表示用于MACS分选的方案。

图5表示以下照片(染色图像)，其显示当对人成纤维细胞(H-fibroblast)部分进行16小时长的胰蛋白酶培养(图5a)、以1800rpm-2200rpm/分钟涡旋3分钟(图5b)，然后进行锥虫蓝染色时死细胞的除去。

图6表示各种细胞的照片。图6a表示富含Muse的细胞部分中的单一细胞(比例尺＝10μm)，图6b表示人ES细胞来源的胚状体细胞团(比例尺＝25μm)，图6c表示直径约25μm的M团(比例尺＝25μm)，图6d表示通过碱性磷酸酶染色进行染色的人ES来源的细胞团(第4天)(比例尺＝25μm)，图6e-g表示M团中Oct3/4(e)、Sox2(f)和PAR4(g)的免疫染色图像。

图7-1表示以下照片，其显示来自人成纤维细胞部分和人MSC(H-MSC)部分的细胞团的特征。图7-1a和b表示通过未处理人MSC部分的普通贴壁培养自发形成的细胞团(比例尺＝100μm)。图7-1c和d表示第0天(c)和进行长期胰蛋白酶培养接着MC培养第7天(d)人成纤维细胞-1部分的状态(比例尺＝100μm)。图7-1d中的箭头表示M团。图7-1e和f表示MC培养第7天由人成纤维细胞-1部分形成的M团(比例尺＝50μm)。

图7-2表示以下照片，其显示人成纤维细胞部分和人MSC(H-MSC)部分的细胞团的特征。图7-2g-l表示免疫染色结果；即表示由人成纤维细胞部分形成的M团(图7-2g、i和k)和由H-MSC部分形成的M团(图7-2h、j和l)中的Nanog(图7-2g和j)、Oct3/4(图7-2h)、SSEA-3(图7-2i)、PAR4(图7-2k)和Sox2(图7-2l)的定位(比例尺＝50μm)。

图7-3表示以下照片，其显示人成纤维细胞部分和人MSC(H-MSC)部分的细胞团的特征。图7-3m-o表示人ES细胞(图7-3m)、得自人成纤维细胞部分的M团(图7-3n)和未处理人成纤维细胞-1部分(图7-3o)的碱性磷酸酶染色结果(比例尺＝50μm)。

图7-4表示电子显微镜照片，其显示得自人成纤维细胞部分和人MSC(H-MSC)部分的细胞团的特征。图7-4p-r表示人ES细胞胚状体(图7-4p，MC培养第3天)、人成纤维细胞-1部分来源的M团(图7-4q和r，MC培养第5天)的电子显微镜图片(比例尺＝5μm)。

图8-1表示M团的克隆性和自我更新。准确地讲，图8-1表示进行Muse细胞克隆性和自我更新测定的实验的概要图。

图8-2表示悬浮Muse细胞的生长速度。

图8-3表示自单一M团(人成纤维细胞-1来源的，第一代(循环))克隆扩繁的细胞的正常核型。

图9-1表示M团的分化。图9-1a-c表示免疫染色图像，其显示得自人成纤维细胞-1部分的分化细胞团中α平滑肌肌动蛋白和神经丝(图9-1a和b)及甲胎蛋白(图9-1c)的定位(图9-1a比例尺＝500μm；图9-1b和c比例尺＝50μm)。图9-1a的箭头表示贴壁的M团。

图9-2表示通过在明胶上培养未处理细胞部分和得自人成纤维细胞部分的第一代和第三代M团以诱导自发分化而制备的细胞群中甲胎蛋白(α-FP)表达、GATA6表达、MAP-2表达和Nkx2.5表达的RT-PCR分析结果。作为阳性对照，对于α-FP使用人胎儿肝脏，对于GATA6、MAP-2和Nkx2.5使用完整人胚胎。

图9-3e-l表示给予富含Muse的细胞部分的免疫缺陷小鼠的睾丸。图9-3e表示对照无损睾丸、通过给予小鼠ES细胞(mES细胞)得到的睾丸(第8周)、通过给予MEF(饲养细胞)得到的睾丸(第8周)、通过给予M团(M-cluster)得到的睾丸(6个月)和通过给予富含Muse的细胞部分(Muse)得到的睾丸(6个月)。图9-3f-i表示通过给予富含Muse的细胞部分或M团获得的睾丸组织中神经丝M(图9-3f，照片中的绿色染色)、甲胎蛋白(图9-3g，照片中的绿色染色)和平滑肌肌动蛋白(图9-3h，照片中的红色染色)的免疫染色图像(比例尺＝50μm)。图9-3i中的3个图表示人线粒体(绿色染色)和平滑肌肌动蛋白(红色染色)的双重染色图像(比例尺＝20μm)。图9-3j-l表示通过给予富含Muse的细胞部分获得的睾丸组织的图片(图9j和k)。图9k中观察到的管状结构用抗人线粒体抗体染色(图9-3j的比例尺＝500μm；图9-3k-l的比例尺＝50μm)。

图10a表示涉及人成纤维细胞(Fibro-1和Fibro-2)和H-MSC(MSC-1和MSC-2)的多能性和未分化细胞状态的因子的定量PCR结果(No.2)。图10a栏中给出的各种图案表示富含Muse的细胞部分或M团(第7天)中的基因表达水平与未处理细胞部分的基因表达水平进行比较的结果。白色图案表示富含Muse的细胞部分或M团的基因表达水平与未处理细胞部分的基因表达水平的比率大于1/3(1:3)但低于3(3:1)。灰色图案表示富含Muse的细胞部分或M团的基因表达水平与未处理细胞部分的基因表达水平的比率大于3(3:1)。斜线图案表示富含Muse的细胞部分或M团的基因表达水平与未处理细胞部分的基因表达水平的比率低于1/3(1:3)。

图10b表示H-MSC来源的未处理细胞部分(Naive)、富含Muse的细胞部分(Muse)和M团(第7天)的端粒酶活性。使用热灭活样品(Heat)作为阴性对照。

图11表示人成纤维细胞部分来源的未处理细胞部分和H-MSC部分来源的未处理细胞部分、富含Muse的细胞部分和M团的DNA微阵列分析结果。

图12表示以下照片，其显示通过对自人骨髓单核细胞组分作为SSEA-3/CD105二重阳性细胞直接收集的Muse细胞进行MC培养形成的胚状体样细胞团。图12a表示通过对由人骨髓分离的单核细胞部分进行MC培养(8小时-hBM-MC，7天)，然后进行8小时长的胰蛋白酶培养而形成的M团(比例尺＝100μm)。图12b表示由8小时-hBM-MC(7天)形成的M团的碱性磷酸酶染色图像(比例尺＝50μm)。

图13表示细胞群的甲胎蛋白(α-FP)、GATA6、MAP-2和Nkx2.5的RT-PCR分析结果，所述细胞器通过在明胶上培养由未处理H-MSC-1部分(未处理1)、未处理H-MSC-2部分(未处理2)(两个部分为阴性对照)和进行8小时胰蛋白酶培养的人骨髓来源的单核细胞部分(8小时-hBM)或未进行胰蛋白酶培养的人骨髓来源的单核细胞部分(未处理hBM)形成的M团从而诱导其自发分化而制备。

图14表示人成纤维细胞部分(未处理细胞)和H-MSC部分(未处理细胞)的FACS分析结果。

图15-1表示以下照片，其显示：未处理细胞部分的SSEA-3(+)细胞(15-1a左)的染色图像；及自通过FACS分选收集的SSEA-3(+)细胞的单一M团克隆扩繁的SSEA-3(+)细胞(15-1a右)的染色图像。该图中的每个比例尺表示100μm。

图15-2表示染色图像照片，其显示Numblike(绿色)的定位，该因子在Muse细胞(人成纤维细胞)的细胞分裂期间参与不对称分裂。该图中的每个比例尺表示100μm。

图15-3表示电子显微镜照片，其显示人成纤维细胞来源的SSEA-3(-)细胞(图15-3c)和SSEA-3(+)细胞(图15-3d)。该图中的每个比例尺表示5μm。

图15-4表示染色图像照片，其显示人成纤维细胞来源的Muse细胞中的Oct3/4(绿色)(图15-4e)、Sox2(绿色)(图15-4f)和SSEA-3(红色)(图15-4g)。

图16-1表示以下照片，其显示严重免疫缺陷小鼠(Nog小鼠)受损组织中GFP标记的SSEA-3(+)Muse细胞部分的分化。图16-1N和O表示压迫损伤脊髓(4周后)的GFP(+)细胞，其表达神经丝(红色)和人高尔基复合体(白色)。图16-1O表示图16-1N中正方形圈起部分的放大图。图16-1P表示受损肝脏(4周后)的GFP(+)靶细胞，其表达人白蛋白(红色)和人高尔基复合体(白色)。

图16-2表示以下照片，其显示通过RT-PCR检查的植入SSEA-3(+)Muse细胞的肝脏中人白蛋白的表达。

图16-3表示以下照片，其显示严重免疫缺陷小鼠(Nog小鼠)受损组织中GFP标记的SSEA-3(+)Muse细胞部分的分化。准确地讲，照片显示表达人肌养蛋白(红色)的肌肉的GFP(+)细胞(3周后)。

图17-1表示以下照片，其显示自由单一Muse细胞形成的M团生长的细胞的分化。图17-1A-D表示中和结果。图17-1A表示由此形成的球体(sphere)。此外，作为对球体的免疫染色数据，图17-1B表示巢蛋白的表达，图17-1C表示Musashi的表达，图17-1D表示NuroD的表达。图17-1E表示通过使这些球体进一步分化成神经细胞获得的MAP-2(+)细胞。图17-1F-G表示骨细胞诱导结果，更准确地说表示骨钙蛋白(F)和ALP(G)的表达。图17-1H和I表示脂肪细胞诱导的结果。图17-1H表示含脂滴的细胞，图17-1I表示油红染色结果。图17-1J表示肝细胞诱导结果；即甲胎蛋白(+)细胞。

图17-2表示以下照片，其显示经RT-PCR检查，通过肝细胞诱导而诱导的细胞中人白蛋白和人甲胎蛋白的表达。

图18-1表示以下照片，其显示经RT-PCR检查，SSEA-3(+)Muse细胞中Sox10、Snail1、Slug、Tyrp1和Dct的表达。

图18-2表示经FACS分析，NG2、CD34、vWF、CD117、CD146和CD271的表达。在未处理人皮肤成纤维细胞中，发现作为周细胞标记的NG2和作为内皮祖细胞标记的CD34和vWF呈阴性。还发现它们在SSEA-3(+)细胞中为阴性的。发现少数未处理人皮肤成纤维细胞对作为成黑素细胞标记的CD117、作为周细胞标记的CD146和作为NCSC标记的CD271呈阳性(分别为0.2％、0.2％和0.8％)，但不被视为Muse细胞，因为它们是SSEA-3(-)细胞。

图18-3表示Muse细胞吞噬铁酸盐。

图19表示以下照片，其显示由Muse细胞制备的iPS细胞的形成。图19a表示由皮肤成纤维细胞(NHDF)来源的Muse细胞诱导的人iPS细胞的状态。图19b-f表示多能细胞标记的表达(“b”表示Nonog的表达，“c”表示Oct3/4的表达，“d”表示Sox2的表达，“e”表示SSEA-3的表达，“f”表示Tra-1-60的表达)。

图20表示以下照片，其显示Nonog(E)、Oct3/4(F)、Sox2(G)和Tra-1-81(H)的免疫组织化学分析结果。

图21表示以下照片，其显示通过RT-PCR检查，自Muse来源的iPS细胞(Mi-1和Mi-2)和SSEA-3(-)细胞生长的集落((-)-1和(-)-2)中多能性标记的表达。

图22-1表示以下照片，其显示用反转录病毒导入Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc后在MEF饲养细胞上培养后30天，由SSEA-3(+)和(-)细胞形成的集落的Tra-1-81免疫染色结果。人ES细胞用作对照。得自SSEA-3(+)细胞(a1)和人ES细胞(a2)的集落为Tra-1-81阳性的，但得自SSEA-3(-)细胞的所有集落为Tra-1-81阴性的。

图22-2表示以下照片，其显示在与22-1一样在MEF上培养30天后的阶段，SSEA-3(+)和(-)细胞的多能性标记(内源Oct3/4(endoOct)、内源Sox2(endo Sox2)、Nanog、内源Klf4(endo Klf4)、Rex1和UTF1)的表达。在SSEA-3(-)细胞群中，未观察到Sox2和Nanog信号。

图22-3表示以下照片，其显示由从Muse细胞诱导的iPS细胞(Muse细胞来源的iPS细胞)(图22-3C和C1)和SSEA-3(-)细胞生长的集落(图22-3D和D1)。

图23-1表示以下照片，其显示自皮肤成纤维细胞(NHDF)来源的Muse细胞诱导的iPS细胞的体外分化。图23-1i表示作为内胚层标记的甲胎蛋白(绿色)和作为中胚层标记的平滑肌肌动蛋白(红色(蓝色表示DNA))的表达。图23-1j表示作为外胚层标记的神经丝(绿色)的表达。

图23-2表示由Muse细胞诱导的iPS细胞的体外分化的RT-PCR分析结果。准确地说，图23-2表示三胚层的标记的表达。

图23-3表示以下照片，其显示由皮肤成纤维细胞(NHDF)来源的Muse细胞诱导的iPS细胞形成的畸胎瘤的组织结构。图23-3明确显示通过HE(苏木精和伊红)染色揭示的iPS细胞分化成各种类型的组织。图23-3m表示软骨，图23-3n表示肌肉，图23-3o表示神经上皮，图23-3p表示色素上皮，图23-3q表示柱状上皮。

图24表示SSEA-3(-)细胞部分、M团和Muse来源的iPS细胞的Nanog基因和Oct3/4基因的亚硫酸氢盐(bisulfite/hydrogensulfite)测序结果。各栏的数值表明转录起始位点(TSS)下游的CpG位置。空心圆表明未甲基化胞嘧啶，实心圆表明甲基化胞嘧啶。

图25表示参与未处理成纤维细胞(未处理)、M团和iPS细胞的细胞周期的因子的定量PCR结果。在标为“/未处理”的栏中，空心栏表示Muse部分或M团与未处理细胞的比率小于2(2:1)且大于1/2(1:2)。另外，实心栏表示该比率大于2(2:1)。斜线阴影栏表示该比率小于1/2(1:2)。在标为“/iPS”的栏中，符号“*”表示M团中的基因表达水平高于iPS细胞中的基因表达水平。符号“**”表示iPS细胞中的基因表达水平高于M团中的基因表达水平。

图26表示参与未处理成纤维细胞(未处理)、M团和iPS细胞的多能性和未分化细胞状态的因子的定量PCR结果。各栏的含义如图25中的定义。

图27表示有关在人和小鼠模型中制备的iPS细胞系的诱导效率的研究报告概要。图27表示诱导核重编程的转录因子的组合。

优选实施方案详述

下面将对本发明进行详述描述。

本发明涉及可直接从活体(体内)机体组织获得的多能干细胞或多能干细胞部分、用于分离多能干细胞或多能干细胞部分的方法以及通过所述方法获得的机体组织来源的多能干细胞或多能干细胞部分。本发明的多能干细胞称为Muse细胞(多谱系分化应激持久细胞)。

在本发明中，术语“细胞部分”是指含有至少一定量的待分离的细胞的细胞群。例如，术语“多能干细胞部分”是指含有量相当于1％以上、10％以上、30％以上、50％以上、70％以上、90％以上或95％以上的多能干细胞的细胞群。其实例包括通过培养多能干细胞得到的细胞团和通过富集多能干细胞获得的细胞群。此外，细胞部分还可称为基本均质细胞部分。

术语“活体”是指活的哺乳动物体，具体是指发育到某种程度的动物体。在本发明中，这类活体的实例不包括受精卵或囊胚期之前的发育期的胚胎，却包括囊胚期和囊胚期之后的发育期的胚胎，例如胎儿和囊胚。哺乳动物的实例包括但不限于人和猴等灵长类、小鼠、大鼠、兔和豚鼠等啮齿动物、猫、狗、绵羊、猪、牛、马、驴、山头和白鼬。本发明的多能干细胞与胚胎干细胞(ES细胞)或胚胎生殖干细胞(EG细胞)明确区分开来，因为它们来自活的机体组织。

术语“中胚层组织”是指在动物初期发育过程中出现的中胚层起源的组织。中胚层组织的实例包括肌肉系统组织、结缔组织、循环系统组织、排泄系统组织和生殖系统组织。例如，本发明的多能干细胞可获自骨髓液或真皮结缔组织等皮肤组织。

术语“间充质组织”是指骨、软骨、脂肪、血液、骨髓、骨骼肌、真皮、韧带、腱等组织和心脏组织。例如，本发明的多能干细胞可获自骨髓或皮肤。另外，多能干细胞还可获自脐带。

表述“细胞可直接获自组织”意指细胞不需要任何人工诱导操作(例如导入外源基因或外源蛋白或用化合物处理(例如给予化合物))便可从组织中分离出来。这种外源基因可以是例如但不限于能够对体细胞核进行重编程的基因。这种外源基因的实例包括Oct3/4基因等Oct家族基因、Klf基因等Klf家族基因、c-Myc基因等Myc家族基因和Sox2基因等Sox家族基因。另外，外源蛋白的实例包括由这些基因编码的蛋白质和细胞因子。此外，化合物的实例包括能够诱导可对体细胞核重编程的上述基因的表达的低分子量化合物、DMSO、可起还原剂作用的化合物和DNA甲基化剂。本发明的多能干细胞与iPS细胞(诱导多能干细胞)和ES细胞明确区分开来，因为本发明的多能干细胞可直接获自活体或组织。此外，在本发明中，细胞培养、使用细胞表面标记作为指标分离细胞或细胞部分、使细胞暴露于细胞应激及对细胞提供物理冲击都不包括在人工诱导操作的实例中。另外，本发明的多能细胞的特征还可在于它们不需要重编程或诱导去分化便可获得。

一般认为本发明的多能干细胞存在于活体的中胚层组织或间充质组织等。在本发明中，将存在于这些类型的组织中的细胞或细胞部分分离出来。本发明的多能干细胞存在于例如骨髓中，使得通过血液等可从骨髓供应到活体的各个组织中。因此，可从骨髓、活体的各个组织(例如皮肤甚至血液)中分离出多能干细胞。

术语“多能干细胞”是指具有多能性和具有下列性质的细胞。

(1)多能干细胞表达Nanog、Oct3/4、SSEA-3、PAR-4和Sox2等多能性标记。

(2)多能干细胞具有从单一细胞扩繁并持续产生自身的克隆的克隆性。

(3)多能干细胞具有自我更新能力。

(4)多能干细胞可在体外和体内分化成三胚层(内胚层细胞谱系、中胚层细胞谱系和外胚层细胞谱系)。

(5)多能干细胞当移植入小鼠睾丸或皮下组织时分化成三胚层。

(6)多能干细胞通过碱性磷酸酶染色呈阳性。

本发明的多能干细胞与成体干细胞和组织干细胞明确区分开来，因为本发明的多能干细胞具有多能性。此外，本发明的多能干细胞与骨髓基质细胞(MSC)等细胞部分明确区分开来，因为本发明的多能干细胞以具有多能性的单一细胞或大量细胞的形式分离。

此外，本发明的多能干细胞具有下列性质。

(i)生长速度相对较缓，分裂周期需时1天以上，例如1.2-1.5天。然而，多能干细胞不会以类似于ES细胞或iPS细胞的方式进行无限增殖。

(ii)当移植入免疫缺陷小鼠时，多能干细胞分化成内胚层细胞谱系、中胚层细胞谱系和外胚层细胞谱系。多能干细胞的特征在于与ES细胞或iPS细胞(畸胎瘤由此在短时间内癌化)不同，它们不会癌化达半年以上。

(iii)多能干细胞由于悬浮培养而形成胚状体样细胞团。

(iv)多能干细胞由于悬浮培养形成胚状体样细胞团，并在约10天内停止生长。随后，当将细胞团转移到贴壁培养时，它们再次开始生长。

(v)不对称分裂与生长有关。

(vi)细胞核型正常。

(vii)多能干细胞无端粒酶活性或具有低端粒酶活性。表述“…无端粒酶活性或具有低端粒酶活性”是指当使用例如TRAPEZE XL端粒酶检测试剂盒(Millipore)检测这种活性时，未检出端粒酶活性或检出低端粒酶活性。术语“低端粒酶活性”是指其中细胞具有的端粒酶活性与人成纤维细胞的端粒酶活性为同一程度或者具有的端粒酶活性是Hela细胞端粒酶活性的1/5以下和优选1/10以下的情况。

(viii)关于甲基化状态，在由Muse细胞诱导的iPS细胞中Nanog和Oct3/4启动子区的甲基化水平低。

(ix)多能干细胞具有高吞噬能力。

(x)多能干细胞无肿瘤性生长。此处的表述“…细胞无肿瘤性生长”是指其中当进行悬浮培养时，细胞在其团块达到预定大小的时候停止生长并且不进行无限生长的情况。此外，这个表述是指其中当把这种细胞移植入免疫缺陷小鼠睾丸时不形成畸胎瘤的情况。此外，上述(i)-(iv)等还涉及相关细胞(细胞团)不进行肿瘤性生长的事实。

准确地讲，本发明的细胞为例如下列多能干细胞：

(A)从活体的中胚层组织、间充质组织等获得，并且可在不将化学物质、外源基因或外源蛋白导入这类细胞中的情况下直接获得的多能干细胞；

(B)具有上述(1)的性质的多能干细胞，其中活体的中胚层组织或间充质组织选自骨髓、皮肤、血液、脐带和脂肪；

(C)不需要重编程或诱导去分化便可获得的上述(A)或(B)的多能干细胞；

(D)移植入睾丸后至少半年内不会癌化的上述(A)或(B)的多能干细胞；

(E)与ES细胞和iPS细胞不同，不进行无限生长的上述(A)或(B)的多能干细胞；或

(F)来自活体的中胚层组织或间充质组织的多能干细胞，其用蛋白酶处理时保持存活，因此有蛋白酶抗性。

此外，可通过将细胞应激施于活体中胚层组织或间充质组织细胞然后收集存活细胞来分离本发明的多能干细胞。此处的术语“细胞应激”是指外部应激。准确地讲，通过蛋白酶处理、低氧条件下培养、低磷酸盐条件下培养、血清饥饿条件下培养、糖饥饿状态下培养、辐射暴露下培养、热激暴露下培养、有毒物质存在下培养、活性氧存在下培养、机械刺激下培养、压力处理下培养等，将细胞暴露于这类应激中。这些实例中，优选蛋白酶处理，准确地讲，优选在蛋白酶存在下培养。蛋白酶没有限制。可以使用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶等丝氨酸蛋白酶、胃蛋白酶等天冬氨酸蛋白酶、木瓜蛋白酶和木瓜凝乳蛋白酶等半胱氨酸蛋白酶、嗜热菌蛋白酶等金属蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、N端苏氨酸蛋白酶等。待加入用于培养的蛋白酶的浓度没有限制。本文一般可采用用于除去培养在培养皿等中的贴壁细胞的浓度。本发明的多能干细胞可以说是对上述外部应激具有抗性的干细胞，例如对胰蛋白酶具有抗性的细胞。

活体的中胚层组织和间充质组织的实例包括但不限于骨髓单核细胞、皮肤细胞等成纤维细胞部分、牙髓组织、眼球组织和毛根组织。至于细胞，可以使用培养细胞和从组织中收集的细胞两者。在这些细胞中，骨髓细胞和皮肤细胞是合乎要求的。这种细胞的实例包括人骨髓基质细胞(MSC)部分和人皮肤成纤维细胞部分。可通过培养骨髓穿刺液2-3周来获得骨髓基质细胞(MSC)部分。

进行多种上述应激的组织中大多数细胞将死亡。存活细胞包括本发明的多能干细胞。在将应激施于细胞后，应除去死细胞。然而，当使用蛋白酶时，这些死细胞通过蛋白酶的作用而被裂解。

此外，将应激施于细胞后，给细胞提供物理冲击使之易被破坏，然后可除去细胞。物理冲击可通过激烈吸打、激烈搅拌、涡旋等来提供。

将细胞应激施于细胞，必要时提供物理冲击，然后对所得细胞群进行离心。获取所得存活细胞，并以沉淀收集，使得可分离出本发明的多能干细胞。此外，利用下列表面标记作为指标，可从由此得到的细胞中分离出本发明的多能干细胞或多能细胞部分。

还可通过培养遭受创伤或烧伤等应激的机体的中胚层组织、间充质组织等(体内)，然后收集迁移的细胞，来分离本发明的多能干细胞或多能细胞部分。将受损组织细胞暴露于应激。因此，在本发明中，表述“培养受损机体的中胚层组织或间充质组织(体内)”另指将细胞应激施于活体中胚层组织、间充质组织等的细胞。

例如，下面描述了用胰蛋白酶处理这类细胞的方法。此时胰蛋白酶的浓度不受限制。例如，在贴壁细胞普通培养中，胰蛋白酶的浓度可以是用于除去附着在培养瓶上的贴壁细胞的浓度，范围为例如0.1％-1％，优选范围为0.1％-0.5％。例如，可通过将得自活体中胚层组织、间充质组织等的细胞(100,000-500,000个细胞)在5ml上述浓度的胰蛋白酶溶液中培养，来将细胞暴露于外部应激。胰蛋白酶培养的时间范围为约5-24小时，优选范围为约5-20小时。在本发明中，8小时以上的胰蛋白酶培养，例如处理8小时或16小时，是长期胰蛋白酶培养。

在胰蛋白酶培养后，合意地通过上述吸打、搅拌、涡旋等提供物理冲击。进行这种物理冲击以除去死细胞或濒死细胞。

当在胰蛋白酶培养后进行悬浮培养时，合意地在凝胶例如甲基纤维素凝胶中进行培养，以防止细胞与细胞间聚集。此外，细胞培养瓶预先合意地用聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)等包被，以防止细胞附着在培养瓶上，保持悬液状态。

当将细胞暴露于外部应激时，通过离心收集，然后培养，细胞形成细胞团。这种细胞团的大小的直径范围为约25μm-150μm。在暴露于外部应激后存活的细胞群内包括富集状态的本发明的多能干细胞(Muse细胞)。这种细胞群称为富含Muse的细胞部分(Muse富集群)。这种富含Muse的细胞部分中Muse细胞的百分比随应激处理方法而变化。

本发明的多能干细胞或多能干细胞部分在暴露于应激后存活的事实表明，本发明的多能干细胞或多能干细胞部分对这类应激有抗性。

至于用来培养得自活体中胚层组织、间充质组织等的细胞的培养基和培养条件，可以采用一般用于培养动物细胞的任何培养基和培养条件。此外，可以使用用于培养干细胞的已知培养基。培养基可适当补充胎牛血清等血清、青霉素和链霉素等抗生素和各种生物活性物质。

此外，本发明还包括作为可从活体中胚层组织、间充质组织等中直接获得的本发明多能干细胞的衍生细胞或诱导细胞的多能干细胞。术语“衍生细胞或诱导细胞”是指通过培养多能干细胞而得到的细胞或细胞群或者通过对多能干细胞进行人工诱导操作(例如导入外源基因)而获得的细胞。本文还包括子代细胞。此外，据称在本发明时已报道的iPS细胞因重编程(例如将外源基因导入皮肤成纤维细胞等机体组织中的分化细胞)而从多能干细胞诱导出。将通过对细胞(可直接获自本发明的组织且已具有作为多能干细胞的性质)进行人工诱导操作(例如导入外源基因)获得的细胞与iPS细胞区分开来。

通过悬浮培养本发明的多能干细胞获得胚状体样(EB body-like)细胞团。本发明还包括这类胚状体样细胞团和包含在这类胚状体样细胞团中的细胞。通过悬浮培养本发明的多能干细胞形成作为细胞团的胚状体。此时，在本发明中，通过培养本发明的多能干细胞而获得的这类胚状体亦称为M团(Muse细胞来源的胚状体样细胞团)。用于悬浮培养以形成胚状体样细胞团的方法的实例包括使用含有甲基纤维素等水溶性聚合物的培养基培养(Nakahata,T.等,Blood 60,352-361(1982))和悬滴培养(Keller,J.Physiol.(Lond)168:131-139,1998)。本发明还包括通过由胚状体样细胞团自我更新获得的胚状体样细胞团、包含在这种胚状体样细胞团中的细胞和多能干细胞。此处术语“自我更新”是指其中培养包含在胚状体样细胞团中的细胞使得导致再次形成胚状体样细胞团的情况。可通过重复循环一次到若干次来进行自我更新。此外，本发明还包括从上述胚状体样细胞团或包含在这种胚状体样细胞团中的细胞分化的细胞和组织。

图1-1表示间充质细胞(人成纤维细胞、人骨髓基质细胞(MSC)和新鲜骨髓液)部分、Muse细胞和M团间的关系。当向间充质细胞样细胞团强加应激刺激(例如长期胰蛋白酶培养(LTT))时，Muse细胞富集，然后得到含有许多Muse细胞的细胞部分(称为富含Muse的细胞部分)。通过悬浮培养细胞部分中的Muse细胞，得到胚状体样细胞团(M团)。在将胚状体样细胞团培养在包被有明胶的培养皿中时，细胞分化成三胚层的细胞。另外，如图1-1所示，直接分离SSEA-3(+)细胞，然后在不把细胞暴露于长期应激的情况下进行悬浮培养，以便可获得M团。

一旦通过悬浮培养Muse细胞生长便停止，当转移到贴壁培养时，Muse细胞开始生长。通过使用悬浮培养-贴壁培养-SSEA-3表达作为指标的重复分离，Muse细胞可大量生长(图1-2)。

此外，还可在不暴露于细胞应激的情况下，将本发明的多能干细胞或多能细胞部分从机体组织中直接分离。准确地讲，可通过下列方法在不需要导入外源基因等诱导操作的情况下，从活体中胚层组织、间充质组织等中分离本发明的多能干细胞或多能干细胞部分。

机体组织的实例包括但不限于活体的中胚层组织和间充质组织，例如骨髓、皮肤和脐带组织。当使用骨髓时，可使用骨髓的单核细胞部分。可利用在Muse细胞表面大量表达的细胞表面标记进行分离。例如，可利用SSEA-3表达作为指标进行分离。本发明的多能干细胞亦可称为SSEA-3(+)Muse细胞。此外，Muse细胞表达作为间充质细胞标记的CD105。Muse细胞为SSEA-3阳性和CD105阳性的。因此，可利用SSEA-3和CD105两者的表达作为指标分离Muse细胞。使用这些细胞表面标记，可以单一细胞形式分离本发明的多能干细胞。由此分离的单一细胞可通过培养生长。此外，本发明包括可利用相当于SSEA-3的标记，从人以外的哺乳动物机体组织中分离的多能干细胞。

同时，Muse细胞为NG2、CD34、vWF(冯维勒布兰德因子(von Willebrand factor))、c-kit(CD117)、CD146和CD271(NGFR)阴性的。此外，Muse细胞为Sox10、Snai1、Slug、Tyrp1和Dct阴性的。

可通过显微镜下观察细胞是否被显色酶、荧光化合物等标记的抗体(抗表面抗原的抗体)染色，来确定细胞是否对NG2、CD34、vWF、CD117、CD146和CD271等表面抗原呈阴性或者其表达是弱还是不弱。例如，细胞用这些抗体免疫染色，使得可测定表面抗原存在与否。也可使用抗体结合的磁珠测定所述表面抗原存在与否。同样，可利用FACS或流式细胞仪测定表面抗原存在与否。可采用例如FACSAria(Becton Dickinson)、FACS vantage(BectonDickinson)、FACS Calibur(Becton Dickinson)等流式细胞仪。

至于Sox10、Snai1、Slug、Tyrp1和Dct等转录因子，还可通过RT-PCR等技术检查其表达。

表述“…对这些表面抗原呈阴性”是指以下情况，其中当按上述方法进行FACS分析时，细胞不被分选为阳性细胞，或者当通过RT-PCR检查表达时无法证实其表达。即使这类表面抗原以无法被这类技术检出的程度表达，但在本发明中仍将细胞称为阴性的。此外，同时用已知对上述标记呈阳性的细胞(例如造血干细胞)进行测量。当检出几乎无表达或与这类阳性细胞相比表达水平显著较低时，细胞可称为阴性的。

可根据上述细胞表面抗原的性质分离本发明的细胞。

如上所述，可利用“SSEA-3阳性”作为指标分离Muse细胞。此外，可利用CD105的表达作为指标分离Muse细胞。可进一步利用选自以下的至少1种，例如2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或11种标记的无表达作为指标来分离Muse细胞：NG2、CD34、vWF(冯维勒布兰德因子)、c-kit(CD117)、CD146、CD271(NGFR)、Sox10、Snai1、Slug、Tyrp1和Dct。例如，利用不表达CD117和CD146进行分离是可行的。此外，可利用不表达CD117、CD146、NG2、CD34、vWF和CD271作为指标进行分离。此外，可利用不表达上述11种标记作为指标进行分离。

当利用表面标记进行分离时，可在不需要培养等的情况下直接从活体中胚层组织、间充质组织等中分离出一种或多种本发明的多能干细胞。此外，可使用显微镜等通过肉眼观察细胞形态来鉴定和分离本发明的多能干细胞。

在向活体中胚层组织、间充质组织等提供细胞应激后，还可利用表面标记从存活细胞群中进行分离。

此外，除了利用上述标记以外，可通过另一种特殊因子的高水平表达来表征本发明的多能干细胞或多能细胞部分。

可从未处理骨髓基质细胞(MSC)部分或皮肤成纤维细胞部分获得作为本发明的多能干细胞的Muse细胞。将Muse细胞进一步培养，从而获得Muse细胞来源的胚状体(EB)样细胞团。通过对在Muse细胞、未处理细胞、Muse来源的胚状体样细胞团和人ES细胞中表达的因子进行比较和检查，可检出Muse细胞中以高水平表达的因子。这类因子的实例包括基因转录产物、蛋白质、脂质和糖类。

图2表示其在M团中的表达水平与在未处理细胞中的表达水平的比率高的因子。具体来讲，下列18种因子的比率高。

(i)SSEA-3

(ii)v-fos FBJ鼠骨肉瘤病毒癌基因同源物

(iii)溶质载体家族16，成员6(一元羧酸转运蛋白7)

(iv)酪氨酸酶相关蛋白1

(v)钙通道，电压依赖性，P/Q型，α1A亚基

(vi)染色体16可读框81

(vii)几丁质酶3样1(软骨糖蛋白-39)

(viii)蛋白酶，丝氨酸，35

(ix)犬尿氨酸酶(L-犬尿氨酸水解酶)

(x)溶质载体家族16，成员6(一元羧酸转运蛋白7)

(xi)脱脂载脂蛋白E

(xii)突触结合蛋白样5

(xiii)几丁质酶3样1(软骨糖蛋白-39)

(xiv)ATP结合盒，亚家族A(ABC1)，成员13

(xv)促血管生成素(angiopoietin)样4

(xvi)前列腺素内过氧化物合酶2(前列腺素G/H合酶和环加氧酶)

(xvii)司腺钙蛋白1

(xviii)含有卷曲螺旋域的102B

本发明的多能干细胞或多能干细胞部分的特征在于至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18种上述因子以高水平表达。因此，可利用至少2种因子的高水平表达作为指标分离多能干细胞或多能干细胞部分。

图3表示其在M团中的表达水平与在人ES细胞中的表达水平的比率高的因子。具体来讲，下列20种因子的比率高。

(a)基质金属肽酶1(间质胶原酶)

(b)上皮调节蛋白

(c)几丁质酶3样1(软骨糖蛋白-39)

(d)转录基因座(Transcribedlocus)

(e)几丁质酶3样1(软骨糖蛋白-39)

(f)丝甘蛋白

(g)MRNA全长插入片段cDNA克隆EUROIMAGE 1913076

(h)Ras和Rab相互作用因子(interactor)2

(i)腔蛋白聚糖

(j)CLCA家族成员2，氯通道调节因子

(k)白介素8

(l)类似于LOC166075

(m)皮肤桥蛋白(dermatopontin)

(n)EGF，latrophilin和含有7个跨膜域的蛋白1(seven transmembrane domaincontaining 1)

(o)胰岛素样生长因子结合蛋白1

(p)溶质载体家族16，成员4(一元羧酸转运蛋白5)

(q)丝甘蛋白

(r)gremlin 2，半胱氨酸结超家族，同源物(有爪蟾蜍(Xenopus laevis))

(s)胰岛素样生长因子结合蛋白5

(t)硫化物醌还原酶样(酵母)

本发明的多能干细胞或多能干细胞部分的特征在于至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种上述因子以高水平表达。因此，可利用至少2种因子的高水平表达作为指标来分离多能干细胞或多能干细胞部分。

此外，在本发明的多能干细胞或多能干细胞部分中，上述因子(i)-(xviii)的至少2种和上述因子(a)-(t)的至少2种可同时以高水平表达。因此，可利用这些基因的高水平表达作为指标来分离多能干细胞或多能干细胞部分。

此外，本发明的多能干细胞或多能干细胞部分的特征在于：除多能性标记之外，还表达气味受体(嗅觉受体)群的因子和趋化因子受体群的因子；也就是说它们对特定的气味受体或趋化因子受体呈阳性。

在本发明的多能干细胞或多能干细胞部分中表达的气味受体的实例包括下列22种受体。

嗅觉受体，家族8，亚家族G，成员2(OR8G2)；

嗅觉受体，家族7，亚家族G，成员3(OR7G3)；

嗅觉受体，家族4，亚家族D，成员5(OR4D5)；

嗅觉受体，家族5，亚家族AP，成员2(OR5AP2)；

嗅觉受体，家族10，亚家族H，成员4(OR10H4)；

嗅觉受体，家族10，亚家族T，成员2(OR10T2)；

嗅觉受体，家族2，亚家族M，成员2(OR2M2)；

嗅觉受体，家族2，亚家族T，成员5(OR2T5)；

嗅觉受体，家族7，亚家族D，成员4(OR7D4)；

嗅觉受体，家族1，亚家族L，成员3(OR1L3)；

嗅觉受体，家族4，亚家族N，成员4(OR4N4)；

嗅觉受体，家族2，亚家族A，成员7(OR2A7)；

嗅觉受体，家族6，亚家族A，成员2(OR6A2)；

嗅觉受体，家族2，亚家族B，成员6(OR2B6)；

嗅觉受体，家族2，亚家族C，成员1(OR2C1)；

嗅觉受体，家族52，亚家族A，成员1(OR52A1)；

嗅觉受体，家族10，亚家族H，成员3(OR10H3)；

嗅觉受体，家族10，亚家族H，成员2(OR10H2)；

嗅觉受体，家族51，亚家族E，成员2(OR51E2)；

嗅觉受体，家族5，亚家族P，成员2(OR5P2)；和

嗅觉受体，家族10，亚家族P，成员1(OR10P1)

在本发明的多能干细胞或多能干细胞部分中表达的趋化因子受体的实例包括下列5种受体。

趋化因子(C-C基序)受体5(CCR5)；

趋化因子(C-X-C基序)受体4(CXCR4)；

趋化因子(C-C基序)受体1(CCR1)；

达菲血型，趋化因子受体(DARC)；和

趋化因子(C-X-C基序)受体7(CXCR7)。

本发明的多能干细胞或多能干细胞部分表达至少一种上述嗅觉受体或表达至少一种上述趋化因子受体。

因为这些气味受体或趋化因子受体和与受体结合的迁移因子的作用，所以本发明的多能干细胞迁移到受损组织，然后在组织中存活并分化。例如，当肝脏、皮肤、脊髓或肌肉受损时，在细胞表面表达的特殊迁移因子和气味受体起作用引起多能干细胞迁移到相关组织，在该组织中存活，然后分化成肝脏(内胚层)、皮肤(外胚层)、脊髓(外胚层)或肌肉(中胚层)细胞，使得该组织可再生。

在富含作为本发明多能干细胞的Muse细胞的富含Muse的细胞部分中，Rex1、Sox2、KLF-4、c-Myc、DPPA2、ERAS、GRB7、SPAG9、TDGF1等被增量调节。在Muse细胞的细胞团中，DAZL、DDX4、DPPA4、Stella、Hoxb1、PRDM1、SPRY2等被增量调节。

此外，在本发明的多能干细胞或多能干细胞部分中，从未观察到CD34和CD117造血干细胞标记的表达，或者只观察到极低水平。

本发明不仅仅包括Muse细胞，而且还包括由Muse细胞富集产生的细胞群、由Muse细胞生长而产生的细胞群和由Muse细胞分化而产生的细胞群。本发明还包括装有Muse细胞或Muse细胞来源的细胞的研究试剂盒、细胞芯片和治疗装置。

本发明的多能干细胞具有多能性，因此能够分化成所有类型的组织。多能干细胞或多能细胞部分可用于再生医疗等。例如，这种细胞和细胞部分可用于各种类型的组织、各种器官等的再生。其具体实例包括皮肤、脑脊髓、肝脏和肌肉。将本发明的多能干细胞或多能干细胞部分直接给予受伤或受损组织、器官等或者给予受伤或受损组织、器官等附近区域，使得多能干细胞进入该组织或器官，并分化成相关组织或器官特有的细胞。这样的话，多能干细胞可促进组织和器官的再生或再建。此外，可通过静脉内给予等全身给予多能干细胞或多能干细胞部分。在这种情况下，将多能干细胞通过归巢等定向至受损组织或器官，到达并进入组织或器官，然后分化成组织或器官细胞，从而能够促进组织或器官再生和再建。

给药可通过胃肠外给予例如皮下注射、静脉内注射、肌内注射和腹膜内注射来进行，通过口服给予或子宫内注射入例如胚胎来进行。此外，本文中也可进行局部给予或全身给予。局部给予可使用例如导管进行。可根据待再生的器官、组织类型或大小适当确定剂量。

待再生的器官的实例包括但不限于骨髓、脊髓、血液、脾脏、肝脏、肺、肠、眼、脑、免疫系统、循环系统、骨、结缔组织、肌肉、心脏、血管、胰腺、中枢神经系统、外周神经系统、肾、膀胱、皮肤、上皮附属器、乳房-乳腺、脂肪组织和例如口、食管、阴道和肛门的黏膜。此外，其中待治疗的疾病的实例包括癌症、心血管疾病、代谢疾病、肝病、糖尿病、肝炎、血友病、血液系统疾病、脊髓损伤等变性或创伤性神经疾病、自身免疫疾病、遗传缺陷、结缔组织疾病、贫血、感染性疾病、移植排斥、缺血、炎症和皮肤或肌肉损伤。

细胞可与药学上可接受的基料一起给予。这种基料可由具有高生物相容性的物质(例如胶原)或生物可降解的物质制成。其可呈粒子、板、管、容器等形式。可在细胞与基料结合后或在将细胞包含在基料内后给予所述细胞。

此外，对本发明的多能干细胞进行体外分化诱导，利用进一步分化的细胞构建组织，然后可移植分化的细胞或组织。由于本发明的多能干细胞不进行致瘤转化，细胞癌化的可能性低，并且可以说是安全的，即使上述移植的分化细胞或组织中包含本发明未分化的多能干细胞。为了防止在这种再生医疗中接受者对移植的细胞或组织的排斥，需要从待接受再生医疗的患者中收集中胚层组织、间充质组织等，然后从相关组织中分离出本发明的多能干细胞或多能细胞部分备用。此外，本发明的多能干细胞或多能干细胞部分可用于治疗因组织变性或功能障碍所致的疾病。在这种情况下，例如，将本发明的多能干细胞或多能干细胞部分离体富集，生长或使之分化，然后再输回体内。例如，使多能干细胞分化成特定的组织细胞，然后将细胞移植入待治疗的组织中。此外，可通过移植这种细胞进行原位细胞治疗。在这种情况下，靶细胞的实例包括肝细胞、神经元细胞或神经胶质细胞等神经细胞、皮肤细胞和骨骼肌细胞等肌肉细胞。使本发明的多能干细胞分化成这些细胞，移植分化细胞，然后原位进行治疗。通过这种治疗，可以治疗例如帕金森病(Parkinson’s disease)、脑梗塞、脊髓损伤、肌营养不良等。由于本发明的多能干细胞不经历致瘤转化，因此即使用于这种治疗，它们也未必癌化，而且是安全的。

此外，使本发明的多能干细胞分化形成血液或血液组分，使得可离体或体外形成血液或血液组分。这种血液组分的实例包括红细胞、白细胞和血小板。由此形成的血液或血液组分可用于自体输血或交叉输血。

如上所述，当本发明的多能干细胞或多能干细胞部分用于治疗时，可离体、体内或体外使之分化。本发明的多能干细胞分化成例如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、骨髓间质、骨骼肌、平滑肌、心肌、眼、内皮、上皮、肝脏、胰腺、造血系统、神经胶质、神经元细胞或少突神经胶质细胞。本发明的多能干细胞的分化可通过在分化因子存在下对其进行培养而获得。分化因子的实例包括碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、二甲亚砜(DMSO)和异丙肾上腺素；或成纤维细胞生长因子4(FGF4)和肝细胞生长因子(HGF)。本发明还包括由本发明的多能干细胞分化的细胞。

当本发明的多能干细胞用于治疗时，可引入编码蛋白质抗癌物质、生物活性物质等的基因。因此，可以说，本发明的多能干细胞具有递送治疗药的功能。这类物质的实例包括抗血管生成药。

本发明包括用于细胞移植治疗的材料或用于细胞移植治疗的组合物或用于再生医疗的材料或用于再生医疗的组合物，其含有Muse细胞、由Muse细胞形成的胚状体样细胞团和从Muse细胞或上述胚状体样细胞团经由分化获得的细胞或组织/器官。除Muse细胞、由Muse细胞形成的胚状体样细胞团或者自Muse细胞或上述胚状体样细胞团经由分化获得的细胞或组织和/或器官以外，这类组合物还含有药学上可接受的缓冲液、稀释剂等。

此外，从患者中收集细胞，分离出Muse细胞，然后可将Muse细胞用于各种诊断。例如，从Muse细胞中收集患者的基因，然后获取基因信息，使得反映该信息的准确诊断成为可能。例如，通过使患者的细胞来源的Muse细胞分化，可获得具有与受试者相同的特征(例如遗传背景)的各种组织和/或器官的细胞。因此，至于疾病诊断、阐明病理状态、诊断药物的效果或副作用等，可根据各受试者的特征，作出适当诊断。准确地讲，Muse细胞、由Muse细胞形成的胚状体样细胞团和通过分化Muse细胞或上述胚状体样细胞团获得的细胞或组织和/或器官可用作诊断材料。例如，本发明包括用于利用从受试者分离的Muse细胞或利用具有与受试者的遗传背景相同的遗传背景的组织或器官(通过分化自Muse细胞获得)，诊断受试者的疾病等的方法。

此外，可通过分化Muse细胞获得大量体细胞。因此，可进行基础研究，例如阐明疾病机制、开发治疗药、针对药物效果或毒性进行筛选、药物评价等。准确地讲，Muse细胞、由Muse细胞形成的胚状体样细胞团和通过分化Muse细胞或上述胚状体样细胞团获得的细胞或组织和/或器官，可用作药物评价或药物筛选的材料。例如，本发明包括筛选药物或评价药物的方法，所述方法包括使Muse细胞分化和/或生长，获得体细胞，将候选药物给予体细胞，然后检查体细胞的反应。

此外，通过构建各种(例如各种类型的HLA)Muse细胞文库，来构建Muse细胞库，使得可实现能够按需将Muse细胞供应至Muse细胞应用部位的系统。例如，除了上述目的以外，还可进行例如向急需细胞移植治疗提供无(或几乎无)排斥的细胞。准确地讲，本发明包括用于构建具有不同遗传性质的Muse细胞文库即Muse细胞库的方法，所述方法包括分离并收集具有不同遗传性质的Muse细胞。此外，不仅仅可使用Muse细胞，还可使用由Muse细胞形成的胚状体样细胞团和通过分化自Muse细胞或上述胚状体样细胞团获得的细胞或组织和/或器官，来构建文库或库。在本发明中，通过获得由这些Muse细胞形成的胚状体样细胞团以及通过分化Muse细胞或上述胚状体样细胞团获得的细胞或组织和/或器官而构建的文库或库，亦称为细胞文库或细胞库。本发明包括由此构建的细胞文库或细胞库。这类细胞文库或细胞库包括容器例如多种管，其装有具有不同遗传特征的细胞等。还可将这类细胞冻结。例如，当将组织或器官移植入受试者或需要其再生时，从上述细胞文库或细胞库中选出就受试者的遗传背景等而言是适当的的细胞。因此，可利用所述细胞进行移植或再生治疗。

本发明包括治疗方法，所述方法包括将治疗有效剂量的本发明的多能干细胞、其细胞部分或从这类细胞衍生或诱导的细胞，给予需要治疗的患者以治疗疾病。有效剂量可根据例如待给予的细胞数来确定，并且可根据疾病类型或严重程度适当决定。在上述治疗方法中，本发明的多能干细胞不形成任何畸胎瘤，使得不在患者中形成畸胎瘤。此外，当给予自体细胞来源的Muse细胞时，无需通过对患者进行放射线照射、化学疗法等引起骨髓功能障碍。当使用不是自体细胞的Muse细胞时，仍进行上述处理。

此外，Muse细胞可以是iPS细胞(诱导多能干细胞)的来源。与使用另一类型细胞(例如非利用SSEA-3表达作为指标分级分离的皮肤成纤维细胞)作为来源的情况相比，利用Muse细胞作为来源制备iPS细胞的效率高得多(至少为25倍以上，优选至少为30倍以上)。

可通过将特定基因或特定化合物导入Muse细胞从而改变细胞质来制备iPS细胞。细胞质的变化包括重编程或癌化，对此可采用目前已知的方法或未来将建立的所有方法。

例如，按照日本专利号4182742的描述或图27的描述，将基因导入Muse细胞，使得可从Muse细胞建立iPS细胞。此外，除了图27中描述的方法以外，可以说可通过导入化学物质、外源基因或外源蛋白来建立iPS细胞。例如，IPS细胞自Muse细胞的建立可用后面所述实施例中描述的方法进行。

如上所述自Muse细胞获得的iPS细胞也可称为“Muse来源的iPS细胞(Muse-iPSC)”。本发明包括这种Muse来源的iPS细胞。可以说Muse来源的iPS细胞是具有Muse细胞来源的增殖能力的多能干细胞。

下面参照下列实施例更详细地对本发明进行描述，虽然本发明不限于这些实施例。

实施例1.富含Muse的细胞部分和M团的制备和表征

材料与方法

实施例中使用下列细胞。

2个人皮肤成纤维细胞部分(人成纤维细胞)品系和4个人MSC(骨髓基质细胞)部分(H-MSC部分)品系用作间充质细胞。人成纤维细胞部分是(1)人成纤维细胞-1(正常人成纤维细胞(NHDF)，Lonza)和(2)人成纤维细胞-2(成人皮肤成纤维细胞(HDFA，ScienCell，Carlsbad，CA))。人MSC部分、H-MSC-1、H-MSC-2和H-MSC-3获自Lonza，H-MSC-4获自ALLCELLS。人MSC部分具体披露于Pittenger，M.F.等，Science 284，143-147(1999)；Dezawa，M.等，J Clin Invest 113，1701-1710(2004)；以及Dezawa，M.等，Science 309，314-317(2005)。

将细胞在含有10％FBS和0.1mg/ml卡那霉素的α-MEM(α-极限必需培养基)中在37℃、5％CO₂下培养。在运输后直接培养的细胞被视为第1代培养物。当细胞达到95％汇合时，以1:2(细胞培养液:培养基)的比率使细胞扩繁。在该研究中，使用来自第4代到第10代继代培养物的细胞。

本文使用的人ES细胞(hESC)是获自Kyoto University的kyoto hESC-1(KhES-1)。

小鼠ES细胞(TT2细胞)和人ES细胞(KhES-1)在由C57BL/6小鼠12.5天胚胎建立的小鼠胚胎饲养(MEF)细胞上维持。

通过下列方法进行实验。

1.间充质细胞的应激条件

为了进行包括低营养下培养、低血清下培养、低O₂下培养、重复胰蛋白酶培养和长期胰蛋白酶培养在内的应激条件暴露，采用下列6种条件：

1)在不含血清的培养基(STEMPRO MSC SFM，Invitrogen)中培养2天(无血清)；

2)在Hank平衡盐溶液(HBSS)缓冲液(Invitrogen)中培养2天(HBSS)；

3)在含10％FBS的α-MEM中结合低O₂(1％O₂)中培养2天(10％FBS+低O₂)；

4)在胰蛋白酶(0.25％胰蛋白酶-HBSS)中连续3次1小时培养(胰蛋白酶培养共3小时)(Try 3×1小时)；

5)长期胰蛋白酶培养(LTT)持续8小时(LTT 8小时)；和

6)LTT持续16小时(LTT 16小时)。

对于阴性对照，使用人外周单核细胞部分。

对于条件4)、5)和6)，将约1x10⁵-5x10⁵个细胞悬浮于5ml胰蛋白酶溶液中后进行培养。通过5分钟胰蛋白酶培养收集来自应激条件1)-3)的细胞，将应激条件4)-6)的细胞直接转移到管中。

通过涡旋破坏由应激条件产生的大批死细胞。准确地讲，将5ml含有最多500,000个细胞的培养基转移至15-ml Falcon管中，接着使用涡旋混合器(IKA Works，Inc.)以1800-2200rpm/分钟涡旋3分钟。以2000rpm进行离心15分钟，以除去上清液。涡旋后活细胞的收集效率范围为约70％-80％。

2.MC培养

在实施例中，使细胞在含甲基纤维素的培养基中进行悬浮培养。在含甲基纤维素的培养基中的培养称为“MC培养”。MC培养披露于Nakahata，T.等，Blood 60，352-361(1982)。

培养皿首先用poly-HEMA(聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯))包被以避免细胞附着在培养皿底部。简而言之，通过在37℃下搅拌使600mgpoly-HEMA(SIGMA)溶于40ml 95％EtOH，加到培养皿(例如对于96孔培养皿为40μl/孔，对于12孔培养皿为200μl/孔)中后，将培养皿风干过夜。

将MC(MethoCultH4100，StemCell Technologies)悬浮于20％FBS+α-MEM至2％的终浓度。在该浓度下调节半固体MC培养基中细胞的浓度为8×10³个细胞/ml，使得细胞与细胞间距离足够大以使细胞聚集最小化。通过轻轻吸打将细胞和MC培养基充分混合，将混合物转移到polyHEMA包被培养皿中。为了防止干燥，每3天将相当于含10％FBS的α-MEM的最初MC培养1/10的体积缓缓加到培养皿中。

在第7天对细胞团(称为Muse细胞来源的胚状体样细胞团＝M团，因为细胞团是得自本发明的多能干细胞Muse细胞的团块)进行克隆。将0.01M PBS加到培养基中，将细胞以2000rpm离心20分钟，弃去上清液。重复该步骤3次以洗涤细胞。最终将收集的细胞沉淀悬浮于含有锥虫蓝的10μl 0.01M PBS中，加到载玻片上，利用相差显微镜自动拍摄整个区域。仅将大于25μm的锥虫蓝阴性且外观类似于hES细胞的多细胞团统计为M团。M团的形成频率计算为M团数除以所有活细胞数(全为锥虫蓝阴性细胞)。因为难以测定各M团中细胞的准确数目，所以每个聚集体不论其大小均按1个细胞计数。

对于从hES细胞制备细胞团，小心地从饲养细胞中将其分离以便不包括饲养细胞，如上所述转移至MC培养，培养第3天时用相差显微镜拍照。

3.单一细胞悬浮培养

如上所述，将96孔培养皿用polyHEMA包被。在细胞用含10％FBS的α-MEM有限稀释之后，将单一细胞接种到各孔中。接种后，利用相差显微镜经肉眼检查确定置于各孔中的细胞的实际数目。对空白孔或具有多于一个细胞的孔进行标记，并从分析中剔除。在培养第10天进行M团形成的计算。对每个品系根据3次实验计算出M团的形成频率，其中每次实验最少250孔。

4.碱性磷酸酶染色

得自人成纤维细胞部分和H-MSC部分的M团用足够体积的盐水洗涤几次。使用Leukocyte Alkaline Phosphatase试剂盒(Sigma)进行染色。

5.M团的体外分化

在MC培养或单一细胞悬浮培养7-10天后，用玻璃微量移液管挑选出得自人成纤维细胞部分和H-MSC部分的单一M团，并转移在明胶包被的培养皿或盖玻片上。再培养7天后，从细胞团中分散细胞。对细胞进行免疫组织化学和RT-PCR分析以确定细胞分化存在与否。6.免疫组织化学

细胞用0.01M PBS中的4％低聚甲醛固定。富含Muse的细胞部分以及得自人成纤维细胞和H-MSC部分两者的M团通过离心收集，包埋在OCT化合物中，并切下8μm厚的冷冻切片。将细胞团固定在明胶包被的盖玻片上，然后进行免疫组织化学分析。

使用针对以下抗原的第一抗体：Nanog(1:500，Chemicon)、Oct3/4(1:800，Dr.H.Hamada惠赠,OsakaUniversity,Japan)、Sox2(1:1000，Abcam)、PAR4(1:100，SantaCruz)、SSEA-3(1:20，DSHB)、平滑肌肌动蛋白(1:100，Lab Vision)、神经丝M(1:200，Chemicon)、甲胎蛋白(1:100，DAKO)、小鼠Numblike(1:500，Dr.Yuh-Nung Jang惠赠，University of California San Francisco)和1型胶原(1:20，Southern Biotech)。Alexa488或Alexa 568缀合的抗兔IgG、抗小鼠IgG或抗小鼠IgM抗体(Molecular Probes，Carlsbad，CA)用作免疫组织化学分析的第二抗体。

7.测定核型

通过喹吖因-Hoechst染色测定由人成纤维细胞部分和H-MSC部分两者来源的M团(通过重复从M团收集单一细胞然后使细胞再次形成细胞团的循环(1-3次)获得)克隆扩繁的细胞的核型。

8.将细胞注射到免疫缺陷小鼠睾丸

使用未处理细胞部分和富含Muse的细胞部分及人成纤维细胞部分和H-MSC部分两者来源的M团。在LTT后将血清加到细胞中，接着用0.01M PBS洗涤3次来制备富含Muse的细胞部分。从MC培养收集M团，同样用PBS洗涤3次。将1x10⁵个细胞悬浮于PBS中，并使用玻璃微管注射到NOG小鼠(注册商标，小鼠NOD/Shi-scid，IL-2RγKO Jic，8周龄，日本实验动物科学国际理事会监测中心(International Council for Laboratory Animal Science(ICLAS)Monitoring Center Japan)睾丸中。使用随激光共焦显微镜提供的3D图形分析软件测量M团中细胞的平均体积(测量了50个M团，并将团块总体积除以核数)，得到每1μl体积的收集的M团沉淀为1.5x 10⁵个细胞。然后给NOG小鼠的每个睾丸注射相当于1x10⁵个细胞的体积，注射后6个月对小鼠进行分析实验。

作为对照，将1x10⁶个小鼠ES细胞(对于阳性对照，n＝3)和丝裂霉素C处理的MEF细胞(小鼠胚胎饲养细胞，用于阴性对照，n＝3)注射入SCID小鼠睾丸，注射后8周对小鼠进行实验。

9.通过光学显微镜对细胞进行高分辨率分析

利用用于人MSC、成纤维细胞和神经元细胞等细胞类型的稳定的高分辨率光学显微镜观察得自人成纤维细胞部分和H-MSC部分的Muse细胞和M团。

10.用于电子显微镜术的超薄切片

将人成纤维细胞部分和H-MSC部分两者来源的M团、SSEA-3(+)和SSEA-3(–)细胞以及由hES细胞形成的细胞团离心。沉淀用100mM磷酸缓冲液(pH 7.2)中的2.5％戊二醛固定30分钟。将固定样品包埋在1％琼脂中。修整包埋样品至1mm³，用PBS洗涤，在4℃下用100mM磷酸缓冲液(pH 7.2)中的2％OsO₄染色10分钟。样品用蒸馏水洗涤，然后在4℃下用5滴2％乙酸双氧铀(UA)染色20分钟。用蒸馏水洗涤后，在4℃下将染色样品各用50％、70％和90％乙醇递增脱水10分钟，然后更换3次100％乙醇进行完全脱水。将样品与环氧丙烷温育5分钟(用于置换)，并在环氧丙烷中的50％环氧树脂中包埋60分钟，接着在100％环氧树脂中包埋并在60℃下硬化过夜。切下厚度为70-80nm的超薄切片，在100kV电子显微镜中利用CCD摄影机进行观察。

11.M团的生长速度

为了计算人成纤维细胞部分和H-MSC部分两者来源的M团中细胞群倍增时间，将团块各转移到96孔板中，用胰蛋白酶处理15分钟，接着用玻璃微量移液管吸打。统计各孔中的细胞数。在预定时间点(第1、3、5、7、9、10、11、12、13和14天)对至少20-30个M团进行分析。

12.RT-PCR

采用未处理细胞部分(24孔板，约10,000个细胞/孔)和人成纤维细胞部分和H-MSC部分(24孔板，约10,000个细胞/孔)两者来源的单一M团(1-3个循环)体外分化的细胞。采用NucleoSpin RNA XS(Macherey-Nagel)提取并纯化总RNA。采用SuperScript VILO cDNA合成试剂盒(Invitrogen)形成第一链cDNA。使用设计的合适引物和ExTaq DNA聚合酶(TaKaRaBio Inc.)进行PCR反应。所用引物如下。

采用NucleoSpinRNA XS(Macherey-Nagel)提取并纯化总RNA。采用SuperScriptVILO cDNA Synthesis试剂盒(Invitrogen)产生第一链cDNA。使用设计的合适引物和ExTaq DNA聚合酶(TaKaRa Bio Inc.)进行PCR反应。作为阳性对照，对于甲胎蛋白引物使用人胎肝(Clonetech)，对于其它引物使用人完整胚。

13.定量PCR(Q-PCR)

采用RNeasy Mini Kit(Qiagen GmbH)从未处理细胞部分、富含Muse的细胞部分及人成纤维细胞-1、人成纤维细胞-2、H-MSC-1和H-MSC-2来源的M团中收集总RNA，采用RT²First Strand Kit(SABiosciences)合成cDNA。订制引物购自SA Biosciences，DNA用7300实时PCR系统(Applied Biosystems)通过定量PCR扩增。数据应用ΔΔC_T方法处理(LivakKJ等，Methods 25：402-408，2001)。

14.DNA微阵列分析

使用未处理细胞部分、富含Muse的细胞部分及人成纤维细胞-1、人成纤维细胞-2、H-MSC-1和H-MSC-2来源的M团以及获自4名健康志愿者的人外周单核细胞的混合物。总RNA采用RNeasy Mini Kit(Qiagen)收集，并用DNA微阵列(TaKaRa Bio Inc.)分析。阵列信号应用Affymetrix Expression Console V1.1软件处理并归一化。应用Pathway Studio 6.0(Ariadne Genomics)将差异表达基因指派到Gene Ontology中的功能类别中。通过MeV4(Saeed AI等，Biotechniques 34(2)：374-378，2003)用平均连锁聚类以根据差异表达基因的欧几里得距离进行分级群聚(Hierarchical clustering)。

15.端粒酶活性的检测

使用富含Muse的细胞部分及人成纤维细胞部分和H-MSC部分来源的M团以及Hela细胞。采用TRAPEZE XL端粒酶检测试剂盒(Millipore)和Ex Taq聚合酶(TaKaRa Bio Inc.)检测端粒酶活性。用微板读数器(Tecan)测定荧光强度。

16.亚硫酸氢盐测序

采用CpGenome DNA修饰试剂盒(Chemicon)对未处理细胞部分、富含Muse的细胞部分或人成纤维细胞部分和H-MSC部分来源的M团的基因组DNA(1μg)进行处理。采用QIAquick柱(Qiagen)对DNA进行纯化。人Oct3/4和Nanog基因的启动子区通过PCR扩增，然后将PCR产物亚克隆至pCR2.1-TOPO。使用M13通用引物通过测序验证了各样品多达10个克隆，从而检出各启动子区的甲基化。披露于Shimazaki T等，EMBO J，12：4489-4498，1993的引物用于PCR扩增。

17.从人骨髓穿刺液形成M团

健康供体的3份人骨髓穿刺液购自ALLCELLS。单核细胞部分采用Lymphoprep Tube(Axis-ShieldPoC AS)收集，并如上所述直接(不包括胰蛋白酶培养)或8小时LTT后进行MC培养。第7天统计M团。

18.MACS分选

首先使3名健康供体的人骨髓穿刺液(ALLCELLS)的单核细胞部分与微珠缀合的抗CD105抗体反应后，采用MS Columns(Miltenyi Biotech)分选。收集CD105(+)细胞作为部分1(间充质细胞群)。将CD105(-)细胞与微珠缀合的抗CD34和抗CD117抗体的混合物一起温育，再次分选得到CD34(+)/CD117(+)细胞(部分2，相当于造血干细胞群)和CD105(-)/CD34(-)/CD117(-)细胞(部分3)(图4)。对由此收集的样品进行8小时LTT，然后测定M团的形成。

19.免疫组织化学

小鼠睾丸用0.02M PBS中的4％低聚甲醛固定，使用低温恒温器切取10μm厚的切片。样品用0.02M PBS洗涤，与含有20％BlockAce(Yukijirushi)的缓冲液一起温育用于封闭，然后与第一抗体一起温育用于免疫组织化学分析。所用第一抗体为：平滑肌肌动蛋白抗体(1:200，Lab Vision)、抗MAP-2抗体(1:200，Biogenesis)和抗甲胎蛋白抗体(1:10，DAKO)。

在DAPI存在下将用作第二抗体的与Alexa488或Alexa568缀合的抗兔IgG抗体和与Alexa568缀合的抗小鼠IgG抗体一起温育。样品用C1si Nikon共焦显微镜系统(NikonCorporation)观察。

20.流式细胞术和细胞分选

将细胞与藻红蛋白标记的抗CD11c抗体、抗CD29抗体、抗CD34抗体、抗CD44抗体、抗CD45抗体、抗CD49f抗体、抗CD54抗体、抗CD71抗体、抗CD90抗体、抗CD105抗体、抗CD166抗体、抗CD271或抗vWF抗体(BectonDickinson)或与抗SSEA-3抗体(Millipore)一起温育。在用抗SSEA-3抗体标记的情况下，进一步将细胞与FITC缀合的抗大鼠IgM抗体一起温育。不含钙和镁的补充了2mM EDTA和0.5％牛血清白蛋白的0.02M PBS用作FACS抗体稀释液。用FACSCalibur(Becton Dickinson)和CellQuest软件或者用FACSAria和DIA软件获取并分析数据。对于细胞分选，将细胞与FACS抗体稀释液中的抗SSEA-3抗体一起温育，并采用低流速并以4通路纯度(4-way purity)分选模式通过FACSAria(BectonDickinson)进行分选。

21.统计分析

数据用平均值±SEM表示。应用ANOVA按照Bonferroni方法通过成对比较对数据进行比较。

结果

A.人成纤维细胞部分和H-MSC部分的应激条件

人成纤维细胞部分和H-MSC部分暴露于应激条件的结果的实例见表1。

将细胞暴露于应激条件并涡旋后，利用锥虫蓝染色统计活细胞数，从中计算生存率。收集存活细胞，在MC培养中生长7天。应激条件2)产生大量死细胞，且存活细胞收集效率低。因此不可能正确测定形成的M团的数目，因此，应激条件2)的M团的数目在表1中表示为ND(未确定的)。

在测试的6种应激条件中，人成纤维细胞部分的16小时胰蛋白酶培养和H-MSC部分的8小时胰蛋白酶培养最有效。当使用2个人成纤维细胞部分品系和4个H-MSC部分品系重复本实验时，观察到相同的趋势。使用人外周单核细胞的阴性对照中无法识别M团。代表性观察值的实例见表1。

表1

暴露于应激条件后的生存率和MC培养中人成纤维细胞、H-MSC和人外周单核细胞的M团形成。

人成纤维细胞-1

H-MSC-1

人外周单核细胞

5	LTT8小时	300,000	2	0
					6	LTT16小时	300,000	1	0

ND(未确定的)：无法准确计算M团，因为最终部分含大量死细胞，且存活细胞收集效率低。

在所测6种应激条件中，对于M团形成，16小时胰蛋白酶培养(人成纤维细胞部分)和8小时胰蛋白酶培养(H-MSC部分)最有效。包括16小时胰蛋白酶培养或8小时胰蛋白酶培养接着以1800-2200rpm/分钟涡旋3分钟，以2000rpm离心15分钟的一系列步骤称为“长期胰蛋白酶培养(LTT)”，并用于富集Muse细胞。涡旋后活细胞的收集效率范围为约70％-80％(图5)。

B.M团的标准

在实施例中，建立了M团的标准。人成纤维细胞部分和H-MSC部分两者来源的富含Muse的细胞部分的单一细胞的平均直径为10-13μm(图6a)。当将这些细胞转移至MC培养时，细胞开始分裂。在细胞分裂后，各个细胞的大小变得较小，逐渐形成包含直径为8-10μm的细胞的多细胞团(图7e和7f)。细胞的大小和外观与进行MC培养的人ES细胞类似(图6b和6c)。在第7天，大多数多细胞团变得大于25μm，直径为100-150μm。细胞团具有与由ES细胞形成的细胞团非常相似的外观。使用Φ25μm滤器收集大于25μm的细胞团(图6b)，然后通过免疫细胞化学分析(分别得自人成纤维细胞部分和H-MSC部分的多达100个M团)。大部分M团为多能性标记Nanog、Oct3/4、Sox2、PAR4和SSEA-3阳性的，对碱性磷酸酶染色也呈阳性(图6e-g)。在小于25μm的细胞团中可检出或无法检出多能性标记，但它们的定位有时不典型，细胞的外观更类似于富含Muse的细胞部分的细胞的外观。

根据这些研究结果，仅直径大于25μm的多细胞团计为M团。

C.由人间充质细胞部分产生的细胞团的分析

众所周知，当组织暴露于应激、负荷或损害时，休眠组织干细胞被激活。在实施例中，通过各种方法将H-MSC部分和人成纤维细胞部分暴露于应激条件。准确地讲，试验的应激条件为：用无血清培养基处理；用Hank平衡盐溶液(HBSS)处理；用低O₂浓度处理；以及长期胰蛋白酶培养(LTT)持续共3、8或16小时。收集在应激条件下存活的细胞，然后悬浮于含甲基纤维素(MC)的培养基(称为MC培养)，接着以8000个细胞/mL的密度进行MC培养7天(图7-1d)。各种条件产生直径高达150μm大小的细胞团(图7-1e和f)。图7-1c表示第0天MC培养的人成纤维细胞-1部分，图7-1d表示第7天MC培养的人成纤维细胞-1部分。在进行16小时LTT的人成纤维细胞部分中以及在进行8小时LTT的H-MSC部分中观察到形成最高数目的细胞团。图7-1e和f表示由人成纤维细胞-1部分形成的细胞团(M团)。图7-1e表示第7天的MC培养，图7-1f表示第10天单一细胞的悬浮培养。根据细胞团的大小，使用具有不同孔径的滤器分选细胞团，以便进行免疫细胞化学分析。直径大于25μm的细胞团包含对多能干细胞标记Nanog、Oct3/4、SSEA-3、PAR-4和Sox2呈阳性(图7-2g-l)和对碱性磷酸酶染色呈阳性(图7-3m-o)的细胞。电子显微镜术显示由人成纤维细胞部分和H-MSC部分产生的细胞团具有与由ES细胞形成的团块相同的特征。细胞显示相似的核/细胞质比、较少的细胞器且在核中存在一个或二个大的核仁(图7-4p-r)。

从活体的H-MSC部分和人成纤维细胞部分中发现这样的细胞，其通过悬浮培养能够形成对多能性标记和碱性磷酸酶染色呈阳性的细胞团。本发明人将这些细胞命名为“Muse细胞”(多谱系分化应激持久细胞)。由经历16小时LTT的人成纤维细胞部分和经历8小时LTT的H-MSC部分形成的细胞群称为“富含Muse的细胞部分(富含Muse的细胞群)”。对获自细胞群的单一细胞进行悬浮培养。在9％-10％富含Muse的细胞部分中观察到M团的形成。这就表明富含Muse的细胞部分含有约9％-10％的Muse细胞。

检查分离的Muse细胞的生长。细胞在MC培养1-2天后开始分裂，并以约1.3天/细胞分裂的速度保持分裂直到第10天(图8-2)。然而，到第11-12天细胞生长逐渐减慢，第14天左右停止，其中细胞团达到150μm直径的最大尺寸。当形成的M团通过5分钟胰蛋白酶培养直接解离为单一细胞，并转到单一细胞悬浮培养时，细胞保持存活，但分裂非常缓慢(5-7天/细胞分裂)，或者有时根本不分裂(图8-1(1))。因此，一旦细胞的增殖受到限制(或者一旦其生长速度降低)，只要将Muse细胞保持在悬浮培养中，Muse细胞的增殖便不再加速。然而，将单一M团转移到贴壁培养重新启动细胞增殖。在5-7天后，当较小规模的细胞群(3,000-5,000个细胞的阶段)通过胰蛋白酶培养5分钟解离并进行MC培养时，40％的细胞形成新的细胞团(图8-1(2))。当允许克隆扩繁的细胞群达到约5-10x 10⁴个细胞的规模然后进行LTT以再次产生Muse细胞(第2个循环)时，这些细胞中几乎10％形成M团(图8-1)。重复由LTT-悬浮培养-贴壁培养组成的这种培养循环5次，使得每个细胞子代都具有相似的M团形成的行为和频率。第5代M团(在第5个循环)仍对多能性标记和碱性磷酸酶染色呈阳性。

为了证实这些现象不是因经历突变等的异常细胞所致，测定了细胞的核型。由M团克隆扩繁的大多数细胞的核型是正常的，并无显示可检测的染色体异常(图8-3)。这些结果表明该现象是由正常细胞产生的。

这些结果表明Muse细胞自我更新和克隆扩繁的能力。Muse细胞通过“Muse细胞—M团—克隆扩繁”的系列循环而生长。从间充质细胞群获得大量Muse细胞可能是可能的。

D.M团分化成三胚层

为了证实分化能力，将单一M团转移到明胶包被培养皿中并对分化进行分析。在第7天，检出α-平滑肌肌动蛋白(中胚层标记)、结蛋白(中胚层标记)、神经丝-M(外胚层标记)、甲胎蛋白(内胚层标记)或细胞角蛋白-7(内胚层标记)(图9-1a-c)。RT-PCR证实第1代和第3代M团(第1-第3个循环)表达甲胎蛋白和GATA6(内胚层标记)、微管相关蛋白-2(MAP-2)(外胚层标记)和Nkx2.5(中胚层标记)，而在明胶包被培养皿中培养的未处理人成纤维细胞或MSC群中未观察到分化(图9-2)。

将富含Muse的细胞部分、M团或ES细胞注射到免疫缺陷小鼠睾丸，以证实畸胎瘤形成(图9-3e)。睾丸的组织学检查显示，注射ES细胞的所有小鼠在8周内均形成畸胎瘤。然而，如图9-3e所示，在注射富含Muse的细胞部分的13只小鼠中有10只以及在注射M团的11只小鼠中有10只，在睾丸中检出余留的移植人细胞并分化成各种细胞种类。在已移植富含Muse细胞的细胞部分或M团的组中直到至少6个月都未检出畸胎瘤形成。移植的人细胞用抗人线粒体抗体标记。同时证实这些细胞表达外胚层标记(神经丝)、内胚层标记(甲胎蛋白)和中胚层标记(平滑肌肌动蛋白)(图9-3f-i)。

这些数据表明，人成纤维细胞部分来源的Muse细胞和H-MSC部分来源的Muse细胞及M团体外和体内均能够分化成三胚层。

E.定量PCR

有关多能性和分化状态的标记的表达见图10。与未处理细胞相比，富含Muse的细胞部分和细胞团中Nanog的表达水平不太高。一些多能干细胞不会高水平表达Nanog(ChouYF等，Cell 135，449-461(2008))；Bui HT等，Development.135(23)：3935-3945(2008))。与Nanog相同，与小鼠ES细胞相比，在重编程体细胞中，通过Q-PCR测定的Oct-4以低水平表达(Bui HT等，Development.135(23)：3935-3945(2008))。因此，Nanog和其它多能性标记的表达水平对多能性不那么重要。

F.富含Muse的细胞部分和M团中的基因表达

采用定量PCR发现，在富含Muse的细胞部分和M团两者中，多能性和未分化细胞状态的一些标记被增量调节到不同程度。富含Muse的细胞部分只包含上述9％-10％Muse细胞。然而，与未处理细胞部分相比，在富含Muse的细胞部分中，以下基因显示较高程度或中等的增量调节趋势：Rex1(ZFP42)、Sox2、KLF-4、c-Myc、DPPA2(发育多能相关蛋白2(developmental pluripotency associated 2))、ERAS、GRB7(生长因子受体结合蛋白7)、SPAG9(精子相关抗原9)和TDGF1(畸胎癌衍生生长因子1)。与未处理细胞相比，在M团中显示较高程度或中等增量调节趋势的基因为：DAZL(无精子症样)、DDX4(VASA)、DPPA4(发育多能相关蛋白4)、Stella、Hoxb1、PRDM1和SPRY2(sprouty同源物2)(图10a)。

将在人成纤维细胞部分和H-MSC部分来源的未处理细胞部分、富含Muse的细胞部分和M团中的总体基因表达与作为对照的人外周单核细胞部分的总体基因表达进行了比较。结果，在未处理细胞部分、富含Muse的细胞部分和M团中观察到一些基因表达模式中的波动(图10a)。

富含Muse的细胞部分和M团显示低的端粒酶活性，这就表明端粒酶活性不与Muse细胞的增殖活性强相关(图10b)。

G.总体基因表达的DNA微阵列分析

对人外周血液单核细胞(作为阴性对照)、未处理细胞部分和富含Muse的细胞部分以及人成纤维细胞部分和H-MSC部分来源的M团进行了108种探针的Pearson相关分析(图11)。

此外，通过DNA微阵列分析挑选出表达的气味受体和趋化因子受体。

H.体内存在Muse细胞

到目前为止所述实验都用稳定的培养细胞进行，所述细胞在获自成体然后进行培养时，可能获得不同于原位细胞的特征。因此，不可否认Muse细胞或M团是人为产物的可能性。因此，我们试图从人体直接获得M团；也就是说不进行培养的人骨髓细胞。从人骨髓穿刺液中分离出单核细胞部分，并直接在MC培养(未处理hBM-MC)或在MC培养前进行8小时LTT(8小时-hBM-MC；LTT后单核细胞的生存率约为3.5％)。7天后，测定培养物的M团形成。8小时-hBM-MC以约0.3％的频率形成M团，为未处理hBM-MC的频率(约0.004％)的约75倍(图12a)。M团为碱性磷酸酶染色阳性的(图12b)。从未处理hBM-MC和8小时-hBM-MC两者来源的单一M团克隆增殖的细胞的RT-PCR显示表达甲胎蛋白、GATA6、MAP-2和Nkx2.5(图13)。这些结果证明，Muse细胞体内存在于人骨髓中，可通过8小时LTT富集，而且可形成M团。还证实了在骨髓的许多细胞类型中，大部分Muse细胞属于CD105(+)间充质细胞部分。

如上所述，在直接从人骨髓穿刺液中分离的单核细胞部分中，未处理hBM-MC以约0.004％的极低频率形成M团。因为可以设想培养细胞改变了细胞群的构成，所以与从骨髓中分离的未处理单核细胞相比，稳定培养中的细胞可具有不同的形成M团的倾向。为了证实这种可能性，培养人骨髓穿刺液培养以收集原代MSC，然后将细胞直接进行MC培养。这种方案导致M团形成的频率高得多，约为0.2％。在对这些原代MSC进一步培养到第2代和第5代继代培养时，与未处理细胞部分相比，M团形成的频率分别提高约0.5％和约1.0％。与该研究结果一致，约1.2％的未处理人成纤维细胞部分和H-MSC部分形成M团。这些结果表明，Muse细胞具有高的应激耐受性，并且可耐受体外培养环境，例如继代培养步骤。因此，稳定的继代培养细胞部分具有比从骨髓穿刺液直接分离的单核细胞部分高的M团形成频率。

骨髓含有单核细胞的许多细胞类型，包括MSC、造血谱系细胞和内皮细胞。为了确定哪个部分含有Muse细胞，从人骨髓穿刺液分离单核细胞部分，然后使用抗CD34、CD117(造血细胞标记)和CD105(MSC标记)抗体直接进行MACS分选。该部分然后用8小时LTT处理，使细胞在MC培养中生长7天。在CD34+/CD117+部分中几乎未检出M团，但CD34-/CD117-/CD105+部分含有为CD34-/CD117-/CD105-部分的50倍的细胞团。该结果表明，大部分Muse细胞属于CD105(+)间充质细胞部分。

I.MACS分选

得自骨髓单核细胞的3个部分占总细胞的百分比为：部分1(CD105+部分)：1.8％；部分2(CD34+/CD117+部分)：8.5％；部分3(CD34-/CD117-/CD105-部分)：89.7％。在部分1、2和3中细胞团形成频率分别为0.5％、0％和0.01％。因此，部分1中细胞团的形成为部分3的约50倍。

J.FACS分选

例如，使用SSEA-3作为标记进行FACS分选。

对于人成纤维细胞和H-MSC两者，通过FACS分选分离SSEA-3(+)和SSEA-3(-)细胞，并进行单一细胞悬浮培养。约50％-60％的SSEA-3(+)细胞产生M团，而从SSEA-3(-)细胞仅形成少量M团。

K.Muse细胞的特征

FACS分析显示，未处理人成纤维细胞部分和H-MSC部分含有对在间充质细胞中表达的CD44、CD49f、CD54、CD90和CD105呈阳性；但对CD11c、CD34、CD45、CD71、CD166、CD271和冯维勒布兰德(vWF)因子呈阴性的部分。富含Muse的细胞部分含有约0.7％-1.9％SSEA-3(+)部分(CD44和CD54阴性)(图14)。

SSEA-3是已知的多能性标记之一。在未处理人成纤维细胞部分和H-MCS部分中，M团形成频率(约1.2％)和富含Muse的细胞部分形成频率(9％-10％)与SSEA-3(+)细胞的相关百分比(未处理细胞部分：约0.7％-0.9％；富含Muse的细胞部分：7％-8.3％)类似。SSEA-3(+)细胞的这种百分比可能表明Muse细胞的状态。免疫组织化学分析显示，未处理人成纤维细胞部分和H-MSC部分中SSEA-3(+)细胞的百分比(数目)小于1％。然后从来源于人成纤维细胞部分和H-MSC部分的富含Muse的细胞部分中分选SSEA-3(+)细胞，然后进行单一细胞悬浮培养。结果，50％-60％的SSEA-3(+)细胞产生M团。这种结果为在富含Muse细胞的细胞部分中的M团形成的约6-7倍，而且为在未处理细胞部分中的M团形成的约60倍。同时，在SSEA-3(-)细胞部分中未观察到M团形成。值得注意的是，在从来源于FACS分选的SSEA-3(+)细胞部分的单一细胞团克隆扩繁的细胞(3000-5000个细胞)中，约45％的细胞是SSEA-3(+)(图15-1a)。该研究结果表明，不对称细胞分裂参与M团形成，也可以说参与单一M团的克隆扩繁。实际上，已知参与不对称细胞分裂的Numblike仅存在于细胞分裂后两个子细胞之一中(图15-2b)。这些结果表明，不对称细胞分裂参与Muse细胞的生长。

电子显微镜术显示，在LTT后分选的人成纤维细胞部分和H-MSC部分来源的SSEA-3(-)细胞中存在核变形，细胞质中有液泡，这就表明了细胞损伤。电子显微镜术未显示在SSEA-3(-)和SSEA-3(+)细胞之间有清晰可辨认的形态差异(图15-3c和d)。SSEA-3(-)

在移植实验中还证实了SSEA-3(+)细胞的重要性。在将SSEA-3(-)细胞部分移植时，与SSEA-3(+)细胞部分移植相比，极少数的细胞为组织标记阳性的。

在富含Muse的细胞部分中，大部分SSEA-3(+)细胞表达Oct3/4和Sox2两者，其可在细胞质中检出(图15-4e和g)，而极少数细胞在核中表达(图15-4f)。此结果表明SSEA-3可为Muse细胞的良好标记。相比之下，在M团的细胞中，Oct3/4和Sox2主要定位于核中(图7-2h和l)。有可能的是两种标记在胞内定位中的这种差异反映了细胞状态的差异。

Muse细胞通过LTT人工诱导的可能性依旧存在。如上所述，大部分Muse细胞存在于骨髓的CD105(+)细胞部分中。此外，SSEA-3(+)细胞还具有Muse细胞性质。因此我们试图通过分离作为SSEA-3/CD105二重阳性细胞的Muse细胞，而从成人骨髓穿刺液中直接获得Muse细胞。将构成骨髓来源的单核细胞的0.025％-0.05％的二重阳性细胞直接进行单一细胞悬浮培养而不进行LTT。7天后，11.4％±1.2％的细胞(相当于0.003％-0.005％的单核细胞)形成ALP(+)M团。单一M团然后通过贴壁培养再次扩繁到3000个细胞，随后进行单一细胞悬浮培养。这些细胞中，33.5％±3.1％细胞形成第2代M团，从明胶包被培养皿上的单一M团扩繁的细胞的RT-PCR表明表达甲胎蛋白、GATA6、MAP-2和Nkx2.5，这就表明该细胞具有与存在于成人骨髓中的Muse细胞的性质一致的性质。

如上所述，通过暴露于应激条件除去非干细胞，使得可富集干细胞。通过LTT和随后的SSEA-3(+)细胞分选，可有效地收集Muse细胞。表达多能性标记的Muse细胞为碱性磷酸酶染色阳性的，并且形成能够分化成外胚层、中胚层和内胚层细胞的M团。此外，Muse细胞不具有与致癌增殖有关的特征，并且没有端粒酶活性，正如通过测定生长速度所揭示的一样。这就表明Muse细胞具有防止增殖爆发的多层安全系统。通过其中将Muse细胞注射到小鼠睾丸的实验也证实了Muse细胞的这种非致癌性质。这种性质便于维持生物功能的平衡。缺乏这种性质可因异常生长或发育异常而破坏活体，导致肿瘤发生或畸胎瘤形成。

Muse细胞的多能性在贴壁培养系统中不明显，但在悬浮培养中观察得到。

通常认为，Muse细胞处于休眠状态，但在响应与严重危机相关的信号或响应重度伤、饥饿或缺血等持续应激性条件时被激活。激活时，Muse细胞可促进组织再生、细胞间相互作用以及因此而组织机化。

实施例2.利用SSEA-3分离的Muse细胞的表征

实施例1的检查显示，通过FACS获得的SSEA-3(+)细胞部分具有多能干细胞的性质；也就是说它们是Muse细胞(上述J、K等)。此外，利用分离的SSEA-3(+)细胞检查了体外分化能力和体内分化能力，然后建立了Muse来源的iPS细胞。

1.通过将细胞移植入受损组织来检查体内分化能力

分离出用GFP(绿色荧光蛋白质)-慢病毒标记的SSEA-3(+)Muse细胞，然后通过静脉内注射入脊髓损伤(脊髓挤压伤)、肝脏损伤(腹膜内注射CCl₄，暴发性肝炎模型)或腓肠肌(肌肉)损伤(心脏毒素注射)的免疫缺陷小鼠(NOG小鼠)中进行移植。人皮肤细胞来源的Muse细胞用GFP(绿色荧光蛋白质)-慢病毒标记(Hayase M等，J Cereb Blood FlowMetab.29(8)：1409-20，2009)，然后利用GFP证实M团来源于标记细胞。对于NOG小鼠，脊髓挤压伤在Th9水平下进行(Farooque M等，ActaNeuropathol.，100；13-22，2000)。将心脏毒素注射入NOG小鼠腓肠肌(肌肉)以诱导肌肉变性。通过腹膜注射给予NOG小鼠四氯化碳以诱导肝脏变性。对于肌肉和肝脏在2天后和对于脊髓在7天后通过静脉内注射，移植1×10⁵个Muse细胞。每种情况使用6只小鼠。接受静脉内注射的GFP标记的MEC群的未受损小鼠用作对照。移植后3或4周，小鼠用4％低聚甲醛固定，然后进行免疫组织化学分析和共焦激光显微镜观察。

4周后，在脊髓损伤小鼠中发现：GFP和人高尔基复合体阳性细胞表达神经丝(图16-1N和O)；在肝脏损伤小鼠中，GFP和人高尔基复合体阳性细胞(在再生肝脏中)表达人白蛋白(图16-1P)。RT-PCR进一步证实了在Muse细胞移植NOG小鼠肝脏中人白蛋白的表达(图16-2)。注射入再生肌肉的GFP(+)细胞在3周时表达人肌养蛋白(图16-3)。与这些结果大不相同，SSEA-3(-)人皮肤成纤维细胞部分的移植产生显著较少数目的整合细胞，而且较少细胞对相关组织标记呈阳性。这些研究结果表明，Muse细胞具有整合到受损组织以及体内分化成外胚层、内胚层和中胚层谱系细胞的能力。

2.由单一Muse细胞产生的M团来源的扩繁细胞的分化

检查了诱导系统是否有效调节Muse细胞的分化。将单一SSEA-3(+)-Muse细胞来源的M团分别转移到贴壁培养以扩繁。收集单一Muse细胞来源的扩繁细胞，分成4群，然后各自进行神经、骨细胞、脂肪细胞和肝细胞诱导(n＝5)。

对于神经诱导，将细胞以1.0×10⁵个细胞/ml的密度培养在poly-HEMA包被培养皿内补充了B-27Supplement的NEUROBASAl培养基(Gibco)中，培养7天以便形成球体。对于分化，将该球体转移至聚-L-赖氨酸(Lysin)包被的玻璃上，并在补充了25ng/ml FGF和25ng/ml BDNF的2％FBS中培养10天。

对于骨细胞诱导，将细胞以4.2×10³细胞/cm²的密度用人间充质干细胞功能鉴定试剂盒(Human Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit)(R&DSystems,SC-006)的骨细胞诱导培养基培养14天。

对于脂肪细胞诱导，将细胞以2.1×10⁴细胞/cm²的密度用人间充质干细胞功能鉴定试剂盒(R&D Systems,SC-006)的脂肪细胞诱导培养基培养14天。

对于肝细胞诱导，将细胞以2.0×10⁴细胞/cm²的密度用补充10nM地塞米松和100ng/ml HGF、50ng/ml FGF4)的DMEM(+10％FBS，10×ITS(GIBCO)，在胶原包被培养皿中培养14天。

神经诱导形成含有神经干细胞标记巢蛋白、Musashi和NeuroD阳性的细胞的球体(图17-1A-D)，当在分化培养基中培养时，该细胞进一步分化成MAP-2阳性或GFAP阳性细胞(图17-1E；89±5.7％对MAP-2或GFAP呈阳性)。骨细胞诱导产生骨钙蛋白(97±3.5％)和碱性磷酸酶阳性的细胞(图17-1F-G)。脂肪细胞分化产生具有被油红染色的脂滴的细胞(90±4.9％)(图17-1H-I)。肝细胞诱导产生人甲胎蛋白阳性细胞(图17-1J；87±7.6％)，而且RT-PCR证实人白蛋白和甲胎蛋白的表达(图17-2)。这些结果表明，可以调节Muse细胞(通过诱导)以以非常高的效率分化成3个谱系的细胞。

3.自成人皮肤采集SSEA-3(+)细胞

试图在不温育培养细胞或形成M团的情况下直接从成人皮肤分离Muse细胞。

得自健康供体(n＝3)的人皮肤获自BIOPREDIC International。小心地切除表皮和脂肪组织以分离出真皮，使真皮与含有10％FBS的α-MEM中的胶原酶/分散酶一起在37℃下温育36小时。通过过滤经消化的真皮来收集细胞，以1500rpm离心20分钟，用α-MEM洗涤后，与0.25％胰蛋白酶-HBSS一起温育5分钟。细胞进一步用FACS缓冲液洗涤，与SSEA-3一起温育，以采用FACS通过细胞分选收集SSEA-3(+)细胞。从约7cm²的皮肤组织中，最终可收集1.3±0.3x10⁴个单一细胞。SSEA-3(+)细胞占这些收集的单一细胞的1.7±0.2％。

21.0±1.7％的SSEA-3(+)细胞通过有限稀释在7天单一细胞悬浮培养内形成M团。M团为ALP染色阳性的，且RT-PCR显示，从明胶包被培养皿上的单一M团扩繁的的细胞表达MAP-2、Brachyury、Nkx2.5、GATA6和甲胎蛋白。这些研究结果表明成人真皮含有性质与在成人骨髓穿刺液的情况下Muse细胞的性质相同的细胞。

成人真皮含有若干类型的干细胞或祖细胞，例如SKP(皮肤来源的祖细胞)、NCSC(神经嵴干细胞)、成黑素细胞(MB)、血管周围细胞(PC)、内皮祖细胞(EP)和脂肪来源的干细胞(ADSC)。为了排除Muse细胞与这些已知干细胞之一相同的可能性，对Muse细胞进行了以下标记表达的分析：Snai1(SKP的标记)、Slug(SKP的标记)、Sox10(NCSC的标记)、CD271(NCSC的标记)、Tyrp1(MB的标记)、Dct(MB的标记)、CD117(MB的标记)、CD146(PC和ADSC的标记)、NG2(PC的标记)、CD34(EP和ADSC的标记)和冯维勒布兰德因子(EP的标记)。通过FACS或RT-PCR分析，在SSEA-3(+)细胞中未检出这些标记(图18-1和图18-2)，这就表明Muse细胞不同于已知存在于成人真皮中的这些干细胞或祖细胞。

使用铁酸盐粒子测定Muse细胞的吞噬活性。Muse细胞容易掺入铁酸盐粒子，这就表明Muse细胞具有高吞噬活性(图18-3)。

4.Muse来源的iPS细胞(Muse-iPSC)的建立

例如通过导入Oct3/4基因、Sox2基因、Klf4基因、c-Myc基因、Nanog基因和Lin28基因，来制备iPS细胞。Muse细胞具有类似于iPS细胞的性质，因为它们表达多能性标记，并可分化成外胚层、中胚层和内胚层细胞。检查了Muse细胞是否可以是iPS细胞的良好材料。

为此目的采用的方法如下。

按照Takahashi等，Cell,131，861-872(2007)所述，使用反转录病毒载体，将4种因子(Nanog、Oct3/4、KLF4和c-Myc)导入人成纤维细胞部分来源的SSEA-3(+)细胞和SSEA-3(-)细胞，然后培养。该方法具体描述如下。

质粒的建立

将人Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc的可读框插入pMX反转录病毒载体(CellBiolabs)。

用反转录病毒感染与iPS细胞的建立

以5x 10⁶个细胞/100-mm培养皿的密度接种PLAT-A细胞，然后培养过夜。次日，使用Fugene HD进行转染。转染后24小时，进行培养基更换。3天后收集上清液，然后通过0.45-μm滤器过滤。然后加入聚凝胺(Polybrene)(4μg/ml)。以1x 10⁵细胞/60-mm培养皿的密度接种的NHDF(正常人皮肤成纤维细胞)用病毒溶液感染。24小时后，更换培养基为不含病毒的新培养基。病毒感染后第4天，用胰蛋白酶剥离细胞，然后以3x 10⁴个细胞的密度接种在MEF(饲养细胞)中。次日，更换培养基为补充4ng/ml bFGF的Primate ES培养基。2天后，每隔一天进行培养基更换一次。30天后，挑选集落，然后接种在24孔板上。

PCR分析

采用RNeasy Mini Kit(QIAGEN)纯化RNA。用SuperScriptII使RNA(500ng)反转录。内源Oct、Sox2、Klf4、Myc和Nanog引物、PCR条件等披露于Takahashi等,Cell,131，861-872(2007)。

体外iPS细胞分化

用胶原酶收集iPS细胞。将细胞团置入用Poly-HEMA包被的培养皿中，然后在含有20％敲除血清置换(Knockout serum replacement)(Invitrogen)、2mM L-谷氨酰胺、1×10^-4M非必需氨基酸、1×10^-4M 2-巯基乙醇(Nacalai)和0.5％青霉素/链霉素的DMEM/F12培养基中培养。每隔7天更换培养基一次。7天后，将胚状体接种在明胶包被的培养皿中，接着在同一培养基中培养1周。

畸胎瘤的形成

60-mm培养皿中的iPS细胞用Rock抑制剂处理，使用Accutase(注册商标)收集在管中，进行离心，然后悬浮于PBS中。将这些细胞注射到NOG小鼠(注册商标)(实验动物中央研究所(Central Institute for Experimental Animals))睾丸中。12周后，所得物用4％低聚甲醛固定。对石蜡切片进行HE(苏木精和伊红)染色。

得到下列结果。

按照Takahashi等,Cell,131，861-872(2007)所述方法，使用反转录病毒载体，将4种因子Nanog、Oct3/4、KLF4和c-Myc导入人成纤维细胞部分来源的SSEA-3(+)和(-)细胞中。5天后，再次将细胞接种在MEF上，然后培养。临挑选集落前，也就是MEF上培养第30天，在SSEA-3(-)细胞中产生的集落是非ES细胞样集落，它们中无一是Tra-1-80(ES细胞标记)阳性的。相比之下，许多SSEA-3(+)细胞形成的集落是Tra-1-80阳性的SSEA-3(-)细胞群形成的集落数的约7倍。重要的是，甚至临挑选集落前在MEF上第30天，与多能性密切相关的基因例如Nanog和Sox2，在SSEA-3(-)细胞(收集所有集落和不形成集落的细胞)中全为阴性，正如通过RT-PCR所测一样。同时，SSEA-3(+)细胞显示内源Oct3/4、KLF4和Rex1增量调节并表达Nanog和Sox2。按预期对SSEA-3(+)细胞进行集落挑选，然后转移到新的MEF(饲养细胞)中，可成功产生iPS细胞，其效率约为未处理人成纤维细胞部分细胞的效率的30倍。通过免疫细胞化学、RT-PCR和Q-PCR表明，这些iPS细胞显示Tra-1-60、Tra-a-80、Rex1、UTF-1、端粒酶反转录酶(TERT)和在人ES细胞中表达的因子增量调节或新出现(图19和21)。此外，Nanog、Oct3/4、Sox 2和TRA-1-81在由此获得的Muse细胞来源的iPS细胞中表达(图19)。RT-PCR显示，Nanog、Oct3/4和Sox 2在Muse细胞来源的iPS细胞中表达，但不在SSEA-3(-)细胞来源的集落中表达(图21)。

Oct3/4基因、Sox 2基因、Klf4基因和c-Myc基因的转导效率与SSEA-3(+)和SSEA-3(-)细胞部分的几乎相同。然后将用上述4种因子转导的细胞以1x10⁵个细胞/培养皿的密度转移并培养在小鼠饲养细胞上。在2个群中观察到集落形成，但SSEA-3(+)细胞部分形成的集落为SSEA-3(-)细胞的7倍。此外，与来源于SSEA-3(+)细胞部分的集落大不相同，甚至在培养第30天临挑选集落前，来源于SSEA-3(-)细胞部分的集落中无一发现对人多能干细胞标记TRA-1-81呈阳性(图22-1)。RT-PCR显示内源Sox2和Nanog只在SSEA-3(+)细胞来源的部分表达，而不在SSEA-3(-)细胞部分中表达(图22-2)。

挑选从SSEA-3(+)和SSEA-3(-)细胞部分产生的全部集落，在各孔中传代以建立iPS细胞系。3次传代后，对显示人ES细胞样形态(扁平集落)的所有集落分别进行RT-PCR(图22-3C和C1)。表达所有3种因子(内源Oct3/4、内源Sox2和Nanog)的集落记为iPS集落。该项分析显示仅来源于SSEA-3(+)细胞的集落产生iPS细胞，效率为0.03％，而来源于SSEA-3(-)细胞的集落无一产生iPS细胞(图22-3D和D1)。

此外，自Muse细胞建立的iPS细胞分化成外胚层、中胚层和内胚层细胞，并在小鼠睾丸中形成畸胎瘤(图23-1-图23-3)。

就生长速度和端粒酶活性而言，Muse细胞的增殖活性不是非常高。同样，虽然Muse细胞在小鼠睾丸中分化成三胚层细胞，但它们不会发展成畸胎瘤。有理由认为，因为如果Muse细胞在皮肤和骨髓等成人组织中维持，则它们的增殖应受到严格调节，否则它们实际上容易在身体的每个部位发展成肿瘤。此外，甚至多能细胞也不总是出现畸胎瘤形成，因为培养在某些条件下的外胚层干细胞表明不会在小鼠睾丸中形成畸胎瘤(Chou等,Cell,135，449-461(2008))。由于Muse细胞最初表现出一些多能细胞的特征(例如多能性标记表达及其分化能力)，因此认为Muse细胞仅通过提高增殖活性便可容易地变成iPS细胞，并在小鼠睾丸中形成畸胎瘤。尚不清楚iPS的诱导机制，但是间充质细胞群中Muse细胞获得致癌增殖可能为可能性之一。

可以约0.001％的效率从未处理人皮肤成纤维细胞部分中建立iPS细胞。这与K.Takahashi等,Cell 131，861(2007)的报告一致。因此，iPS细胞自SSEA-3(+)细胞的制备效率为未处理成纤维细胞的30倍。这就表明Muse细胞主要促进iPS细胞产生。

从Muse来源的iPS细胞发育的胚状体的免疫组织化学分析和RT-PCR分析显示，细胞体外分化成表达神经丝和MAP-2的外胚层细胞、表达SMA、Brachyury和Nkx2.5的中胚层细胞及表达甲胎蛋白和GATA-6的内胚层细胞。此外，将Muse来源的iPS细胞注射到免疫缺陷小鼠睾丸导致畸胎瘤形成。相比之下，注射M团的睾丸不形成畸胎瘤长达6月，且大多数不显著大于注射失活MEF的对照睾丸。然而，鉴定出人线粒体阳性以及SMA、甲胎蛋白和神经丝阳性的细胞。这些结果显示与Muse来源的iPS细胞不同，在免疫缺陷小鼠中，原始Muse细胞不形成畸胎瘤，却分化成中胚层、外胚层和内胚层谱系细胞。

对M团和Muse来源的iPS细胞进行定量PCR(Q-PCR)。结果见图25和26。与细胞周期调节有关的基因的表达模式基本不同。与细胞周期进程有关的基因在M团中多被减量调节，在Muse来源的iPS细胞中却被增量调节。与多能性和未分化细胞状态有关的基因的表达在M团和Muse来源的iPS细胞中相似，但Nanog、Oct3/4和Sox2的表达水平在M团中比在Muse来源的iPS细胞中低得多。此外，Nanog和Oct3/4基因启动子区的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpGs)的甲基化在Muse来源的iPS细胞中比在M团中少，而且Nanog基因启动子区显示在M团中的CpG甲基化水平比未处理SSEA-3(-)细胞部分中的低(图24)。这种结果可部分解释Muse细胞和Muse来源的iPS细胞之间多能性标记表达水平的差异。

工业实用性

按照本发明，可在不使用任何生殖细胞或早期胚胎以及在不使用外源基因转移或导入特定化合物等人工诱导操作的情况下，从机体组织获得多能干细胞。可在不使用外源基因转移等人工操作的情况下，有效地制备本发明的多能干细胞，使得所述多能干细胞在应用于治疗时可安全地使用。此外，本发明的多能干细胞可用于再生医疗和功能障碍组织的治疗等，而且还可用于例如细胞分裂或组织再生的研究。

本说明书引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用以其整体结合到本文中。

Claims

1. 一种包含SSEA-3 (+)多能干细胞的细胞部分，所述细胞部分使用SSEA-3的表达作为指标从活体的中胚层组织或间充质组织中获得，所述细胞部分包含具有以下性质的SSEA-3 (+)多能干细胞：

(i)所述细胞具有低的端粒酶活性或无端粒酶活性；

(ii)所述细胞能够分化成三胚层；

(iii)所述细胞不出现肿瘤性增殖；

(iv)所述细胞具有自我更新能力；和

(v)所述细胞为CD105阳性的。

2.权利要求1的细胞部分，其中所述多能干细胞对应激有抗性。

3.权利要求1的细胞部分，其中所述多能干细胞具有高吞噬能力。

4.权利要求1的细胞部分，其中活体的间充质组织是皮肤或骨髓。

5.权利要求1的细胞部分，其中所述多能干细胞以悬浮培养和贴壁培养的组合培养增殖。

6.一种用于从活体的中胚层组织或间充质组织中获得权利要求1-5中任一项的细胞部分的方法，所述方法包括从来源于活体的中胚层组织或间充质组织的细胞中收集表达SSEA-3和CD105的细胞，其中所述方法不包括从活体获得中胚层组织或间充质组织的步骤。