JP2014132830A - 生体の臍帯又は脂肪組織から単離できる多能性幹細胞 - Google Patents

生体の臍帯又は脂肪組織から単離できる多能性幹細胞 Download PDF

Info

Publication number
JP2014132830A
JP2014132830A JP2011076635A JP2011076635A JP2014132830A JP 2014132830 A JP2014132830 A JP 2014132830A JP 2011076635 A JP2011076635 A JP 2011076635A JP 2011076635 A JP2011076635 A JP 2011076635A JP 2014132830 A JP2014132830 A JP 2014132830A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
negative
pluripotent stem
cell
cells
stem cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP2011076635A
Other languages
English (en)
Inventor
Mari Idesawa
真理 出澤
Masayori Yoshida
正順 吉田
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Clio Inc
Original Assignee
Clio Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Clio Inc filed Critical Clio Inc
Priority to JP2011076635A priority Critical patent/JP2014132830A/ja
Priority to PCT/JP2012/059422 priority patent/WO2012133942A1/ja
Priority to CN2012800170872A priority patent/CN103459590A/zh
Priority to US13/435,703 priority patent/US9399758B2/en
Publication of JP2014132830A publication Critical patent/JP2014132830A/ja
Priority to US15/189,215 priority patent/US11261426B2/en
Priority to US16/104,224 priority patent/US20180355313A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0605—Cells from extra-embryonic tissues, e.g. placenta, amnion, yolk sac, Wharton's jelly
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0607—Non-embryonic pluripotent stem cells, e.g. MASC
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0667—Adipose-derived stem cells [ADSC]; Adipose stromal stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Virology (AREA)

Abstract

【課題】生体の臍帯又は脂肪組織から多能性幹細胞を直接得る方法の提供及びその方法により得られた多能性幹細胞の提供。
【解決手段】生体の臍帯又は脂肪組織から単離できるSSEA-3陽性の多能性幹細胞。
【選択図】なし

Description

本発明は生体の臍帯又は脂肪組織由来の多能性幹細胞に関する。
近年、組織再生に貢献し得る成人幹細胞又は組織幹細胞が注目されている。
成体から得られる分化能を有する細胞として、例えば骨、軟骨、脂肪細胞、神経細胞、骨格筋等への分化能を有する骨髄間葉系細胞画分（MSC: Bone marrow stromal cell)が報告されている（非特許文献１及び２を参照）。しかしながら、骨髄間葉系細胞画分は様々な細胞を含む細胞群であり、その分化能は多様でありながら本体がはっきりせず、また特定の細胞に分化させるために特定の化合物による刺激や遺伝子導入等が必要であり、分化誘導システムを構築する必要があった。
さらに、成体由来の多能性幹細胞としてiPS細胞（induced pluripotent stem cell）（特許文献１、特許文献２、非特許文献３等を参照）が報告されていた。しかしながら、iPS細胞の樹立には、間葉系細胞である皮膚線維芽細胞画分(dermal fibroblast)に特定の遺伝子や特定の化合物を体細胞に導入するという特定の物質を用いた誘導操作が必要であった。
また、生体組織から単離できるSSEA-3陽性の多能性幹細胞であって、それまで知られていなかった生体由来の幹細胞についての報告があった（特許文献３及び非特許文献４等を参照）。
特許第4183742号公報 特開2008-307007号公報 国際公開第WO2011/007900号国際公開パンフレット
M. DEZAWA et al., The Journal of Clinical Investigation, 113, 12, pp. 1701-1710, (2004) M. DEZAWA et al., SCIENCE, 2005 July 8, 309, pp. 314-317, (2005) Okita K. et al. SCIENCE, 2008 Nov 7, 322(5903), pp.949-953 Proc.Natl.Acad.Sci USA, 107(19):8639-43, 2010
本発明は、生体の臍帯又は脂肪組織から多能性幹細胞を直接得る方法の提供及びその方法により得られた多能性幹細胞の提供を目的とする。
本発明者らは、皮膚線維芽細胞及び骨髄細胞よりSSEA-3陽性であり、従来の幹細胞には認められない抗原発現パターンを有する幹細胞を単離し、Muse（Multilineage-differentiating Stress Enduring cells)細胞と名付けた（国際公開第WO2011/007900号国際公開パンフレット、Proc.Natl.Acad.Sci USA, 107(19):8639-43, 2010）。
さらに、検討を行い臍帯、及び脂肪組織よりMuse細胞を単離し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１] 生体の臍帯又は脂肪組織から単離できるSSEA-3陽性の多能性幹細胞。
[２] CD105陽性の[１]の多能性幹細胞。
[３] CD117陰性及びCD146陰性の[１]又は[２]の多能性幹細胞。
[４] CD117陰性、CD146陰性、NG2陰性、CD34陰性、vWF陰性及びCD271陰性の[１]又は[２]の多能性幹細胞。
[５] CD34陰性、CD117陰性、CD146陰性、CD271陰性、NG2陰性、vWF陰性、Sox10陰性、Snail陰性、Slug陰性、Tyrp1陰性及びDct陰性の[１]又は[２]の多能性幹細胞。
[６] テロメラーゼ活性が低いか又は無い、[１]〜[５]のいずれかの多能性幹細胞。
[７] 三胚葉に分化する能力を持つ、[１]〜[６]のいずれかの多能性幹細胞。
[８] 腫瘍性増殖を示さない、[１]〜[７]のいずれかの多能性幹細胞。
[９] セルフリニューアル能を持つ、[１]〜[８]のいずれかの多能性幹細胞。
[１０] ストレス耐性である、[１]〜[９]のいずれかの多能性幹細胞。
[１１] 貪食能が高い、[１]〜[１０]のいずれかの多能性幹細胞。
[１２] 以下に示す２２個のオドラント受容体の少なくとも一つが陽性の[１]〜[１１]のいずれかの多能性幹細胞：
olfactory receptor, family 8, subfamily G, member 2 (OR8G2)；
olfactory receptor, family 7, subfamily G, member 3 (OR7G3)；
olfactory receptor, family 4, subfamily D, member 5 (OR4D5)；
olfactory receptor, family 5, subfamily AP, member 2 (OR5AP2)；
olfactory receptor, family 10, subfamily H, member 4 (OR10H4)；
olfactory receptor, family 10, subfamily T, member 2 (OR10T2)；
olfactory receptor, family 2, subfamily M, member 2 (OR2M2)；
olfactory receptor, family 2, subfamily T, member 5 (OR2T5)；
olfactory receptor, family 7, subfamily D, member 4 (OR7D4)；
olfactory receptor, family 1, subfamily L, member 3 (OR1L3)；
olfactory receptor, family 4, subfamily N, member 4 (OR4N4)；
olfactory receptor, family 2, subfamily A, member 7 (OR2A7)；
guanine nucleotide binding protein (G protein), alpha activating activity polypeptide, olfactory type (GNAL)；
olfactory receptor, family 6, subfamily A, member 2 (OR6A2)；
olfactory receptor, family 2, subfamily B, member 6 (OR2B6)；
olfactory receptor, family 2, subfamily C, member 1 (OR2C1)；
olfactory receptor, family 52, subfamily A, member 1 (OR52A1)；
olfactory receptor, family 10, subfamily H, member 3 (OR10H3)；
olfactory receptor, family 10, subfamily H, member 2 (OR10H2)；
olfactory receptor, family 51, subfamily E, member 2 (OR51E2)；
olfactory receptor, family 5, subfamily P, member 2 (OR5P2)；及び
olfactory receptor, family 10, subfamily P, member 1 (OR10P1)。
[１３] 以下に示す５個のケモカイン受容体の少なくとも一つが陽性の[１]〜[１２]のいずれかの多能性幹細胞：
chemokine (C-C motif) receptor 5（CCR5)；
chemokine (C-X-C motif) receptor 4（CXCR4)；
chemokine (C-C motif) receptor 1（CCR1)；
Duffy blood group, chemokine receptor(DARC)；及び
chemokine (C-X-C motif) receptor 7(CXCR7)。
[１４] [１]〜[１３]のいずれかの多能性幹細胞を含む細胞塊または細胞画分。
[１５] 生体の臍帯又は脂肪組織から、以下の(i)〜(vi)の特性の少なくとも１つの特性を指標に多能性幹細胞又は多能性細胞画分を単離する方法：
(i) SSEA-3陽性；
(ii) CD105陽性；
(iii) CD117陰性及びCD146陰性；
(iv) CD117陰性、CD146陰性、NG2陰性、CD34陰性、vWF陰性及びCD271陰性；
(v) CD34陰性、CD117陰性、CD146陰性、CD271陰性、NG2陰性、vWF陰性、Sox10陰性、Snail陰性、Slug陰性、Tyrp1陰性及びDct陰性；並びに
(vi) テロメラーゼ活性が低いか又は無い。
[１６] 生体の臍帯又は脂肪組織由来細胞を細胞ストレスに暴露し生き残った細胞を回収することを含む多能性幹細胞又は多能性細胞画分を単離する方法。
[１７] 細胞ストレスが、プロテアーゼ処理、低酸素条件下での培養、低リン酸条件下での培養、血清飢餓状態での培養、糖飢餓状態での培養、放射線曝露下での培養、熱ショックへの曝露下での培養、有害物質存在下での培養、活性酸素存在下での培養、機械的刺激下での培養及び圧力処理下での培養から選択される、[１６]の多能性幹細胞又は多能性細胞画分を単離する方法。
[１８] 細胞ストレスが、トリプシン処理である、[１６]の多能性幹細胞又は多能性細胞画分を単離する方法。
[１９] [１]〜[１３]のいずれかの多能性幹細胞の派生細胞又は誘導細胞である多能性幹細胞。
[２０] [１]〜[１３]のいずれかの多能性幹細胞の派生細胞又は誘導細胞である分化した細胞。
[２１] [１]〜[１３]及び[１９]のいずれかの多能性幹細胞を含む医薬組成物。
[２２] [２０]の分化した細胞を含む医薬組成物。
本発明により、生殖細胞や初期胚を利用することなく、かつ外来遺伝子の導入や特定の化合物の導入等の人為的な誘導操作を経ずに、臍帯又は脂肪組織から多能性幹細胞を得ることができる。外来遺伝子の導入等の人為的操作を経ないために、本発明の多能性幹細胞は効率的に作製することが可能であり、治療に用いる場合であっても安全に用いることができる。また、本発明の多能性幹細胞は、再生医療や機能不全組織の治療等に用いることができ、さらに、細胞分化や組織再生の研究等に用いることができる。
臍帯より単離した多能性幹細胞であるMuse細胞の形態を示す図である。 臍帯より単離した多能性幹細胞であるMuse細胞のα-フェトプロテイン（α-FP)、GATA6、MAP-2及びNkx2.5のRT-PCR分析の結果を示す図である。 脂肪組織より単離した多能性幹細胞であるMuse細胞の形態を示す図である。 脂肪幹細胞より単離した多能性幹細胞であるMuse細胞のMAP-2、α-フェトプロテイン（α-FP)、及びNkx2.5のRT-PCR分析の結果を示す図である。 脂肪幹細胞より単離した多能性幹細胞であるMuse細胞の形態を示す図である。 細胞の形態を示す図である。 フローサイトメーターによる分析の結果を示す図である。 得られた細胞集団の特徴を示す図である。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、生体の臍帯又は脂肪組織から直接得ることができる多能性(pluripotent)幹細胞又は多能性幹細胞画分及び該多能性幹細胞又は該多能性幹細胞画分を単離する方法、並びに該方法により得られた臍帯又は脂肪組織由来の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分である。本発明の多能性幹細胞をMuse細胞（multilineage differentiating stress enduring cells)という。
本発明において、細胞画分というときは、単離したい細胞を少なくとも一定量含む細胞群のことをいう。例えば、多能性幹細胞画分とは、多能性幹細胞を１％以上、10％以上、30％以上、50％以上、70％以上、90％以上、又は95％以上含む細胞群が挙げられ、多能性幹細胞の培養によって得られる細胞塊や多能性幹細胞を濃縮した細胞群を含む。また、前記細胞画分を実質的に均一な細胞画分ということもある。
臍帯は、哺乳動物の臍帯である。臍帯とは臍帯組織をいう。
脂肪組織は、脂肪組織中に含まれる幹細胞である脂肪幹細胞（脂肪由来幹細胞）（adipose-derived stem cell; ADSC)から好適に単離することができる。皮下脂肪吸引物から公知の方法で脂肪幹細胞画分を得ることができる。脂肪幹細胞の細胞表面抗原はCD13陽性、CD29陽性、CD44陽性、CD73陽性、CD90陽性、CD105陽性、CD166陽性、CD14陰性、CD31陰性、CD45陰性である。脂肪幹細胞は、市販されており、例えばLonza社のヒト脂肪由来幹細胞を利用することができる。
臍帯、脂肪組織共に採取後、凍結保存しておいたものも用いることができる。
哺乳動物は限定されないが、例えばヒト、サル等の霊長類、マウス、ラット、ウサギ、モルモット等のげっ歯類、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、ヤギ、フェレット等が含まれる。本発明の多能性幹細胞は、生体の臍帯又は脂肪組織由来である点で、胚性幹細胞（ES細胞）や胚性生殖幹細胞（EG細胞）と明確に区別される。
細胞が臍帯又は脂肪組織から直接得ることができるとは、臍帯又は脂肪組織から単離することができ、外来遺伝子や外来タンパク質の導入又は化合物の投与などの化合物処理等の人為的な誘導操作を経ずに得られることを意味する。ここで、外来遺伝子は、限定されないが、例えば体細胞の核を初期化し得る遺伝子をいい、例えば、Oct3/4遺伝子等のOctファミリー遺伝子、Klf遺伝子等のKlfファミリー遺伝子、c-Myc遺伝子等のMycファミリー遺伝子、Sox2遺伝子等のSoxファミリー遺伝子が挙げられる。また、外来タンパク質としてはこれらの遺伝子がコードするタンパク質やサイトカインが挙げられる。さらに、化合物としては、例えば、上記の体細胞の核を初期化し得る遺伝子の発現を誘導する低分子化合物やDMSO、還元剤として機能する化合物、DNAメチル化剤等が挙げられる。本発明の多能性幹細胞は、生体の臍帯又は脂肪組織から直接得ることができるという点で、iPS(induced pluripotent stem cell)細胞及びES細胞とは明確に区別される。なお、本発明においては、細胞の培養、細胞の表面マーカーを指標に細胞又は細胞画分を単離すること、細胞を細胞ストレスに曝露すること、及び細胞に物理的衝撃を与えることは、人為的な誘導操作には含まれない。また、本発明の多能性細胞は、リプログラミング又は脱分化の誘導を必要とせずに得られることを特徴としてもよい。
多能性幹細胞とは、pluripotencyを有している細胞をいい、以下の特性を有する。
（１） Nanog、Oct3/4、SSEA-3、PAR-4及びSox2等の多能性マーカー（Pluripotent marker）を発現する。
（２） １細胞から増殖し、自己のクローンを作り続けるクローナリティー（Clonality）を有する。
（３） 自己複製（セルフリニューアル）能を有する。
（４） ３胚葉系（内胚葉系、中胚葉系及び外胚葉系）へin vitro及びin vivoで分化し得る。
（５） マウスの精巣や皮下に移植した場合、３胚葉系への分化を呈する。
（６） アルカリフォスファターゼ染色で陽性となる。
本発明の多能性幹細胞は、pluripotencyを有している点で、成人幹細胞、組織幹細胞とは明確に区別される。また、本発明の多能性幹細胞は、pluripotencyを有している単一の又は複数の細胞として単離されている点で、骨髄間葉系細胞等の細胞画分とは明確に区別される。
さらに、本発明の多能性幹細胞は、以下の特性を有する。
（i） 増殖速度が比較的緩やかで、分裂周期が１日以上、例えば1.2〜1.5日である。ただし、ES細胞やiPS細胞が示すような無限増殖は示さない。
（ii） 免疫不全マウスに移植した場合に内胚葉系、中胚葉系及び外胚葉系への分化を示す。ES細胞やiPS細胞ではテラトーマが短期間で癌化するのに比べ、半年以上癌化しないことを特徴とする。
（iii) 浮遊培養により胚様体様細胞塊を形成する。
（iv) 浮遊培養にて胚様体様細胞塊を形成し、10日程度で増殖が停止する。その後、接着培養に移動させることにより再増殖する。
（v） 増殖の際に非対称分裂を伴う。
（vi） 核型は正常である。
（vii） テロメラーゼ活性が無いか又は低い。ここで、テロメラーゼ活性が無いか又は低いとは、例えばTRAPEZE XL telomerase detection kit（Millipore社）を用いてテロメラーゼ活性を検出した場合に検出できないか又は低いことをいう。テロメラーゼ活性が低いとは、例えば、ヒト線維芽細胞と同程度のテロメラーゼ活性を有しているか、あるいはHela細胞に比べて1/5以下、好ましくは1/10以下のテロメラーゼ活性を有していることをいう。
（viii） メチル化の状態については、Muse細胞から誘導したiPS細胞に関してはNanogおよびOct3/4のプロモータ領域のメチル化レベルが低い。
（ix） 貪食能が高い。
（x） 腫瘍性増殖を示さない。ここで、腫瘍性増殖を示さないとは、浮遊培養を行った場合、一定の大きさの細胞塊（クラスター）に達すると増殖が止まり、無限増殖しないことをいう。また免疫不全マウスの精巣に移植しても奇形腫を形成しないことである。なお、上記(i)〜(iv)等も腫瘍性増殖を示さないことに関連する。
すなわち、本発明の細胞は、例えば以下の多能性幹細胞である。
（A） 生体の臍帯又は脂肪組織から得られる細胞であって、当該細胞内に化学物質、外来遺伝子又は外来タンパク質を導入することなく直接得ることができる多能性幹細胞。
（B） リプログラミングまたは脱分化を誘導することなく得ることができる、上記（A）の多能性幹細胞。
（C） 精巣へ移植した場合に、少なくとも半年間は癌化しない、上記（A）の多能性幹細胞。
（D） ES細胞、iPS細胞のように無限増殖を示さない、上記（A）の多能性幹細胞。
（E） 生体の臍帯又は脂肪組織由来の多能性幹細胞であって、生体の臍帯又は脂肪組織の細胞をプロテアーゼで処理したときに生き残る、プロテアーゼに耐性である多能性幹細胞。
本発明の臍帯又は脂肪組織由来の多能性幹細胞であるMuse細胞は、Muse細胞の表面に多く発現している細胞表面マーカーを利用して行うことができ、例えばSSEA-3の発現を指標に単離することができる。本発明の多能性幹細胞をSSEA-3陽性Muse細胞ということもある。さらに、Muse細胞は多能性幹細胞マーカーであるCD105を発現しており、SSEA-3陽性であり、CD105陽性である。従って、SSEA-3の発現を指標に単離することができる。また、SSEA-3及びCD105の両方の発現を指標に単離することができる。これらの細胞表面マーカーを利用することにより、本発明の多能性幹細胞を単一細胞として単離でき、単離した単一細胞を、培養により増殖させることができる。なお、本発明は、ヒト以外の哺乳動物の生体組織からSSEA-3に相当するマーカーによって単離できる多能性幹細胞をも含むものとする。
一方、Muse細胞は、NG2、CD34、vWF（フォンビルブランド因子）、c-kit（CD117)、CD146、CD271（NGFR)が陰性である。さらに、Sox10、Snai1、Slug、Tyrp1、Dctが陰性である。
NG2、CD34、vWF、CD117、CD146、CD271などの表面抗原が陰性かどうか、発現が弱いかどうかはこれらの抗原に対する抗体であって、発色酵素、蛍光化合物等で標識した抗体を用いて細胞が染色されたか否かを顕微鏡観察等により測定することにより決定することができる。例えば、これらの抗体を用いて細胞を免疫染色して、表面抗原の有無を決定することができ、また該抗体を結合させた磁性ビーズを用いても決定することができる。また、FACS又はフローサイトメーターを用いても表面抗原があるかどうか決定することができる。フローサイトメーターとしては例えばFACSAria(ベクトン・ディッキンソン社製)、FACS vantage(ベクトン・ディッキンソン社製)、FACS Calibur(ベクトン・ディッキンソン社製)等を用いることができる。
また、Sox10、Snai1、Slug、Tyrp1、Dctなどの転写因子に関してはRT-PCR等の手法により発現を調べることもできる。
これらの表面抗原が陰性とは、上記のようにFACSを用いて分析した場合に、陽性細胞としてソーティングされないこと、あるいはRT-PCRにより発現を調べた場合に、発現が認められないことをいい、これらの手法により検出できない程度発現していたとしても、本発明においては陰性とする。また、上記マーカーが陽性であることが公知の造血幹細胞等の細胞と同時に測定を行い、これらの陽性細胞と比較して、ほとんど検出されないか、あるいは有意に発現量が低い場合に陰性としてもよい。
本発明の細胞は、これらの細胞表面の抗原特性に基づいて単離することができる。
上記のように、Muse細胞は、SSEA-3陽性を指標に単離することができ、さらにCD105の発現を指標に単離することができるが、さらに、NG2、CD34、vWF（フォンビルブランド因子）、c-kit（CD117)、CD146、CD271（NGFR)、Sox10、Snai1、Slug、Tyrp1及びDctからなる群から選択される１１個のマーカーのうち少なくとも１個、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又は１１個のマーカーの非発現を指標に単離することができる。例えば、CD117及びCD146の非発現を指標に単離することができ、さらに、CD117、CD146、NG2、CD34、vWF及びCD271の非発現を指標に単離することができ、さらに、上記の１１個のマーカーの非発現を指標に単離することができる。
表面マーカーを用いて単離する場合、生体の臍帯又は脂肪組織から１個又は複数個の本発明の多能性幹細胞を、培養等を経ることなく直接単離することが可能である。また、本発明の多能性幹細胞を、細胞形態を顕微鏡等を使って目視することにより同定して単離することが可能である。
また、上記のマーカーに加えて、本発明の多能性幹細胞又は多能性細胞画分は、他の特定の因子の高発現によっても特徴付けられる。
生体の臍帯又は脂肪組織から本発明の多能性幹細胞であるMuse細胞が得られ、さらにMuse細胞を培養することによりMuse細胞由来の胚様体（EB)様細胞塊が得られる。Muse細胞、無処理細胞、Muse由来胚様体様細胞塊及びヒトES細胞において発現している因子を比較検討することにより、Muse細胞で高発現している因子がわかる。ここで、因子とは遺伝子転写産物、タンパク質、脂質、糖を含む。
本発明のMuse細胞においては、以下の１８個の因子が高発現している。
(i) SSEA-3
(ii) v-fos FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog
(iii) solute carrier family 16, member 6 (monocarboxylic acid transporter 7)
(iv) tyrosinase-related protein 1
(v) Calcium channel, voltage-dependent, P/Q type, alpha 1A subunit
(vi) chromosome 16 open reading frame 81
(vii) chitinase 3-like 1 (cartilage glycoprotein-39)
(viii) protease, serine, 35
(ix) kynureninase (L-kynurenine hydrolase)
(x) solute carrier family 16, member 6 (monocarboxylic acid transporter 7)
(xi) apolipoprotein E
(xii) synaptotagmin-like 5
(xiii) chitinase 3-like 1 (cartilage glycoprotein-39)
(xiv) ATP-binding cassette, sub-family A (ABC1), member 13
(xv) angiopoietin-like 4
(xvi) prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (prostaglandin G/H synthase and cyclooxygenase)
(xvii) stanniocalcin 1
(xviii) coiled-coil domain containing 102B
本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分は、上記因子の少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、10、11、12、13、14、15、16、17又は18が高発現していることを特徴として、少なくとも２つの因子が高発現していることを指標に単離することができる。
また、以下の２０個の因子において、ヒトES細胞に対する本発明のMuse細胞の発現量の比が高い。
(a) matrix metallopeptidase 1 (interstitial collagenase)
(b) epiregulin
(c) chitinase 3-like 1 (cartilage glycoprotein-39)
(d) Transcribed locus
(e) chitinase 3-like 1 (cartilage glycoprotein-39)
(f) serglycin
(g) MRNA full length insert cDNA clone EUROIMAGE 1913076
(h) Ras and Rab interactor 2
(i) lumican
(j) CLCA family member 2, chloride channel regulator
(k) interleukin 8
(l) Similar to LOC166075
(m) dermatopontin
(n) EGF, latrophilin and seven transmembrane domain containing 1
(o) insulin-like growth factor binding protein 1
(p) solute carrier family 16, member 4 (monocarboxylic acid transporter 5)
(q) serglycin
(r) gremlin 2, cysteine knot superfamily, homolog (Xenopus laevis)
(s) insulin-like growth factor binding protein 5
(t) sulfide quinone reductase-like (yeast)
本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分は、上記因子の少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20が高発現していることを特徴として、少なくとも２つの因子が高発現していることを指標に単離することができる。
さらに、本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分は、上記(i)〜(xviii)の因子の少なくとも２つと上記(a)〜(t)の因子の少なくとも２つが同時に高発現していてもよく、これらの遺伝子が高発現していることを指標に単離することができる。
さらに、本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分は多能性マーカー以外のオドラント（odorant）受容体（オルファクトリーレセプター; olfactory receptor）群及びケモカイン（chemokine）受容体群の因子を発現していること、すなわち特定のオドラント受容体やケモカイン受容体陽性であることを特徴とする。
本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分で発現しているオドラント受容体として例えば、以下の２２個の受容体が挙げられる。
olfactory receptor, family 8, subfamily G, member 2 (OR8G2)；
olfactory receptor, family 7, subfamily G, member 3 (OR7G3)；
olfactory receptor, family 4, subfamily D, member 5 (OR4D5)；
olfactory receptor, family 5, subfamily AP, member 2 (OR5AP2)；
olfactory receptor, family 10, subfamily H, member 4 (OR10H4)；
olfactory receptor, family 10, subfamily T, member 2 (OR10T2)；
olfactory receptor, family 2, subfamily M, member 2 (OR2M2)；
olfactory receptor, family 2, subfamily T, member 5 (OR2T5)；
olfactory receptor, family 7, subfamily D, member 4 (OR7D4)；
olfactory receptor, family 1, subfamily L, member 3 (OR1L3)；
olfactory receptor, family 4, subfamily N, member 4 (OR4N4)；
olfactory receptor, family 2, subfamily A, member 7 (OR2A7)；
guanine nucleotide binding protein (G protein), alpha activating activity polypeptide, olfactory type (GNAL)；
olfactory receptor, family 6, subfamily A, member 2 (OR6A2)；
olfactory receptor, family 2, subfamily B, member 6 (OR2B6)；
olfactory receptor, family 2, subfamily C, member 1 (OR2C1)；
olfactory receptor, family 52, subfamily A, member 1 (OR52A1)；
olfactory receptor, family 10, subfamily H, member 3 (OR10H3)；
olfactory receptor, family 10, subfamily H, member 2 (OR10H2)；
olfactory receptor, family 51, subfamily E, member 2 (OR51E2)；
olfactory receptor, family 5, subfamily P, member 2 (OR5P2)；及び
olfactory receptor, family 10, subfamily P, member 1 (OR10P1)
本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分で発現しているケモカイン受容体としては以下の５個の受容体が挙げられる。
chemokine (C-C motif) receptor 5（CCR5)；
chemokine (C-X-C motif) receptor 4（CXCR4)；
chemokine (C-C motif) receptor 1（CCR1)；
Duffy blood group, chemokine receptor(DARC)；及び
chemokine (C-X-C motif) receptor 7(CXCR7)
本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分は、上記の嗅覚受容体の少なくとも１個を発現しており、あるいは、上記のケモカイン受容体の少なくとも１個を発現している。
これらのオドラント受容体やケモカイン受容体と受容体に結合する遊走因子の作用で本発明の多能性幹細胞は、損傷組織へ遊走し、生着し、その場で分化する。例えば、肝臓、皮膚、脊髄、筋肉が損傷した場合、特定の遊走因子と細胞表面に発現しているオドラント受容体の働きで、それぞれの組織に遊走し、生着し、肝臓（内胚葉）、皮膚（外胚葉）、脊髄（外胚葉）、筋肉（中胚葉）細胞に分化し、組織を再生することができる。
さらに、本発明の多能性幹細胞であるMuse細胞が豊富に含まれる富Muse細胞画分において、Rex1、Sox２、KLF-4、c-Myc、DPPA2、ERAS、GRB7、SPAG9、TDGF1等がアップレギュレートされており、Muse細胞の細胞塊において、DAZL、DDX4、DPPA4、Stella、Hoxb1、PRDM1、SPRY2等がアップレギュレートされている。
また、本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分においては、造血幹細胞マーカーであるCD34及びCD117の発現は認めらないか又は発現が極めて低い。
さらに、本発明の多能性幹細胞は、生体の臍帯又は脂肪組織の細胞に細胞ストレスをかけ、生き残った細胞を回収することにより単離することができる。ここで、細胞ストレスとは外的ストレスをいい、プロテアーゼ処理、低酸素条件下での培養、低リン酸条件下での培養、血清飢餓状態での培養、糖飢餓状態での培養、放射線曝露下での培養、熱ショックへの曝露下での培養、有害物質存在下での培養、活性酸素存在下での培養、機械的刺激下での培養、圧力処理下での培養等によりストレスに曝露することをいう。この中でもプロテアーゼ処理、すなわちプロテアーゼ存在下での培養が好ましい。プロテアーゼは限定されず、トリプシン、キモトリプシン等のセリンプロテアーゼ、ペプシン等のアスパラギン酸プロテアーゼ、パパイン、キモパパイン等のシステインプロテアーゼ、サーモリシン等の金属プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、N-末端スレオニンプロテアーゼなどを用いることができる。プロテアーゼを培養に添加する際の添加濃度は限定されず、一般的にシャーレ等で培養した付着細胞を剥がすときに用いる濃度で用いればよい。本発明の多能性幹細胞は、上記外的ストレスに耐性を有する幹細胞、例えば、トリプシンに耐性を有する細胞ということができる。
上記の各種のストレスを受けた細胞の大部分は死滅し、生き残った細胞中に本発明の多能性幹細胞が含まれる。細胞にストレスをかけたのち、死細胞を除去する必要があるが、プロテアーゼを用いた場合は、これらの死細胞はプロテアーゼの作用により分解される。
また、細胞にストレスをかけた後に、細胞に物理的衝撃を与え壊れ易くなった細胞を除去してもよい。物理的衝撃は、例えば激しいピペッティング、激しい攪拌、ボルテックス等により与えることができる。
細胞に細胞ストレスをかけ、必要に応じて物理的衝撃を与えた後に、細胞群を遠心分離にかけ、生き残った細胞をペレットとして得て回収することにより、本発明の多能性幹細胞を単離することができる。また、このようにして得られた細胞からさらに、下記の表面マーカーを指標に本発明の多能性幹細胞又は多能性細胞画分を単離することもできる。
一例として、これらの細胞をトリプシン処理する方法について説明する。このときのトリプシン濃度は、限定されないが、例えば接着細胞の通常の培養において、培養容器に接着した接着培養を剥がすときに用いられる濃度範囲で用いればよく、0.1〜１％、好ましくは0.1〜0.5％が例示される。例えば、10〜50万個の細胞を含む生体の臍帯又は脂肪組織由来の細胞を上記濃度のトリプシン溶液５ml中でインキュベーションすることにより外的ストレスに曝すことができる。トリプシン処理時間は、５〜24時間、好ましくは５〜20時間程度である。本発明においては、８時間以上のトリプシン処理、例えば８時間又は16時間の処理を長時間トリプシン処理という。
トリプシン処理後、上記のように、ピペッティング、攪拌、ボルテックス等により物理的衝撃を与えることが望ましい。それは死んだ細胞あるいは死にかけている細胞を除去するためである。
トリプシン処理後の浮遊培養の際には細胞同士の凝集を防ぐために、例えば、メチルセルロースゲル等のゲル中でインキュベーションするのが望ましい。また、細胞の培養容器への付着を防ぎ浮遊状態を維持するために、容器をPoly(2-hydroxyethyl methacrylate)等でコートしておくことが望ましい。
外的ストレスに曝した細胞を遠心分離により集め培養を行うと細胞塊（細胞クラスター）を形成する。この細胞塊の大きさは直径25μmから150μm程度である。本発明の多能性幹細胞（Muse細胞）は、この外的ストレスに曝して生き残った細胞集団中に濃縮した状態で含まれる。この細胞集団を富Muse細胞画分(Muse enriched population）と呼ぶ。富Muse細胞画分中のMuse細胞の存在割合は、ストレス処理の方法により異なる。
このように本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分がストレスをかけた後も生存することは、本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分がストレス耐性であることを示している。
生体の臍帯又は脂肪組織由来の細胞の培養に用いる培地、培養条件は通常の動物細胞の培養で用いる培地、培養条件を採用すればよい。また、公知の幹細胞培養用培地を用いてもよい。培地には、適宜ウシ胎児血清等の血清やペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質及び種々の生理活性物質を添加してもよい。
さらに、本発明は、本発明の生体の臍帯又は脂肪組織から直接得ることができる多能性幹細胞の派生細胞又は誘導細胞である多能性幹細胞も含む。派生細胞又は誘導細胞とは前記多能性幹細胞を培養して得られる細胞又は細胞群、あるいは前記多能性幹細胞に外来遺伝子の導入等の人為的な誘導操作を行い得られる細胞をいい、子孫細胞も含む。なお、本発明時点において報告されているiPS細胞は、皮膚線維芽細胞などの生体組織の分化した細胞に外来遺伝子導入等することによりリプログラミングした結果、多能性幹細胞に誘導された細胞といわれており、本発明の臍帯又は脂肪組織由来から直接得ることができ、すでに多能性幹細胞としての性質を有する細胞に外来遺伝子導入等の人為的な誘導操作を行い得られた細胞は、iPS細胞と区別される。
本発明の多能性幹細胞を浮遊培養することにより、胚様体様(Embryoid body(EB body)-like)細胞塊が得られるが、本発明はこの胚様体様細胞塊及び胚様体様細胞塊に含まれる細胞も包含する。胚様体は、本発明の多能性幹細胞を浮遊培養することにより、細胞塊として形成される。この際、本発明においては、本発明の多能性幹細胞を培養することにより得られる胚様体をMuse細胞由来胚様体様細胞塊と呼ぶことがある（Mクラスター（M-cluster）と呼ぶこともある）。胚様体様細胞塊を形成するための浮遊培養の方法として、メチルセルロース等の水溶性ポリマーを含有した培地を用いた培養（Nakahata, T. et al., Blood 60, 352-361 (1982)）やハンギングドロップ培養（Keller,J.Physiol.(Lond)168:131-139,1998）等が挙げられる。本発明は前記胚様体様細胞塊からセルフリニューアルして得られる胚様体様細胞塊及び胚様体様細胞塊に含まれる細胞及び多能性幹細胞も包含する。ここで、セルフリニューアルとは、胚様体様細胞塊に含まれる細胞を培養し、再度胚様体様細胞塊を形成させることをいう。セルフリニューアルは１〜複数回のサイクルを繰り返せばよい。また、本発明は前記いずれかの胚様体様細胞塊及び胚様体様細胞塊に含まれる細胞から分化した細胞及び組織も包含する。
本発明は、Muse細胞のみならず、Muse細胞を濃縮した細胞集団、Muse細胞を増殖させた細胞集団、Muse細胞を分化させた細胞集団を含み、さらに、Muse細胞やMuse細胞由来の細胞を含む研究用キット、細胞チップ、治療用デバイスも含む。
本発明の多能性幹細胞は、pluripotencyを有しており、あらゆる組織へと分化し得る。該多能性幹細胞又は多能性細胞画分は、再生医療等に用いることができる。例えば、各種組織、各種器官等の再生に用いることができる。具体的には皮膚、脳脊髄、肝臓、筋肉等が挙げられる。本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分を損傷あるいは障害を受けた組織、器官等に直接あるいは近傍に投与することにより、該多能性幹細胞はその組織、器官内に侵入し、その組織特有の細胞に分化し、組織、器官の再生、再建に貢献し得る。また、静脈投与等により全身投与してもよい。この場合、該多能性幹細胞は、例えば、損傷を受けた組織や器官をホーミング等により指向し、そこに到達・侵入した上で、その組織や器官の細胞に分化し、組織、器官の再生、再建に貢献し得る。
投与は、例えば皮下注、静注、筋注、腹腔内注等の非経口投与や経口投与、あるいは胚への子宮内注射等により行うことができる。また、局所投与でも全身投与でもよい。局所投与は例えばカテーテルを利用して行うことができる。投与量は、再生しようとする器官、組織の種類や、サイズにより適宜決定することができる。
再生しようとする器官は限定されず、骨髄、脊髄、血液、脾臓、肝臓、肺、腸管、眼、脳、免疫系、循環系、骨、結合組織、筋、心臓、血管、膵臓、中枢神経系、末梢神経系、腎臓、膀胱、皮膚、上皮付属器、乳房−乳腺、脂肪組織、角膜、および口、食道、膣、肛門を含む粘膜等を含む。また、治療対象となる疾患として、癌、心血管疾患、代謝疾患、肝疾患、糖尿病、肝炎、血友病、血液系疾患、脊髄損傷等の変性または外傷性神経疾患、自己免疫疾患、遺伝的欠陥、結合組織疾患、貧血、感染症、移植拒絶、虚血、炎症、皮膚や筋肉の損傷等が挙げられる。
細胞は医薬として許容される基材と共に投与してもよい。該基材は例えばコラーゲン等でできた生体親和性が高い物質や、生分解性の物質できており、粒子状、板状、筒状、容器状等の形状とすればよく、細胞を該基材に結合させあるいは該基材中に収容して投与すればよい。
また、本発明の多能性幹細胞をin vitroで分化誘導し、さらに分化した細胞を用いて組織を構築させ、該分化した細胞又は該組織を移植してもよい。本発明の多能性幹細胞は、腫瘍化しないので、移植した前記分化した細胞又は該組織に本発明の多能性幹細胞が未分化のまま含まれていても癌化の可能性が低く安全である。これらの再生医療において、移植した細胞又は組織のレシピエントによる拒絶を避けるためには、再生医療を受けようとする患者から中胚葉系組織又は間葉系組織等を採取し、該組織から本発明の多能性幹細胞又は多能性細胞画分を単離し、利用することが望ましい。さらに、本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分を組織の変性や機能不全を原因とする疾患の治療に用いることができる。この場合、例えば、本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分をex vivoで濃縮し、増殖させ、あるいは分化させて体内に戻せばよく、例えば、多能性幹細胞を特定の組織の細胞に分化させ、該細胞を治療しようとする組織に移植すればよい。また、細胞の移植により、in situ 細胞治療を行うこともできる。この場合、対象細胞の例として、肝臓細胞、神経細胞やグリア細胞などの神経系細胞、皮膚細胞、骨格筋細胞などの筋肉細胞が挙げられ、本発明の多能性幹細胞をこれらの細胞に分化させ、移植し、in situで治療を行うことができる。該治療により、例えば、パーキンソン病、脳梗塞、脊髄損傷、筋変性疾患などを治療することができる。本発明の多能性幹細胞は、腫瘍化しないので、このような治療に用いても癌化の可能性が低く安全である。
また、本発明の多能性幹細胞を、分化させて血液や血液成分を形成させることにより、血液や血液成分をex vivo、in vitroで形成させることができる、血液成分として、赤血球、白血球、血小板等が挙げられる。このようにして形成させた血液や血液成分を、自家輸血や他家輸血に用いることができる。
上記のように、本発明の多能性幹細胞又は多能性幹細胞画分を治療に用いる場合、ex vivo、in vivo、in vitroのいずれで分化させてもよい。本発明の多能性幹細胞は、例えば、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、線維芽細胞、骨髄間質、骨格筋、平滑筋、心筋、眼、内皮、上皮、肝、膵、造血、グリア、神経細胞、稀突起膠細胞等に分化する。本発明の多能性幹細胞の分化は、分化因子の存在下で、培養することにより達成することができる。分化因子としては、塩基性繊維芽細胞成長因子（bFGF）、血管内皮成長因子（VEGF）、ジメチルスルホキシド（DMSO）およびイソプロテレノール；あるいは繊維芽細胞成長因子4（FGF4）、肝細胞成長因子（HGF）等が挙げられる。本発明は、本発明の多能性幹細胞から分化した細胞も包含する。
本発明の多能性幹細胞を治療に用いる場合、タンパク質性の抗癌物質や生理活性物質等をコードする遺伝子を導入してもよい。これにより、本発明の多能性幹細胞は、治療薬のデリバリー機能も有することになる。このような物質として例えば、抗血管新生薬が挙げられる。
本発明は、Muse細胞、Muse細胞からできた胚様体様細胞塊、及びMuse細胞や前記胚様体様細胞塊から分化させて得られた細胞若しくは組織・器官を含む、細胞移植治療用材料若しくは細胞移植治療用組成物、又は再生医療用材料若しくは再生医療用組成物を包含する。該組成物はMuse細胞、Muse細胞からできた胚様体様細胞塊、又はMuse細胞や前記胚様体様細胞塊から分化させて得られた細胞若しくは組織・器官に加えて、医薬的に許容される緩衝液や希釈液等を含む。
さらに、患者の臍帯又は脂肪組織から本発明のMuse細胞を採取し、Muse細胞を単離し、該Muse細胞を用いて種々の診断に用いることができる。例えば、Muse細胞から患者の遺伝子を採取し、遺伝子情報を得て、該情報を反映させた正確な診断が可能になる。例えば、被験体の細胞由来のMuse細胞を分化させることで、被験者と同じ遺伝子背景などの性質を持った各組織・器官の細胞を得ることができるため、疾病の診断や病態解明、薬剤の効果や副作用の診断、などに関し、各々の被験者の性質に合わせ適切な診断を行うことができる。すなわち、Muse細胞、Muse細胞からできた胚様体様細胞塊、及びMuse細胞や前記胚様体様細胞塊から分化させて得られた細胞若しくは組織・器官は診断用材料として用いることができ、例えば、本発明は、被験体からMuse細胞を単離し、該Muse細胞又はMuse細胞から分化させて得られた、被験体と同じ遺伝子背景を有する組織や器官を用いて被験体の疾病等を診断する方法を包含する。
また、Muse細胞を分化させることで体細胞を大量に得ることができるため、疾病のメカニズム解明等の基礎的研究、治療薬開発、薬剤の効果や毒性に関するスクリーニング、薬剤評価などを行うことができる。すなわち、Muse細胞、Muse細胞からできた胚様体様細胞塊、及びMuse細胞や前記胚様体様細胞塊から分化させて得られた細胞若しくは組織・器官を薬剤評価や薬剤スクリーニングの材料として用いることができる。例えば、本発明はMuse細胞を分化・増殖させ、体細胞を得て、該体細胞に候補薬剤を投与し、体細胞の応答を調べることにより、薬剤のスクリーニングや薬剤評価を行う方法を包含する。
また、種々の（例えば様々なHLA型の）Muse細胞をライブラリー化したMuse細胞バンクを構築することで、上記のMuse細胞利用場面における細胞を必要に応じて提供できる体制を実現でき、例えば、上記に挙げた目的の他、緊急に要する細胞移植治療のための拒絶反応の無い（少ない）細胞提供、などを行うことができる。すなわち、本発明は種々の遺伝子特性を有するMuse細胞を単離し、集めることにより、異なる遺伝子特性を有するMuse細胞のライブラリー、すなわちMuse細胞バンクを作製する方法を包含する。また、Muse細胞だけでなく、Muse細胞からできた胚様体様細胞塊、及びMuse細胞や前記胚様体様細胞塊から分化させて得られた細胞若しくは組織・器官を得てライブラリーやバンクを構築することもできる。本発明においては、これらのMuse細胞からできた胚様体様細胞塊、及びMuse細胞や前記胚様体様細胞塊から分化させて得られた細胞若しくは組織・器官を得てライブラリーやバンクも細胞ライブラリー又は細胞バンクと称する。本発明は、このようにして作製した細胞ライブラリー又は細胞バンクを包含する。該細胞ラブラリー又は細胞バンクは例えば、異なる遺伝的特性を有する細胞等が収納された複数のチューブ等の容器からなり、該細胞は凍結されていてもよい。例えば、被験体において、組織や器官を移植し、あるいは再生する必要が生じた場合に、上記細胞ライブラリー又は細胞バンクから、前記被験体に遺伝的背景等に関して適合した細胞を選択し、該細胞を用いて移植や再生治療を行うことができる。
本発明は、疾患の治療のために、本発明の多能性幹細胞や該細胞画分や該細胞由来の派生細胞や誘導細胞の治療上有効な量を治療を必要としている患者に投与することを含む治療方法を包含する。ここで、有効な量とは、例えば、投与する細胞数で特定することができ、疾患の種類や重篤度により適宜決定することができる。上記治療法においては、本発明の多能性幹細胞は、テラトーマ（奇形腫）を形成しないため、患者にテラトーマが形成されない。また、自己細胞由来のMuse細胞を投与する場合、患者を放射線照射や化学療法等の処置により骨髄機能を欠損させる必要はないが、自己細胞ではないMuse細胞を用いる場合は、上記処置を行えばよい。
さらに、Muse細胞は、iPS細胞(induced pluripotent stem cell）のソースとなり得る。Muse細胞をソースとしたiPS細胞の作製効率は他の細胞（例えば、SSEA-3発現を指標に分画していない皮膚線維芽細胞）をソースとした場合に比べ、はるかに（少なくとも25倍以上）高い。
Muse細胞に特定の遺伝子を導入し、あるいは特定の化合物を導入すること等により細胞形質を変化させることによりiPS細胞を作製することができる。細胞形質の変化は、リプログラミングや癌化を含み、現在知られている方法、あるいは将来的に確立されるあらゆる方法を用いることができる。
例えば、特許4182742号の記載に従って遺伝子をMuse細胞に導入し、あるいは図２７の記載に従って、Muse細胞からiPS細胞を確立することができる。また、図２７に記載の方法以外に、化学物質、外来遺伝子又は外来タンパク質を導入して、iPS細胞を樹立することが可能であるといえる。Muse細胞からのiPS細胞の確立は、例えば後述の実施例に記載の方法で行うことができる。
このようにしてMuse細胞から得られたiPS細胞をMuse由来iPS細胞（Muse-iPSC）と呼ぶことがあり、本発明は該Muse由来iPS細胞をも包含する。Muse由来iPS細胞は、Muse細胞由来の増殖性を有する多能性幹細胞ということができる。

Claims (22)

  1. 生体の臍帯又は脂肪組織から単離できるSSEA-3陽性の多能性幹細胞。
  2. CD105陽性の請求項１記載の多能性幹細胞。
  3. CD117陰性及びCD146陰性の請求項１又は２に記載の多能性幹細胞。
  4. CD117陰性、CD146陰性、NG2陰性、CD34陰性、vWF陰性及びCD271陰性の請求項１又は２に記載の多能性幹細胞。
  5. CD34陰性、CD117陰性、CD146陰性、CD271陰性、NG2陰性、vWF陰性、Sox10陰性、Snail陰性、Slug陰性、Tyrp1陰性及びDct陰性の請求項１又は２に記載の多能性幹細胞。
  6. テロメラーゼ活性が低いか又は無い、請求項１〜５のいずれか１項に記載の多能性幹細胞。
  7. 三胚葉に分化する能力を持つ、請求項１〜６のいずれか１項に記載の多能性幹細胞。
  8. 腫瘍性増殖を示さない、請求項１〜７のいずれか１項に記載の多能性幹細胞。
  9. セルフリニューアル能を持つ、請求項１〜８のいずれか１項に記載の多能性幹細胞。
  10. ストレス耐性である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の多能性幹細胞。
  11. 貪食能が高い、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の多能性幹細胞。
  12. 以下に示す２２個のオドラント受容体の少なくとも一つが陽性の請求項１〜１１のいずれか１項に記載の多能性幹細胞：
    olfactory receptor, family 8, subfamily G, member 2 (OR8G2)；
    olfactory receptor, family 7, subfamily G, member 3 (OR7G3)；
    olfactory receptor, family 4, subfamily D, member 5 (OR4D5)；
    olfactory receptor, family 5, subfamily AP, member 2 (OR5AP2)；
    olfactory receptor, family 10, subfamily H, member 4 (OR10H4)；
    olfactory receptor, family 10, subfamily T, member 2 (OR10T2)；
    olfactory receptor, family 2, subfamily M, member 2 (OR2M2)；
    olfactory receptor, family 2, subfamily T, member 5 (OR2T5)；
    olfactory receptor, family 7, subfamily D, member 4 (OR7D4)；
    olfactory receptor, family 1, subfamily L, member 3 (OR1L3)；
    olfactory receptor, family 4, subfamily N, member 4 (OR4N4)；
    olfactory receptor, family 2, subfamily A, member 7 (OR2A7)；
    guanine nucleotide binding protein (G protein), alpha activating activity polypeptide, olfactory type (GNAL)；
    olfactory receptor, family 6, subfamily A, member 2 (OR6A2)；
    olfactory receptor, family 2, subfamily B, member 6 (OR2B6)；
    olfactory receptor, family 2, subfamily C, member 1 (OR2C1)；
    olfactory receptor, family 52, subfamily A, member 1 (OR52A1)；
    olfactory receptor, family 10, subfamily H, member 3 (OR10H3)；
    olfactory receptor, family 10, subfamily H, member 2 (OR10H2)；
    olfactory receptor, family 51, subfamily E, member 2 (OR51E2)；
    olfactory receptor, family 5, subfamily P, member 2 (OR5P2)；及び
    olfactory receptor, family 10, subfamily P, member 1 (OR10P1)。
  13. 以下に示す５個のケモカイン受容体の少なくとも一つが陽性の請求項１〜１２のいずれか１項に記載の多能性幹細胞：
    chemokine (C-C motif) receptor 5（CCR5)；
    chemokine (C-X-C motif) receptor 4（CXCR4)；
    chemokine (C-C motif) receptor 1（CCR1)；
    Duffy blood group, chemokine receptor(DARC)；及び
    chemokine (C-X-C motif) receptor 7(CXCR7)。
  14. 請求項１〜１３のいずれか１項に記載の多能性幹細胞を含む細胞塊または細胞画分。
  15. 生体の臍帯又は脂肪組織から、以下の(i)〜(vi)の特性の少なくとも１つの特性を指標に多能性幹細胞又は多能性細胞画分を単離する方法：
    (i) SSEA-3陽性；
    (ii) CD105陽性；
    (iii) CD117陰性及びCD146陰性；
    (iv) CD117陰性、CD146陰性、NG2陰性、CD34陰性、vWF陰性及びCD271陰性；
    (v) CD34陰性、CD117陰性、CD146陰性、CD271陰性、NG2陰性、vWF陰性、Sox10陰性、Snail陰性、Slug陰性、Tyrp1陰性及びDct陰性；並びに
    (vi) テロメラーゼ活性が低いか又は無い。
  16. 生体の臍帯又は脂肪組織由来細胞を細胞ストレスに暴露し生き残った細胞を回収することを含む多能性幹細胞又は多能性細胞画分を単離する方法。
  17. 細胞ストレスが、プロテアーゼ処理、低酸素条件下での培養、低リン酸条件下での培養、血清飢餓状態での培養、糖飢餓状態での培養、放射線曝露下での培養、熱ショックへの曝露下での培養、有害物質存在下での培養、活性酸素存在下での培養、機械的刺激下での培養及び圧力処理下での培養から選択される、請求項１６に記載の多能性幹細胞又は多能性細胞画分を単離する方法。
  18. 細胞ストレスが、トリプシン処理である、請求項１６に記載の多能性幹細胞又は多能性細胞画分を単離する方法。
  19. 請求項１〜１３のいずれか１項に記載の多能性幹細胞の派生細胞又は誘導細胞である多能性幹細胞。
  20. 請求項１〜１３のいずれか１項に記載の多能性幹細胞の派生細胞又は誘導細胞である分化した細胞。
  21. 請求項１〜１３及び１９のいずれか１項に記載の多能性幹細胞を含む医薬組成物。
  22. 請求項２０に記載の分化した細胞を含む医薬組成物。
JP2011076635A 2009-07-15 2011-03-30 生体の臍帯又は脂肪組織から単離できる多能性幹細胞 Withdrawn JP2014132830A (ja)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2011076635A JP2014132830A (ja) 2011-03-30 2011-03-30 生体の臍帯又は脂肪組織から単離できる多能性幹細胞
PCT/JP2012/059422 WO2012133942A1 (ja) 2011-03-30 2012-03-30 生体の臍帯又は脂肪組織から単離できる多能性幹細胞
CN2012800170872A CN103459590A (zh) 2011-03-30 2012-03-30 可由机体的脐带或脂肪组织分离的多能干细胞
US13/435,703 US9399758B2 (en) 2009-07-15 2012-03-30 SSEA3(+) pluripotent stem cell that can be isolated from body tissue
US15/189,215 US11261426B2 (en) 2009-07-15 2016-06-22 Pluripotent stem cell that can be isolated from body tissue
US16/104,224 US20180355313A1 (en) 2009-07-15 2018-08-17 Pluripotent stem cell that can be isolated from body tissue

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2011076635A JP2014132830A (ja) 2011-03-30 2011-03-30 生体の臍帯又は脂肪組織から単離できる多能性幹細胞

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2014132830A true JP2014132830A (ja) 2014-07-24

Family

ID=46931615

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2011076635A Withdrawn JP2014132830A (ja) 2009-07-15 2011-03-30 生体の臍帯又は脂肪組織から単離できる多能性幹細胞

Country Status (3)

Country Link
JP (1) JP2014132830A (ja)
CN (1) CN103459590A (ja)
WO (1) WO2012133942A1 (ja)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014190150A1 (en) 2013-05-22 2014-11-27 The Regents Of The University Of California Pluripotent human adipose adult stem cells: isolation, characterization and clinical implications
CA2921948C (en) * 2013-09-04 2019-11-19 Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc. Method for preparing pluripotent stem cells
EP3643316A4 (en) * 2017-06-19 2021-01-20 National University Corporation Hokkaido University TREATMENT PRODUCTS FOR EPIDERMOLYSIS BULLOSA
JP2020167956A (ja) * 2019-04-03 2020-10-15 学校法人東京医科大学 成熟組織の製造方法、および臓器の製造方法
EP4130251A4 (en) * 2020-04-02 2024-05-08 Tohoku University HIGH POTENTIAL PLURIPOTENT STEM CELLS
CN112226406A (zh) * 2020-10-19 2021-01-15 中国医学科学院北京协和医院 一种人体血管周围脂肪组织单细胞悬液制备方法
CN115025288B (zh) * 2022-06-17 2023-06-13 中南大学湘雅医院 一种外泌体水凝胶混合体系及其制备方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7575921B2 (en) * 1999-12-30 2009-08-18 Vbi Technologies, L.L.C. Spore-like cells and uses thereof
US9550975B2 (en) * 2009-07-15 2017-01-24 Mari Dezawa SSEA-3 pluripotent stem cell isolated from body tissue

Also Published As

Publication number Publication date
WO2012133942A1 (ja) 2012-10-04
CN103459590A (zh) 2013-12-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6937821B2 (ja) 生体組織から単離できる多能性幹細胞
US11261426B2 (en) Pluripotent stem cell that can be isolated from body tissue
WO2012133948A1 (ja) 生体組織から単離できるssea-3陽性の多能性幹細胞を含む他家移植用細胞治療用組成物
WO2012133942A1 (ja) 生体の臍帯又は脂肪組織から単離できる多能性幹細胞
JP2023129719A (ja) ヒト多能性成人幹細胞

Legal Events

Date Code Title Description
A300 Withdrawal of application because of no request for examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300

Effective date: 20140805