KR102478360B1 - 인비트로로 다능성 간세포를 분화유도하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 비용과 시간을 절감하며, 보다 안전성에 뛰어난 산업응용의 가능성이 높은 세포창출기술을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명에 따르면, 다능성 간세포 또는 그 다능성 간세포가 농축된 세포획분을, 정보제시세포 유래의 상해세포 혹은 사세포 또는 그 일부와 공배양하는 것을 포함하는 인비트로에서 다능성 간세포를 정보제시세포와 같은 표현형 및 기능을 가지는 세포로 분화유도하는 방법을 제공한다.
Description
본 발명은, 인비트로로 다능성 간세포(幹細胞)를 분화유도하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은, 다능성 간세포 또는 그 다능성 간세포가 농축된 세포획분을, 정보제시세포 유래의 상해세포 및/또는 사세포(그들의 일부를 포함)와 공배양하는 것을 포함하는, 인비트로로 다능성 간세포를 정보제시세포와 같은 표현형 및 기능을 가지는 세포로 분화유도하는 방법에 관한 것이다.
최근, 다능성 간세포로부터 분화유도하는 연구가 진행되고 있고, 분화유도한 다양한 세포는, 재생의료, 창약연구, 약물안전성 시험 등의 다양한 용도로의 응용이 기대되고 있다.
재생의료에서는, 자가 또는 타가로부터 채취된 다능성 간세포 또는 뱅크 보존된 다능성 간세포, 또는 이들의 다능성 간세포로부터 분화유도한 세포를 대상질환에 이식함으로써, 질환을 치료하는 것이 시도되고 있다. 또한, 창약연구에서는, 정상인 유래의 다능성 간세포나 환자로부터 얻어진 질환특이적 다능성 간세포로부터 분화유도된 목적으로 하는 세포를 해석이나 스크리닝에 이용하여, 그 질환에 대한 신약을 개발하는 것이 기대되고 있다. 더욱이, 약물안전성 시험에서는, 개발중 혹은 개발된 의약의 독성의 스크리닝에 분화유도된 세포를 이용하는 것이 기대되고 있다.
이러한 용도로 목적으로 하는 세포를 의료 현장에서 또는 산업상 이용될 수 있게 하기 위하여, 다능성 간세포, 다능성 간세포로부터 대량으로 안정적이고 용이하게 분화유도된 세포를 얻을 필요가 있다. 다능성 간세포로부터 목적으로 하는 다양한 세포를 분화유도하는 시도가 보고되어 있는데, 분화유도과정에서 특정 유전자를 다능성 간세포로 도입하는 방법(특허문헌 1 등), 각종 사이토카인을 첨가한 배지에서 다능성 간세포를 분화시키는 방법(특허문헌 2)이 알려져 있다. 하지만, 이러한 분화유도법은, 유도순서가 복잡하고, 또한 세포를 유도하기 위하여 장기간(예를 들어, 수주간) 걸리기 때문에, 용이한 수법이라고는 할 수 없으며, 더욱이 비용도 매우 불어난다.
그 한편으로, 사이토카인을 사용하지 않고 심근세포를 분화유도하는 방법도 제안되어 있다(비특허문헌 1). 이러한 제안에서는, 피더-레스(feeder-less) 배양 후, 단세포로 단리하고, 그 후에 고밀도로 파종하여, 접착배양하고 있다. 하지만, 피더-레스 배양에 순화할 수 있는 세포가 아니라면 분화시키는 것이 어렵다는 문제가 있다.
또한, 분화유도의 전제가 되는 다능성 간세포의 하나로서는, 본 발명자들의 한 사람인 데자와에 의하여 발견된, 간엽계 세포획분에 존재하는 SSEA-3(Stage-Specific Embryonic Antigen-3)을 표면항원으로서 발현하고 있는 Muse(Multilineage-differentiating Stress Enduring cells)가 전형예로서 거론된다(특허문헌 3; 비특허문헌 2). Muse 세포는, 다른 다능성 간세포로서 알려지는 인공 다능성 간세포(iPS 세포), 배성 간세포(ES 세포), 신경간/전구세포(NSPC), 제대혈 간세포(UCBC)와는 달리, 세포의 조달이 용이하며, iPS 세포와 같이 그 조달을 위한 유전자 도입을 필요로 하지 않아, 종양형성능을 가지지 않는다.
Muse 세포의 재생의료에 있어서의 공헌은, 지금까지 많이 알려져 왔고, 심근경색, 뇌종양, 뇌경색, 신장병 등의 치료에서 발견할 수 있다(특허문헌 4 등). 예를 들어, 심근경색의 치료에 있어서는, Muse 세포를 정맥으로부터 주입하고, Muse 세포가 경색부위에 도달하여, 심근세포로 분화함으로써 심근경색의 치료가 달성되는 것이 판명되어 있다. 한편, 정맥에 투여된 Muse 세포가 질환부위에 유주하는 메커니즘도 서서히 알려지고 있으며, 예를 들어 질환부위로부터 방출되고 있다고 생각되는 SIP1 등의 유주인자(상해 시그널)가 관여하고 있는 것이 시사되어 있다(특허문헌 5). 하지만, Muse 세포가 질환부위의 조직을 구성하는 세포로 분화하는 상세한 메커니즘은 해명되어 있지 않다.
Muse 세포에 대하여 말하자면, 이러한 세포를 이용한 질환의 치료는, 상해부위로부터 상해 시그널을 발하는 심근경색 등의 급성질환에 있어서의 경우와 같은 세포장해와 그것에 수반하는 염증반응이 일어나고 있는데 상해를 입은 세포나 그 일부가 아직 그곳에 남아 있는 상태, 즉 '장이론(field theory)'이 발생하고 있는 Muse 세포의 투여, 유주, 및 분화라고 하는 일련의 흐름에 의하여 치료를 가능하게 하는 전략이라고 할 수 있다. 하지만, 장애 시그널의 방출이 낮고 '장이론'이 이미 소실되어 있는 만성질환이나 혈관을 통한 도달이 어려운 조직이나 장기, 또는 희소세포의 재생에는, 상기와 같은 Muse 세포의 혈관내 투여에 따른 것만으로는 달성되지 않는 경우가 많다. 그래서, 인비트로에 있어서, Muse 세포 등의 다능성 간세포로부터 대량으로, 안정적으로, 쉽게, 그리고 낮은 비용으로 분화유도하여, 원하는 세포를 얻을 수 있다면, 재생의료, 창약연구, 약물안정성 시험 등의 다양한 용도로 더욱 더 응용할 수 있게 된다.
비특허문헌 1: Yang L, et al., Nature, Vol.453, p.524-528(2008)
비특허문헌 2: Wakao, S, et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.108, p.9875-9880(2011)
기존에 알려져 있는 다능성 간세포를 각종 세포로 분화시키는 방법은, 다단계의 분화유도를 거칠 필요가 있어, 균일하고 대량으로 원하는 세포를 단기간에 조제하는 것은 어렵다. 또한, 외래의 유전자가 도입된 iPS 세포로부터 분화한 세포에서는 종양화하는 등의 가능성도 부정할 수 없다. 따라서, 본 발명은, 균일하고 고기능의 각종 분화세포를 쉽고 효율적으로 조제하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 인비트로에 있어서, Muse 세포가 탐식성을 가지는 것, 및 상해세포 또는 사세포(그들의 일부를 포함)를 탐식하는 것에 의하여 이들의 세포로 분화하는 것을 발견하고, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.
즉, 본 발명은, 이하와 같다.
[1] 다능성 간세포 또는 그 다능성 간세포가 농축된 세포획분을, 정보제시세포 유래의 상해세포, 사세포, 및/또는 그 일부와 공배양하는 것을 포함하는, 인비트로에서 다능성 간세포를 정보제시세포와 같은 표현형 및 기능을 가지는 세포로 분화유도하는 방법.
[2] 상기 [1]에 있어서, 다능성 간세포가 정보제시세포 유래의 상해세포, 사세포, 및/또는 그 일부를 탐식하는 것을 특징으로 하는 방법.
[3] 상기 [1] 또는 [2]에 있어서, 상기 다능성 간세포가, 생체의 간엽계 조직 또는 배양간엽계 세포로부터 분리된 SSEA-3 양성세포인 방법.
[4] 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 있어서, 상기 다능성 간세포가 CD105 양성인 방법.
[5] 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 있어서, 상기 다능성 간세포가 CD117 음성 및 CD146 음성인 방법.
[6] 상기 [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 있어서, 상기 다능성 간세포가 CD117 음성, CD146 음성, NG2 음성, CD34 음성, vWF 음성, 및 CD271 음성인 방법.
[7] 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 있어서, 상기 다능성 간세포가 CD34 음성, CD117 음성, CD146 음성, CD271 음성, NG2 음성, vWF 음성, Sox10 음성, Snai1 음성, Slug 음성, Tyrp1 음성, 및 Dct 음성인 방법.
[8] 상기 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 있어서, 상기 다능성 간세포가, 이하의 성질 모두를 가지는 다능성 간세포인 방법:
(i) 텔로머레이스 활성이 낮거나 또는 없음;
(ii) 삼배엽 중 어느 배엽의 세포로 분화하는 능력을 가짐;
(iii) 종양성증식을 나타내지 않음; 및
(iv) 셀프리뉴얼능을 가짐.
[9] 상기 [1] 내지 [8] 중 어느 하나에 있어서, 다능성 간세포의 수와 정보제시세포 유래의 상해세포 또는 사세포의 수의 비가 1:10,000~10,000:1인 방법.
[10] 상기 [1] 내지 [9] 중 어느 하나에 있어서, 정보제시세포 유래의 상해세포, 사세포, 및/또는 그 일부가, 아포토시스 유도제, 대사길항약, 알킬화제, 안트라사이클린, 항생물질, 유계분열저해제, 토포이소머라아제 저해제, 프로테아좀 저해제, 항암제, 열, 저온, 산, 알칼리, 초음파, 및 볼텍스 등에 따른 물리적 파쇄로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 약제의 첨가에 의하여 얻어진 것인 방법.
[11] 상기 [1] 내지 [10] 중 어느 하나에 있어서, 정보제시세포가 외배엽 유래세포인 방법.
[12] 상기 [11]에 있어서, 외배엽 유래세포가, 신경세포, 글리아세포, 색소세포, 피부세포, 내이세포, 망막세포, 각막세포, 및 모근세포로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 방법.
[13] 상기 [1] 내지 [10] 중 어느 하나에 있어서, 정보제시세포가 중배엽 유래세포인 방법.
[14] 상기 [13]에 있어서, 중배엽 유래세포가, 심근세포, 골격근세포, 평활근세포, 골세포, 연골세포, 생식계세포, 및 조혈계세포로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 방법.
[15] 상기 [1] 내지 [10] 중 어느 하나에 있어서, 정보제시세포가 내배엽 유래세포인 방법.
[16] 상기 [15]에 있어서, 내배엽 유래세포가, 췌장β세포, 간세포, 담관세포, 호흡기계 상피세포, 소화관 상피세포, 혈관 내피세포, 신장 구성세포, 방광 상피세포, 및 췌장 외분비세포로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 방법.
[17] 상기 [1] 내지 [10] 중 어느 하나에 있어서, 정보제시세포가 희소세포인 방법.
[18] 상기 [17]에 있어서, 상기 희소세포가, 운동뉴런, 도파민신경, 개재뉴런, 글루타민 작동성 뉴런, 뇌하수체세포, 갑상선세포, 부신피질, 부신속질, 경동맥의 압력센서세포, 심장자극전달계, 맥락망막 상피세포, 췌장-α세포, 췌장-δ세포, 및 폐클라라세포로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 방법.
[19] 인비트로에 있어서 세포제제 내에 함유되는 세포가, 생존하는 다능성 간세포인 것을 확인하기 위한 방법으로서,
(a) 세포제제 내의 세포와, 상해세포, 사세포, 및/또는 그 일부를 공배양하고; 및
(b) 그 세포제제 내의 세포가, 상해세포, 사세포, 및/또는 그 일부에 유래하는 외배엽계 세포, 중배엽계 세포 및/또는 내배엽계 세포와 같은 표현형 및 기능을 가지는 세포로 분화한 경우, 그 세포제제 중에 다능성 간세포가 생존하고 있다고 판단하는 것을 포함하는 상기 방법.
[20] 다능성 간세포 또는 그 다능성 간세포가 농축된 세포획분을, 정보제시세포 유래의 상해세포, 사세포, 및/또는 그 일부와 공배양하는 것을 포함하는, 인비트로에서 다능성 간세포로부터 정보제시세포와 같은 표현형 및 기능을 가지는 세포를 제조하는 방법.
본 발명에 따르면, 다능성 간세포를 정보제시세포 유래의 상해세포, 사세포, 및/또는 그 일부와 공배양시킴으로써, 상해세포 또는 사세포가 기원으로 하는 정보제시세포를 다능성 간세포로부터 쉽게 분화시켜 얻을 수 있다. 이렇게 하여서 얻어진 분화세포는, 재생의료, 창약연구, 약물안전성 시험 등의 다양한 용도로의 응용이 가능하다.
도 1은 정상 마우스 심근세포를 이용한 분화유도에 대하여 검증한 결과를 나타낸다. 도 1의 (a) 및 (b)는, 각각 Muse 세포를 정상 마우스 심근세포로부터 얻은 배양상청 또는 엑소좀을 배양계에 첨가한 경우의 각종 마커의 mRNA 발현을 검출한 결과이다. 도 1의 (c)는, Muse 세포에 정상 마우스 심근세포를 직접 접촉시킨 경우의 mRNA 발현을 검토한 결과이다. 도 1의 (d)는, 직접 접촉에 의한 배양 3일 후 및 7일 후에 GATA-4의 발현의 유무를 면역염색에 의하여 검토하고, 형광현미경 하에서 관찰한 결과이다.
도 2는, 상해 마우스 심근세포를 이용한 분화유도에 대하여 검증한 결과를 나타낸다. Muse 세포를 상해 마우스 심근세포로부터 얻어진 배양상청 또는 엑소좀을 배양계에 첨가한 경우의 각종 마커의 mRNA 발현을 검출한 결과이다(각각 도 2의 (a) 및 (b)).
도 3은, Muse 세포의 탐식성을 검증한 결과를 나타낸다. 탐식성을 검증하기 위하여 PKH26PCL(적색)을 이용하였다.
도 4는, 상해심근세포에 대한 Muse 세포의 탐식성을 나타낸다. 아포토시스를 일으킨 GFP 마우스 심근세포와 공배양한 Muse 세포는, 붕괴된 심근세포의 일부(녹색)를 Muse 세포 내(적색)에 포함하고 있다.
도 5는, 심근세포로의 분화유도를 나타낸다. 도 3과 마찬가지로, 아포토시스를 일으킨 GFP 마우스 심근세포와 공배양한 Muse 세포가, 심근세포로 분화유도되는 모습을 각종 심근마커의 발현에 대하여 형광현미경 하에서 관찰한 결과를 나타낸다.
도 6은, 아넥신 V에 의한 탐식저해에 따른 분화유도 억제의 결과를 나타낸다.
도 7은, 골격근세포로의 분화유도를 나타내는 결과이다. 도 7의 (a)는, Muse 세포(녹색)가 골격근세포의 마커인 미오게닌(적색)을 발현하고 있는 것을 나타낸 형광현미경에 의한 화상이다. 도 7의 (b)는, MyoD를 지표로 하여서 Muse 세포가 골격근세포로 분화한 것을 나타낸다.
도 8은, 신경전구세포로의 분화유도를 나타내는 결과이다. Neuro2A를 지표로 하여서 Muse 세포가 신경세포로 분화한 것을 나타낸다.
도 9는, β세포로의 분화유도를 나타내는 결과이다. 전구세포마커(Nkx2.2와 NeuroD1) 및 성숙β세포마커(Islet1)를 지표로 하여서 Muse 세포가 β세포로 분화한 것을 나타낸다.
도 10은, 간세포로의 분화유도를 나타내는 결과이다. AFP를 지표로 하여서 Muse 세포가 간세포로 분화한 것을 나타낸다.
도 2는, 상해 마우스 심근세포를 이용한 분화유도에 대하여 검증한 결과를 나타낸다. Muse 세포를 상해 마우스 심근세포로부터 얻어진 배양상청 또는 엑소좀을 배양계에 첨가한 경우의 각종 마커의 mRNA 발현을 검출한 결과이다(각각 도 2의 (a) 및 (b)).
도 3은, Muse 세포의 탐식성을 검증한 결과를 나타낸다. 탐식성을 검증하기 위하여 PKH26PCL(적색)을 이용하였다.
도 4는, 상해심근세포에 대한 Muse 세포의 탐식성을 나타낸다. 아포토시스를 일으킨 GFP 마우스 심근세포와 공배양한 Muse 세포는, 붕괴된 심근세포의 일부(녹색)를 Muse 세포 내(적색)에 포함하고 있다.
도 5는, 심근세포로의 분화유도를 나타낸다. 도 3과 마찬가지로, 아포토시스를 일으킨 GFP 마우스 심근세포와 공배양한 Muse 세포가, 심근세포로 분화유도되는 모습을 각종 심근마커의 발현에 대하여 형광현미경 하에서 관찰한 결과를 나타낸다.
도 6은, 아넥신 V에 의한 탐식저해에 따른 분화유도 억제의 결과를 나타낸다.
도 7은, 골격근세포로의 분화유도를 나타내는 결과이다. 도 7의 (a)는, Muse 세포(녹색)가 골격근세포의 마커인 미오게닌(적색)을 발현하고 있는 것을 나타낸 형광현미경에 의한 화상이다. 도 7의 (b)는, MyoD를 지표로 하여서 Muse 세포가 골격근세포로 분화한 것을 나타낸다.
도 8은, 신경전구세포로의 분화유도를 나타내는 결과이다. Neuro2A를 지표로 하여서 Muse 세포가 신경세포로 분화한 것을 나타낸다.
도 9는, β세포로의 분화유도를 나타내는 결과이다. 전구세포마커(Nkx2.2와 NeuroD1) 및 성숙β세포마커(Islet1)를 지표로 하여서 Muse 세포가 β세포로 분화한 것을 나타낸다.
도 10은, 간세포로의 분화유도를 나타내는 결과이다. AFP를 지표로 하여서 Muse 세포가 간세포로 분화한 것을 나타낸다.
본 발명은, 인비트로에서 다능성 간세포를 분화유도하는 방법으로서, 다능성 간세포를 상해세포 또는 사세포와 공배양시킴으로써, 상해세포 또는 사세포의 기원이 되는 세포와 같은 표현형 및 기능을 가지는 세포를 얻는 방법에 관한 것이다. 본 발명을 이하에 설명한다.
본 발명은, 다능성 간세포 또는 그 다능성 간세포가 농축된 세포획분을, 정보제시세포 유래의 상해세포, 사세포, 및/또는 그 일부와 공배양하는 것을 포함하는, 인비트로에서 다능성 간세포를 정보제시세포로 분화유도하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 다능성 간세포는, 공배양 중인 상해세포, 사세포, 및/또는 그 일부를 탐식함으로써, 상해세포 등이 유래하는 원래의 정보제시세포와 같은 표현형 및 기능을 가지는 세포로 분화할 수 있다. 다능성 간세포, 특히 Muse 세포의 탐식성에 대하여는, 이제까지 Muse 세포는 페라이트(자성체)를 탐식하는 것은 알려져 있지만(일본공개특허공보 2016-028614), Muse 세포가 정보인식세포로서, 정보제시세포인 상해세포 등을 탐식하는 것에 의하여 분화하는 것은 알려져 있지 않다. 상기와 같이, 본 발명은 Muse 세포가 상해세포 등을 탐식함으로써, 상해세포 등의 기원이 되는 원래의 정보제시세포로 분화할 수 있는 것을 처음으로 발견한 것에 근거하고 있다. 이와 같은 다능성 간세포의 탐식성을 이용한 인비트로에서의 분화유도화는, 다능성 간세포를 상해세포 등과 단순히 공배양함으로써 달성되는데, 상해세포 등을 얻는 방법 및 공배양하는 방법은, 당업자가 통상 행하고 있는 수법에 근거하여 쉽게 이루어지는 것일 수 있고, 한정되지 않는다.
일 실시형태에서는, 본 발명은,
(a) 정보제시세포를 배양하는 공정;
(b) 상기 배양계에서 정보제시세포를 상해 또는 사멸시키는 공정; 및
(c) 다능성 간세포를 공정 (b)의 배양계에 첨가하고, 배양하는 공정
을 포함하는 다능성 간세포를 인비트로에서 분화유도하는 방법이어도 좋다.
또한, 다른 실시형태에서는, 본 발명은,
(a') 다능성 간세포를 배양하는 공정; 및
(b') 정보제시세포를 상해 또는 사멸시키고, 상해세포, 사세포, 및/또는 그 일부를 얻는 공정; 및
(c') 공정 (a)의 배양계에 공정 (b)에서 얻어진 상해세포, 사세포, 및/또는 그 일부를 첨가하여, 배양하는 공정
을 포함하는 다능성 간세포 인비트로에서 분화유도하는 방법이어도 좋다.
(1) 다능성 간세포
본 발명의 분화유도법에 사용되는 다능성 간세포는, 전형적으로는, 본 발명자들 중 한 사람인 데자와가, 인간 생체 내에 그 존재를 발견하고, 'Muse(Multilineage-differentiating Stress Enduring)세포'라고 명명한 세포이다. Muse 세포는, 골수액, 지방조직(Ogura, F., et al., Stem Cells Dev., Nov 20, 2013(published on Jan 17, 2014))이나 진피결합조직 등의 피부조직으로부터 얻을 수 있고, 각 장기의 결합조직에도 산재한다. 또한, 이러한 세포는, 다능성 간세포와 간엽계간세포의 양쪽의 성질을 가지는 세포이고, 예를 들어 각각의 세포표면마커인 'SSEA-3(Stage-specific embryonic antigen-3)'과 'CD105'의 더블양성으로서 동정된다. 따라서, Muse 세포 또는 Muse 세포를 포함하는 세포집단은, 예를 들어 이들의 항원마커를 지표로서 생체조직으로부터 분리할 수 있다. 또한, Muse 세포는 스트레스 내성으로, 간엽계조직 또는 배양간엽계 세포로부터 다양한 스트레스 자극에 의하여 농축할 수 있다. 본 발명의 분화유도법에는, 스트레스 자극에 의하여 Muse 세포가 농축된 세포획분을 이용할 수도 있다. Muse 세포의 분리법, 동정법, 및 특징 등의 상세는, 국제공고공보 WO2011/007900호에 개시되어 있다. 또한, Wakao 등(2011, 상술)에 의하여 보고되어 있는 바와 같이, 골수, 피부 등으로부터 간엽계게포를 배양하고, 그것을 Muse 세포의 모집단으로서 이용하는 경우, SSEA-3 양성 세포의 모두가 CD105 양성세포인 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르면, 생체의 간엽계조직 또는 배양간엽계간세포로부터 Muse 세포를 분리하는 경우는, 단순히 SSEA-3을 항원마커로서 Muse 세포를 정제하여, 사용할 수 있다. 한편, 본 명세서에 있어서는, 본 발명의 분화유도법에 있어서 사용될 수 있는 SSEA-3을 항원마커로서, 생체의 간엽계조직 또는 배양간엽계 세포로부터 분리된 다능성 간세포(Muse 세포) 또는 Muse 세포를 포함하는 세포집단을 단순히 'SSEA-3 양성세포'로 기재하는 경우가 있다. 또한, 본 명세서에 있어서는, '비Muse 세포'란, 생체의 간엽계조직 또는 배양간엽계 세포에 포함되는 세포로서, 'SSEA-3 양성세포' 이외의 세포를 가리킨다.
간단하게는, Muse 세포 또는 Muse 세포를 포함하는 세포집단은, 세포표면마커인 SSEA-3에 대한 항체를 단독으로 이용하고, 또는 SSEA-3 및 CD105에 대한 각각의 항체를 모두 이용하며, 생체조직(예를 들어, 간엽계조직)으로부터 분리할 수 있다. 여기에서, '생체'란, 포유동물의 생체를 말한다. 본 발명에 있어서, 생체에는, 수정란이나 포배기보다 발생단계가 앞인 배아는 포함되지 않지만, 태아나 포배를 포함하는 포배기 이후의 발생단계의 배아는 포함된다. 포유동물에는, 한정되지 않지만, 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트, 토끼, 모르모트 등의 설치류, 고양이, 개, 양, 돼지, 소, 말, 당나귀, 염소, 페렛 등을 들 수 있다. 본 발명의 분화유도법에 사용되는 Muse 세포는, 생체의 조직으로부터 직접 마커를 이용하여 분리되는 점에서, 배성간세포(ES세포)나 iPS세포로 명확하게 구별된다. 또한, '간엽계조직'이란, 뼈, 활막, 지방, 혈액, 골수, 골격근, 진피, 인대, 힘줄, 치수, 제대, 제대혈 등의 조직 및 각종 장기에 존재하는 조직을 말한다. 예를 들어, Muse 세포는, 골수나 피부, 지방조직으로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 생체의 간엽계조직을 채취하고, 이 조직으로부터 Muse 세포를 분리하여 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 분리수단을 이용하여, 섬유아세포나 골수간엽계간세포 등의 배양간엽계세포로부터 Muse 세포를 분리하여도 좋다. 본 발명의 분화유도법에 있어서는, 사용되는 Muse 세포는, 리시피엔트에 대하여 자가여도 좋고, 또는 타가여도 좋다.
상기와 같이, Muse 세포 또는 Muse 세포를 포함하는 세포집단은, 예를 들어 SSEA-3 양성, 및 SSEA-3과 CD105의 이중양성을 지표로 하여 생체조직으로부터 분리할 수 있는데, 인간 성인 피부에는, 다양한 타입의 간세포 및 전구세포를 포함하는 것이 알려져 있다. 하지만, Muse 세포는, 이들 세포와 같지 않다. 이와 같은 간세포 및 전구세포에는 피부유래 전구세포(SKP), 신경제간세포(NCSC), 멜라노블라스트(MB), 혈관주위세포(PC), 내피전구세포(EP), 지방유래간세포(ADSC)를 들 수 있다. 이러한 세포에 고유 마커의 '비발현'을 지표로 하여, Muse 세포를 분리할 수 있다. 보다 구체적으로는, Muse 세포는, CD34(EP 및 ADSC의 마커), CD117(c-kit)(MB의 마커), CD146(PC 및 ADSC의 마커), CD271(NGFR)(NCSC의 마커), NG2(PC의 마커), vWF인자(폰빌레브란트 인자)(EP의 마커), Sox10(NCSC의 마커), Snai1(SKP의 마커), Slug(SKP의 마커), Tyrp1(MB의 마커), 및 Dct(MB의 마커)로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 11개의 마커 중 적어도 1개, 예를 들어 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 11개의 마커의 비발현을 지표로 분리할 수 있다. 예를 들어, 한정되지 않지만, CD117 및 CD146의 비발현을 지표로 분리할 수 있으며, 더욱이 CD117, CD146, NG2, CD34, vWF 및 CD271의 비발현을 지표로 분리할 수 있고, 더욱이 상기 11개의 마커의 비발현을 지표로 분리할 수 있다.
또한, 본 발명의 분화유도법에 사용되는 상기 특징을 가지는 Muse 세포는, 이하:
(i) 텔로머레이스 활성이 낮거나 또는 없음;
(ii) 삼배엽 중 어느 배엽의 세포로 분화하는 능력을 가짐;
(iii) 종양성증식을 나타내지 않음; 및
(iv) 셀프리뉴얼능을 가짐
으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 성질을 가져도 좋다. 본 발명의 일 국면에서는, 본 발명의 분화유도법에 사용되는 Muse 세포는, 상기 성질을 모두 갖는다. 여기에서, 상기 (i)에 대하여, '텔로머레이스 활성이 낮거나 또는 없음'이란, 예를 들어 TRAPEZE XL telomerase detection kit(Millipore사)를 이용하여 텔로머레이스 활성을 검출한 경우에, 낮거나 또는 검출할 수 없는 것을 말한다. 텔로머레이스 활성이 '낮다'란, 예를 들어 체세포인 인간섬유아세포와 같은 정도의 텔로머레이스 활성을 가지고 있거나, 또는 Hela세포에 비하여 1/5 이하, 바람직하게는 1/10 이하의 텔로머레이스 활성을 가지고 있는 것을 말한다. 상기 (ii)에 대하여, Muse 세포는, in vitro 및 in vivo에 있어서, 삼배엽(내배엽계, 중배엽계, 및 외배엽계)으로 분화하는 능력을 가지고, 예를 들어 in vitro에서 유도배양함으로써, 간세포, 신경세포, 골격근세포, 평활근세포, 골세포, 지방세포 등으로 분화할 수 있다. 또한, in vivo에서 정소로 이식한 경우에도 삼배엽으로 분화하는 능력을 나타내는 경우가 있다. 더욱이, 정맥주사에 의하여 생체에 이식함으로써 손상을 받은 장기(심장, 피부, 척수, 간, 근육 등)에 유주 및 생착하여, 조직에 따른 세포로 분화하는 능력을 가진다. 상기 (iii)에 대하여, Muse 세포는, 부유배양에서는 증식속도 약 1.3일로 증식하는데, 부유배양에서는 1세포로부터 증식하고, 배양체양세포 덩어리를 만들어 14일간 정도에서 증식이 멈춘다,라고 하는 성질을 가지는데, 이들 배양체양세포 덩어리를 접착배양으로 가지고 가면, 다시 세포증식이 개시되어, 세포 덩어리로부터 증식한 세포가 확산되어 간다. 더욱이, 정소로 이식한 경우, 적어도 반년 동안은 암화하지 않는다는 성질을 가진다. 또한, 상기 (iv)에 대하여, Muse 세포는, 셀프리뉴얼(자기복제)능을 가진다. 여기에서, '셀프리뉴얼'이란, 1개의 Muse 세포로부터 부유배양으로 배양함으로써 얻어지는 배양체양세포 덩어리에 포함되는 세포로부터 3배엽성의 세포로의 분화를 확인할 수 있는 동시에, 배양체양세포 덩어리의 세포를 다시 1세포로 부유배양으로 가지고 감으로써, 다음 세대의 배양체양세포 덩어리를 형성시키고, 거기에서 다시 3배엽성의 분화와 부유배양에서의 배양체양세포 덩어리를 확인할 수 있는 것을 말한다. 셀프리뉴얼은 1회 또는 복수회의 사이클을 반복하면 좋다.
또한, 본 발명의 분화유도법에 사용되는 Muse 세포를 포함하는 세포획분은, 생체의 간엽계조직 또는 배양간엽계세포에 외적 스트레스 자극을 주고, 스트레스 내성인 세포를 회수하는 것을 포함하는 방법에 의하여 얻어지는 이하의 성질의 적어도 하나, 바람직하게는 모두를 가지는 SSEA-3 양성 및 CD105 양성의 다능성 간세포가 농축된 세포획분이어도 좋다.
(i) SSEA-3 양성;
(ii) CD105 양성;
(iii) 텔로머레이스 활성이 낮거나 또는 없음;
(iv) 삼배엽으로 분화하는 능력을 가짐;
(v) 종양성증식을 나타내지 않음; 및
(vi) 셀프리뉴얼능을 가짐.
상기 외적 스트레는, 프로테아제 처리, 저산소 농도에서의 배양, 저인산 조건 하에서의 배양, 저혈청 농도에서의 배양, 저영양 조건에서의 배양, 열쇼크로의 폭로 하에서의 배양, 저온에서의 배양, 동결처리, 유해물질 존재 하에서의 배양, 활성산소 존재 하에서의 배양, 기계적 자극 하에서의 배양, 진동처리 하에서의 배양, 압력처리 하에서의 배양 또는 물리적 충격 중 어느 것 또는 복수의 조합이어도 좋다. 예를 들어, 상기 프로테아제에 의한 처리시간은, 세포에 외적 스트레스를 주기 위하여 합계 0.5~36시간 행하는 것이 바람직하다. 또한, 프로테아제 농도는, 배양용기에 접착한 세포를 벗길 때, 세포 덩어리를 단일세로포 각각으로 할 때, 또는 조직으로부터 단일세포를 회수할 때에 이용되는 농도라면 좋다. 프로테아제는, 세린프로테아제, 아스파라긴산 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 금속 프로테아제, 글루타민산 프로테아제 또는 N말단 트레오닌 프로테아제인 것이 바람직하다. 더욱이, 상기 프로테아제가 트리프신, 콜라게나아제 또는 디스파아제인 것이 바람직하다.
(2) 정보제시세포
본 발명의 인비트로 분화유도법에 있어서 사용되는 '정보제시세포'란, 다능성 간세포로부터 최종적으로 분화한 상태에 있는 세포와 같은 표현형 및 기능특성을 가지고, 분화유도되기 전의 세포로서, 상해세포 또는 사세포의 디원이 되는 세포를 의미한다. 본 발명에 있어서 사용되는 정보제시세포는, 다능성 간세포로부터 원하는 분화세포를 얻을 수 있다면, 그 기원은 어느 것이어도 좋다. 예를 들어, 세포의 기원은, 그 목적에 따라서, 다양한 포유동물을 기원으로 하여도 좋고, 한정되지 않지만, 인간, 침팬지, 그 밖의 영장류, 가축동물, 예를 들어 개, 고양이, 축산동물, 예를 들어 소, 돼지, 말, 양, 염소, 실험용동물, 예를 들어 토끼, 래트, 마우스 모르모트 등에 유래한다.
(3) 상해세포 및 사세포
본 발명에 따르면, 다능성 간세포를 원하는 세포로 분화시키기 위하여 사용되는 상해세포 또는 사세포는, 상기 정보제시세포를 기원으로 할 수 있다. 본 명세서에서 사용할 때, 용어 '상해세포'란, 예를 들어 인위적 스트레스 또는 환경적 스트레스에 의하여 상해를 받기 때문에, 일반적으로 적합한 배양조건에 의하여 배양한 경우라도, 증식이 어렵지만, 그 세포가 가지는 대사활성은, 생세포와 비교하면 저하되어 있지만, 사세포와 비교하면 유의하게 활성을 가지는 상태의 세포를 말한다. 본 명세서에서 사용할 때, 용어 '사세포'란, 적합한 배양조건에 의하여 배양한 경우라도 증식이 불가능하며, 대사활성을 나타내지 않는 상태의 세포를 말한다. '사세포'는, 네크로시스에 의한 사세포 또는 아포토시스에 의한 사세포 중 어느 것이어도 좋다. 한편, 본 발명에 따르면, 다능성 간세포의 탐식성은, 상기 장해세포나 사세포로 한정되지 않으며, 그들의 일부(예를 들어, 세포질, 세포막, 핵, 미토콘드리아, 골지체, 소포체, 세포질에 포함되는 세포골격, 효소, 단백, RNA, DNA) 또는 세포의 파쇄물에 대하여도 나타날 수 있다.
정보제시세포로부터 상해세포, 사세포, 및/또는 그 일부를 얻는 방법은, 한정되지 않지만, 통상 사용되는 방법에 준하여 행할 수 있다. 상해세포를 제작하는 경우에는, 예를 들어 당해 기술분야에 있어서 알려져 있는 바와 같은 세포의 증식을 저해하는 약제를 이용할 수 있다. 이와 같은 약제로서는, 한정되지 않지만, S기에 있어서의 세포의 백분율을 유의하게 저감시키는 것을 들 수 있고, 전형적으로는, 세포분열동기의 진행을 블로킹하는 약제, 예를 들어 G1 정지 또는 M기 정지를 유발하는 약제 등이 포함된다. 상해세포를 제작하기 위하여 사용될 수 있는 시약의 구체예로서는, 대사길항약/항암제(예를 들어, 아자티오프린, 6-메르캅토프린, 6-티오구아닌, 플루다라빈, 펜토스타틴, 클라드리빈, 5-플루오로우라실(5FU), 플록스우리딘(FUDR), 사이토신 아라비노사이드(시타라빈), 메토트렉세이트, 트리메소프림, 피리메타민, 페메트렉시드, 카페시타빈, 젬시타빈, 시타라빈); 알킬화제(예를 들어, 시클로포스파미드, 메클로레타민, 우라무스틴, 멜팔란, 클로람부실, 티오테파/클로람부실, 이포스파마이드, 카르무스틴, 로무스틴, 스트렙토조신, 부설판, 디브로모만니톨, 시스플라틴, 카보플라틴, 네다플라틴, 옥살리플라틴, 사트라플라틴, 트리플라틴테트라니트레이트, 프로카바진, 알트레타민, 디카바진, 미토졸로마이드, 테모졸로미드); 안트라사이클린(예를 들어, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 아이다루비신, 발루비신); 항생물질(예를 들어, 닥티노마이신, 블레오마이신, 미스라마이신, 안트라마이신, 스트렙토조토신, 그라미시딘D, 마이토마이신류(예를 들어, 마이토마이신C), 듀오카르마이신류(예를 들어, CC-1065), 칼리키아미신류); 유계분역저해제(메이탄시노이드류, 아우린스타틴류, 돌라스타틴류, 크립토파이신류, 빈카알칼로이드(예를 들어, 빈크라스틴, 빈블라스틴, 빈데실, 비노렐빈), 탁산류(예를 들어, 파클리탁셀, 도세탁셀), 및 콜히친류; 토포아이소머레이스 저해제(예를 들어, 이리노테칸, 토포테칸, 암사크린, 에토포시드, 테니포시드, 미잔토론); 및 프로테아솜 저해제(예를 들어, 펩티딜보론산)를 들 수 있다. 한편, 이들 시약의 사용에 있어서는, 시약의 농도나 사용방법, 더욱이 배양조건 등은 통상 행하여지고 있는 바와 같으며, 당업자라면 적절히 결정할 수 있다. 예를 들어, 상기 시약을 이용하는 경우, 상해세포를 얻기에 적합한 농도로서는, 사용하는 시약의 종류에 따라서 변경 가능하지만, 1~100μM이 바람직하다.
다른 실시형태에서는, 저해세포를 제작하기 위한 수단으로서는, 상기에 예거한 것과 같은 시약의 사용 이외에, 정보제시세포에 UV 조사 및/또는 X선 처리를 실시하여 행하는 방법이어도 좋다. UN 조사 및 X선 처리는, 당해 기술분야에 있어서 알려져 있는 조건을 적절히 선택하여 행할 수 있다. 한편, UV 조사 및 X선 처리는, 상기 시약과 병용하여 행하여도 좋다.
사세포를 제작하기 위하여 사용될 수 있는 시약에는, 상기 상해세포를 제작하기 위하여 사용될 수 있는 시약이 포함되며, 예를 들어 이들의 사용농도를 높이거나, 또는 장기사용에 의하여 그 목적을 달성할 수 있다. 또한, UV 조사나 X선 처리를 실시하는 경우에는, 예를 들어 조사 등의 시간을 길게, UV나 X선의 강도를 증대시키는 것이어도 좋다.
다른 일 실시형태에서는, 상해세포 또는 사세포를 제작하기 위한 수단으로서, 한정되지 않지만, 열을 가하거나, 저온상태로 하거나, 산 또는 알칼리 처리하거나, 초음파 또는 볼텍스로 처리하거나, 동결융해하거나, 저산소 처리하거나, 저영양 처리하거나, 활성산소 처리하거나 하는 등의 방법을 들 수 있다. 이들 수단의 사용에 관하여는, 당업자라면 적절히 조건을 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명의 방법에서는, 상기 방법에 의하여 얻어진 상해세포 및 사세포를 제작할 수 있는지 아닌지를 확인하기 위한 수단을 포함하여도 좋다. 확인수단으로서는, 한정되지 않지만, 현미경 하에 의한 관찰, 세포상해를 측정하는 시판 키트의 사용, 세포로부터 분비된 내용물의 생리학적 또는 면역학적인 측정 등을 들 수 있다. 사세포 중, 세포가 아포토시스에 기인한 사세포에서는, 세포표면의 굴곡, 핵크로마틴의 응축, 염색체 DNA의 단편화 등의 독특한 형태이상 관찰에 근거하여 판단할 수 있다. 더욱이, 사세포의 정량적 측정에는, 사세포를 트리판블루로 염색하는 방법, 또는 테트라졸륨에 의한 비색분석(MTT 어세이)을 이용할 수 있다.
(4) 공배양 조건
본 발명은, 다능성 간세포와 상해세포, 사세포, 및/또는 그 일부를 공배양함으로써, 인비트로에서 다능성 간세포를 분화유도하는 방법에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용할 때, '공배양'이란, 동일한 환경 하에서 2종류 이상의 세포(또는 일부)를 배양하는 것을 의미하고, 동일 배양용기 또는 샬레 내에 다능성 간세포와 상해세포 등을 각각 소정수 넣고 배양하는 것을 가리킨다. 공배양의 실시형태로서는, (i) 배양 중인 다능성 간세포에 상해세포 등을 첨가하여 공배양하는 시스템, (ii) 정보제시세포로부터 상해세포 등을 제작한 후, 다능성 간세포를 첨가하여 공배양하는 시스템, (iii) 배양용기 내에 다능성 간세포와 상해세포 등을 소정으로 혼재시켜 공배양하는 시스템 등을 들 수 있다.
다능성 간세포의 수와 정보제시세포 유래의 상해세포 또는 사세포의 수의 비는, 1:10,000~10,000:1이고, 예를 들어, 1:10,000, 1:7,000, 1:5,000, 1:3,000, 1:2,000, 1:1,000, 1:700, 1:500, 1:300, 1:200, 1:100, 1:70, 1:50, 1:30, 1:20, 1:10, 1:7, 1:5, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 5:1, 7:1, 10:1, 20:1, 30:1, 50:1, 70:1, 100:1, 200:1, 300:1, 500:1, 700:1, 1,000:1, 2,000:1, 3,000:1, 5,000:1, 7,000:1, 10,000:1이다. 세포를 배양하기 위한 배양액은, 실제로 배양하는 세포에 맞춘 배지라면 좋고, 일반적으로는, DMEM, RPMI-1640, Ham's F12 등을 사용할 수 있다. 또한, 통상 이용되는 항생물질, 소태아 혈청, 유전자 도입 세포선택용 항생제 등을 0.1~10%의 농도로 첨가하여도 좋다.
배양온도 등의 배양조건은, 통상의 세포배양 조건에 따르는 것으로 하고, 예를 들어 36~38℃, 바람직하게는 37℃이며, 더욱이 4~6% CO2, 바람직하게는 5% CO2 분위기 하일 수 있다. 또한, 공배양의 시간은, 유도되어, 최종적으로 얻어지는 세포종에 의존하지만, 대체적으로 2~10일 정도이다.
(5) 분화유도
본 발명에서 사용할 때 '분화유도'란, 어떤 수단에 의하여 다능성 간세포로부터 특정 장기, 기관 혹은 조직을 구성하는 세포 또는 그 전구세포로 안내하는 것을 의미하는데, 내배엽세포, 중배엽세포 및 외배엽세포 등의 다종류의 세포를 포함하는 세포그룹으로 분화시키는 것도 포함한다. 본 발명에 따르면, 다능성 간세포로부터 특정 세포로의 분화유도는, 다능성 간세포를 상해세포 등과 단순히 공배양함으로써 달성되며, 상해세포 등 이외의 시약이나 UV 조사 등을 필료로 하지 않는 것을 특징으로 한다. 이와 같은 분화유도는, 다능성 간세포의 상해세포 등에 대한 탐식성에 기인하는 것으로, 상해 또는 사멸 전의 대응하는 정보제시세포로부터 분비되는 어떤 액성인자나 엑소좀, 또는 정보제시세포와의 세포간 직접적 접촉에 의한 것이 아닌 것이 시사되었다(실시예 1을 참조).
분화유도된 세포의 확인은, 당해 기술분야에 있어서 행하여지고 있는 수법에 의하여 행할 수 있으며, 전형적으로는, 세포에 있어서 소정의 분화마커의 유전자 발현이나 단백질 발현의 유무를 조사함으로써 행할 수 있다. 이와 같은 수법으로서는, RT-PCR법, 노던 블로팅법, 유세포분석(flow cytometry)법, 웨스턴 블로팅법, ELISA법 등을 들 수 있다. 예를 들어, 다능성 간세포가 심근세포로 분화되었는지 아닌지는, 심근세포의 분화마커인 Nkx2.5(NK-2 transciption factor related, locus 5), GATA-4, 트로포닌-T, ANP(심방성 나트륨 이뇨 펩티드)의 유전자 발현이 분화유도된 세포에 있어서 보이는 것을 RT-PCR법을 이용하여 mRNA 레벨에서 확인할 수 있다(실시예 3 등).
(6) 용도
다능성 간세포가, 상해세포, 사세포, 및/또는 그 일부를 탐식함으로써, 이들에 유래하는 세포로 분화한다는 성질을 이용하여, 다능성 간세포를 함유하는 세포제제의 품질관리에 응용할 수 있다. 본 발명에 따르면, 인비트로에 있어서 세포제제 내에 함유되는 세포가, 생존하는 다능성 간세포인 것을 확인하기 위한 방법으로서,
(a) 세포제제 내의 세포와, 상해세포, 사세포, 및/또는 그 일부를 공배양하고; 및
(b) 그 세포제제 내의 세포가, 상해세포, 사세포, 및/또는 그 일부에 유래하는 외배엽계 세포, 중배엽계 세포, 및/또는 내배엽계 세포와 같은 표현형 및 기능을 가지는 세포로 분화한 경우에, 그 세포제제 내에 다능성 간세포가 생존하고 있다고 판단하는
것을 포함하는 상기 방법이 제공된다. 여기에서, 다능성 간세포(예를 들어, Muse 세포)가, 삼배엽계 세포(외배엽계 세포, 중배엽계 세포, 및 내배엽계 세포)로 분화하였는지 아닌지를 확인하는 방법은, 상술과 같이, 각종 세포마커의 발현의 유무를 조사함으로써 가능하다.
본 발명에 따르면, 다능성 간세포 또는 그 다능성 간세포가 농축된 세포획분을, 정보제시세포 유래의 상해세포, 사세포, 및/또는 그 일부와 공배양하는 것을 포함하는 인비트로에서 다능성 간세포로부터 정보제시세포와 같은 표현형 및 기능을 가지는 세포를 제조하는 방법을 제공할 수 있다.
이하의 실시예에 의하여, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이들 실시예에 의하여 한정되는 것이 전혀 아니다.
실시예
실시예
1: Muse 세포의 분화유도 메커니즘의 해석
Muse 세포는, 생체 내에서 상해부위로부터 발하여지는 상해 시그널(예를 들어, S1P)에 의하여, 상해부위에 유주하고, 생착한 후, '장이론'에 따라서 분화 유도되는데, Muse 세포가 분화하는 메커니즘에 대하여 상세하게는 알려져 있지 않다. 본 실시예에서는, Muse 세포의 분화유도가 어떠한 메커니즘으로 행하여지고 있는지에 대하여, 인비트로에 있어서 검증하였다. Muse 세포가 '장이론'의 정보를 어떻게 받고 있는지, 즉 분화유도에 관계한다고 생각되는 요인이 어떠한 것인지를 해명하는 것은, '장이론'이 소실되어 있는 만성질환이나 혈관을 통한 도달이 어려운 조직이나 장기, 또는 희소세포의 재생으로의 응용의 기초가 된다.
Muse 세포가 받고 있다고 생각되는 '장이론'의 정보로서, 정보제시세포로부터 분비되는 액성인자나 엑소좀, 또는 이러한 인자 등을 매개하지 않고, 정보제시세포와의 직접적인 접촉, 또는 상해를 받은 정보제시세포를 Muse 세포가 탐식하는 것 등이 상정된다. 그래서, 정상 마우스 심근세포 및 상해 마우스 심근세포를 이용하여, 상기 중 액성인자, 엑소좀, 및 직접적 접촉에 의하여 Muse 세포의 분화유도의 가능성에 대하여 검토하였다.
(1) 정상 마우스 심근세포를 이용한 분화유도
일본에스엘씨(주)로부터 구입한 C57BL/6-TG(CAG-EGFP)로부터 태어난 생후 1일째의 마우스 심장으로부터 수립한 정상 마우스 심근세포를 약 10일간 배양한 후, 세포의 배양상청을 회수하고, 이것을 액성인자에 의한 분화유도의 가능성을 검토하기 위한 재료로 하였다. 다음으로, 무혈청배지에서 3일간 배양한 상기 심근세포의 배양상청을 회수하고, 그 배양상청을 ExoQuick Exosome Precipitation Solution(System Biosciences)과 혼합 후, 원심분리를 하는 것에 의하여, 심근세포로부터 분비된 엑소좀을 얻었다(Douglas, D., et al., Molecular Biology 728(4), 235~246(2011)을 참조). 엑소좀이 얻어졌다는 확인은, HSP70을 지표로 웨스턴블로팅에 의하여 행하였다.
다음으로, 인간 Muse 세포는, 국제공개공보 WO2011/007900호에 기재된 방법에 의하여 얻었다. Muse 세포를 1×104세포/웰이 되도록 플레이트(Nunc multidish 6 nunclon delta SI, Thermo, #140675)에 파종하고, 24시간 배양하였다. 이어서, 상기에서 얻어진 정상 마우스 심근세포 유래의 배양상청 또는 엑소좀을 첨가하여 배양을 계속하였다. 첨가하고나서 배양 3일 후, 1주일 후, 2주일 후 및 3주일 후에, 배양한 Muse 세포를 회수하고, Muse 세포가 정보제시세포와 같은 심근세포로 분화하고 있는지 아닌지를 조사하였다. 구체적으로는, 회수된 Muse 세포로부터 총 RNA를 추출하고, 심근분화마커인 Nkx2.5(NK-2 transcription factor related, locus 5), GATA-4, 트로포닌-T, 및 ANP(심방성 나트륨 이뇨 펩티드)에 대하여, 이들의 인간 특이적인 mRNA 발현의 유무를 RT-PCR에 의하여 확인하였다. Nkx2.5 및 GATA-4를 심근전구세포로 발현하고 있는 초기의 분화마커로서, ANP를 미분화형 심근세포마커로서, 트로포닌-T를 성숙심근 분화마커로서 선택하였다. RT-PCR의 양성 대상으로서 인간 태아 심장, 및 음성 대상으로서 마우스 심근 세포를 시료로서 이용하였다. 도 1에 나타내는 바와 같이, Muse 세포는, 정상 마우스 심근세포로부터 얻어진 액성인자(배양상청)(도 1의 (a)) 및 엑소좀(도 1의 (b))의 어느 것을 이용한 경우에도 심근세포마커를 발현하지 않아, 심근세포로 분화유도되지 않았다.
한편, RT-PCR에 있어서 검출대상으로서 각종 마커에 사용한 프라이머는, Nkx2.5(NM_004387; 배열번호 1), GATA-4(NM_002052; 배열번호 4), 트로포닌-T(NM_000364; 배열번호 7), 및 ANP(NM_006172; 배열번호 10)의 뉴클레오티드 배열에 근거하여, 설계 및 합성하였다. 구체적으로는, 이하와 같다.
(1) Nkx2.5
포워드 프라이머: 5'-CAGGACCAGACTCTGGAGCTG-3'(배열번호 1의 821-841nt에 대응)
리버스 프라이머: 5'-CGCCGAAGTTCACGAAGTTGT-3'(배열번호 3)(배열번호 1의 1118-1098nt에 대응)
(2) GATA-4
포워드 프라이머: 5'-AGCAGCTCCGTGTCCCAGACGTT-3'(배열번호 5)(배열번호 4의 1683-1705nt에 대응)
리버스 프라이머: 5'-CCAACTCACAGGAGAGATGCAGTGTG-3'(배열번호 6)(배열번호 4의 2139-2114nt에 대응)
(3) 트로포닌-T
포워드 프라이머: 5'-CTCAAAGACAGGATCGAGAG-3'(배열번호 8)(배열번호 7의 489-508nt에 대응)
리버스 프라이머: 5'-GATCTTCATTCAGGTGGTCA-3'(배열번호 9)(배열번호 7의 795-771nt에 대응)
(4) ANP
포워드 프라이머: 5'-TCCAGCTCCTAGGTCAGACC-3'(배열번호 11)(배열번호 10의 149-168nt에 대응)
리버스 프라이머: 5'-TCTGGGCTCCAATCCTGTCC-3'(배열번호 12)(배열번호 10의 523-504nt에 대응)
이어서, Muse 세포가 정상 마우스 심근세포와 직접 접촉함으로써, 분화유도될 수 있는지 아닌지를 검토하였다. 우선, 정상 마우스 심근세포에 대하여는, 녹색형광단백질(GFP)을 발현하도록 유전자 도입을 하였다. 다음으로, GFP 표식한 심근세포를 플레이트(Nunc multidish 6 nunclon delta SI, Thermo, #140675)에 3×104세포/웰로 파종하고, 배양하였다. 그 후 미리 핵을 DAPI로 표식한 인간 Muse 세포를 1×104세포/웰로 첨가하고, 배양을 계속하였다. 배양 개시로부터 3일 후, 1주일 후, 2주일 후 및 3주일 후에, 상기와 마찬가지로, 심근분화마커의 인간 특이적인 mRNA 발현의 유무를 RT-PCR에 의하여 검토하였다(도 1의 (c)). 상술한 배양상청 및 엑소좀의 결과와 마찬가지로, 심근세포마커의 발현은 관찰되지 않았다. 또한, 배양 3일 후 및 7일 후에, GATA-4의 발현의 유무를 면역발색에 의하여 검토하고, 형광현미경 하에서 관찰한 결과를 도 1의 (d)에 나타낸다. 핵이 청색으로 표식된 Muse 세포에 있어서는, GATA-4의 발현은 인정되지 않았다. 상기의 결과로부터, Muse 세포는, 정상 마우스 심근세포와의 세포접촉에 의하여는 분화유도되지 않는 것을 알 수 있었다.
(2) 상해 마우스 심근세포를 이용한 분화유도
상해 마우스 심근세포를 이용한 경우에 있어서, Muse 세포가 분화될 수 있는지 아닌지를 검토하였다. 상해 마우스 심근세포의 제작은, 아포토시스를 유도하는 에토포시드를 이용하여 행하였다. 간단하게는, GFP 표식한 마우스 심근세포를 3×104세포/웰로 파종하고, 배양 2일 후에 50μM의 에토포시드(SIGMA, #E1383)를 첨가하였다. 배양 1일 후, 아포토시스 유도 마우스 심근세포의 배양상청을 회수하고, 1×104세포/웰로 파종한 인간 Muse 세포를 배양하였다. 정상 마우스 심근세포의 경우와 마찬가지로, 배양 개시부터 3일 후, 1주일 후, 2주일 후 및 3주일 후에 심근분화마커의 인간 특이적인 mRAN 발현의 유무를 RT-PCR에 의하여 검토하였다(도 2의 (a)). 하지만, 어떤 마커도 확인할 수 없었으므로, 상해세포의 배양상청에 포함되는 인자만으로는, Muse 세포의 심근세포로의 분화는 일어나지 않는 것이 판명되었다.
더욱이, 상해 마우스 심근세포로부터 분비된 엑소좀을 이용하여 검토하였다. 상기와 같은 농도의 Muse 세포를 파종하고, 엑소좀을 첨가하였다. 첨가로부터 3일 후, 1주일 후, 2주일 후 및 3주일 후에, 상기와 마찬가지로, 심근분화마커의 인간 특이적인 mRNA 발현의 유무를 RT-PCR에 의하여 검토하였다(도 2의 (b)). 배양상청을 이용한 결과와 마찬가지로, 엑소좀의 첨가에 의하여, Muse 세포는 심근세포로 분화유도되지 않았다.
실시예
2: Muse 세포의 탐식성의 검증
Muse 세포는, 페라이트를 탐식하는 것은 보고되어 있지만, 상해세포, 사세포 또는 그 일부도 탐식할 수 있는지에 대하여는 검토되지 않았다. 그래서, Muse 세포의 탐식성에 대하여, PKH26PCL 비즈를 이용하여 재검증하였다.
PKH26PCL(에탄올 중 1×10- 3M스톡; SIGMA, #PKH26PCL)은, 대식세포, 호중구, 마이크로글리아 등의 탐식능을 가지는 세포를 선택적으로 표식할 수 있는 색소로, 당해 기술분야에 있어서 널리 사용되고 있다. 우선, GRP(녹색) 및 DAPI(청색)으로 이중염색된 Muse 세포를 배양하고, PKH26PCL(적색)을 첨가하였다. 그 후, 24시간 배양하였다. 도 3에 나타나는 바와 같이, PKH26은, Muse 세포의 세포질에 포함되어 있는 것이 확인되고, Muse 세포는 탐식성을 가지는 것을 재확인할 수 있었다. 약 74.1±4.6%의 Muse 세포가 PKH26PCL을 포함하고 있어, Muse 세포는 탐식성을 가지고 있는 것을 확인하였다.
실시예
3: Muse 세포와
상해세포의
공배양에
의한 분화유도
Muse 세포가 상해세포를 탐식함으로써, 직접 '장이론'의 정보를 받아, 분화한다고 하는 가능성을 검증하였다.
(1) 중배엽세포(심근세포)로의 분화유도
토포이소머라아제 저해제인 에토포시드를 이용하여, 상해심근세포를 조제하였다. 숙주가 되는 심근세포로서, 실시예 1에서 제조한 GFP 표식한 마우스 유래의 심근세포를 이용하였다. GPR 마우스 심근세포를 3×104세포/웰의 세포밀도로 플레이트에 파종하고, 1일간 배양한 배양계에, 50μM의 에토포시드를 각 웰에 첨가하였다. 그 후, 다시 1일간 배양하였다. 다음으로, 표식한 인간 Muse 세포를 1×104세포/웰로 첨가하고, 공배양을 행하였다. 공배양을 개시하고 나서 3일 후에, Muse 세포에 의한 상해심근세포의 탐식능을 형광현미경 하에서 검증하였다. 도 4에 나타나는 바와 같이, 아포토시스를 일으킨 GFP 마우스 심근세포와 공배양한 Muse 세포는, 붕괴된 심근세포의 일부(녹색)를 Muse 세포 내(적색)에 포함하고 있으므로, Muse 세포의 탐식능이 확인되었다.
다음으로, 같은 배양계에서, 공배양을 개시하고 나서 3일 후, 1주일 후, 2주일 후 및 3주일 후에 각각 세포를 고정하고, Muse 세포가 심근세포로 분화유도되었는지 아닌지를 검증하였다. 심근세포의 분화마커로서의 GATA-4(심근전구세포마커), ANP(미분화형 심근세포마커), 및 트로포닌-I(심근세포의 성숙분화마커)에 대하여 면역염색을 행함으로써 분화유도를 확인하였다. 결과를 도 5에 나타낸다. 아포토시스를 일으킨 심근세포와 공배양한 Muse 세포는, 3일째와 7일째에 있어서, GATA-4를 발현하고 있었다(각각 도 5의 (a)와 (b)). 더욱이, Muse 세포는, 2주째에는 ANP를 발현하고, 3주째에는 트로포닌-I를 발현하고 있었다(각각 도 5의 (c)와 (d)). 이와 같이, 어떤 분화마커도 발현하고 있으므로, Muse 세포는 상해심근세포와의 공배양에 의하여, 중배엽계세포인 심근세포로 분화한 것이 확인되었다.
더욱이, 상기에서 나타난 심근세포로의 분화유도가, Muse 세포에 의한 상해심근세포의 탐식에 따른 것인 것을 검증하기 위하여, 배양계에 아넥신V를 첨가하고, 세포의 탐식능을 억제시킴으로써, 분화유도가 저해되는지 아닌지를 검증하였다. 상기 공배양과 같은 배양계에 있어서, 에토포시드(50μM)를 첨가하고 나서 1일 후에, 1μg/mL의 아넥신V를 첨가하고, 8시간 배양하였다. 그 후, 이 배양계에 Muse 세포(1×104세포/웰)를 첨가하고, 배양을 계속하였다. 아넥신V를 첨가하고 나서 3일 후, 1주일 후, 2주일 후 및 3주일 후에 Muse 세포로부터 총 RNA를 추출하고, 각 마커의 유전자 발현의 유무를 RT-PCR에 의하여 확인하였다(도 6).
Nkx2.5 및 GATA4는, 분화과정의 초기로서, 보다 유약한 심근세포에 발현하는 분화마커이며, 3일 후와 1주일 후에 아넥신V를 첨가하지 않은 시료에서는, Muse 세포는 심근으로 분화되어 있지만, 아넥신V를 첨가한 시료에서는, 이들의 분화마커의 발현은 관찰되지 않았다. 보다 후기에 발현이 보이는 ANP와 트로포닌T(TNT)에서도 마찬가지로, 아넥신V에 의하여 Muse 세포에서는 분화마커의 발현은 관찰되지 않았다. 이와 같이, Muse 세포의 탐식을 저해하면, 심근세포로의 분화는 저해된 것으로부터, Muse 세포는 사세포 또는 거의 죽어가는 세포(상해세포)를 탐식함으로써 '장이론'의 정보를 취득하고, 분화유도되는 것이 나타났다.
(2) 중배엽계세포(골격근세포)로의 분화
마우스 C2C12(횡문근육종 유래 세포주)(ATCC, #CRL-1772)를 이용하여, Muse 세포의 중배엽계세포로의 분화유도에 대하여 검토하였다. 에토포시드 처리한 C2C12세포와 GFP 표식한 Muse 세포를 공배양하고, 분화유도를 시도하였다. 구체적으로는, 5×104세포/웰의 세포농도로 C2C12세포를 파종하고, 에토포시드로 처리한 후, 같은 세포농도의 Muse 세포를 파종하여 공배양하였다. 공배양을 개시하고 나서 14일 후에 미오게닌(골격근세포의 분화마커)의 발현의 유무를 면역염색에 의하여 검토하였다. 형광현미경 하에서 관찰한 결과 및 MyoD 발현의 RP-PCR의 결과를 각각 도 7의 (a) 및 (b)에 나타낸다. Muse 세포(녹색)는, 미오게닌(적색)을 발현하고, 다핵이며, 더욱이 MyoD의 mRAN 발현(공배양 개시로부터 1주일 후)을 확인할 수 있었으므로, 상해를 유도한 C2C12와의 공배양에 의하여 중배엽계세포인 골격근세포로 분화되는 것이 나타났다.
한편, RT-PCR에 있어서 검출 대상으로서 각종 마커에 사용한 프라이머는, MyoD(NM_002478; 배열번호 13)의 뉴클레오티드 배열에 근거하여, 설계 및 합성하였다. 구체적으로는, 이하와 같다.
포워드 프라이머: 5'-GAGCAATCCAAACCAGCGGTTG-3'(배열번호 14)(배열번호 13의 631-652nt에 대응)
리버스 프라이머: 5'-TAGTAGGCGCCTTCGTAGCAG-3'(배열번호 15)(배열번호 13의 912-892nt에 대응)
(3) 외배엽계세포(신경세포)로의 분화
상해를 유도한 신경세포(Neuro2A, ATCC, #CCL-131)를 이용하여, Muse 세포의 외배엽계세포로의 분화유도에 대하여 검토하였다. 상기와 마찬가지로 에토포시드 처리로 상해를 유도한 신경을 제작하고, Muse 세포와 공배양하였다. 공배양의 개시로부터 3일 후와 1주일 후에, Muse 세포로부터 총 RNA를 추출하고, 분화유도에 대하여 검증하였다. 보다 구체적으로는, 신경세포 마커로서 알려져 있는 NeuN의 mRAN 발현을 RT-PCR에 의하여 조사하였다. 마우스 배아(15일 배양) 및 인간 MSC-Muse 세포(L26)에서는, NeuN의 발현은 없었다. 한편, 상해를 유도한 Neuro2A와의 공배양계에서는, 공배양 개시 후 1주일째에 Muse 세포에 있어서 NeuN의 발현이 확인되었다. 이에 따라, Muse 세포는, 상해신경세포와의 공배양에 의하여, 외배엽계세포인 신경세포로 분화되는 것이 나타났다.
(4) 내배엽계세포(β세포)로의 분화
상해를 유도한 마우스 β세포(NIT-1)(ATCC, #CRL-2055)를 이용하여, Muse 세포의 내배엽계세포로의 분화유도에 대하여 검토하였다. 상기와 마찬가지로 에토포시드 처리로 상해를 유도한 β세포를 제작하고, Muse 세포와 공배양하였다. 공배양의 개시로부터 3일 후와 1~3주 후에, Muse 세포로부터 총 RNA를 추출하고, 분화유도에 대하여 검증하였다. 보다 구체적으로는, β세포의 전구세포마커로서 알려져 있는 Nkx2.2와 NeuroD1, 및 성숙 β세포마커로서 알려져 있는 Islet1의 mRNA 발현을 RT-PCR에 의하여 조사하였다. 도 9에 나타나는 바와 같이, 각종 마커의 경시적인 발현의 변화로부터 Muse 세포는 공배양의 시간경과와 함께 전구세포로부터 성숙 β세포로 분화하여 가는 것이 확인되었다. Muse 세포는, 상해 β세포와의 공배양에 의하여, 내배엽계세포인 β세포로 분화되는 것이 나타났다.
한편, RT-PCR에 있어서 검증대상으로서 각종 마커에 사용한 프라이머는, Nkx2.2(NM_002509; 배열번호 16), NeuroD1(NM_002500; 배열번호 19), Islet1(NM_002202; 배열번호 22)의 뉴클레오티드 배열에 근거하여, 설계 및 합성하였다. 구체적으로는, 이하와 같다.
1) Nkx2.2
포워드 프라이머: 5'-GACATAAATTTTGGGGTCT-3'(배열번호 17)(배열번호 16의 25-43nt에 대응)
리버스 프라이머: 5'-GGTTCTGGAACCAGATCTT-3'(배열번호 18)(배열번호 16의 584-566nt에 대응)
2) NeuroD1
포워드 프라이머: 5'-GCACAATTTGAGCAATTCAT-3'(배열번호 20)(배열번호 19의 1988-2017nt에 대응)
리버스 프라이머: 5'-CAAGCTTGTGCAAGTAATGTG-3'(배열번호 21)(배열번호 19의 2144-2124nt에 대응)
3) Islet1
포워드 프라이머: 5'-GGCTGTTCACCAACTGTA-3'(배열번호 23)(배열번호 22의 490-507nt에 대응)
리버스 프라이머: 5'-ACTCGATGTGATACACCTTG-3'(배열번호 24)(배열번호 22의 858-839nt에 대응)
(5) 내배엽계세포(간세포)로의 분화
상해를 유도한 간세포(마우스 간암세포주: Hepa1-6)(ATCC, #CRL-1830)를 이용하여, Muse 세포의 내배엽계세포로의 분화유도에 대하여 검토하였다. 상기와 마찬가지로 에토포시드 처리로 상해를 유도한 간세포를 제작하고, Muse 세포와 공배양하였다. 공배양의 개시로부터 3일 후와 1~2주 후에, Muse 세포로부터 총 RAN를 추출하고, 분화유도에 대하여 검증하였다. 보다 구체적으로는, 간세포의 발생초기에 보이는 α-페토프로테인(AFP)의 mRAN 발현을 RP-PCR에 의하여 조사하였다. 도 10에 나타나는 바와 같이, AFP의 발현은, 공배양 개시 후 1주일째에 관찰되어, Muse 세포는 상해간세포와의 공배양에 의하여, 내배엽계세포인 간세포로 분화되는 것이 나타났다.
한편, RT-PCR에 있어서 검출대상으로서 각종 마커에 사용한 프라이머는, AFP(NM_001134; 배열번호 25)의 뉴클레오티드 배열에 근거하여, 설계 및 합성하였다. 구체적으로는, 이하와 같다.
포워드 프라이머: 5'-CCGAACTTTCCAAGCCATAACTG-3'(배열번호 26)(배열번호 25의 740-762nt에 대응)
리버스 프라이머: 5'-CACTTCTCCAATAACTCCTGGTATC-3'(배열번호 27)(배열번호 25의 1195-1171nt에 대응)
본 발명의 인비트로에 있어서의 다능성 간세포를 분화유도하는 방법은, 다능성 간세포, 특히 Muse 세포로부터 공통의 계를 이용하여, 내배엽세포, 중배엽세포 및 외배엽세포로 분화유도할 수 있다. 더욱이, '장이론'이 이미 소실되어 있는 만성질환이나 혈관을 통한 도달이 어려운 조직이나 장기, 또는 희소세포의 재생으로 응용할 수 있다. 본 발명의 분화유도법은, Muse 세포 등의 다능성 간세포로부터 대량으로, 안정적으로, 쉽게, 그리고 낮은 비용으로 분화세포를 유도할 수 있고, 이렇게 하여서 유도된 세포는, 외래 유전자가 도입되어 분화유도된 세포와는 달리, 종양화할 가능성이 없어, 보다 안전하게 이용할 수 있다.
본 명세서에 인용하는 모든 간행물 및 특허문헌은, 참조에 의하여 전체적으로 본 명세서 내에 원용된다. 한편, 예시를 목적으로 본 발명의 특정 실시형태를 본 명세서에 있어서 설명하였는데, 본 발명의 정신 및 범위로부터 벗어나지 않게 다양한 변경이 가능한 것은 당업자가 쉽게 이해할 수 있을 것이다.
SEQUENCE LISTING
<110> Life Science Institute, Inc.
<120> In vitro differentiation-inducing method of pluripotent stem cells
<130> P170368WO
<150> JP2016-153259
<151> 2016-08-03
<160> 27
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1669
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
gctcctgtca tcgaggcccc tggcccaatg gcaggctgag tccccctcct ctggcctggt 60
cccgcctctc ctgccccttg tgctcagcgc tacctgctgc ccggacacat ccagagctgg 120
ccgacgggtg cgcgggcggg cggcggcacc atgcagggaa gctgccaggg gccgtgggca 180
gcgccgcttt ctgccgccca cctggcgctg tgagactggc gctgccacca tgttccccag 240
ccctgctctc acgcccacgc ccttctcagt caaagacatc ctaaacctgg aacagcagca 300
gcgcagcctg gctgccgccg gagagctctc tgcccgcctg gaggcgaccc tggcgccctc 360
ctcctgcatg ctggccgcct tcaagccaga ggcctacgct gggcccgagg cggctgcgcc 420
gggcctccca gagctgcgcg cagagctggg ccgcgcgcct tcaccggcca agtgtgcgtc 480
tgcctttccc gccgcccccg ccttctatcc acgtgcctac agcgaccccg acccagccaa 540
ggaccctaga gccgaaaaga aagagctgtg cgcgctgcag aaggcggtgg agctggagaa 600
gacagaggcg gacaacgcgg agcggccccg ggcgcgacgg cggaggaagc cgcgcgtgct 660
cttctcgcag gcgcaggtct atgagctgga gcggcgcttc aagcagcagc ggtacctgtc 720
ggcccccgaa cgcgaccagc tggccagcgt gctgaaactc acgtccacgc aggtcaagat 780
ctggttccag aaccggcgct acaagtgcaa gcggcagcgg caggaccaga ctctggagct 840
ggtggggctg cccccgccgc cgccgccgcc tgcccgcagg atcgcggtgc cagtgctggt 900
gcgcgatggc aagccatgcc taggggactc ggcgccctac gcgcctgcct acggcgtggg 960
cctcaatccc tacggttata acgcctaccc cgcctatccg ggttacggcg gcgcggcctg 1020
cagccctggc tacagctgca ctgccgctta ccccgccggg ccttccccag cgcagccggc 1080
cactgccgcc gccaacaaca acttcgtgaa cttcggcgtc ggggacttga atgcggttca 1140
gagccccggg attccgcaga gcaactcggg agtgtccacg ctgcatggta tccgagcctg 1200
gtagggaagg gacccgcgtg gcgcgaccct gaccgatccc acctcaacag ctccctgact 1260
ctcgggggga gaaggggctc ccaacatgac cctgagtccc ctggattttg cattcactcc 1320
tgcggagacc taggaacttt ttctgtccca cgcgcgtttg ttcttgcgca cgggagagtt 1380
tgtggcggcg attatgcagc gtgcaatgag tgatcctgca gcctggtgtc ttagctgtcc 1440
ccccaggagt gccctccgag agtccatggg cacccccggt tggaactggg actgagctcg 1500
ggcacgcagg gcctgagatc tggccgccca ttccgcgagc cagggccggg cgcccgggcc 1560
tttgctatct cgccgtcgcc cgcccacgca cccacccgta tttatgtttt tacctattgc 1620
tgtaagaaat gacgatcccc ttcccattaa agagagtgcg ttgaccccg 1669
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequens
<220>
<223> Forward primer for amplifying Nkx2.5
<400> 2
caggaccaga ctctggagct g 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> Reverse primer for amplifying Nkx2.5
<400> 3
cgccgaagtt cacgaagttg t 21
<210> 4
<211> 3419
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
ttggaggcgg ccggcgcagg ggccgcgaga ggcttcgtcg ccgctgcagc tccgggggct 60
cccaggggag cgtgcgcgga acctccaggc ccagcaggac cccggctgcg gcgaggagga 120
aggagccagc ctagcagctt ctgcgcctgt ggccgcgggt gtcctggagg cctctcggtg 180
tgacgagtgg gggacccgaa ggctcgtgcg ccacctccag gcctggacgc tgccctccgt 240
cttctgcccc caataggtgc gccggacctt caggccctgg ggtgaattca gctgctccta 300
catcagcttc cggaaccacc aaaaattcaa attgggattt tccggagtaa acaagagcct 360
agagcccttt gctcaatgct ggatttaata cgtatatatt tttaagcgag ttggtttttt 420
cccctttgat ttttgatctt cgcgacagtt cctcccacgc atattatcgt tgttgccgtc 480
gttttctctc cccgcgtggc tccttgacct gcgagggaga gagaggacac cgaagccggg 540
agctcgcagg gaccatgtat cagagcttgg ccatggccgc caaccacggg ccgccccccg 600
gtgcctacga ggcgggcggc cccggcgcct tcatgcacgg cgcgggcgcc gcgtcctcgc 660
cagtctacgt gcccacaccg cgggtgccct cctccgtgct gggcctgtcc tacctccagg 720
gcggaggcgc gggctctgcg tccggaggcg cctcgggcgg cagctccggt ggggccgcgt 780
ctggtgcggg gcccgggacc cagcagggca gcccgggatg gagccaggcg ggagccgacg 840
gagccgctta caccccgccg ccggtgtcgc cgcgcttctc cttcccgggg accaccgggt 900
ccctggcggc cgccgccgcc gctgccgcgg cccgggaagc tgcggcctac agcagtggcg 960
gcggagcggc gggtgcgggc ctggcgggcc gcgagcagta cgggcgcgcc ggcttcgcgg 1020
gctcctactc cagcccctac ccggcttaca tggccgacgt gggcgcgtcc tgggccgcag 1080
ccgccgccgc ctccgccggc cccttcgaca gcccggtcct gcacagcctg cccggccggg 1140
ccaacccggc cgcccgacac cccaatctcg atatgtttga cgacttctca gaaggcagag 1200
agtgtgtcaa ctgtggggct atgtccaccc cgctctggag gcgagatggg acgggtcact 1260
atctgtgcaa cgcctgcggc ctctaccaca agatgaacgg catcaaccgg ccgctcatca 1320
agcctcagcg ccggctgtcc gcctcccgcc gagtgggcct ctcctgtgcc aactgccaga 1380
ccaccaccac cacgctgtgg cgccgcaatg cggagggcga gcctgtgtgc aatgcctgcg 1440
gcctctacat gaagctccac ggggtcccca ggcctcttgc aatgcggaaa gaggggatcc 1500
aaaccagaaa acggaagccc aagaacctga ataaatctaa gacaccagca gctccttcag 1560
gcagtgagag ccttcctccc gccagcggtg cttccagcaa ctccagcaac gccaccacca 1620
gcagcagcga ggagatgcgt cccatcaaga cggagcctgg cctgtcatct cactacgggc 1680
acagcagctc cgtgtcccag acgttctcag tcagtgcgat gtctggccat gggccctcca 1740
tccaccctgt cctctcggcc ctgaagctct ccccacaagg ctatgcgtct cccgtcagcc 1800
agtctccaca gaccagctcc aagcaggact cttggaacag cctggtcttg gccgacagtc 1860
acggggacat aatcactgcg taatcttccc tcttccctcc tcaaattcct gcacggacct 1920
gggacttgga ggatagcaaa gaaggaggcc ctgggctccc aggggccggc ctcctctgcc 1980
tggtaatgac tccagaacaa caactgggaa gaaacttgaa gtcgacaatc tggttagggg 2040
aagcgggtgt tggattttct cagatgcctt tacacgctga tgggactgga gggagcccac 2100
ccttcagcac gagcacactg catctctcct gtgagttgga gacttctttc ccaagatgtc 2160
cttgtcccct gcgttcccca ctgtggccta gaccgtgggt tttgcattgt gtttctagca 2220
ccgaggatct gagaacaagc ggagggccgg gccctgggac ccctgctcca gcccgaatga 2280
cggcatctgt ttgccatgta cctggatgcg acgggcccct ggggacaggc ccttgcccca 2340
tccatccgct tgaggcatgg caccgccctg catccctaat accaaatctg actccaaaat 2400
tgtggggtgt gacatacaag tgactgaaca cttcctgggg agctacaggg gcacttaacc 2460
caccacagca cagcctcatc aaaatgcagc tggcaacttc tcccccaggt gccttccccc 2520
tgctgccggc ctttgctcct tcacttccaa catctctcaa aataaaaatc cctcttcccg 2580
ctctgagcga ttcagctctg cccgcagctt gtacatgtct ctcccctggc aaaacaagag 2640
ctgggtagtt tagccaaacg gcaccccctc gagttcactg cagacccttc gttcaccgtg 2700
tcacacatag aggggttctg agtaagaaca aaacgttctg ctgctcaagc cagtctggca 2760
agcactcagc ccagcctcga ggtccttctg gggagagtgt aagtggacag agtcctggtc 2820
agggggcagg agtgtcccaa gggctggccc acctgctgtc tgtctgctcc tcctagccct 2880
tggtcagatg gcagccagag tccctcagga cctgcagcct cgccccggca gaagtctttt 2940
gtccaggagg caaaaagcca gagattctgc aacacgaatt cgaagcaaac aaacacaaca 3000
caacagaatt cctggaaaga agacgactgc taagacacgg caggggggcc tggagggagc 3060
ctccgactct gagctgctcc gggatctgcc gcgttctcct ctgcacattg ctgtttctgc 3120
ccctgatgct ggagctcaag gagactcctt cctctttctc agcagagctg tagctgactg 3180
tggcattact acgcctcccc acacgcccag acccctcact ccaaaatcct actggctgta 3240
gcagagaata cctttgaacc aagattctgt tttaatcatc atttacattg ttttcttcca 3300
aaggccccct cgtataccct ccctaaccca caaacctgtt aacattgtct taaggtgaaa 3360
tggctggaaa atcagtattt aactaataaa tttatctgta ttcctcttaa aaaaaaaaa 3419
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for amplifying Gata4 gene
<400> 5
agcagctccg tgtcccagac gtt 23
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for amplifying Gata4 gene
<400> 6
ccaactcaca ggagagatgc agtgtg 26
<210> 7
<211> 1195
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
ctccatcctc tgcctcaccc agtccccgct gagactgagc agacgcctcc aggatctgtc 60
ggcagctgct gttctgaggg agagcagaga ccatgtctga catagaagag gtggtggaag 120
agtacgagga ggaggagcag gaagaagcag ctgttgaaga agaggaggac tggagagagg 180
acgaagacga gcaggaggag gcagcggaag aggatgctga agcagaggct gagaccgagg 240
agaccagggc agaagaagat gaagaagaag aggaagcaaa ggaggctgaa gatggcccaa 300
tggaggagtc caaaccaaag cccaggtcgt tcatgcccaa cttggtgcct cccaagatcc 360
ccgatggaga gagagtggac tttgatgaca tccaccggaa gcgcatggag aaggacctga 420
atgagttgca ggcgctgatc gaggctcact ttgagaacag gaagaaagag gaggaggagc 480
tcgtttctct caaagacagg atcgagagac gtcgggcaga gcgggccgag cagcagcgca 540
tccggaatga gcgggagaag gagcggcaga accgcctggc tgaagagagg gctcgacgag 600
aggaggagga gaacaggagg aaggctgagg atgaggcccg gaagaagaag gctttgtcca 660
acatgatgca ttttgggggt tacatccaga agacagagcg gaaaagtggg aagaggcaga 720
ctgagcggga aaagaagaag aagattctgg ctgagaggag gaaggtgctg gccattgacc 780
acctgaatga agatcagctg agggagaagg ccaaggagct gtggcagagc atctataact 840
tggaggcaga gaagttcgac ctgcaggaga agttcaagca gcagaaatat gagatcaatg 900
ttctccgaaa caggatcaac gataaccaga aagtctccaa gacccgcggg aaggctaaag 960
tcaccgggcg ctggaaatag agcctggcct ccttcaccaa agatctgctc ctcgctcgca 1020
cctgcctccg gcctgcactc ccccagttcc cgggccctcc tgggcacccc aggcagctcc 1080
tgtttggaaa tggggagctg gcctaggtgg gagccaccac tcctgcctgc ccccacaccc 1140
actccacacc agtaataaaa agccaccaca cactgactgg caaaaaaaaa aaaaa 1195
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for amplifying troponin T
<400> 8
ctcaaagaca ggatcgagag 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for amplifying troponin T
<400> 9
gatcttcatt caggtggtca 20
<210> 10
<211> 858
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 10
gagacaggga cagacgtagg ccaagagagg ggaaccagag aggaaccaga ggggagagac 60
agagcagcaa gcagtggatt gctccttgac gacgccagca tgagctcctt ctccaccacc 120
accgtgagct tcctcctttt actggcattc cagctcctag gtcagaccag agctaatccc 180
atgtacaatg ccgtgtccaa cgcagacctg atggatttca agaatttgct ggaccatttg 240
gaagaaaaga tgcctttaga agatgaggtc gtgcccccac aagtgctcag tgagccgaat 300
gaagaagcgg gggctgctct cagccccctc cctgaggtgc ctccctggac cggggaagtc 360
agcccagccc agagagatgg aggtgccctc gggcggggcc cctgggactc ctctgatcga 420
tctgccctcc taaaaagcaa gctgagggcg ctgctcactg cccctcggag cctgcggaga 480
tccagctgct tcgggggcag gatggacagg attggagccc agagcggact gggctgtaac 540
agcttccggt actgaagata acagccaggg aggacaagca gggctgggcc tagggacaga 600
ctgcaagagg ctcctgtccc ctggggtctc tgctgcattt gtgtcatctt gttgccatgg 660
agttgtgatc atcccatcta agctgcagct tcctgtcaac acttctcaca tcttatgcta 720
actgtagata aagtggtttg atggtgactt cctcgcctct cccaccccat gcattaaatt 780
ttaaggtaga acctcacctg ttactgaaag tggtttgaaa gtgaataaac ttcagcacca 840
tggacagaag acaaaaaa 858
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for amplifying ANP
<400> 11
tccagctcct aggtcagacc 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for amplifying ANP
<400> 12
tctgggctcc aatcctgtcc 20
<210> 13
<211> 1823
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 13
gagaagctag gggtgaggaa gccctggggc gctgccgccg ctttccttaa ccacaaatca 60
ggccggacag gagagggagg ggtgggggac agtgggtggg cattcagact gccagcactt 120
tgctatctac agccggggct cccgagcggc agaaagttcc ggccactctc tgccgcttgg 180
gttgggcgaa gccaggaccg tgccgcgcca ccgccaggat atggagctac tgtcgccacc 240
gctccgcgac gtagacctga cggcccccga cggctctctc tgctcctttg ccacaacgga 300
cgacttctat gacgacccgt gtttcgactc cccggacctg cgcttcttcg aagacctgga 360
cccgcgcctg atgcacgtgg gcgcgctcct gaaacccgaa gagcactcgc acttccccgc 420
ggcggtgcac ccggccccgg gcgcacgtga ggacgagcat gtgcgcgcgc ccagcgggca 480
ccaccaggcg ggccgctgcc tactgtgggc ctgcaaggcg tgcaagcgca agaccaccaa 540
cgccgaccgc cgcaaggccg ccaccatgcg cgagcggcgc cgcctgagca aagtaaatga 600
ggcctttgag acactcaagc gctgcacgtc gagcaatcca aaccagcggt tgcccaaggt 660
ggagatcctg cgcaacgcca tccgctatat cgagggcctg caggctctgc tgcgcgacca 720
ggacgccgcg ccccctggcg ccgcagccgc cttctatgcg ccgggcccgc tgcccccggg 780
ccgcggcggc gagcactaca gcggcgactc cgacgcgtcc agcccgcgct ccaactgctc 840
cgacggcatg atggactaca gcggcccccc gagcggcgcc cggcggcgga actgctacga 900
aggcgcctac tacaacgagg cgcccagcga acccaggccc gggaagagtg cggcggtgtc 960
gagcctagac tgcctgtcca gcatcgtgga gcgcatctcc accgagagcc ctgcggcgcc 1020
cgccctcctg ctggcggacg tgccttctga gtcgcctccg cgcaggcaag aggctgccgc 1080
ccccagcgag ggagagagca gcggcgaccc cacccagtca ccggacgccg ccccgcagtg 1140
ccctgcgggt gcgaacccca acccgatata ccaggtgctc tgaggggatg gtggccgccc 1200
acccgcccga gggatggtgc ccctagggtc cctcgcgccc aaaagattga acttaaatgc 1260
ccccctccca acagcgcttt aaaagcgacc tctcttgagg taggagaggc gggagaactg 1320
aagtttccgc ccccgcccca cagggcaagg acacagcgcg gttttttcca cgcagcaccc 1380
ttctcggaga cccattgcga tggccgctcc gtgttcctcg gtgggccaga gctgaacctt 1440
gaggggctag gttcagcttt ctcgcgccct cccccatggg ggtgagaccc tcgcagacct 1500
aagccctgcc ccgggatgca ccggttattt gggggggcgt gagacccagt gcactccggt 1560
cccaaatgta gcaggtgtaa ccgtaaccca cccccaaccc gtttcccggt tcaggaccac 1620
tttttgtaat acttttgtaa tctattcctg taaataagag ttgctttgcc agagcaggag 1680
cccctggggc tgtatttatc tctgaggcat ggtgtgtggt gctacaggga atttgtacgt 1740
ttataccgca ggcgggcgag ccgcgggcgc tcgctcaggt gatcaaaata aaggcgctaa 1800
tttataaaaa aaaaaaaaaa aaa 1823
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for amplifying MyoD
<400> 14
gagcaatcca aaccagcggt tg 22
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for amplifying MyoD
<400> 15
tagtaggcgc cttcgtagca g 21
<210> 16
<211> 2084
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 16
gaccaagtga agctacaact ttgcgacata aattttgggg tctcgaacca tgtcgctgac 60
caacacaaag acggggtttt cggtcaagga catcttagac ctgccggaca ccaacgatga 120
ggagggctct gtggccgaag gtccggagga agagaacgag gggcccgagc cagccaagag 180
ggccgggccg ctggggcagg gcgccctgga cgcggtgcag agcctgcccc tgaagaaccc 240
cttctacgac agcagcgaca acccgtacac gcgctggctg gccagcaccg agggccttca 300
gtactccctg cacggtctgg ctgccggggc gccccctcag gactcaagct ccaagtcccc 360
ggagccctcg gccgacgagt caccggacaa tgacaaggag accccgggcg gcggggggga 420
cgccggcaag aagcgaaagc ggcgagtgct tttctccaag gcgcagacct acgagctgga 480
gcggcgcttt cggcagcagc ggtacctgtc ggcgcccgag cgcgaacacc tggccagcct 540
catccgcctc acgcccacgc aggtcaagat ctggttccag aaccaccgct acaagatgaa 600
gcgcgcccgg gccgagaaag ggcctggatc acagttcctc aagctttggg atacaaacga 660
atcacctggg atttggataa aatgcagatt cgtgttcagc agccctggca ttctgcattt 720
ctcatgagct ccagggagac gctggtgctg ctggggcagg accacacttt gggtggcaag 780
ggcttggcag gcaattccag gtgtcaccct agagatggcc tgctattgca ctgtcagtag 840
gtagctgcca cagtgacggc cgctccagat caaggggagg accttttgaa aagggtcctt 900
gaatcatttg ggaaataaat caagccatat gagtaaaaag taatcaaaaa atatgttgaa 960
tattggaacc agaggaaatc ttagcatcat tttgtaatga ctccctccac gaattttcca 1020
gataaggaaa ctgacaaagc caggtggcct gtggctgagg agcgagacgg tcagcgaggt 1080
ctccctgctg cactctcgtg cacttccaca gtgaaaccct gctgagagac acaggaaatg 1140
ttgaacatag tgtctttaaa attaagacta tgactgccct aaacatttac aaagcacaaa 1200
ccatgagaaa aaagcctgta ccagaaatca gaagatggct tttgtccatg tgcaaccttg 1260
gacaagttaa ttacttatcg ctgctctctg agcccgtttc cccactggtt accgaaaaaa 1320
tagaaaagga tatgcctgcc cttcctaatt cacagggcat cgcagggagg taggtagtta 1380
atatgctgaa ccacttcaaa acggtggagc tgaactcaca gcaggaaccc tgtcacacct 1440
ttccatgaca aggatatcag tggggtgagg gaggtgggga gaggcatgag gatgggagac 1500
aaaggagtgg ggtggggggc gggggaagga ggaagccaga aggacaggcc caggctaggc 1560
tctgaagtca gcaggtgagc gaggtagaga actagcagca ccactgtcca tggatatttg 1620
cggtgatgga aatgtactgt atccatgttc tccaatatgg cagccactag ccacatgtgg 1680
ctatcaagcg ctagaaatgt agctagtgtg atcgaggaac tgatctttaa tttttcttta 1740
attgttatta atttccattt aaatagccac atgtggccag tggcttatgt agcaaagatc 1800
tagatcattt gtttgaagca gtaaaaagag aaatgtgaat cccctcttct tacctcctat 1860
aacatgctaa ttaacatcac tgcaattaac caccattcac agctcttcag ctgctctgtg 1920
gaacctcagc ccactctgaa atgaacagcc gcagtggcag gggttacaga atgggctggg 1980
agtggcaatg tagatttatc tcttcacaca ctctatgccc tctatcaaaa atgcctcagg 2040
ctgtgtaaaa ttccacaaat aataaagaga ttttaaaaat gtga 2084
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for amplifying Nkx2.2
<400> 17
gacataaatt ttggggtct 19
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for amplifying Nkx2.2
<400> 18
ggttctggaa ccagatctt 19
<210> 19
<211> 3002
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 19
ggggaggagg ggagaacggg gagcgcacag cctggacgcg tgcgcaggcg tcaggcgcat 60
agacctgcta gcccctcagc tagcggcccc gcccgcgctt agcatcacta actgggctat 120
ataacctgag cgcccgcgcg gccacgacac gaggaattcg cccacgcagg aggcgcggcg 180
tccggaggcc ccagggttat gagactatca ctgctcagga cctactaaca acaaaggaaa 240
tcgaaacatg accaaatcgt acagcgagag tgggctgatg ggcgagcctc agccccaagg 300
tcctccaagc tggacagacg agtgtctcag ttctcaggac gaggagcacg aggcagacaa 360
gaaggaggac gacctcgaag ccatgaacgc agaggaggac tcactgagga acgggggaga 420
ggaggaggac gaagatgagg acctggaaga ggaggaagaa gaggaagagg aggatgacga 480
tcaaaagccc aagagacgcg gccccaaaaa gaagaagatg actaaggctc gcctggagcg 540
ttttaaattg agacgcatga aggctaacgc ccgggagcgg aaccgcatgc acggactgaa 600
cgcggcgcta gacaacctgc gcaaggtggt gccttgctat tctaagacgc agaagctgtc 660
caaaatcgag actctgcgct tggccaagaa ctacatctgg gctctgtcgg agatcctgcg 720
ctcaggcaaa agcccagacc tggtctcctt cgttcagacg ctttgcaagg gcttatccca 780
acccaccacc aacctggttg cgggctgcct gcaactcaat cctcggactt ttctgcctga 840
gcagaaccag gacatgcccc cccacctgcc gacggccagc gcttccttcc ctgtacaccc 900
ctactcctac cagtcgcctg ggctgcccag tccgccttac ggtaccatgg acagctccca 960
tgtcttccac gttaagcctc cgccgcacgc ctacagcgca gcgctggagc ccttctttga 1020
aagccctctg actgattgca ccagcccttc ctttgatgga cccctcagcc cgccgctcag 1080
catcaatggc aacttctctt tcaaacacga accgtccgcc gagtttgaga aaaattatgc 1140
ctttaccatg cactatcctg cagcgacact ggcaggggcc caaagccacg gatcaatctt 1200
ctcaggcacc gctgcccctc gctgcgagat ccccatagac aatattatgt ccttcgatag 1260
ccattcacat catgagcgag tcatgagtgc ccagctcaat gccatatttc atgattagag 1320
gcacgccagt ttcaccattt ccgggaaacg aacccactgt gcttacagtg actgtcgtgt 1380
ttacaaaagg cagccctttg ggtactactg ctgcaaagtg caaatactcc aagcttcaag 1440
tgatatatgt atttattgtc attactgcct ttggaagaaa caggggatca aagttcctgt 1500
tcaccttatg tattattttc tatagctctt ctatttaaaa aataaaaaaa tacagtaaag 1560
tttaaaaaat acaccacgaa tttggtgtgg ctgtattcag atcgtattaa ttatctgatc 1620
gggataacaa aatcacaagc aataattagg atctatgcaa tttttaaact agtaatgggc 1680
caattaaaat atatataaat atatattttt caaccagcat tttactactt gttacctttc 1740
ccatgctgaa ttattttgtt gtgattttgt acagaatttt taatgacttt ttataatgtg 1800
gatttcctat tttaaaacca tgcagcttca tcaattttta tacatatcag aaaagtagaa 1860
ttatatctaa tttatacaaa ataatttaac taatttaaac cagcagaaaa gtgcttagaa 1920
agttattgtg ttgccttagc acttctttcc tctccaattg taaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1980
aaaaaaaaaa aaaaattgca caatttgagc aattcatttc actttaaagt ctttccgtct 2040
ccctaaaata aaaaccagaa tcataatttt caagagaaga aaaaattaag agatacattc 2100
cctatcaaaa catatcaatt caacacatta cttgcacaag cttgtatata catattataa 2160
ataaatgcca acataccctt ctttaaatca aaagctgctt gactatcaca tacaatttgc 2220
actgttactt tttagtcttt tactcctttg cattccatga ttttacagag aatctgaagc 2280
tattgatgtt tccagaaaat ataaatgcat gattttatac atagtcacaa aaatggtggt 2340
ttgtcatata ttcatgtaat aaatctgagc ctaaatctaa tcaggttgtt aatgttggga 2400
tttatatcta tagtagtcaa ttagtacagt agcttaaata aattcaaacc atttaattca 2460
taattagaac aatagctatt gcatgtaaaa tgcagtccag aataagtgct gtttgagatg 2520
tgatgctggt accactggaa tcgatctgta ctgtaatttt gtttgtaatc ctgtatatta 2580
tggtgtaatg cacaatttag aaaacattca tccagttgca ataaaatagt attgaaagtg 2640
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gcttttttgc tgagttaaaa aatactaaac actatatgta gaataaaaga aaagaaaaaa 2760
gtttaccttg gcatatgctc ttgtctgttt atcttgcaca gggagtcacc agttctatgt 2820
agataatgaa aagacctaac tgatatttca ttatttggaa tatgggactg gacggcagta 2880
caaacagtgt gtttttttct ttgttttaag tggcttagcc tttaggtttt ttatttccat 2940
ttttaaaaat gattgttaca tgttttcttc tatttctttt tttaaaaggt ggattttaat 3000
aa 3002
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for amplifying NeuroD1
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gcacaatttg agcaattcat 20
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for amplifying NeuroD1
<400> 21
caagcttgtg caagtaatgt g 21
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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gaaggaagag gaagaggagg agagggaggc cagagccaga acagcccggc agcccgagct 60
tcgggggaga acggcctgag ccccgagcaa gttgcctcgg gagccctaat cctctcccgc 120
tggctcgccg agcggtcagt ggcgctcagc ggcggcgagg ctgaaatatg ataatcagaa 180
cagctgcgcc gcgcgccctg cagccaatgg gcgcggcgct cgcctgacgt ccccgcgcgc 240
tgcgtcagac caatggcgat ggagctgagt tggagcagag aagtttgagt aagagataag 300
gaagagaggt gcccgagccg cgccgagtct gccgccgccg cagcgcctcc gctccgccaa 360
ctccgccggc ttaaattgga ctcctagatc cgcgagggcg cggcgcagcc gagcagcggc 420
tctttcagca ttggcaaccc caggggccaa tatttcccac ttagccacag ctccagcatc 480
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ttacagatat gggagacatg ggagatccac caaaaaaaaa acgtctgatt tccctatgtg 600
ttggttgcgg caatcagatt cacgatcagt atattctgag ggtttctccg gatttggaat 660
ggcatgcggc atgtttgaaa tgtgcggagt gtaatcagta tttggacgag agctgtacat 720
gctttgttag ggatgggaaa acctactgta aaagagatta tatcaggttg tacgggatca 780
aatgcgccaa gtgcagcatc ggcttcagca agaacgactt cgtgatgcgt gcccgctcca 840
aggtgtatca catcgagtgt ttccgctgtg tggcctgcag ccgccagctc atccctgggg 900
acgaatttgc gcttcgggag gacggtctct tctgccgagc agaccacgat gtggtggaga 960
gggccagtct aggcgctggc gacccgctca gtcccctgca tccagcgcgg ccactgcaaa 1020
tggcagcgga gcccatctcc gccaggcagc cagccctgcg gccccacgtc cacaagcagc 1080
cggagaagac cacccgcgtg cggactgtgc tgaacgagaa gcagctgcac accttgcgga 1140
cctgctacgc cgcaaacccg cggccagatg cgctcatgaa ggagcaactg gtagagatga 1200
cgggcctcag tccccgtgtg atccgggtct ggtttcaaaa caagcggtgc aaggacaaga 1260
agcgaagcat catgatgaag caactccagc agcagcagcc caatgacaaa actaatatcc 1320
aggggatgac aggaactccc atggtggctg ccagtccaga gagacacgac ggtggcttac 1380
aggctaaccc agtggaagta caaagttacc agccaccttg gaaagtactg agcgacttcg 1440
ccttgcagag tgacatagat cagcctgctt ttcagcaact ggtcaatttt tcagaaggag 1500
gaccgggctc taattccact ggcagtgaag tagcatcaat gtcctctcaa cttccagata 1560
cacctaacag catggtagcc agtcctattg aggcatgagg aacattcatt ctgtattttt 1620
tttccctgtt ggagaaagtg ggaaattata atgtcgaact ctgaaacaaa agtatttaac 1680
gacccagtca atgaaaactg aatcaagaaa tgaatgctcc atgaaatgca cgaagtctgt 1740
tttaatgaca aggtgatatg gtagcaacac tgtgaagaca atcatgggat tttactagaa 1800
ttaaacaaca aacaaaacgc aaaacccagt atatgctatt caatgatctt agaagtactg 1860
aaaaaaaaag acgtttttaa aacgtagagg atttatattc aaggatctca aagaaagcat 1920
tttcatttca ctgcacatct agagaaaaac aaaaatagaa aattttctag tccatcctaa 1980
tctgaatggt gctgtttcta tattggtcat tgccttgcca aacaggagct ccagcaaaag 2040
cgcaggaaga gagactggcc tccttggctg aaagagtcct ttcaggaagg tggagctgca 2100
ttggtttgat atgtttaaag ttgactttaa caaggggtta attgaaatcc tgggtctctt 2160
ggcctgtcct gtagctggtt tattttttac tttgccccct ccccactttt tttgagatcc 2220
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acttataaag cattgcaaca aggttacctc tattttgcca caagcgtctc gggattgtgt 2340
ttgacttgtg tctgtccaag aacttttccc ccaaagatgt gtatagttat tggttaaaat 2400
gactgttttc tctctctatg gaaataaaaa ggaaaaaaaa aaaggaaact ttttttgttt 2460
gctcttgcat tgcaaaaatt ataaagtaat ttattattta ttgtcggaag acttgccact 2520
tttcatgtca tttgacattt tttgtttgct gaagtgaaaa aaaaagataa aggttgtacg 2580
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for amplifying Islet1
<400> 23
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for amplifying Islet1
<400> 24
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 25
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ttgcacacaa aaagcccact ccagcatcga tcccactttt ccaagttcca gaacctgtca 480
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aaaaaaaaaa aaaaaaa 2057
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<223> Forward primer for amplifying AFP
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for amplifying AFP
<400> 27
cacttctcca ataactcctg gtatc 25
Claims (20)
- 다능성 간세포 또는 그 다능성 간세포가 농축된 세포획분을, 정보제시세포 유래의 상해세포, 사세포, 그 일부 또는 이들의 조합과 공배양하는 것을 포함하며, 상기 다능성 간세포가 정보제시세포 유래의 상해세포, 사세포, 그 일부 또는 이들의 조합을 탐식하는 것을 특징으로 하는 인비트로에서 다능성 간세포를 정보제시세포와 같은 표현형 및 기능을 가지는 세포로 분화유도하는 방법으로,
여기서, 상기 다능성 간세포가, 생체의 간엽계 조직 또는 배양간엽계 세포로부터 분리된 SSEA-3 양성세포이고, 더욱이, 이하의 성질:
(i) CD105 양성임;
(ii) 텔로머레이스 활성이 낮거나 또는 없음;
(iii) 삼배엽 중 어느 배엽의 세포로 분화하는 능력을 가짐;
(iv) 종양성증식을 나타내지 않음; 및
(v) 셀프리뉴얼능을 가짐
의 모두를 가지는 다능성 간세포인, 상기 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 다능성 간세포가 CD117 음성 및 CD146 음성인 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 다능성 간세포가 CD117 음성, CD146 음성, NG2 음성, CD34 음성, vWF 음성, 및 CD271 음성인 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 다능성 간세포가 CD34 음성, CD117 음성, CD146 음성, CD271 음성, NG2 음성, vWF 음성, Sox10 음성, Snai1 음성, Slug 음성, Tyrp1 음성, 및 Dct 음성인 방법. - 제 1 항에 있어서,
다능성 간세포의 수와 정보제시세포 유래의 상해세포 또는 사세포의 수의 비가 1:10,000~10,000:1인 방법. - 제 1 항에 있어서,
정보제시세포 유래의 상해세포, 사세포, 그 일부 또는 이들의 조합이, 아포토시스 유도제, 대사길항약, 알킬화제, 안트라사이클린, 항생물질, 유계분열저해제, 토포이소머라아제 저해제, 프로테아좀 저해제, 항암제, 열, 저온, 산, 알칼리, 초음파, 및 볼텍스 등에 따른 물리적 파쇄로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 약제의 첨가에 의하여 얻어진 것인 방법. - 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
정보제시세포가 외배엽 유래세포인 방법. - 제 7 항에 있어서,
외배엽 유래세포가, 신경세포, 글리아세포, 색소세포, 피부세포, 내이세포, 망막세포, 각막세포, 및 모근세포로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 방법. - 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
정보제시세포가 중배엽 유래세포인 방법. - 제 9 항에 있어서,
중배엽 유래세포가, 심근세포, 골격근세포, 평활근세포, 골세포, 연골세포, 생식계세포, 및 조혈계세포로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 방법. - 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
정보제시세포가 내배엽 유래세포인 방법. - 제 11 항에 있어서,
내배엽 유래세포가, 췌장β세포, 간세포, 담관세포, 호흡기계 상피세포, 소화관 상피세포, 혈관 내피세포, 신장 구성세포, 방광 상피세포, 및 췌장 외분비세포로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 방법. - 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
정보제시세포가 희소세포인 방법. - 제 13 항에 있어서,
상기 희소세포가, 운동뉴런, 도파민신경, 개재뉴런, 글루타민 작동성 뉴런, 뇌하수체세포, 갑상선세포, 부신피질, 부신속질, 경동맥의 압력센서세포, 심장자극전달계, 맥락망막 상피세포, 췌장-α세포, 췌장-δ세포, 및 폐클라라세포로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 방법. - 인비트로에 있어서 세포제제 내에 함유되는 세포가, 생존하는 다능성 간세포인 것을 확인하기 위한 방법으로서,
(a) 세포제제 내의 세포와, 상해세포 또는 사세포 또는 그 일부를 공배양하고; 및
(b) 그 세포제제 내의 세포가, 상해세포 또는 사세포 또는 그 일부를 탐식하고 이로 인하여 상기 상해세포 또는 사세포 또는 그 일부에 유래하는 외배엽계 세포, 중배엽계 세포, 내배엽계 세포 또는 이들의 조합과 같은 표현형 및 기능을 가지는 세포로 분화한 경우, 그 세포제제 내에 다능성 간세포가 생존하고 있다고 판단하는 것을 포함하고,
여기서, 상기 다능성 간세포가, 생체의 간엽계 조직 또는 배양간엽계 세포로부터 분리된 SSEA-3 양성세포이고, 더욱이, 이하의 성질:
(i) CD105 양성임;
(ii) 텔로머레이스 활성이 낮거나 또는 없음;
(iii) 삼배엽 중 어느 배엽의 세포로 분화하는 능력을 가짐;
(iv) 종양성증식을 나타내지 않음; 및
(v) 셀프리뉴얼능을 가짐
의 모두를 가지는 다능성 간세포인, 상기 방법. - 다능성 간세포 또는 그 다능성 간세포가 농축된 세포획분을, 정보제시세포 유래의 상해세포, 사세포, 그 일부 또는 이들의 조합과 공배양하는 것을 포함하며, 상기 다능성 간세포가 정보제시세포 유래의 상해세포, 사세포, 그 일부 또는 이들의 조합을 탐식하는 것을 특징으로 하는 인비트로에서 다능성 간세포로부터 정보제시세포와 같은 표현형 및 기능을 가지는 세포를 제조하는 방법으로,
여기서, 상기 다능성 간세포가, 생체의 간엽계 조직 또는 배양간엽계 세포로부터 분리된 SSEA-3 양성세포이고, 더욱이, 이하의 성질:
(i) CD105 양성임;
(ii) 텔로머레이스 활성이 낮거나 또는 없음;
(iii) 삼배엽 중 어느 배엽의 세포로 분화하는 능력을 가짐;
(iv) 종양성증식을 나타내지 않음; 및
(v) 셀프리뉴얼능을 가짐
의 모두를 가지는 다능성 간세포인, 상기 방법. - 삭제
- 삭제
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- 삭제
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KR20190034552A (ko) | 2019-04-02 |
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Dawson | Cardiac Tissue Engineering |
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