JP5970245B2 - 幹細胞から肝細胞への分化誘導方法 - Google Patents
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1.幹細胞から肝細胞への分化過程において、Adベクターを用いて細胞にFOXA2遺伝子および/またはHNF1α遺伝子を導入する工程を含む、幹細胞から肝細胞への分化誘導方法。
2.幹細胞から肝細胞への分化過程において、Adベクターを用いて細胞に遺伝子を導入する工程が、中内胚葉系細胞にFOXA2遺伝子を導入する工程である、前項1に記載の幹細胞から肝細胞への分化誘導方法。
3.幹細胞から肝細胞への分化過程において、Adベクターを用いて細胞に遺伝子を導入する工程が、内胚葉系細胞にFOXA2遺伝子および/またはHNF1α遺伝子を導入する工程である、前項1または2に記載の幹細胞から肝細胞への分化誘導方法。
4.幹細胞から肝細胞への分化過程において、Adベクターを用いて細胞に遺伝子を導入する工程が、肝幹前駆細胞にFOXA2遺伝子および/またはHNF1α遺伝子を導入する工程である、前項1〜3のいずれか1に記載の幹細胞から肝細胞への分化誘導方法。
5.さらに、Adベクターを用いて核内受容体遺伝子であるCAR (constitutive androstane receptor)遺伝子および/またはFXR (Farnesoid X Receptor)遺伝子を導入する工程を含む前項1〜4のいずれか1に記載の幹細胞から肝細胞への分化誘導方法。
6.Adベクターを用いて核内受容体遺伝子であるCAR遺伝子および/またはFXR遺伝子の導入が、FOXA2遺伝子および/またはHNF1α遺伝子を導入する工程の後になされる前項5に記載の幹細胞から肝細胞への分化誘導方法。
7.前項1〜6のいずれか1に記載の幹細胞から肝細胞への分化誘導方法により得られた肝細胞。
8.前項7に記載された肝細胞について、CYP酵素活性を測定することを特徴とする、肝細胞による薬剤代謝能の測定方法。
9.CYP酵素活性に加えて、UGT活性および/またはGST活性を測定することを特徴とする、前項8に記載の薬剤代謝能の測定方法。
10.薬物を、前項1〜6のいずれか1に記載の幹細胞から肝細胞への分化誘導方法により得られた肝細胞と接触させ、細胞毒性を評価することを特徴とする、薬物の毒性検査方法。
A)導入遺伝子の非翻訳領域にプロモーター配列を含む発現コンストラクトを構築する工程。
B)Adゲノムを制限酵素で切断し、A)で作製した発現コンストラクトをAdゲノムにライゲーションする工程。
本参考例では、本発明の分化誘導肝細胞を作製するための中内胚葉系細胞の作製方法について示した。
(1)幹細胞の培養
幹細胞として、ヒトES細胞(human embryonic stem cells:以下「hESCs」)であるhESCs株H9 (WiCell Research Institute)、またはヒトiPS細胞(human induced pluripotent stem cells:以下「hiPSCs」)であるhiPSCs株Dotcom(JCRB Cellbankから供与;Dotcom、JCRB Number:JCRB1327)を使用した。以下の各実施例においても同様である。
hESCsは、5 ng/mLの塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF, Sigma)を含むRepro Stem培地(ReproCELL)を用いて、マイトマイシンC処理済みのマウス胚性線維芽細胞(mouse embryonic fibroblasts;MEF)上で培養した。hiPSCsは、10 ng/mLのbFGFを含むiPSellon培地 (Cardio) を用いて、マイトマイシンC処理済みのMEF上で培養した。4〜5日ごとに0.1 mg/mLディスパーゼ(Roche)を用いて継代を行った。
幹細胞から中内胚葉系細胞への分化誘導は以下の方法で行った。hESCsまたはhiPSCsについて、分化誘導開始の24時間前に無血清培地hESF9で培地交換した。次に、細胞剥離液(Accutase, Millipore)を用いてhESCsまたはhiPSCsを回収後、100 ng/ml アクチビンA(Activin A, R&D systems)を含むDifferentiation hESF-GRO培地(10 μg/mL human recombinant insulin、5 μg/mL human apotransferrin、10 μM 2-mercaptoethanol、10 μM ethanolamine、10 μM sodium selenite、0.5 mg/mL fatty acid free bovine albumin [all from Sigma]を含む hESF-GRO培地 [Cell Science & Technology Institute]))に懸濁後、BDマトリゲルTM(Matrigel, BD Biosciences)でコーティングした細胞培養用12ウェルプレート(住友ベークライト)の各ウェルに6.25×104 cells/cm2の細胞密度でhESCsまたはhiPSCsを播種し、2日間培養し、中内胚葉系細胞を作製した。
本実施例では、Adベクターを用いて各種遺伝子を導入することによる、肝細胞への効果的な分化誘導方法について示した。本実施例では、hESCs由来の細胞を用いて検討した。
Adベクターの作製はin vitro ライゲーション法により行った。シャトルプラスミドpHMEF5のマルチクローニング部位に、FOXA2遺伝子またはHNF1α遺伝子を挿入した、FOXA2遺伝子またはHNF1α遺伝子発現シャトルプラスミドを作製した。導入する遺伝子は、FOXA2遺伝子では例えばGenBank Accession No. NM_021784に登録されているものを、HNF1α遺伝子では例えばGenBank Accession No. NM_000545に登録されているものを用いた。
中内胚葉系細胞から内胚葉系細胞への分化を促進するために、参考例1で作製した培養2日目の中内胚葉系細胞に対して、上記(1)で作製した7種類の転写因子をそれぞれ搭載したAdベクター(Ad-SOX17、Ad-FOXA2、Ad-HEX、Ad-HNF1α、Ad-HNF1β、Ad-HNF4α、Ad-HNF6)を、各3,000 vector particles(VP)/cell加え、作用させた(図1)。
各作用させた細胞の培養5日目にそれぞれの細胞の内胚葉マーカー(CXCR4)の発現をFACSにより評価した。CXCR4は、FOXA2遺伝子導入細胞とSOX17遺伝子導入細胞の間で同程度の発現を示した(図2)。したがって、FOXA2遺伝子の導入により中内胚葉系細胞から内胚葉系細胞へ分化促進できることが示された。
上記(2)で作製した培養6日目の内胚葉系細胞に対して、上記(1)で作製したAdベクターAd-FOXA2、Ad-HNF1α)各々を1,500 vector particles(VP)/cell(合計3,000 vector particles(VP)/cell)作用させ、3日間培養した(図3)。その後、肝幹前駆細胞への分化誘導効率は肝幹前駆細胞マーカーであるAFP(α-1-fetoprotein)およびCYP3A7の発現を、FACSおよびRT-PCR法により確認した。その結果、Ad-FOXA2またはAd-HNF1αを3,000 vector particles(VP)/cellを導入した系で、AFP陽性細胞の割合が高かった(図4)。また、Ad-FOXA2およびAd-HNF1αを1,500 vector particles(VP)/cell(合計3,000 vector particles(VP)/cell)を導入した系で、CYP3A7の発現が高かった(図5)。したがって、FOXA2遺伝子およびHNF1α遺伝子の導入により内胚葉系細胞から肝幹前駆細胞へ分化促進できることが示された。
肝幹前駆細胞から成熟肝細胞への分化を促進するため、上記(3)で作製した培養9日目の肝幹前駆細胞に対して、上記(1)で作製した7種類の転写因子をそれぞれ搭載したAdベクター(Ad-SOX17、Ad-FOXA2、Ad-HEX、Ad-HNF1α、Ad-HNF1β、Ad-HNF4α又はAd-HNF6)を、各3,000 vector particles(VP)/cellずつ加え、作用させた(図6)。各作用させた細胞のそれぞれの細胞の成熟肝細胞への分化誘導効率を、培養20日目に肝細胞マーカーであるASGR1(asialoglycoprotein receptor 1)及びCYP2C19の発現をFACSおよびRT-PCR法により確認した(図7、8)。FOXA2、HNF1α遺伝子もしくはFOXA2、HNF4α遺伝子を組み合わせることによって、さらなる肝成熟化の促進が確認された。
本実施例では、分化誘導肝細胞による薬物代謝能の評価について検討した。本実施例では、hiPSCs由来の細胞を用いて検討した。薬物の大半は肝臓において代謝され、CYP、UGT酵素がその役割において特に重要であることが知られている。図9に示すプロトコールによる分化誘導肝細胞が、ヒト初代培養肝細胞(PHs)と比較して、どの程度の肝機能を有するか評価した。薬物代謝の第I相反応に関与するCYP遺伝子(図11)、薬物代謝の第II相反応に関与するUGT遺伝子やGST遺伝子(図12)、薬物代謝の第III相反応に関与する各種トランスポーター(図13)、CYP誘導に関与する肝関連核内受容体遺伝子(図14)の発現を調べた。その結果、分化誘導肝細胞における各種遺伝子の発現はヒト初代培養肝細胞と同程度のものが多かった。しかしながら、胎児型のCYPであるCYP3A7の発現がヒト初代培養肝細胞と比較して高いことから、幼弱肝細胞としての性質を有しており、分化誘導肝細胞はさらなる成熟化の余地があると考えられた。
本実施例では、hESCsから分化誘導した培養2日目の中内胚葉系細胞にFOXA2遺伝子、培養6日目の内胚葉および培養 9日目の肝幹前駆細胞にそれぞれFOXA2, HNF1α遺伝子を導入して肝分化誘導させた後、培養20日目の細胞に対して、以下の核内受容体遺伝子を導入した。本実施例でさらに導入する遺伝子は、肝細胞において発現するAR (androstane receptor)、 CAR (constitutive androstane receptor)、FXR (Farnesoid X Receptor)、PPAR (peroxi- some proliferator-activated receptor)α、PXR (Pregnane X receptor)、RXR (retinoid X receptor)α、SHP (small heterodimer partner)等の核内受容体遺伝子である。各種遺伝子は、実施例1と同手法により各Adベクターを作製し、培養20日目の細胞に対して導入した。培養35日目に肝細胞への成熟度を肝関連マーカー(ASGR1)、胆管関連マーカー(CK7:cytokeratin 7)、肝幹前駆細胞等の未熟肝マーカー(AFP)の発現を測定することにより評価した。各マーカーの確認は、培養35日目にFACSにより調べた。
Claims (5)
- 幹細胞から肝細胞への分化過程のうち、中内胚葉系細胞、内胚葉系細胞および肝幹前駆細胞のいずれかの細胞において、アデノウイルスベクターを用いて細胞にFOXA2遺伝子および/またはHNF1α遺伝子を導入し、発現させる工程を含む、幹細胞から肝細胞への分化誘導方法。
- アデノウイルスベクターを用いて中内胚葉系細胞にFOXA2遺伝子を導入し、発現させる工程を含む、請求項1に記載の幹細胞から肝細胞への分化誘導方法。
- アデノウイルスベクターを用いて内胚葉系細胞にFOXA2遺伝子および/またはHNF1α遺伝子を導入し、発現させる工程を含む、請求項1または2に記載の幹細胞から肝細胞への分化誘導方法。
- アデノウイルスベクターを用いて肝幹前駆細胞にFOXA2遺伝子および/またはHNF1α遺伝子を導入し、発現させる工程を含む、請求項1〜3のいずれか1に記載の幹細胞から肝細胞への分化誘導方法。
- 請求項1〜4のいずれか1に記載の方法でFOXA2遺伝子および/またはHNF1α遺伝子を細胞に導入し、幹細胞から肝細胞へ分化誘導させた後、さらに、アデノウイルスベクターを用いて核内受容体遺伝子であるCAR (constitutive androstane receptor)遺伝子および/またはFXR (Farnesoid X Receptor)遺伝子を導入し、発現させる工程を含む、請求項1〜4のいずれか1に記載の幹細胞から肝細胞への分化誘導方法。
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