JPWO2019107535A1 - 多能性幹細胞からの立体臓器の構築 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)血管系細胞、間葉系細胞、及び組織又は臓器細胞から作製された器官芽であって、前記血管系細胞、間葉系細胞、及び組織又は臓器細胞のそれぞれが多能性幹細胞から誘導されたものである、前記器官芽。
(2)器官芽は、成熟することで器官に分化することができる構造体である(1)記載の器官芽。
(3)多能性幹細胞がヒト由来である(1)又は(2)に記載の器官芽。
(4)多能性幹細胞が人工多能性幹細胞及び胚性幹細胞からなる群より選択される少なくとも1つの細胞である(1)〜(3)のいずれかに記載の器官芽。
(5)臓器細胞が肝細胞であり、器官芽が肝芽である(1)〜(4)のいずれかに記載の器官芽。
(6)肝細胞がTBX3陽性及びADRA1B陽性である(5)記載の器官芽。
(7)間葉系細胞がCD166陽性及びCD31陰性である(1)〜(6)のいずれかに記載の器官芽。
(8)間葉系細胞がLHX2陽性及びWT1陽性である(1)〜(7)のいずれかに記載の器官芽。
(9)間葉系細胞のFOXF1、HLX1、COL4A及びALCAMの転写が活性化しており、間葉系細胞がLHX2陽性、WT1陽性及びMIIA陽性である(8)記載の器官芽。
(10)血管系細胞がCD31陽性及びCD144陽性である(1)〜(9)のいずれかに記載の器官芽。
(11)血管系細胞のPECAM1、CDH5、KDR及びCD34からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現が分化誘導前の多能性幹細胞より上昇している(10)記載の器官芽。
(12)多能性幹細胞をROCK阻害剤の存在下で培養した後、トランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子、Wntファミリーに属する因子及びclass I histone脱アセチル化酵素(HDAC)阻害剤の存在下で培養し、さらに、トランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子及びWntファミリーに属する因子の存在下で培養する工程を経て得られた細胞をFGF及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養して分化誘導したTBX3陽性及びADRA1B陽性である細胞を組織又は臓器細胞として用いる(1)〜(11)のいずれかに記載の器官芽。
(13)多能性幹細胞をROCK阻害剤の存在下で培養した後、βカテニン活性化剤、PI3K阻害剤及びトランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子の存在下で培養し、さらに、トランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子及びBMP阻害剤の存在下で培養する工程を経て得られた細胞をFGF及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養して分化誘導したTBX3陽性及びADRA1B陽性である細胞を組織又は臓器細胞として用いる(1)〜(11)のいずれかに記載の器官芽。
(14)多能性幹細胞をROCK阻害剤の存在下で培養した後、トランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子の存在下で培養する工程を経て得られた細胞をFGF及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養して分化誘導したTBX3陽性及びADRA1B陽性である細胞を組織又は臓器細胞として用いる(1)〜(11)のいずれかに記載の器官芽。
(15)多能性幹細胞をROCK阻害剤の存在下で培養した後、トランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子及びβカテニン活性化剤の存在下で培養し、さらに、トランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子の存在下で培養する工程を経て得られた細胞をFGF及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養して分化誘導したTBX3陽性及びADRA1B陽性である細胞を組織又は臓器細胞として用いる(1)〜(12)のいずれかに記載の器官芽。
(16)多能性幹細胞をβカテニン活性化剤及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養した後、PDGF受容体活性化剤及びトランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子の存在下で培養し、さらに、FGFの存在下で培養する工程を経て得られたLHX2陽性及びWT1陽性である細胞を間葉系細胞として用いる(1)〜(15)のいずれかに記載の器官芽。
(17)多能性幹細胞をβカテニン活性化剤及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養した後、PDGF受容体活性化剤及びトランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子の存在下で培養し、さらに、FGFの存在下で培養し、その後、間葉系細胞用培地で維持培養する工程を経て得られたCD166陽性及びCD31陰性である細胞を間葉系細胞として用いる(1)〜(15)のいずれかに記載の器官芽。
(18)多能性幹細胞をROCK阻害剤の存在下で培養した後、βカテニン活性化剤及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養し、さらに、血管内皮細胞増殖因子受容体(VEGFR)活性化剤及びアデニル酸シクラーゼ活性化剤の存在下で培養する工程を経て得られたCD31陽性及びCD144陽性である細胞を血管系細胞として用いる(1)〜(17)のいずれかに記載の器官芽。
(19)多能性幹細胞をROCK阻害剤の存在下で培養した後、血管内皮細胞増殖因子受容体(VEGFR)活性化剤、トランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子、βカテニン活性化剤及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養し、さらに、血管内皮細胞増殖因子受容体(VEGFR)活性化剤及びTGF-βのI型受容体の阻害剤の存在下で培養する工程を経て得られたCD31陽性及びCD144陽性である細胞を血管系細胞として用いる(1)〜(17)のいずれかに記載の器官芽。
(20)多能性幹細胞をROCK阻害剤の存在下で培養した後、トランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子の存在下で培養し、さらに、FGF及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養し、その後、血管内皮細胞増殖因子受容体(VEGFR)活性化剤の存在下で培養する工程を経て得られたCD31陽性及びCD144陽性である細胞を血管系細胞として用いる(1)〜(17)のいずれかに記載の器官芽。
(21)多能性幹細胞をROCK阻害剤の存在下で培養した後、TGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養し、さらに、TGFβスーパーファミリーに属する因子、血管内皮細胞増殖因子受容体(VEGFR)活性化剤及びFGFの存在下で培養する工程を経て得られたCD31陽性及びCD144陽性である細胞を血管系細胞として用いる(1)〜(17)のいずれかに記載の器官芽。
(22)血管系細胞、間葉系細胞、及び組織又は臓器細胞をin vitroで培養することを含む、器官芽の作製方法であって、前記血管系細胞、間葉系細胞、及び組織又は臓器細胞のそれぞれが多能性幹細胞から誘導されたものである、前記方法。
(23)足場材料を用いることなく、細胞が培養される(22)記載の方法。
(24)(1)〜(21)のいずれかに記載の器官芽を非ヒト動物に移植し、組織又は臓器に分化させることを含む、組織又は臓器の作製方法。
(25)(1)〜(21)のいずれかに記載の器官芽をヒト又は非ヒト動物に移植することを含む、器官芽の移植方法。
(26)(1)〜(21)のいずれかに記載の器官芽をヒト又は非ヒト動物に移植し、組織又は臓器に分化させることを含む、組織又は臓器の再生又は機能回復方法。
(27)(1)〜(21)のいずれかに記載の器官芽を非ヒト動物に移植し、組織又は臓器に分化させることを含む、非ヒトキメラ動物の作製方法。
(28)(1)〜(21)のいずれかに記載の器官芽、(24)記載の方法によって作製された組織及び臓器、並びに(27)記載の方法によって作製された非ヒトキメラ動物からなる群より選択される少なくとも一つを用いて、薬剤を評価する方法。
(29)多能性幹細胞をROCK阻害剤の存在下で培養した後、トランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子、Wntファミリーに属する因子及びclass I histone脱アセチル化酵素(HDAC)阻害剤の存在下で培養し、さらに、トランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子及びWntファミリーに属する因子の存在下で培養する工程を経て得られた細胞をFGF及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養して、TBX3陽性及びADRA1B陽性である細胞へ分化誘導することを含む、TBX3陽性及びADRA1B陽性である細胞を作製する方法。
(30)多能性幹細胞をROCK阻害剤の存在下で培養した後、βカテニン活性化剤、PI3K阻害剤及びトランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子の存在下で培養し、さらに、トランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子及びBMP阻害剤の存在下で培養する工程を経て得られた細胞をFGF及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養して、TBX3陽性及びADRA1B陽性である細胞へ分化誘導することを含む、TBX3陽性及びADRA1B陽性である細胞を作製する方法。
(31)多能性幹細胞をROCK阻害剤の存在下で培養した後、トランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子の存在下で培養する工程を経て得られた細胞をFGF及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養して、TBX3陽性及びADRA1B陽性である細胞へ分化誘導することを含む、TBX3陽性及びADRA1B陽性である細胞を作製する方法。
(32)多能性幹細胞をROCK阻害剤の存在下で培養した後、トランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子及びβカテニン活性化剤の存在下で培養し、さらに、トランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子の存在下で培養する工程を経て得られた細胞をFGF及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養して、TBX3陽性及びADRA1B陽性である細胞へ分化誘導することを含む、TBX3陽性及びADRA1B陽性である細胞を作製する方法。
(33)多能性幹細胞をβカテニン活性化剤及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養した後、PDGF受容体活性化剤及びトランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子の存在下で培養し、さらに、FGFの存在下で培養することを含む、LHX2陽性及びWT1陽性である細胞を作製する方法。
(34)多能性幹細胞をβカテニン活性化剤及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養した後、PDGF受容体活性化剤及びトランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子の存在下で培養し、さらに、FGFの存在下で培養し、その後、間葉系細胞用培地で維持培養することを含む、CD166陽性及びCD31陰性である細胞を作製する方法。
(35)多能性幹細胞をROCK阻害剤の存在下で培養した後、βカテニン活性化剤及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養し、さらに、血管内皮細胞増殖因子受容体(VEGFR)活性化剤及びアデニル酸シクラーゼ活性化剤の存在下で培養することを含む、CD31陽性及びCD144陽性である細胞を作製する方法。
(36)多能性幹細胞をROCK阻害剤の存在下で培養した後、血管内皮細胞増殖因子受容体(VEGFR)活性化剤、トランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子、βカテニン活性化剤及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養し、さらに、血管内皮細胞増殖因子受容体(VEGFR)活性化剤及びTGF-βのI型受容体の阻害剤の存在下で培養することを含む、CD31陽性及びCD144陽性である細胞を作製する方法。
(37)多能性幹細胞をROCK阻害剤の存在下で培養した後、トランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子の存在下で培養し、さらに、FGF及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養し、その後、血管内皮細胞増殖因子受容体(VEGFR)活性化剤の存在下で培養することを含む、CD31陽性及びCD144陽性である細胞を作製する方法。
(38)多能性幹細胞をROCK阻害剤の存在下で培養した後、TGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養し、さらに、TGFβスーパーファミリーに属する因子、血管内皮細胞増殖因子受容体(VEGFR)活性化剤及びFGFの存在下で培養することを含む、CD31陽性及びCD144陽性である細胞を作製する方法。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2017‐230647の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。
本明細書において、細胞表面マーカーについて、「陽性」、「+」などの表現は、細胞表面マーカーがその細胞に発現していることが免疫染色などの方法により確認できる状態にあることをいい、また、「陰性」、「−」などの表現は、免疫染色などの方法により発現が確認できない状態であることをいう。
TBX3 ADR1AB共陽性の肝臓内胚葉細胞(iPSC-HE)は、後述の実施例に記載の方法により作製することができる(図8AのProtocol 1-3及び図13A)。
図8AのProtocol 1によれば、多能性幹細胞をROCK阻害剤、トランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子、Wntファミリーに属する因子及びclass I histone脱アセチル化酵素(HDAC)阻害剤(入れなくても良い)の存在下で培養した(例えば1〜2日間)後、トランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子、Wntファミリーに属する因子及びclass I histone脱アセチル化酵素(HDAC)阻害剤(入れなくても良い)の存在下で培養する(例えば、1〜2日間)。さらに、トランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子及びWntファミリーに属する因子の存在下で培養する(例えば、0〜3日間)工程を経て得られた細胞(Definitive Endoderm)をFGF及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養して(例えば、1〜4日間)TBX3陽性及びADRA1B陽性である細胞へ分化誘導することができる。
図8AのProtocol 2によれば、多能性幹細胞をROCK阻害剤の存在下で培養した(例えば1〜2日間)後、βカテニン活性化剤、PI3K阻害剤及びトランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子の存在下で培養する(例えば1〜2日間)。さらに、トランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子及びBMP阻害剤の存在下で培養する(例えば2〜4日間)工程を経て得られた細胞(Definitive Endoderm)をFGF及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養して(例えば1〜4日間)、TBX3陽性及びADRA1B陽性である細胞を分化誘導することができる。
図8AのProtocol 3によれば、多能性幹細胞をROCK阻害剤の存在下で培養した(例えば1〜2日間)後、トランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子の存在下で培養する(例えば2〜5日間)工程を経て得られた細胞(Definitive Endoderm)をFGF及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養して(例えば1〜4日間)、TBX3陽性及びADRA1B陽性である細胞へ分化誘導することができる。
図13Aのプロトコルによれば、多能性幹細胞をROCK阻害剤の存在下、トランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子及びβカテニン活性化剤及びclass I histone脱アセチル化酵素(HDAC)阻害剤(入れなくても良い)の存在下で培養した(例えば1〜2日間)後、トランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子及びβカテニン活性化剤及びclass I histone脱アセチル化酵素(HDAC)阻害剤(入れなくても良い)の存在下で培養する(例えば1〜2日間)。さらに、トランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子の存在下で培養する(例えば0〜4日間)工程を経て得られた細胞(Definitive Endoderm)をFGF及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養して(例えば1〜4日間)、TBX3陽性及びADRA1B陽性である細胞を分化誘導することができる。
上述した、多能性幹細胞からTBX3陽性及びADRA1B陽性である細胞を分化誘導するまでの各培養工程の前後には、追加の培養工程が入ってもよい。
本発明は、多能性幹細胞をROCK阻害剤、βカテニン活性化剤及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養した(例えば1〜2日間)後、βカテニン活性化剤及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養し(例えば2〜3日間)、さらに、血管内皮細胞増殖因子受容体(VEGFR)活性化剤及びアデニル酸シクラーゼ活性化剤の存在下で培養する(例えば4〜8日間)ことを含む、CD31陽性及びCD144陽性である細胞を作製する方法を提供する(図11AのPr1)。CD31陽性及びCD144陽性である細胞は、iPSC-ECでありうる。CD31陽性及びCD144陽性である細胞は、器官芽の作製に用いることができる。
本発明は、多能性幹細胞をROCK阻害剤、血管内皮細胞増殖因子受容体(VEGFR)活性化剤、トランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子、βカテニン活性化剤及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養した(例えば1〜2日間)後、血管内皮細胞増殖因子受容体(VEGFR)活性化剤、トランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子、βカテニン活性化剤及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養し(例えば2〜4日間)、さらに、血管内皮細胞増殖因子受容体(VEGFR)活性化剤及びTGF-βのI型受容体の阻害剤の存在下で培養する(例えば4〜7日間)ことを含む、CD31陽性及びCD144陽性である細胞を作製する方法も提供する(図11AのPr2)。CD31陽性及びCD144陽性である細胞は、iPSC-ECでありうる。CD31陽性及びCD144陽性である細胞は、器官芽の作製に用いることができる。
本発明は、多能性幹細胞をROCK阻害剤、トランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子の存在下で培養した(例えば1〜2日間)後、トランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子の存在下で培養し(例えば1〜3日間)、さらに、FGF及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養し(例えば1〜3日間)、その後、血管内皮細胞増殖因子受容体(VEGFR)活性化剤の存在下で培養する(例えば2〜7日間)ことを含む、CD31陽性及びCD144陽性である細胞を作製する方法も提供する(図11AのPr3)。CD31陽性及びCD144陽性である細胞は、iPSC-ECでありうる。CD31陽性及びCD144陽性である細胞は、器官芽の作製に用いることができる。
本発明は、多能性幹細胞をROCK阻害剤、TGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養した(例えば1〜2日間)後、TGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養し(例えば2〜4日間)、さらに、TGFβスーパーファミリーに属する因子、血管内皮細胞増殖因子受容体(VEGFR)活性化剤及びFGFの存在下で培養する(例えば2〜7日間)ことを含む、CD31陽性及びCD144陽性である細胞を作製する方法も提供する(図11AのPr4)。CD31陽性及びCD144陽性である細胞は、iPSC-ECでありうる。CD31陽性及びCD144陽性である細胞は、器官芽の作製に用いることができる。
上述した、多能性幹細胞からCD31陽性及びCD144陽性である細胞を分化誘導するまでの各培養工程の前後には、追加の培養工程が入ってもよい。
さらに、CD31陽性及びCD144陽性である細胞を再播種し、拡張培地で培養することで、CD31及び/又はCD144の陽性率を上げることも可能である(後述の実施例3)。拡張培地は一定の期間経過後に交換する際に種類を変更してもよい。再播種時の拡張培地としては、VEGF-Aを補充したStemPro-34SFMが好適であり、これと交換する培地としては、Miracell (登録商標) EC(タカラバイオ)が好適であるが、これらの培地に限定されるわけではない。再播種時に1日間 ROCK阻害剤を添加するとよい。
本発明の器官芽の作製において、血管系細胞は、CD31陽性であり、CD144陽性であるとよい。また、血管系細胞は、PECAM1、CDH5、KDR及びCD34からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現が分化誘導前の多能性幹細胞より上昇しているとよい。
本発明は、多能性幹細胞をROCK阻害剤、βカテニン活性化剤及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養した(例えば1〜2日間)後、βカテニン活性化剤及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養し(例えば3〜5日間)、PDGF受容体活性化剤及びトランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子の存在下で培養し(例えば1〜4日間)、さらに、FGF及びトランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子の存在下で培養し(例えば2〜6日間)、その後、間葉系細胞用培地で維持培養する(例えば3〜20日間)ことを含む、CD166陽性及びCD31陰性である細胞を作製する方法も提供する。多能性幹細胞からCD166陽性及びCD31陰性である細胞を分化誘導するまでの各培養工程の前後には、追加の培養工程が入ってもよい。CD166陽性及びCD31陰性である細胞は、間葉系細胞(iPSC-MC)でありうる。CD166陽性及びCD31陰性である細胞は、器官芽の作製に用いることができる。
間葉系細胞用培地としては、MSCGMなどを例示することができるが、これに限定されるわけではない。
本発明の器官芽の作製において、間葉系細胞は、中隔膜間葉(STM)細胞であってもよい。STM細胞は、LHX2陽性であり、WT1陽性であるうる。STM細胞は、FOXF1、HLX1、COL4A及びALCAMの転写が活性化しており、LHX2陽性、WT1陽性及びMIIA陽性でありうる。
本発明は、多能性幹細胞をROCK阻害剤、βカテニン活性化剤及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養した(例えば1〜2日間)後、βカテニン活性化剤及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養し(例えば3〜5日間)、PDGF受容体活性化剤及びトランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子の存在下で培養し(例えば1〜4日間)、さらに、FGF及びトランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子の存在下で培養する(例えば2〜6日間)ことを含む、LHX2陽性及びWT1陽性である細胞を作製する方法も提供する。多能性幹細胞からLHX2陽性及びWT1陽性である細胞を分化誘導するまでの各培養工程の前後には、追加の培養工程が入ってもよい。LHX2陽性及びWT1陽性である細胞は、中隔膜間葉(STM)細胞でありうる。LHX2陽性及びWT1陽性である細胞は、器官芽の作製に用いることができる。
ROCK阻害剤としては、Y-27632、GSK429286A、SR3677、Ripasudil(K-115)、Fasudil、Thiazovivinなどを例示することができ、このうち、Y-27632が好ましい。
トランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子としては、ActivinA、Nodalなどを例示することができ、このうち、ActivinAが好ましい。
Wntファミリーに属する因子としては、Wnt3a、Wnt3a-AFM、CHIR99021、R-Spondin-1、BIO(6-bromoindirubin-3′-oxime)などを例示することができ、このうち、Wnt3aが好ましい。Wntファミリーに属する因子はβカテニンを活性化することができるものであるとよい。
class I histone脱アセチル化酵素(HDAC)阻害剤としては、酪酸塩(例えば、Sodium butyrate)、Valproic Acid、Panobinosta(LBH589)、Apicidin、BML-210、Depudecin、HC Toxin、M344、Oxamflatin、Scriptaid、Splitomicin、Suberoyl bis-hydroxamic acid、Trichostatin A、Vorinostat (SAHA, MK0683)、Entinostat (MS-275)、Panobinostat (LBH589)、Mocetinostat (MGCD0103)、Biphenyl-4-sulfonyl chloride、ACY-738、Belinostat (PXD101)、Romidepsin (FK228, Depsipeptide)、MC1568、Tubastatin A、Givinostat (ITF2357)、Dacinostat (LAQ824)、CUDC-101、Quisinostat (JNJ-26481585)、Pracinostat (SB939)、PCI-34051、Droxinostat、Abexinostat (PCI-24781)、RGFP966、AR-42、Rocilinostat (ACY-1215)、Tacedinaline (CI994)、CUDC-907、Curcumin、Tubacin、RG2833 (RGFP109)、Resminostat、Divalproex Sodium、Sodium Phenylbutyrate、Tubastatin A、TMP269、Santacruzamate A (CAY10683)、TMP195、Tasquinimod、BRD73954、Citarinostat (ACY-241)、HPOB、LMK-235、Nexturastat A、Tucidinostat (Chidamide)、(-)-Parthenolide、CAY10603、4SC-202、BG45、ITSA-1 (ITSA1)などを例示することができ、このうち、Sodium butyrateが好ましい。
FGF(線維芽細胞増殖因子)としては、塩基性FGF(bFGF、FGF2と記すこともある)、FGF4、FGFC(Chimeric Fibroblast Growth Factor)などを例示することができ、このうち、塩基性FGFが好ましい。
TGFβスーパーファミリーに属する因子としては、BMP4、BMP2、BMPなどを例示することができ、このうち、BMP4が好ましい。
βカテニン活性化剤としては、CHIR99021、Wnt3a、Wnt3a-AFM、R-Spondin-1、BIO(6-bromoindirubin-3′-oxime)などを例示することができ、このうち、CHIR99021が好ましい。CHIR99021は、iPSCからDEへの分化誘導においてWnt3aの代替品となりうる(後述の実施例2、図13AのCHIR d3)。
PI3K阻害剤としては、PI-103、ZSTK474、NVP-BEZ235、LY294002、Wortmanninなどを例示することができ、このうち、PI-103が好ましい。PI3K阻害剤は、PI3K、Akt、mTOR阻害剤であるとよい。
BMP阻害剤としては、LDN-193189、Galunisertib (LY2157299)、LY2109761、SB525334、SB505124、Pirfenidone、GW788388、LY364947、RepSox、K02288、SD-208、LDN-214117、SIS3 HCl、Vactosertib (TEW-7197)、DMH1、LDN-212854、ML347、Kartogenin、Hesperetin、Alantolactoneなどを例示することができ、このうち、LDN-193189が好ましい。BMP阻害剤は、ALK2およびALK3阻害剤であるとよい。
血管内皮細胞増殖因子受容体(VEGFR)活性化剤としては、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、PlGFなどを例示することができ、このうち、VEGFが好ましい。
アデニル酸シクラーゼ活性化剤としては、Forskolin、HJC0350、8-Br-cAMP、Adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate (cAMP)、Dibutyryl-cAMP (Bucladesine)などを例示することができ、このうち、Forskolinが好ましい。アデニル酸シクラーゼ活性化剤は、細胞内cAMP濃度を上昇させるものであるとよい。
TGF-βのI型受容体の阻害剤としては、SB431542、LDN-193189、Galunisertib (LY2157299)、LY2109761、SB525334、SB505124、GW788388、LY364947、RepSox、LDN-193189、K02288、LDN-214117、SD-208、Vactosertib(TEW-7197)、ML347、LDN-212854、DMH1、Pirfenidone、Alantolactone、SIS3、Hesperetinなどを例示することができ、このうち、SB431542が好ましい。TGF-βのI型受容体の阻害剤は、ALK4、ALK5、ALK7阻害剤であり、アクチビン阻害剤であるとよい。
PDGF受容体活性化剤としては、PDGFBB、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-CC、PDGF-DDなどを例示することができ、このうち、PDGFBBが好ましい。
〔実施例1〕
ヒト多能性幹細胞からの肝芽の大量製造手法の確立
オルガノイド移植療法は、革新的な疾患治療パラダイムとなる可能性があるが、主に再現性およびスケーラビリティの確保が最重要課題であった。本研究では、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)から器官芽の大量生産プラットフォームを構築することにより、これらの課題解決を試みた。まず、大規模な「逆」スクリーニング実験を行うことにより、再現性高く肝芽を生成するための効果的な前駆細胞集団(肝内胚葉、内皮、および横中隔間充織)を同定した。さらに、我々は、>108スケールで均質で小型化された肝芽を量産するためのオムニウェルアレイ培養プラットフォームを開発することにより、移植治療に求められるレベルの容量を達成した。すべてiPSCから生成され、血管が形成され、かつ機能的な肝臓組織は、段階的な発生上の前駆細胞の相互作用により増強されるその後の肝臓の機能化を有意に改善した。また、この肝臓組織は、移植により、急性肝不全に対する機能的救済を可能にした。本研究は、多細胞からなる肝芽オルガノイド供給のための製造プラットフォームを実現するものであり、将来的に肝疾患の治療のための臨床および創薬応用を大幅に加速するものと期待される。
「オルガノイド技術」は、難治性疾患の治療、並びにヒトの発生および疾患モデルに対する最近進化しているアプローチである(Huch and Koo, 2015、Lancaster and Knoblich, 2014、Sasai, 2013)。自己凝縮原理に基づいて、我々は最近、種々のマウス疾患モデルに対して治療可能性を有する肝芽、膵芽、および腎臓芽などの多細胞臓器芽を発達させることにより、オルガノイドにさらなる複雑性を構築することに成功した(Takebe et al., 2015、Takebe et al., 2013、Takebe et al., 2014)。それにもかかわらず、ヒトにおける移植および薬物試験のために十分に大きい安定したオルガノイドを生成することができるようにするため、オルガノイドに基づくアプローチのより広い応用は、スケーラビリティおよび再現性の課題にさらされている(Ding and Cowan, 2013)。将来的に臓器芽をベースにしたアプローチの治療応用を促進するために、我々は、フィーダーフリーのヒトiPSCから血管形成されたヒト肝芽(LB)を完全に生成するための包括的でスケーラブルで再現性のある方法を確立し、移植適用のためのそれらの機能的能力を検証することを目的とした。
最初に、肝芽(LB)の例を用いてスケーラブルな3次元オルガノイド培養プラットフォームを確立することを目指した。全体的な戦略は図1A、B(Figure 1A, B)に要約されている。簡潔には、我々は、樹脂膜に正確に鋳型構造を転写することによって微細構造の膜を開発するコンビナトリアルケミストリー技術によってU字底型マイクロウェルプレートを開発した。我々のマイクロウェルアレイは非常に高いアスペクト比を有する(図1C(Figure 1C)に示すように、各窪みの開口径は約500μmであり、深さは400μmであり、窪みは30μm間隔で密接かつ三角形状に配置された。)。このようなアスペクト比は、従来の成形機では広く転写することが困難である。このため、我々は、内部で最適化した成形機を使用することによって転写精度を改善した(方法を参照)。その結果、プロトタイピングは、24ウェルおよび6ウェルフォーマット、すなわちElplasiaTM RB(丸底)(24ウェルで600スポット/ウェル;6ウェルで3,000スポット/ウェル)で成功したことが示された。その後、我々は、ヒトiPSC由来肝内胚葉(iPSCHE)、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)、および骨髄間葉系幹細胞(BMSC)を以前に記述したように(Takebe et al., 2013)混合することにより、このプレートを肝芽培養に適応させた。コーティング材料(図5(Fig. S1))、窪みの形状(データは示されていない)、混合比(図6A-C(Fig. S2 A-C))および細胞数(図6D-F(Fig. S2 D-F))の最適化により、このマイクロウェルアレイに基づくアプローチを用いて小型肝芽を効果的に形成することができる(サプリメンタリーテキスト)。
結論として、この研究で概説された技術は、薬剤試験および再生応用へiPSCベースの多細胞性オルガノイドを供給することに対するエキサイティングな戦略を明らかにする。特に、本実施例で得られた108細胞スケール以上の肝芽の生産は、ヒト移植応用への合理的な規模と考えられる。なぜなら、細胞移植試験の数は、特に小児患者のための最低用量の108細胞で臨床的有効性を実証しているからである(Enosawa et al., 2014、Jorns et al., 2012)。標準的な治療規模が患者1人当たり109個の肝細胞であるとしたら、あるいはそれ以上であるとしたら(Horslen and Fox, 2004)、代謝障害の動物モデルにおける対応する有効性の研究では継続的なスケーリングの努力が予想されるであろう。それにもかかわらず、このプロトコールは、臨床的グレード成分の使用による複数の学術的および産業的共同作業努力によって開発されている。臨床的グレード成分には、遺伝的に特徴付けられたiPSC、規定された培地および基質、マイクロウェルアレイプレート、並びに将来の臨床試験のための準備としての顕微鏡検査が含まれる。これを加速するために、すべてのiPSC-LB戦略をcGMPグレードシステムに完全に適合させることは、将来の臨床応用ならびに臨床的に適切な移植ルートを通じた安全性評価にとって重要である。最終的には、一連の製造技術の統合により、現在困難な肝疾患を治療するための臨床的に効果的な肝芽移植療法を開発することが実現可能であると我々は考えている。
マイクロウェルにおけるヒト肝芽の培養
全てのiPSC系統は、Laminin 511 E8断片(iMatrix-511(商標)、Nippi, Inc.から親切に提供された)をコートしたディッシュ上で、StemFit(登録商標)(Ajinomoto Co., Inc.)中で維持した。各系統への特異的分化のための方法は補足的方法に記載された。インビトロでヒトLBを生成するために、マイクロウェル当たり合計1140〜10,140細胞を、10:7:2(=ヒトiPSC-tHE:iPSC-EC:iPSC-STM)の比で、EGMと肝細胞培養培地(HCM)(Cambrex, Baltimore, MD)の混合培地に再懸濁した。この混合培地は、デキサメタゾン(0.1 μM, Sigma-Aldrich, St Louis, MO)、オンコスタチンM(10 ng/ml, R&D System, Minneapolis, MN)、HGF(20 ng/ml, PromoKine)、およびSingleQuots(Lonza)を含む。再懸濁された細胞を、24ウェルプレート、又は24ウェル、6ウェル若しくは1ウェルプレート中のElplasia(商標)プラットフォーム(Kuraray, Inc.によって共同開発された)のいずれかの上に播種した。図3B(Figure 3B)の上に示される位相差コロニー像獲得は、BioStation CT培養インキュベーター、顕微鏡、およびデジタルイメージングシステム(Nikon, Tokyo, Japan)を用いて達成された。図3B(Figure 3B)の下に示す蛍光時間経過イメージングを、Lightsheet Z.1顕微鏡(Zeiss, Germany)で画像化した。生成したヒトiPSC-LBを、穏やかなピペッティングにより収集し、インビトロ成熟評価およびインビボ移植実験に使用した。対照として、我々は、5つの異なるヒト初代成人肝細胞(ロット番号:H768、H737、HC2-8、H4.1およびロット番号:M00995、XenoTech, KS, USA およびVeritas, Tokyo, Japanから購入)を使用した。
データは説明中で特定される独立した実験の平均±s.e.m又は平均±s.d.として表される。この研究では無作為化または盲検化法を用いなかった。生産されたアルブミン量の統計的有意性は、非パラメトリックマンホイットニーU検定によって評価した。0.05より小さい両側p値を有意とみなした。生存分析のために、GraphPad Prism Softwareバージョン6.0を統計解析に使用した。
補足情報には、補足的な実験手順、8つの図(図5〜12(Figs. S1-S8))が含まれている。
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マウス
インビトロで生成されたLBを採取し、非肥満糖尿病/重症複合免疫不全(NOD / SCID)マウス(Sankyo Lab. Co., Tsukuba, Japan)の予め形成された頭蓋窓または他の示された部位に移植した。移植された細胞のin vivo運命を、Leica TCS SP8共焦点顕微鏡(Leica Microsystems, Germany)を用いた生体内イメージングによってモニターした。in vivoでの機能化研究のために、8週齢の雄性NOGマウス(体重約20-30g)を使用した(Central Institute for Experimental Animals (CIEA), Kanagawa, Japanにより供給)(Hasegawa et al., 2011 )。生存曲線については、アルブミン-TK-NOGマウス(体重約20-30g)をこの研究で使用した(CIEA, Kanagawa, Japanにより供給)。移植に先立ってトランスジェニック肝臓実質細胞の組織特異的アブレーションを誘導するために、ヒトまたはマウス組織に毒性のない薬物であるガンシクロビル(GCV, 50mg / kg, i.p.)を投与し、各マウスあたり1×107細胞に相当するiPSC-LBを腎臓の肩甲下部位に移植した。試料のサイズは、分泌されたアルブミンタンパク質に30%の変化があった場合、80%の出力で有意な差(P <0.05)を得るために必要な最小サイズによって決定された。安楽死の時点はランダムに割り当てられた。移植実験の除外基準に関しては、病気により安楽死させたマウスからデータを除外することを事前に決定した。このようなデータは移植に関連しないものである。マウスは、実験動物の使用に関する横浜市立大学の施設ガイドラインに従って飼育し、維持した。
ヒトiPSC培養およびtHE分化
ヒトiPSC系統(TkDA3-4,1231A3,1383D2,1383D6およびFf01)は、京都大学および東京大学から提供された。1231A3,1383D2および1383D6は、京都大学CiRAのePBMC(登録商標)(Cellular Technology Limited, OH)から確立された系統である。全てのiPSC系統を、Laminin 511 E8断片(iMatrix-511(商標)、Nippi, Inc.から親切に提供された)をコートしたディッシュ上でStemFit(登録商標)(Ajinomoto Co., Inc.)中で維持した。インビトロおよびインビボでのライブイメージング分析のために、アデノ関連ウイルス組み込み部位1(AAVS1 :: EGFPまたはmCherry)の発現下での蛍光タンパク質ノックインレポーターを使用した。iPSC-tHEを導出するために、我々は2段階分化法を開発した(サプリメンタルテキストを参照)。第1段階において、ヒトiPSCを、10μM ROCK阻害剤Y-27632(Wako, カタログ番号253-00513)と共に、iMatrix-511被覆ディッシュ上に播種し、1%B27を加え、ヒト100ng / mlアクチビンA(Ajinomoto Co., Inc.から提供)および50ng / ml Wnt3a(R&D Systems)を含むRPMI-1640を培地として6日間用いた。iPSCプレーティングの最初の日に、1mM酪酸ナトリウム(Sigma)を添加した。成功した内胚葉の特異化は、Cerberus 1 ELISAキット(Dojin Kagaku, Kumamoto, Japan)を用いて定量的に評価した。続いて、ヒトiPSC由来内胚葉細胞を、1%B27、10ng / mlヒト塩基性FGFおよび20ng / mlヒトBMP4を含むRPMI-1640でさらに2日間処理して、TBX3およびADRA1B陽性移行肝内胚葉集団に誘導した。iPSCクローンごとに記述されたプロトコールを適合させる前に、我々は、注意深い顕微鏡観察に加えて、ヒトiPSCのそれぞれの特異化マーカーを、免疫染色および遺伝子発現研究によって分化の各時点で調べることを強く推奨する。なぜなら、成功した肝芽の生成は、インビボでの機能的成熟にとって重要だからである。この実施例でのヒトiPSCの使用は、横浜市立大学の倫理委員会で承認された。
EC分化のために、ヒトiPSCを、Accutaseを用いて解離させ、Laminin 511 E8断片(iMatrix-511(商標)、Nippi, Inc.から提供された)上にプレーティングした。ヒトiPSCは、10μMのROCK阻害剤Y-27632を含むStemFit(登録商標)(Ajinomoto Co., Inc.)中で、様々な最適密度(細胞系に依存して)になるようにした。翌日、培地をプライミング培地に置き換えた。プライミング培地は、8μMのCHIR99021(Tocris Bioscience)と25 ng/ml BMP4 (R&D Systems)を含むB27培地(1%Glutamaxおよび1%B27(すべてLife Technologies)を含むDMEMとF12の1:1の混合培地)からなる。さらに3日後、プライミング培地をEC誘導培地に置き換えた。EC誘導培地は、200ng / ml VEGF(Life Technologies)および2μMフォルスコリン(Sigma-Aldrich)を補充したStemPro-34 SFM培地(Life Technologies)からなる。誘導培地を毎日更新した。分化の7日目に、ECを0.05%トリプシンで解離させ、FACS分析に供した。iPSC由来のECは、CD144およびCD31の接合部局在化を伴う典型的な内皮形態を示すはずである。 ECを、1μg / cm2のフィブロネクチン(Sigma-Aldrich)でコーティングしたディッシュ上に、EC拡張培地中に、50,000細胞cm-2の密度で再プレーティングした。EC拡張培地は、50ng / mlのVEGF-Aを補充したStemPro-34SFMからなる。EC拡張培地を1日おきに交換した。STM分化のために、ヒトiPSCを、Accutaseを用いて解離させ、Laminin 511 E8断片上に、10μMのROCK阻害剤Y-27632を含むStemFit(登録商標)中に、2000〜8000細胞/cm2でプレーティングし、誘導前の4〜6日間培養した。中胚葉誘導段階では、維持培地を、中胚葉誘導培地で置き換え、続いて 2ng / mlアクチビンAおよび10ng / ml PDGFBB(R&D Systems)に3日間暴露した。中胚葉誘導培地は、1%Glutamaxおよび1%B27を含むDMEMとF12の1:1の混合培地であり、B27は8 μM CHIR99021および 25 ng/ml BMP4を含む。3日後、中胚葉誘導培地をSTM誘導培地に置き換え、3日間培養した。STM誘導培地は、10ng / mlのFGF2および10ng / mlのPDGFBBを補充したStmePro-34 SFM培地からなる。
Elplasia(商標)マイクロウェルプレートは、2つの技術の組み合わせによって工業的に製造された。一つは、細かく構造化された金型を作製することであり、別の一つは鋳型から樹脂膜へ正確に構造を転写することである。細かく構造化された金型の作製は、マスターブロックの準備工程から始めた。我々は、精密な金属切削加工により等間隔で金属板にマイクロウェルを彫った。各マイクロウェルはU字底型であり、開口径は約500μm、深さは400μmであった。播種した細胞のすべてが各マイクロウェルに分けられるようにするために、これらを30μm間隔で密接かつ三角形状に配置した。金属切削加工の後、正方形に切り出し、裏面を研磨し、金型からの樹脂の剥離を改善する離型処理を行った。以上の工程を通じて、その表面に、マイクロウェルの反転された形状としての微細な柱状体を持つ金型としてのニッケル板を作製した。金型から樹脂フィルムへのマイクロウェル形状の転写は、内部で開発した転写成形機を用いて行った。一般的な射出成形機と比較して、我々の成形機は、特にプレートの形状のような高アスペクト比領域の部分で転写精度を著しく改善する(「アスペクト比」は微細構造の高さと幅の比である。)。実際、我々のマイクロウェル(深さ:400μm、間隔;30μm)は、従来の成形機では転写が困難な非常に高いアスペクト比を有する。我々は、金型を成形機に取り付け、溶融したポリスチレン樹脂を金型に塗布した。温度、プレス重量および保持時間を含むいくつかの条件最適化により、我々は、最終的に完全にマイクロウェルを転写した樹脂フィルムを得た。トリムされたフィルムは、底部のない予め作製されたウェルプレートフレームに結合され、これにより、プレートの底にマイクロウェルアレイを有するElplasia(商標)マイクロウェルプレートが完成された。1cm2あたり約320個のマイクロウェルがあるので、24ウェルフォーマットにおいてはウェル当たり約600個のマイクロウェルが存在し、6ウェルフォーマットにおいてはウェル当たり約3,000個のマイクロウェルが存在し、オムニウェルフォーマットにおいてはプレート当たり約20,000個のマイクロウェルが存在する。
図3B(Figure 3B)の上に示す位相差コロニー画像の獲得は、BioStation CT培養インキュベーター、顕微鏡、並びに提供される指示に従ってオートフォーカスおよび細胞画像タイリング取得機能を最適化するように調整されたデジタルイメージングシステム(Nikon, Tokyo, Japan)を用いて、達成された。図3B(Figure 3B)の下に示す蛍光時間経過イメージングは、Lightsheet Z.1顕微鏡(Zeiss, Germany)で画像化された。
1%テトラメチルローダミン結合デキストラン(MW 2,000,000)、フルオレセインイソチオシアネート結合デキストラン(MW 2,000,000)およびテキサスレッド結合デキストラン(70,000MW、ニュートラル)の尾静脈注射を用いて、血管内腔(すべてInvitrogen, Carlsbad, CA, USAから)を同定した。静脈内注射したAlexa647結合マウス特異的CD31(BD)を用いて、宿主内皮細胞を視覚化した。共焦点画像スタックを、移植された血管およびデキストランについて取得した。
qRT-PCR分析は以前に記載されたように行った(Takebe et al., 2013)。マイクロアレイについては、RNeasy Mini Kit(Qiagen, Valencia, CA)を用いて全RNAを調製した。遺伝子発現プロファイリングのためのRNAは、Whole Human Genome Agilent 4x44K v2オリゴヌクレオチドマイクロアレイまたはWhole Human Genome Agilent 8x60K v2オリゴヌクレオチド(Agilent Technologies、Palo Alto、CA)上で製造者の指示に従ってハイブリダイズさせた。対照サンプルとして、上述したヒト初代肝細胞サンプルに加え、ヒトのFLT (10gwk or 22-40gwk pool Fetal Liver Tissue)、ILT (0yr Infant Liver Tissue)およびALT (5yrs, 30yrs, 44yrs or 55yrs old Adult Liver Tissues)RNAサンプルを、Biochain Institute(Hayward, CA, USA)から入手した。
マイクロアレイデータはGeneSpring標準プロトコールを用いて処理した。手短に言えば、1未満の信号強度は1(検出されなかった)に補正され、次に75パーセントシフト正規化が行われた。レプリケートスポット内のシグナル強度を平均した後、異なる8x60k v2アレイチップ内で観察された(データは示さず)バッチ効果は、同じ分化段階の共変量でCombat(Leek et al., 2012)によって除去された。4x44k v2アレイのデータと比較するときは、我々は、チップ間の差異とバッチ効果を確実に除去するための分位数標準化を行った。ゲノムワイドの分化状態を解析するために、我々は、タンパク質コード遺伝子のスケールされた発現レベルを用いて主成分分析(PCA)を行った(Le et al., 2008)。上層主成分(PC)は、2-D培養されたiPSCから臨床検体までのすべてのサンプルの分散の約40%を説明したので、我々は主にPC1を使用した(図2D(Figure 2D))。教師なしの階層的クラスタリングは、ピアソンの相関に基づく距離および平均結合方法を用いて実施された。開発の特徴を明らかにするために、我々は、http://discovery.lifemapsc.com/in-vivo-development/、2015/4/8からディスカバリー・ライフマップ・シグネチャーを使用し、また、Gene Set Enrichment Analysis(GSEA)(Subramanian et al.,2005)からのp値は、ヒートマップ(図2H(Figure 2H)、比較はこの図に記載されている)によって示された。特記しない限り、データ処理および分析は、統計ソフトウェアRバージョン3.0.1を使用して実施した。
最初に、MSigDBバージョン5.0(Subramanian et al., 2005)に特徴的な遺伝子セットを用いて、我々は、ヒト胎児肝組織(FLT、10w)といくつかの異なる分化段階の組織/細胞を比較する濃縮分析を行った。GSEAソフトウェアによる計算された正規化濃縮スコア(NES)は、以下のように改変NES(mNES)に変換された:NES> 1の場合、mNESはNESであり; -1 <NES <1ならば、mNESは1であり; 他は、mNESは1 / | NES |である。この変換により、サンプルまたはFLTの比較において標的遺伝子セットが濃縮されたかどうかにかかわらず、NESを比較することが可能になる。次に、我々は、ヒト成人肝細胞(AHEP 2D)とFLTとの比較から計算したmNESの相対的なサイズを用いて、アスタープロットの各成分の幅を決定した。各組織または細胞タイプについて、相対mNESスコアをAHEP 2D対FLTのmNESで割って計算し、このスコアをアスタープロットの各成分の高さとして示した。最後に、我々は、コンポーネントの幅と高さを掛け、それらを加えて総相対スコアと定義した。総相対スコアは、アスタープロットの中心に示された(図4F(Figure 4F))。
血液サンプルを室温で遠心チューブ(約5分)中で凝固させ、チューブの側面からゆるめ、4℃(融解氷)で20分間インキュベートした。凝固した血液を、10〜15分間、400g、4℃で遠心分離し、赤血球または凝固した物質を排除するよう注意しながら血清画分を除去した。ヒトCER1、ALBおよびAATは、マウス血清サンプル中で、Human Cerberus 1 Quantification Kit (Dojin Kagaku, Kumamoto, Japan)、Human Albumin ELISA Quantitation Kit (Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, TX, USA)、および human alpha 1-antitrypsin ELISA Quantitation Kit (GenWay Biotech, Inc., San Diego, CA, USA)を用い、製造者の指示に従って、測定された。盲検研究者が、インビトロ培養上清またはインビボ血清を用いて、すべてのELISA実験を行った。
この実施例で報告されたマイクロアレイデータの受託番号は、データがNCBI GEOを介してアップロードされると更新される。
小型肝芽培養
コーティング材料の選択(図5(Fig. S1))の後、我々はまず、混合比および用量依存性試験を実施することによって細胞培養条件を最適化した。内皮細胞対全細胞の混合プロトコールは、効率的な移植後血管新生に基づいて以前に最適化されていた(Takebe et al., 2014)。しかし、間葉系細胞のプロトコールは未だ決定されていない。SEM分析から、間葉系細胞混合物の10%〜1.4%(内胚葉細胞の1/5〜1/40)が再現性のあるLB生成を可能にすることが確認され(図6A(Fig. S2A))、その後の遺伝子発現分析により、2.8%(内胚葉細胞の1/20)が安定した肝臓分化および組織形成のための最も効率的な割合であるが示唆された(図6B、C(Fig. S2B, C))。次に、我々は、機能的LB生産のための最小細胞数を決定するための用量減少研究を行った(図6D-F(Fig. S2D-F))。細胞数に依存するLBサイズを図6D(Fig. S2D)に示す。LBサイズは、4000個の細胞(マイクロウェルあたり6000個を超える細胞はLBを形成できなかった。)まで用量依存性の増加を示した。長期間分化させたLBに関するELISAに基づく機能スクリーニングは、LBあたり600個のiPSC-tHE細胞(合計1130細胞)を含むことが、それよりも多い量または少ない量(LBあたり150-1200個のiPSC-tHE細胞の範囲)に比べ、ヒトアルブミンを最も多く生産することを示した(図6F(Fig. S2F))。これは、追加の肝臓分化マーカーの遺伝子発現分析によりも確認された(図6D、E(Fig. S2 D, E))。
我々は、複数の分化段階の内胚葉細胞を用いて、分化した肝芽の形態および機能性を比較することによって、多数の「逆」スクリーニング実験を行った。莫大な数の刊行物が、遺伝子およびタンパク質の逐次的な添加によるそれぞれの特異的方法が肝細胞様細胞の生産をもたらすことを報告した。しかし、比較分析はほとんど行われなかった。最初に、3つの有望な段階的分化プロトコール(Kajiwara et al., 2012、 Loh et al., 2014、Si-Tayeb et al., 2010)を選択するために、2Dベースのスクリーニングを行った(図8A(Fig. S4A))。そこで、細胞密度、サイトカイン曝露期間および基礎培地を最適化することによって、3つの主要なプロトコールを我々のフィーダーフリーiPSC培養に変更した後、プロトコール(Pr)1における分化細胞は、Pr 2およびPr 3と比較して、多能性マーカー(OCT4およびNANOG)の最小限の発現および胚体内胚葉(DE)および成熟肝細胞様(MH)細胞における肝マーカー(FOXA2、HNF4A、ALBおよびAFP)のより高い発現を明らかにした(図8B-E(Fig. S4B-E))。これらの結果は、ELISAによるヒトアルブミン分泌分析によって確認され、Pr 1のMHからの分泌はPr 2および3の分泌の約2.5倍であることが明らかになった(データ示さず)。Wntシグナル伝達経路を増幅するPr1の下で、4つの異なる患者由来iPSCクローンが、機能的な肝細胞様細胞を非常に再現性のある様式で分化させることができた(図4F(Figure 4F))。まとめると、早期内胚葉明特異化におけるWnt3A曝露は、2D培養において機能性肝細胞様細胞を生成するのに有効である。
アルブミン高(良好)/低(不良)MHと元のDE細胞のトランスクリプトームに基づく比較は、将来の検証マーカーを同定するために、2D MH機能のより良い結果がDE特異化の効率と相関することを示唆した(データは表示されない)。したがって、我々は、成功した肝臓成熟が、特にDEステージにおいて、初期内胚葉特異化の質に大きく依存すると仮定した。良好なDEマーカーを同定するために、良好DEと不良DE(最終的なiPSC-MH機能によって区別される)の全体的な遺伝子発現プロファイルを比較することにより、良好なDEは、Cerberus 1(CER1)をはるかに高いレベルで発現する傾向があることが明らかになった(Iwashita et al., 2013)。Cerberus 1は分泌タンパク質であり、既知の胚体内胚葉マーカーである。その量は培養上清中でELISAによって測定することができる。したがって、我々は、6日目の培地中のCER1タンパク質の検出は、20日目の最終ALB検出に少なくとも必須であることを見出した(図4G(Figure 4G))。このことは、6日目の分泌タンパク質の量は最終分化の完了後の肝機能の潜在的な必要性であることを示唆した。
Iwashita, H., Shiraki, N., Sakano, D., Ikegami, T., Shiga, M., Kume, K., and Kume, S. (2013). Secreted cerberus1 as a marker for quantification of definitive endoderm differentiation of the pluripotent stem cells. PLoS One 8, e64291.
Kajiwara, M., Aoi, T., Okita, K., Takahashi, R., Inoue, H., Takayama, N., Endo, H., Eto, K., Toguchida, J., Uemoto, S., et al. (2012). Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A 109, 12538-12543. Loh, K.M., Ang, L.T., Zhang, J., Kumar, V., Ang, J., Auyeong, J.Q., Lee, K.L., Choo, S.H.,
Lim, C.Y., Nichane, M., et al. (2014). Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations. Cell stem cell 14, 237-252.
Si-Tayeb, K., Noto, F.K., Nagaoka, M., Li, J., Battle, M.A., Duris, C., North, P.E., Dalton, S., and Duncan, S.A. (2010). Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology 51, 297-305.
Takebe, T., Zhang, R.R., Koike, H., Kimura, M., Yoshizawa, E., Enomura, M., Koike, N., Sekine, K., and Taniguchi, H. (2014). Generation of a vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nat Protoc 9, 396-409.
ヒトiPSCからtHE分化誘導について、実施例1のヒトiPSC培養およびtHE分化部分と同様の分化方法を実施したが、下記の点を変更した。
第1段階において、ヒトiPSCを、10μM ROCK阻害剤Y-27632(Wako, カタログ番号253-00513)と共に、iMatrix-511被覆ディッシュ上に播種し、1%B27を加え、100ng / mlヒトアクチビンA(Ajinomoto Co., Inc.から提供)および50ng / ml Wnt3a(R&D Systems)を含むRPMI-1640を培地として6日間用いた。上記の50ng / ml Wnt3a(R&D Systems)について2uM CHIR99021 3日間添加に代替する事で、コスト低減及びxeno-free化および生物由来原料基準に適合可能になる(図13, 14)。
Wnt3aの代替としてCHIR99021を用いるプロトコールの模式図を図13Aに示す。条件検討の結果、DE分化誘導6日間の内、CHIR99021, 2μMを3日間添加する条件を選択した。
Wnt3aを用いる従来法とCHIR99021, 2μMを3日間添加条件での各分化段階の細胞形態を図13Bに示す。Wnt3aを用いた場合と形態的な違いは見られない。
Wnt3aを用いる従来法とCHIR99021, 2μMを3日間添加条件でのDE段階でのフローサイトメトリーによるDEマーカーであるCXCR4陽性率解析を図13Cに示す。Wnt3aを用いた場合とCXCR4陽性率は同等である。
定量PCR(qPCR)による各分化マーカーの発現解析を図13Dに示す。CHIR d3における各ステージのマーカー発現量は、Wnt3aを用いた場合と同等である。
MH段階での分泌アルブミン量のELISA解析を図13Eに示す。複数のiPSCクローンにおいて、CHIR d3におけるALB分泌量は、Wnt3aを用いた場合と同等か高い傾向が見られた。
MH(図14A)およびLB(図14B)での細胞形態において、Wnt3aを用いた場合と形態的な違いは見られない。
定量PCR(qPCR)によるMHおよびLBでのマーカー発現解析を図14Cに示す。マーカー発現量とALB分泌量について、Wnt3aとCHIR間に有意差は認められなかった。腸管マーカーなど他の細胞系譜のマーカー遺伝子の発現増加も見られない。
EC拡張培養について、実施例1のヒトiPSC-ECおよびSTM分化部分と同様の分化方法を実施したが、下記の点を変更した。
EC分化のために、ヒトiPSCを、Accutaseを用いて解離させ、Laminin 511 E8断片(iMatrix-511(商標)、Nippi, Inc.から提供された)上にプレーティングした。培地はRock阻害剤を含むプライミング培地に置き換えた。プライミング培地は、8μMのCHIR99021(Tocris Bioscience)と25 ng/ml BMP4 (R&D Systems)を含むB27培地(1%Glutamaxおよび1%B27(すべてLife Technologies)を含むDMEMとF12の1:1の混合培地)からなる。翌日にはRock阻害剤を含まないプライミング培地に置き換える。
さらに3日後、プライミング培地をEC誘導培地に置き換えた。EC誘導培地は、200ng / ml VEGF(Life Technologies)および2μMフォルスコリン(Sigma-Aldrich)を補充したStemPro-34 SFM培地(Life Technologies)からなる。誘導培地を毎日更新した。分化の7日目に、ECを0.05%トリプシンで解離させ、FACS分析に供した。iPSC由来のECは、CD144およびCD31の接合部局在化を伴う典型的な内皮形態を示すはずである。 ECを、Laminin 511 E8断片(iMatrix-511(商標)、Nippi, Inc.から提供された)上に、Rock阻害剤を含むEC拡張培地中に、50,000細胞cm-2の密度で再プレーティングした。EC拡張培地は、50ng / mlのVEGF-Aを補充したStemPro-34SFMからなる。
翌日Miracell (登録商標) EC(タカラバイオ)に培地交換し、1日おきに交換した。
これにより、より安定して高いCD31/CD144共陽性細胞を得ることが可能である(図15, 16)。
iPSC由来血管内皮細胞(iPSC-EC)の分化誘導プロトコール改変版を図15に示す。
分化誘導プロトコールの模式図を図16Aに示す。
従来法及び改訂法の細胞形態を図16Bに示す。形態的な違いは見られない。
従来法及び改訂法のフローサイトメトリーによるECマーカー陽性率の解析を図16Cに示す。
図16Cのフローサイトメトリー解析のまとめを図16Dに示す。改訂法では従来法と比べより安定的に高いCD31/CD144陽性率となる。
定量PCR(qPCR)による各分化マーカーの発現解析を図16Eに示す。継代を経てもECマーカー発現量が安定している。
継代ごとの細胞増殖を図16Fに示す。改訂法では従来法と比べ継代後の増殖能が高い
以上のことから、EC P0 時で陽性率が安定しなくとも、再播種により安定的なECの作出が可能であった。EC完成後の増殖に成功した。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
Claims (38)
- 血管系細胞、間葉系細胞、及び組織又は臓器細胞から作製された器官芽であって、前記血管系細胞、間葉系細胞、及び組織又は臓器細胞のそれぞれが多能性幹細胞から誘導されたものである、前記器官芽。
- 器官芽は、成熟することで器官に分化することができる構造体である請求項1記載の器官芽。
- 多能性幹細胞がヒト由来である請求項1又は2に記載の器官芽。
- 多能性幹細胞が人工多能性幹細胞及び胚性幹細胞からなる群より選択される少なくとも1つの細胞である請求項1〜3のいずれかに記載の器官芽。
- 臓器細胞が肝細胞であり、器官芽が肝芽である請求項1〜4のいずれかに記載の器官芽。
- 肝細胞がTBX3陽性及びADRA1B陽性である請求項5記載の器官芽。
- 間葉系細胞がCD166陽性及びCD31陰性である請求項1〜6のいずれかに記載の器官芽。
- 間葉系細胞がLHX2陽性及びWT1陽性である請求項1〜7のいずれかに記載の器官芽。
- 間葉系細胞のFOXF1、HLX1、COL4A及びALCAMの転写が活性化しており、間葉系細胞がLHX2陽性、WT1陽性及びMIIA陽性である請求項8記載の器官芽。
- 血管系細胞がCD31陽性及びCD144陽性である請求項1〜9のいずれかに記載の器官芽。
- 血管系細胞のPECAM1、CDH5、KDR及びCD34からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現が分化誘導前の多能性幹細胞より上昇している請求項10記載の器官芽。
- 多能性幹細胞をROCK阻害剤の存在下で培養した後、トランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子、Wntファミリーに属する因子及びclass I histone脱アセチル化酵素(HDAC)阻害剤の存在下で培養し、さらに、トランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子及びWntファミリーに属する因子の存在下で培養する工程を経て得られた細胞をFGF及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養して分化誘導したTBX3陽性及びADRA1B陽性である細胞を組織又は臓器細胞として用いる請求項1〜11のいずれかに記載の器官芽。
- 多能性幹細胞をROCK阻害剤の存在下で培養した後、βカテニン活性化剤、PI3K阻害剤及びトランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子の存在下で培養し、さらに、トランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子及びBMP阻害剤の存在下で培養する工程を経て得られた細胞をFGF及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養して分化誘導したTBX3陽性及びADRA1B陽性である細胞を組織又は臓器細胞として用いる請求項1〜11のいずれかに記載の器官芽。
- 多能性幹細胞をROCK阻害剤の存在下で培養した後、トランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子の存在下で培養する工程を経て得られた細胞をFGF及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養して分化誘導したTBX3陽性及びADRA1B陽性である細胞を組織又は臓器細胞として用いる請求項1〜11のいずれかに記載の器官芽。
- 多能性幹細胞をROCK阻害剤の存在下で培養した後、トランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子及びβカテニン活性化剤の存在下で培養し、さらに、トランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子の存在下で培養する工程を経て得られた細胞をFGF及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養して分化誘導したTBX3陽性及びADRA1B陽性である細胞を組織又は臓器細胞として用いる請求項1〜12のいずれかに記載の器官芽。
- 多能性幹細胞をβカテニン活性化剤及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養した後、PDGF受容体活性化剤及びトランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子の存在下で培養し、さらに、FGFの存在下で培養する工程を経て得られたLHX2陽性及びWT1陽性である細胞を間葉系細胞として用いる請求項1〜15のいずれかに記載の器官芽。
- 多能性幹細胞をβカテニン活性化剤及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養した後、PDGF受容体活性化剤及びトランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子の存在下で培養し、さらに、FGFの存在下で培養し、その後、間葉系細胞用培地で維持培養する工程を経て得られたCD166陽性及びCD31陰性である細胞を間葉系細胞として用いる請求項1〜15のいずれかに記載の器官芽。
- 多能性幹細胞をROCK阻害剤の存在下で培養した後、βカテニン活性化剤及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養し、さらに、血管内皮細胞増殖因子受容体(VEGFR)活性化剤及びアデニル酸シクラーゼ活性化剤の存在下で培養する工程を経て得られたCD31陽性及びCD144陽性である細胞を血管系細胞として用いる請求項1〜17のいずれかに記載の器官芽。
- 多能性幹細胞をROCK阻害剤の存在下で培養した後、血管内皮細胞増殖因子受容体(VEGFR)活性化剤、トランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子、βカテニン活性化剤及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養し、さらに、血管内皮細胞増殖因子受容体(VEGFR)活性化剤及びTGF-βのI型受容体の阻害剤の存在下で培養する工程を経て得られたCD31陽性及びCD144陽性である細胞を血管系細胞として用いる請求項1〜17のいずれかに記載の器官芽。
- 多能性幹細胞をROCK阻害剤の存在下で培養した後、トランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子の存在下で培養し、さらに、FGF及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養し、その後、血管内皮細胞増殖因子受容体(VEGFR)活性化剤の存在下で培養する工程を経て得られたCD31陽性及びCD144陽性である細胞を血管系細胞として用いる請求項1〜17のいずれかに記載の器官芽。
- 多能性幹細胞をROCK阻害剤の存在下で培養した後、TGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養し、さらに、TGFβスーパーファミリーに属する因子、血管内皮細胞増殖因子受容体(VEGFR)活性化剤及びFGFの存在下で培養する工程を経て得られたCD31陽性及びCD144陽性である細胞を血管系細胞として用いる請求項1〜17のいずれかに記載の器官芽。
- 血管系細胞、間葉系細胞、及び組織又は臓器細胞をin vitroで培養することを含む、器官芽の作製方法であって、前記血管系細胞、間葉系細胞、及び組織又は臓器細胞のそれぞれが多能性幹細胞から誘導されたものである、前記方法。
- 足場材料を用いることなく、細胞が培養される請求項22記載の方法。
- 請求項1〜21のいずれかに記載の器官芽を非ヒト動物に移植し、組織又は臓器に分化させることを含む、組織又は臓器の作製方法。
- 請求項1〜21のいずれかに記載の器官芽をヒト又は非ヒト動物に移植することを含む、器官芽の移植方法。
- 請求項1〜21のいずれかに記載の器官芽をヒト又は非ヒト動物に移植し、組織又は臓器に分化させることを含む、組織又は臓器の再生又は機能回復方法。
- 請求項1〜21のいずれかに記載の器官芽を非ヒト動物に移植し、組織又は臓器に分化させることを含む、非ヒトキメラ動物の作製方法。
- 請求項1〜21のいずれかに記載の器官芽、請求項24記載の方法によって作製された組織及び臓器、並びに請求項27記載の方法によって作製された非ヒトキメラ動物からなる群より選択される少なくとも一つを用いて、薬剤を評価する方法。
- 多能性幹細胞をROCK阻害剤の存在下で培養した後、トランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子、Wntファミリーに属する因子及びclass I histone脱アセチル化酵素(HDAC)阻害剤の存在下で培養し、さらに、トランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子及びWntファミリーに属する因子の存在下で培養する工程を経て得られた細胞をFGF及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養して、TBX3陽性及びADRA1B陽性である細胞へ分化誘導することを含む、TBX3陽性及びADRA1B陽性である細胞を作製する方法。
- 多能性幹細胞をROCK阻害剤の存在下で培養した後、βカテニン活性化剤、PI3K阻害剤及びトランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子の存在下で培養し、さらに、トランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子及びBMP阻害剤の存在下で培養する工程を経て得られた細胞をFGF及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養して、TBX3陽性及びADRA1B陽性である細胞へ分化誘導することを含む、TBX3陽性及びADRA1B陽性である細胞を作製する方法。
- 多能性幹細胞をROCK阻害剤の存在下で培養した後、トランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子の存在下で培養する工程を経て得られた細胞をFGF及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養して、TBX3陽性及びADRA1B陽性である細胞へ分化誘導することを含む、TBX3陽性及びADRA1B陽性である細胞を作製する方法。
- 多能性幹細胞をROCK阻害剤の存在下で培養した後、トランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子及びβカテニン活性化剤の存在下で培養し、さらに、トランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子の存在下で培養する工程を経て得られた細胞をFGF及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養して、TBX3陽性及びADRA1B陽性である細胞へ分化誘導することを含む、TBX3陽性及びADRA1B陽性である細胞を作製する方法。
- 多能性幹細胞をβカテニン活性化剤及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養した後、PDGF受容体活性化剤及びトランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子の存在下で培養し、さらに、FGFの存在下で培養することを含む、LHX2陽性及びWT1陽性である細胞を作製する方法。
- 多能性幹細胞をβカテニン活性化剤及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養した後、PDGF受容体活性化剤及びトランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子の存在下で培養し、さらに、FGFの存在下で培養し、その後、間葉系細胞用培地で維持培養することを含む、CD166陽性及びCD31陰性である細胞を作製する方法。
- 多能性幹細胞をROCK阻害剤の存在下で培養した後、βカテニン活性化剤及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養し、さらに、血管内皮細胞増殖因子受容体(VEGFR)活性化剤及びアデニル酸シクラーゼ活性化剤の存在下で培養することを含む、CD31陽性及びCD144陽性である細胞を作製する方法。
- 多能性幹細胞をROCK阻害剤の存在下で培養した後、血管内皮細胞増殖因子受容体(VEGFR)活性化剤、トランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子、βカテニン活性化剤及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養し、さらに、血管内皮細胞増殖因子受容体(VEGFR)活性化剤及びTGF-βのI型受容体の阻害剤の存在下で培養することを含む、CD31陽性及びCD144陽性である細胞を作製する方法。
- 多能性幹細胞をROCK阻害剤の存在下で培養した後、トランスフォーミング増殖因子βファミリーに属する因子の存在下で培養し、さらに、FGF及びTGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養し、その後、血管内皮細胞増殖因子受容体(VEGFR)活性化剤の存在下で培養することを含む、CD31陽性及びCD144陽性である細胞を作製する方法。
- 多能性幹細胞をROCK阻害剤の存在下で培養した後、TGFβスーパーファミリーに属する因子の存在下で培養し、さらに、TGFβスーパーファミリーに属する因子、血管内皮細胞増殖因子受容体(VEGFR)活性化剤及びFGFの存在下で培養することを含む、CD31陽性及びCD144陽性である細胞を作製する方法。
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