CN114891749B

CN114891749B - 一种胰腺癌类器官的培养基及胰腺癌类器官的培养方法

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Publication number: CN114891749B
Application number: CN202210817864.7A
Authority: CN
Inventors: 冯宗苗; 邢华杨; 谢素瑶; 刘松
Original assignee: Hangzhou Aiming Medical Technology Co ltd
Current assignee: Hangzhou Aiming Medical Technology Co ltd
Priority date: 2022-07-13
Filing date: 2022-07-13
Publication date: 2022-12-02
Anticipated expiration: 2042-07-13
Also published as: CN114891749A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种胰腺癌类器官的培养基及胰腺癌类器官的培养方法。该培养基包括Advanced DMEM/F12基础培养基、N‑乙酰半胱氨酸、烟酰胺、Wnt 3A、R‑spondin、BMP4、A83‑01、毛喉素、成纤维细胞生长因子、L‑丙氨酰‑L‑谷氨酰胺、B27；还包括苯丁酸钠和H‑1152。该培养基成分中含有苯丁酸钠和H‑1152，能够提高促进类器官细胞增殖和细胞活率。同时，苯丁酸钠和H‑1152具有显著的协同作用，能够进一步促进细胞的生长和增殖。该培养基能够有效的建立胰腺癌类器官并对其长期的维持培养和扩增，使胰腺癌类器官快速稳定生长，并具有良好的活性和尺寸。该培养方法具有培养周期短、增殖快、细胞数和活率高的优点。

Description

一种胰腺癌类器官的培养基及胰腺癌类器官的培养方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种胰腺癌类器官的培养基及胰腺癌类器官的培养方法。

背景技术

胰腺癌是恶性程度较高的消化道肿瘤之一，其致死率与发病率相当，预计未来10内年胰腺癌或将成为恶性肿瘤中第二位的致死原因。目前，手术治疗仍是治愈胰腺癌的主要方式，但超过80 %的胰腺癌患者在就诊时丧失手术机会，因此，药物治疗仍具有同样不可替代的手段。胰腺癌的药物治疗主要是以吉西他滨和氟尿嘧啶为基础的广谱化疗方案，但是由于胰腺癌在个体间的异质性，目前的治疗手段难以使所有患者获益。所以，针对胰腺癌患者特征制定个体化的治疗方案，有希望从根本上改善胰腺癌患者的预后。

利用胰腺癌患者来源的肿瘤组织建立个体化的类器官肿瘤模型，为患者筛选敏感的化疗药物或靶向药物，是胰腺癌个体化治疗的一个重要途径。

类器官是细胞的三维组装体，包含一种以上的细胞类型，能够至少表现出细胞所述器官的生理特性。由于其保持了亲本肿瘤的关键特征，可以利用类器官进行药物筛选、预测患者放化疗反应等。

类器官是成体干细胞或多能干细胞在体外三维培养而形成的具有特定空间结构的细胞模型，它能模拟体内组织的结构和功能，并在体外进行长期传代。肿瘤类器官同样可以保留肿瘤的组织形态学、基因组及转录组等特征。然而目前国内在建立胰腺癌类器官培养方法方面的研究较少，主要问题在于胰腺癌类器官的专用培养体系开发存在难度。例如专利号为CN202210181982的“一种建立胰腺或胰腺癌类器官的培养基及方法和应用”，其中公开的培养基培养的胰腺癌类器官数量仅能达到4×10⁶左右，数量较低，活率也较低，难以满足实际需求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种胰腺癌类器官的培养基及胰腺癌类器官的培养方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

本发明提供一种胰腺癌类器官的培养基，包括Advanced DMEM/F12基础培养基、N-乙酰半胱氨酸、烟酰胺、Wnt 3A、R-spondin、BMP4、A83-01、毛喉素、成纤维细胞生长因子、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、B27；还包括苯丁酸钠和H-1152。

进一步，所述成纤维细胞生长因子为FGF10。

进一步，所述N-乙酰半胱氨酸的浓度为0.5-5 mM；所述烟酰胺的浓度为5-15 mM；所述Wnt 3A的浓度为50-300 ng/μL；所述R-spondin的浓度为200-800 ng/mL；所述A83-01的浓度为300-800 nM，所述毛喉素的浓度为5-20 μM；所述FGF10的浓度为5-20 ng/mL；所述L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的浓度为A（1×）；所述B27的浓度为A（1~2×）；所述苯丁酸钠的浓度为0.5-3 μg/mL；所述H-1152的浓度为5-15 μm；溶剂为Advanced DMEM/F12基础培养基。

进一步，所述N-乙酰半胱氨酸的浓度为1.5 mM；所述烟酰胺的浓度为10 mM；所述Wnt 3A的浓度为100 ng/μL；所述R-spondin的浓度为200 ng/mL；所述A83-01的浓度为500nM，所述毛喉素的浓度为10 μM；所述FGF10的浓度为10 ng/mL；所述苯丁酸钠的浓度为2 μg/mL；所述H-1152的浓度为10 μm。

进一步，还包括pH缓冲液，所述pH缓冲液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸。

进一步，还包括抗菌成分，所述抗菌成分为青链霉素溶液。

本发明还提供一种胰腺癌类器官的培养方法，采用如上述的培养基进行培养。

进一步，包括以下步骤：

S1、获取待培养的胰腺癌组织样本，采用DPBS清洗并剪切均匀；

S2、采用消化液对所述步骤S1得到的胰腺癌组织样本进行消化，消化后离心，得到细胞沉淀；

所述消化液含有透明质酸酶和胶原酶Ⅳ以及DNA酶；

S3、采用DPBS对所述细胞沉淀进行重悬，重悬后再次离心，得到细胞沉淀；

S4、在所述步骤S3得到的细胞沉淀中加入红细胞裂解液1-2 mL，并置于冰上裂解10 min，待裂解完成后加入DPBS终止并去除上清，保留沉淀；

S5、采用所述培养基对步骤S4得到的沉淀进行重悬并得到细胞溶液，再将所述细胞溶液与Matrigel胶以质量比为1:2的比例进行混合；混合后，进行滴胶接种，每个胶滴为50 μL；

S6、滴胶接种后，放置于培养箱中进行培养；待所述胶滴凝固后，在每个所述胶滴上覆盖1mL所述胰腺癌类器官的培养基，并于37℃、CO₂浓度为5 %的条件下培养7天，即可得到胰腺癌肿瘤类器官。

进一步，所述步骤S2中的消化条件为，在37 ℃条件下震荡消化30 min；消化完成后加入DPBS终止消化。

进一步，所述步骤S3中，采用DPBS对所述细胞沉淀进行重悬后，过70 μm的网筛，收集过筛后的细胞悬液，再对所述细胞悬液进行离心。

本发明的有益效果在于：

（1）本发明的胰腺癌类器官的培养基，其成分中含有苯丁酸钠和H-1152，具有组蛋白去乙酰化酶抑制功能，能够提高促进类器官细胞增殖和细胞活率；

（2）本发明的胰腺癌类器官的培养基，苯丁酸钠和H-1152具有显著的协同作用，能够进一步促进细胞的生长和增殖；

（3）本发明的胰腺癌类器官的培养基，能够有效的建立胰腺癌类器官以及对其长期的维持培养和扩增。实现胰腺癌类器官的快速稳定生长，在7天内即可得到活性较好，尺寸约为200 μm大小的胰腺癌类器官；

（4）本发明的胰腺癌类器官的培养方法，采用本发明的培养基进行培养，具有培养周期短、增殖快、细胞数和活率高的优点。

附图说明

图1为本发明的胰腺癌类器官的培养基，实施例1的培养7天胰腺癌类器官培养图；放大倍数为10倍；

图2为本发明的胰腺癌类器官的培养基，实施例2的培养7天胰腺癌类器官培养图；放大倍数为10倍；

图3为本发明的胰腺癌类器官的培养基，实施例3的培养7天胰腺癌类器官培养图；放大倍数为10倍；

图4为本发明的胰腺癌类器官的培养基，实施例4的培养7天胰腺癌类器官培养图；放大倍数为10倍；

图5为本发明的胰腺癌类器官的培养基，对比例1的培养7天胰腺癌类器官培养图；放大倍数为10倍；

图6为本发明的胰腺癌类器官的培养基，对比例2的培养7天胰腺癌类器官培养图；放大倍数为10倍；

图7为本发明的胰腺癌类器官的培养基，对比例3的培养7天胰腺癌类器官培养图；放大倍数为10倍；

图8为本发明的胰腺癌类器官的培养基，实施例1、对比例1~3的类器官数量对比柱形图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

本发明的胰腺癌类器官的培养基，包括Advanced DMEM/F12基础培养基、N-乙酰半胱氨酸（N-Acetylcysteine）、烟酰胺（Nicotinamide）、Wnt 3A、R-spondin、BMP4、A83-01、毛喉素（Forskolin）、成纤维细胞生长因子、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（GlutaMAX-I）、B27；还包括苯丁酸钠和H-1152。

Wnt 3A、R-spondin、BMP4为信号通路因子；其中，Wnt 3A为Wnt信号通路因子，R-Spondin为调控wnt/β-catenin信号通路的因子，BMP4为抑制BMP信号通路的因子。Forskolin可以激活腺苷环化酶，可提高细胞内cAMP的水平，在与其他小分子联用时，可诱导成纤维细胞重编程为诱导多能性干细胞。

L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、Nicotinamide、A83-01、N-Acetylcysteine、B27为基础养分；其中，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺是细胞培养的通用添加剂，Nicotinamide可以提高提高细胞活力，N-Acetylcysteine为抗氧化剂，B27为血清替代物。

本发明的胰腺癌类器官的培养基，其中含有苯丁酸钠。苯丁酸钠（Sodium 4-phenylbutyrate）是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，可以通过表观遗传途径调控肿瘤细胞特征。虽然有研究发现其可以抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡。但是，本发明的培养基中添加苯丁酸钠可以通过保留其组蛋白的乙酰化水平促进胰腺癌类器官的生长和自组装。

另外，本发明的培养基中还添加了H-1152，H-1152是一种选择性的Rock抑制剂，在构建肿瘤类器官过程中，通常在培养基中加入Rock抑制剂来保持干细胞多能性，促进干细胞自我更新和增殖。通过实验验证，苯丁酸钠和H-1152还具有协同作用。实验表明在胰腺癌类器官培养基中同时添加苯丁酸钠和H-1152两种生长因子，有利于胰腺癌类器官的生长与增殖。当H-1152和同样为组蛋白去乙酰化酶抑制剂的恩替诺特（Entinostat）共同作用时，效果不佳。

优选的，N-乙酰半胱氨酸的浓度为0.5-5 mM；烟酰胺的浓度为5-15 mM；Wnt 3A的浓度为50-300 ng/μL；R-spondin的浓度为200-800 ng/mL；A83-01的浓度为300-800 nM，毛喉素的浓度为5-20 μM；FGF10的浓度为5-20 ng/mL；L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的浓度为A（1×）；B27的浓度为A（1~2×）；苯丁酸钠的浓度为0.5-3 μg/mL；H-1152的浓度为5-15 μm；溶剂为Advanced DMEM/F12基础培养基。

进一步优选的，N-乙酰半胱氨酸的浓度为1.5 mM；烟酰胺的浓度为10 mM；Wnt 3A的浓度为100 ng/μL；R-spondin的浓度为200 ng/mL；A83-01的浓度为500 nM，毛喉素的浓度为10 μM；FGF10的浓度为10 ng/mL；苯丁酸钠的浓度为2μg/mL；H-1152的浓度为10 μm。

优选的，胰腺癌类器官的培养基中还包括pH缓冲液、抗菌成分，进一步确保该培养基能够有利于对胰腺癌类器官进行培养。

进一步优选的，pH缓冲液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES），其浓度为A(1×)，一般是5~20 mM。

进一步优选的，抗菌成分为青链霉素溶液（Penicillin-StreptomycinSolution）；青链霉素溶液的浓度为A（1×）。

优选的，本发明的Advanced DMEM/F12基础培养基中，DMEM与F12的质量比为1:1。

本发明的胰腺癌类器官的培养方法，采用上述的培养基进行培养。包括以下步骤：

S1、获取待培养的胰腺癌组织样本，采用DPBS清洗并去除多余的脂肪组织，然后将组织剪切并剪切均匀；剪切至到1 cm³大小的碎片。

S2、加入约10倍样本体积的消化液对步骤S1得到的胰腺癌组织样本进行消化，消化后离心，得到细胞沉淀；消化液含有1%透明质酸酶和2%胶原酶Ⅳ以及10 %DNA酶；

优选的，消化条件为，在37 ℃条件下震荡消化30 min；消化完成后加入DPBS终止消化；终止消化后，在500 xg条件下离心3 min，去除上清收集细胞沉淀。

S3、采用DPBS对细胞沉淀进行重悬，重悬后再次离心，得到细胞沉淀。

优选的，采用DPBS对细胞沉淀进行重悬后，过70 μm的网筛，收集过筛后的细胞悬液，再对细胞悬液500 xg条件下离心3 min，去除上清得到细胞沉淀。

S4、在步骤S3得到的细胞沉淀中加入红细胞裂解液1-2 mL，并置于冰上裂解10min，待裂解完成后加入DPBS终止并去除上清，保留沉淀。

S5、采用培养基对步骤S4得到的沉淀进行重悬并得到细胞溶液，再将细胞溶液与Matrigel胶以质量比为1:2的比例进行混合；混合后，进行滴胶接种，每个胶滴为50 μL；

S6、滴胶接种后，放置于培养箱中进行培养；待胶滴凝固后，在每个胶滴上覆盖1mL所述胰腺癌类器官的培养基，并于37 ℃、CO₂浓度为5 %的条件下培养7天，即可得到胰腺癌肿瘤类器官。

以下通过具体的实施例和对比例对本发明的效果进行具体说明：

需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品，实施例中的腹水均来源于受试者。

实施例1

本实施例采用的胰腺癌类器官的培养基的具体成分和含量为：

Advanced DMEM/F12基础培养基、苯丁酸钠2 μg/mL、H-1152 10 μm、N-Acetylcysteine 1.5 mM、Nicotinamide 10 mM、Wnt3A 100 ng/μL、R-spondin 200 ng/mL、A83-01 500 nM、Forskolin 10 μM、FGF10 10 ng/mL、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺 1×、HEPES 10mM、Penicillin-Streptomycin Solution 1×、B27 1×。

采用本发明的培养方法和上述培养基对胰腺癌类器官的培养方法，对采集到的人的胰腺癌组织进行处理和培养。

如图1所示，采用本实施例培养基及培养方法，所得的类器官直径较大，尺寸约为200 μm大小，并具有良好的球形规则。

实施例2

Advanced DMEM/F12基础培养基、苯丁酸钠3 μg/mL、H-1152 15 μm、N-Acetylcysteine 2 mM、Nicotinamide 15 mM、Wnt3A 150 ng/μL、R-spondin 300 ng/mL、A83-01 600 nM、Forskolin 15 μM、FGF10 15 ng/mL、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺1×、HEPES 10mM、Penicillin-Streptomycin Solution 1×、B27 1×。

如图2所示，采用本实施例培养基及培养方法，所得的类器官直径较大，尺寸约为200 μm大小，并具有良好的球形规则。

实施例3

Advanced DMEM/F12基础培养基、苯丁酸钠0.5 μg/mL、H-1152 5 μm、N-Acetylcysteine 4.5 mM、Nicotinamide 12.5 mM、Wnt3A 300 ng/μL、R-spondin 600 ng/mL、A83-01 600 nM、Forskolin 15 μM、FGF10 20 ng/mL、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺1×、HEPES15 mM、Penicillin-Streptomycin Solution 2×、B27 2×。

如图3所示，采用本实施例培养基及培养方法，所得的类器官活性较好，大小均一，尺寸约为200 μm大小。

实施例4

Advanced DMEM/F12基础培养基、苯丁酸钠1 μg/mL、H-1152 8.5 μm、N-Acetylcysteine 2.5 mM、Nicotinamide 12 mM、Wnt3A 200 ng/μL、R-spondin 500 ng/mL、A83-01 600 nM、Forskolin 5 μM、FGF10 15 ng/mL、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺1×、HEPES 5mM、Penicillin-Streptomycin Solution 1×、B27 1×。

如图4所示，采用本实施例培养基及培养方法，所得的类器官大小均一，尺寸约为200 μm大小，并具有清晰类器官边界。

对比例1

本对比例提供的培养基，与实施例1的培养基相比，减去苯丁酸钠，培养过程同实施例1。如图5所示，用此培养基进行培养的胰腺癌类器官生长较为缓慢，数量较少。相较于实施例1，此培养基生长的胰腺癌类器官数量显著降低，活性降低。

对比例2

本对比例提供的培养基，与实施例1的培养基相比，减去H-1152，培养过程同实施例1。如图6所示，用此培养基进行培养的胰腺癌类器官生长状态较差，类器官数量较少，活性差。

对比例3

本对比例提供的培养基，与实施例1的培养基相比，将其中的苯丁酸钠替换为同为组蛋白去乙酰化酶抑制剂的恩替诺特，培养过程同实施例1。如图7所示，用此培养基进行培养的胰腺癌类器官生长较慢，类器官活性较低。

苯丁酸钠和H-1152具有协同作用，当H-1152和同样为组蛋白去乙酰化酶抑制剂的恩替诺特因子共同作用时，效果不佳。

实施例1与对比例1~3的类器官数量对比如图8所示，细胞活率如表1所示：

表1

通过图8和表1可以得到以下结论：

（1）对比例1的培养基中未添加苯丁酸钠，在其他成分和含量相同的情况下，与实施例1相比，类器官数量大幅下降，细胞活率也大大降低，因此，苯丁酸钠在胰腺癌类器官的培养具有重要的作用。

（3）对比例2的培养基中未添加H-1152，在其他成分和含量相同的情况下，与实施例1相比，类器官数量大幅下降，细胞活率也大大降低，因此，H-1152在胰腺癌类器官的培养具也有重要的作用。

（4）对比例3将苯丁酸钠替换为同为组蛋白去乙酰化酶抑制剂的恩替诺特。与实施例1相比，虽然类器官数量比对比例1和对比例2高，但仍显著的低于实施例1；同时，细胞活率也比较低。这说明本发明的培养基中，苯丁酸钠与H-1152之间具有协同作用，两者并不是独立的发挥作用。虽然恩替诺特与苯丁酸钠的性质相同，但替换后的培养基培养的胰腺癌类器官数量和细胞活率都很低。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种胰腺癌类器官的培养基，其特征在于，

所述培养基的具体成分和含量为：Advanced DMEM/F12基础培养基、苯丁酸钠2 μg/mL、H-1152 10 μm、N-Acetylcysteine 1.5 mM、Nicotinamide 10 mM、Wnt3A 100 ng/μL、R-spondin 200 ng/mL、A83-01 500 nM、Forskolin 10 μM、FGF10 10 ng/mL、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺 1×、HEPES 10 mM、Penicillin-Streptomycin Solution 1×、B27 1×；

或，所述培养基的具体成分和含量为：Advanced DMEM/F12基础培养基、苯丁酸钠3 μg/mL、H-1152 15 μm、N-Acetylcysteine 2 mM、Nicotinamide 15 mM、Wnt3A 150 ng/μL、R-spondin 300 ng/mL、A83-01 600 nM、Forskolin 15 μM、FGF10 15 ng/mL、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺1×、HEPES 10 mM、Penicillin-Streptomycin Solution 1×、B27 1×；

或，所述培养基的具体成分和含量为：Advanced DMEM/F12基础培养基、苯丁酸钠0.5 μg/mL、H-1152 5 μm、N-Acetylcysteine 4.5 mM、Nicotinamide 12.5 mM、Wnt3A 300 ng/μL、R-spondin 600 ng/mL、A83-01 600 nM、Forskolin 15 μM、FGF10 20 ng/mL、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺1×、HEPES 15 mM、Penicillin-Streptomycin Solution 2×、B27 2×；

或，所述培养基的具体成分和含量为：Advanced DMEM/F12基础培养基、苯丁酸钠1 μg/mL、H-1152 8.5 μm、N-Acetylcysteine 2.5 mM、Nicotinamide 12 mM、Wnt3A 200 ng/μL、R-spondin 500 ng/mL、A83-01 600 nM、Forskolin 5 μM、FGF10 15 ng/mL、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺1×、HEPES 5 mM、Penicillin-Streptomycin Solution 1×、B27 1×。

2.一种胰腺癌类器官的培养方法，其特征在于，采用如权利要求1所述的胰腺癌类器官的培养基进行培养。

3.根据权利要求2所述一种胰腺癌类器官的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

所述消化液含有透明质酸酶和胶原酶Ⅳ以及DNA酶；

S4、在所述步骤S3得到的细胞沉淀中加入红细胞裂解液1-2 mL，并置于冰上裂解10min，待裂解完成后加入DPBS终止并去除上清，保留沉淀；

S5、采用所述胰腺癌类器官的培养基对步骤S4得到的沉淀进行重悬并得到细胞溶液，再将所述细胞溶液与Matrigel胶以质量比为1:2的比例进行混合；混合后，进行滴胶接种，每个胶滴为50 μL；

S6、滴胶接种后，放置于培养箱中进行培养；待所述胶滴凝固后，在每个所述胶滴上再覆盖1 mL所述胰腺癌类器官的培养基，并于37 ℃、CO₂浓度为5 %的条件下培养7天，即可得到胰腺肿瘤类器官。

4. 根据权利要求3所述一种胰腺癌类器官的培养方法，其特征在于，所述步骤S2中的消化条件为，在37 ℃条件下震荡消化30 min；消化完成后加入DPBS终止消化。

5.根据权利要求3所述一种胰腺癌类器官的培养方法，其特征在于，所述步骤S3中，采用DPBS对所述细胞沉淀进行重悬后，过70 μm的网筛，收集过筛后的细胞悬液，再对所述细胞悬液进行离心。