CN111690615B - 一种鼻咽癌类器官专用培养基及无支架培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鼻咽癌类器官专用培养基及无支架培养方法，培养基由EGF、Noggin、Y‑27632、A83‑01、SB202190、bFGF、氢化可的松、Insulin、青霉素/链霉素双抗、FBS和Keratinocyte‑SFM组成。培养方法是将分离的鼻咽癌肿瘤细胞接种超低吸附U型细胞培养板中，加入鼻咽癌类器官专用培养基，经离心后置于37℃，体积浓度为5％的CO2培养箱中进行培养，每隔2‑3天更换一次无支架培养基。本发明鼻咽癌类器官专用培养基及无支架培养方法无需引入外源性支架材料，借助重力可促进细胞聚集成团，实现肿瘤细胞短时间内快速扩增构建类器官，成功率可达100％，且能保持原代肿瘤特异性；同时，可长期维持肿瘤细胞活力和功能性高表达。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤类器官培养领域，进一步涉及鼻咽癌类器官培养领域，特别是用于鼻咽癌类器官专用培养基、无支架培养方法。
背景技术
鼻咽癌来源于鼻咽上皮细胞，是鼻咽部上皮组织发生的恶性肿瘤，在流行病学上有明显的地域特点，高发于我国南部和东南亚地区。鼻咽癌具有与其他头颈部鳞癌不同的发病因素和肿瘤生物学行为。随着诱导化疗、同期放化疗和适形调强放疗在鼻咽癌治疗中的广泛应用，鼻咽癌的局部控制率得到了明显的改善。但是，疗后的局部/区域复发与远处转移仍然常见，是鼻咽癌治疗失败的主要原因，而且常常难以预料并予以有效预防。另外，目前临床上用于抗鼻咽癌的药物主要以传统的抗恶性肿瘤药如顺铂、氟尿嘧啶为主，但是常产生耐药性，且不良反应严重。并且对于已经接受过初次综合治疗的患者，复发的肿瘤细胞的敏感性较前下降，同时患者的身心状况较初次治疗也存在不同程度的下降。如何能够从众多抗癌药物中快速寻找出对鼻咽癌/复发转移癌敏感的药物，最大程度减少药物耐药性的出现，避免延误最佳治疗时机，成为鼻咽癌临床治疗亟待解决的问题之一。
类器官，是一类由干细胞，包括多能干细胞和成体干细胞，在体外培养时形成的能够进行自我组装的微观三维结构。人源肿瘤类器官能够取自组织癌变过程中各个阶段的肿瘤组织，突破性地提高了肿瘤细胞体外培养的效率，同时最大程度地维持了肿瘤细胞在体内的特征，因而得到广大研究人员的青睐，被《Nature Methods》评为2017年生命科学领域年度技术。目前鼻咽癌肿瘤类器官培养已有研究报道，但是其培养多局限于基质胶中，该培养方式限制了类器官与外界的气体交换和物质代谢，当类器官形成较大的组织后，循环系统的缺乏和氧气养分交换的局限性严重影响了类器官所需营养物质的吸收以及代谢废物的清除；并且因3D细胞球周围有外基质而无法进行原位光学检测，而去除外基质的过程不仅繁琐，一定程度上还会对细胞活性造成影响，干扰实验结果的真实性。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中培养类器官需要支架材料，导致细胞生长不良、支架材料去除困难等缺陷，提供一种可以无需支架材料的鼻咽癌专用培养基，还提供了一种配套的培养方法，可快速形成类器官，且大小均一、形状规则，遗传及生物学性状稳定。
本发明提供的鼻咽癌类器官专用培养基，由以下组分组成：EGF、Noggin、Y-27632、A83-01、SB202190、bFGF、氢化可的松、Insulin、青霉素/链霉素双抗、FBS和Keratinocyte-SFM。
EGF是人体内分泌的一种重要细胞生长因子，具有很强的生理活性，如能促进上皮细胞、成纤维细胞的增值。
Noggin是一种重要的胚胎蛋白，在胚胎背腹轴模式形成、神经管发育及神经诱导方面有重要功能。
Y-27632是一种ATP竞争性的ROCK-I和ROCK-II抑制剂，具有防止细胞凋亡的作用。
A83-01是一种TGF-βI型受体ALK5激酶、I型激活素ALK4以及I型节点受体ALK7的选择性抑制剂，加入培养基发挥维持细胞干性，抑制细胞分化的作用。
SB202190是一种有效的p38 MAPK抑制剂，靶向作用于p38α/β，对分离的原代肿瘤细胞具有保护作用。
bFGF是碱性成纤维细胞生长因子。
氢化可的松：糖皮质激素，具有抗炎及免疫抑制作用。
Insulin：胰岛素，可刺激细胞对尿苷和葡萄糖的吸收以合成RNA、蛋白质和脂质；还能与细胞膜上的胰岛素受体结合而调控细胞内的多种代谢途径，增加脂肪酸和葡萄糖的合成，对细胞生长起重要作用
青霉素/链霉素双抗：是专门用于细胞培养的，可以直接添加到细胞培养液内，抑制细菌生长；避免细胞污染。
FBS：胎牛血清，提供细胞生长、贴壁必须的营养成分和因子，如提供对维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或量很少的营养物及因子，以及主要的低分子营养物。
Keratinocyte-SFM：一种细胞基础培养基。
优选的，上述鼻咽癌类器官专用培养基，各组分在培养基中的终浓度或体积百分比如下：
EGF 10-30ng/mL、Noggin 100-500ng/mL、Y-27632 10-100μM、A83-01 0.5-1.5μM、SB202190 10-50μM、bFGF 0.5-50ng/mL、氢化可的松20-200ng/mL、Insulin 0.5-1.5μg/mL、青霉素/链霉素双抗1％、FBS 1-5％。
优选的，上述鼻咽癌类器官专用培养基，各组分在培养基中的终浓度或体积百分比如下：
EGF 20ng/mL、Noggin 200ng/mL、Y-27632 10μM、A83-01 0.6μM、SB202190 10μM、bFGF 5ng/mL、氢化可的松80ng/mL、Insulin 1μg/mL、青霉素/链霉素双抗1％、FBS 2％。
本发明还提供了一种使用以上任一所述鼻咽癌类器官专用培养基培养3D鼻咽癌类器官的方法，包括以下步骤：
将分离的鼻咽癌肿瘤细胞接种到鼻咽癌类器官专用培养基中，经离心后置于37℃，体积浓度为5％的CO2培养箱中进行培养，每隔2-3天更换一次无支架培养基。离心的目的是使细胞通过物理方式在培养初期聚集成小团，便于后期沿着小团进行外延生长繁殖。
优选的，上述方法中，所述肿瘤细胞接种的器皿为超低吸附U型细胞培养板。
优选的，上述方法中，所述肿瘤细胞接种的器皿为信安佳96孔类器官专用培养板。信安佳96孔类器官专用培养板是江苏信安佳医疗科技有限公司研制的专门用于培养3D类器官的培养板，使用本发明培养基配合该培养板后，培养时间更短，培养效果更佳
优选的，上述方法中，所述离心条件为温度4℃，转速1000rpm/min，时间3分钟。
优选的，上述方法中，所述鼻咽癌肿瘤细胞是由鼻咽癌肿瘤组织经预处理获得，预处理步骤为：
使用4℃预冷的组织洗涤液将鼻咽癌肿瘤组织清洗干净，在离心管内用灭菌眼科剪将组织剪成小块；加入10倍体积的组织消化液后，将离心管放置到37℃恒温箱内摇床，消化30分钟；用200目尼龙网筛过滤消化液中的细胞，滤液中加入5mL含体积浓度5％FBS的Keratinocyte-SFM培养基终止消化；剩余组织加入组织消化液进行二次消化，30分钟后过滤收集滤液，加入体积浓度5％FBS的Keratinocyte-SFM培养基终止消化；合并两次消化获得滤液，1000rpm，4℃，离心3min，弃上清，所得细胞进行活细胞计数。
优选的，上述方法中，所述组织洗涤液用PBS配制，其成分含量如下：青霉素/链霉素500U/mL，两性霉素B12.5mg/L。
优选的，上述方法中，所述组织消化液用Hank's溶液配制，其成分含量如下：Ⅰ型胶原质量浓度0.1％，Ⅳ型胶原质量浓度0.1％。
本发明提供的鼻咽癌类器官专用培养基及培养方法，具有如下有益效果：
本发明的培养基在培养类器官时，无需引入Matrigel等外源性基质作为支架材料，只需将细胞放置在装有该培养基的U型和V型孔板内，借助重力即可促进细胞聚集成团，培养过程中专用培养基能充分保证细胞球内部细胞的营养及生长分裂需求，促进细胞之间的交互，使得原代肿瘤细胞无需支架即可自组装成3D细胞球，且保持原代肿瘤异质性。
通过培养基成分优化及方法改进，实现肿瘤细胞短时间内快速扩增构建类器官，成功率可达100％。相比于现有技术，很好的解决了类器官随机形成，成功率低，大小和形状不均一等问题。同时，本发明提供的类器官专用培养基可长期维持细胞活力和功能性高表达(＞20天)。本发明技术可在有效的时间内获得足够多的鼻咽癌肿瘤类器官3D细胞球开展后续实验操作，极大提高了类器官的培养速度和成功率。
本发明的培养方法可从来源于患者的鼻咽癌肿瘤组织中快速分离、培养鼻咽癌原代肿瘤细胞，且可在接种3天内获得稳定的类器官3D细胞球。该类器官细胞球大小均一、外形规则，具有与来源组织高度的一致性，可作为体外研究肿瘤的发生、发展、体外药敏筛选及耐药机制的理想研究模型。
肿瘤类器官三维培养模型，相比传统的二维培养模型，具有更接近生理细胞组成和行为，更稳定的基因组，更适合于高通量药物筛及肿瘤发生、发展的体外研究等优势。相比肿瘤动物模型，类器官模型的操作更简单、成功率高，且时间短。本专利技术提供的无支架鼻咽癌类器官的培养方法克服了现有类器官3D培养的不足，在培养过程中无需引入外源基质作为支架，可以更快速的形成肿瘤类器官，接种3天内即可组装形成类器官，且大小均一，形状规则，更有利于后续开肿瘤相关研究及高通量药物筛选，特别适宜开展针对单个类器官进行的研究及检测。利用该模型对患者进行体外药物敏感性测试，可最大程度提高鼻咽癌的治疗效果，避免耐药性的出现。
附图说明
图1：无支架鼻咽癌类器官显微镜观察照片(3500个细胞/孔，培养3天，放大倍数：100×)；
图2：缺成分培养基与完全培养基构建的类器官活力比较(n＝8)；
图3：缺关键成分类器官培养基培养20天时类器官显微镜观察照片(3500个细胞/孔，放大倍数：100×)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细地解释和说明，以使本领域技术人员能够更好地理解并予以实施。
实施例中使用的培养基成分来源：
EGF：表皮细胞生长因子，购自Novoprotein公司；
Noggin：头蛋白，购自Novoprotein公司；
Y-27632：ROCK抑制剂，购自Novoprotein公司；
A83-01：TGF-β1受体抑制剂，购自MCE公司；
bFGF：碱性成纤维细胞生长因子，购自Gibco公司；
氢化可的松：购自Sigma公司；
Insulin：胰岛素，购自Sigma公司；
青霉素/链霉素双抗：购自Sigma公司；
FBS：胎牛血清，购自Gibco公司；
Keratinocyte-SFM：购自Novoprotein公司。
实施例1
鼻咽癌类器官专用培养基配方：
EGF 20ng/mL、Noggin 200ng/mL、Y-27632 10μM、A83-01 0.6μM、SB202190 10μM、bFGF 5ng/mL、氢化可的松80ng/mL、Insulin 1μg/mL、青霉素/链霉素双抗1％、FBS 2％，Keratinocyte-SFM补充至所需体积。
实施例2
组织洗涤液配方：含有青霉素/链霉素500U/mL，两性霉素B12.5mg/L的PBS溶液。
实施例3
组织消化液配方：含有Ⅰ型胶原0.1％(质量百分含量)，Ⅳ型胶原0.1％(质量百分含量)的Hank's溶液。
实施例4鼻咽癌组织分离
1、新鲜癌组织处理
将鼻咽癌新鲜肿瘤组织使用4℃预冷的组织洗涤液清洗干净。在离心管内用灭菌眼科剪将组织剪成小块，组织块大小为1mm2左右。加入5mL组织消化液(约10倍体积)后，将离心管放置到37℃恒温箱内摇床，消化30分钟。
用200目尼龙网筛过滤消化液中的细胞，滤液中加入5mL含5％FBS的Keratinocyte-SFM培养基终止消化。剩余组织加入组织消化液进行二次消化，30分钟后过滤收集滤液，5％FBS的Keratinocyte-SFM培养基终止消化。合并两次消化获得滤液，1000rpm，4℃，离心3min，弃上清，所得细胞用鼻咽癌类器官专用培养基重悬，活细胞计数后备用。
2、液氮冻存癌组织处理
液氮冻存肿瘤组织也可提取原代肿瘤细胞，具体步骤为：将鼻咽癌新鲜肿瘤组织使用4℃预冷的组织洗涤液清洗干净。在离心管内用灭菌眼科剪将组织剪成小块，组织块大小为1mm2左右。转移至冻存管内，加入适量细胞冻存液，梯度降温后液氮保存，运输。
原代肿瘤细胞提取前，将冻存管从液氮中取出，立即放入37℃水浴；解冻后加入组织洗涤液清洗，100g，4℃，离心2min收集组织块。之后将组织转移至15mL离心管内，操作同新鲜组织的消化过程。
实施例5鼻咽癌原代肿瘤细胞的2D培养
本发明所提供的培养基不仅适用于无支架鼻咽癌肿瘤组织类器官的培养，同时可用于鼻咽癌原代肿瘤细胞的2D常规培养，具体步骤如下：将分离所得细胞接种于6孔贴壁细胞培养板中，每孔接种不少于104个细胞，加入2mL实施例1的培养基，置于37℃，5％CO2培养箱中进行培养，5天后第一次换液，之后每隔2天换液一次。约10天左右可达到80％融合，使用TrypLET消化液消化后，加入含5％FBS的Keratinocyte-SFM培养基终止消化，细胞计数可按1：2进行细胞传代培养。2D扩增培养的鼻咽癌原代肿瘤细胞可TrypLET消化液消化后液氮冻存，也可用于类器官的培养或肿瘤相关的体外研究。
实施例6鼻咽癌原代肿瘤细胞的3D培养
实施例4中分离得到的鼻咽癌原代肿瘤细胞，按3000个细胞/孔(1000-12000细胞/孔)细胞接种于96孔低吸附U型板中，优选信安佳96孔类器官专用培养板。每孔加入100μL实施例1中的培养基，4℃，1000rpm/min，离心3分钟后置于37℃，5％CO2培养箱中进行培养，每两天换液一次，约5-7天可形成外形规则、大小均一的鼻咽癌肿瘤组织类器官3D细胞球。
由于来源于鼻咽癌患者的肿瘤组织获取量有限，直接分离后进行接种很难满足后续研究需求，而本研究提供的方法同样适用于实施例5扩增后的肿瘤原代细胞。用扩增后的原代肿瘤细胞接种24h(1000-12000个细胞/孔)即可形成类器官3D细胞球，3天左右细胞球组装稳定，成功建立外形规则、大小均一的鼻咽癌肿瘤组织类器官3D细胞球，见附图1所示。之后，细胞球体积开始增长，可稳定培养30天以上。
实施例7无支架鼻咽癌肿瘤组织类器官的传代
收集培养孔板中稳定生长的类器官，一般培养10天之后即可进行传代，4℃，1000rpm/min，离心3分钟后，去除上清；沉淀类器官细胞球加入PBS，清洗3次；之后，4℃，1000rpm/min，离心3分钟后，弃上清。加入适量TrypLET消化液(1块96孔培养板收集类器官可加入1.5-2mL的TrypLET消化液)，轻柔吹打至细胞球散开。之后加入等体积含5％FBS的Keratinocyte-SFM培养基终止消化。4℃，1000rpm/min，离心5分钟，收集细胞沉淀，用实施例1的培养基重悬细胞，活细胞计数后按接种需求进行传代。由于本专利技术提供的是一种无支架的鼻咽癌肿瘤类器官培养方法，因此无需复杂的类器官培养基质去除过程，可最大程度的减轻消化传代对细胞损伤，维持细胞特性。
实施例8不同成分培养基的培养效果比较
对实施例1中涉及的鼻咽癌类器官专用培养基中的关键成分作用进行必要性研究，分别设置缺EGF、缺Noggin、缺Y-27632、缺A83-01、缺SB202190、缺bFGF、缺氢化可的松和缺Insulin培养基组进行类器官培养对比研究，肿瘤细胞接种7天后，对形成的类器官进行ATP细胞活力检测，结果见图2。缺少任一成分都会影响类器官的形成时间，且类器官中细胞活力较专用培养基均明显降低，特别是缺Noggin和缺bFGF培养基组原代细胞聚集松散，难以构建形成边界清楚、紧实的3D类器官细胞球。另外，随着培养时间的延长，其他缺成分组类器官3D细胞球会出现不同程度的凋亡现象，培养20天内即严重凋亡，如图3所示。
实施例9
对本发明方法构建的鼻咽癌类器官进行鉴定。实施例6中培养的类器官为无支架培养，使用信安佳96孔类器官专用培养板培养的类器官可以直接在培养孔内对类器官进行石蜡包埋，冰冻切片后进行HE染色，组织结构与细胞种类与来源肿瘤组织一致。同时，对实施例5获取的原代肿瘤细胞、实施例6获取的类器官以及来源肿瘤组织委托博奥晶典生物做全外显子和mRNA测序，证实了原代肿瘤细胞、实肿瘤类器官与来源肿瘤组织的同源性。表明用本发明的鼻咽癌类器官专用培养基及培养方法所获得的秋装类器官遗传及生物学性能稳定。
实施例10用类器官模型筛选药物
基于本发明技术所建立的无支架鼻咽癌类器官模型，选用顺铂、吉西他滨、顺铂+吉西他滨联合用药、奥沙利铂、5-氟尿嘧啶和奥沙利铂+5-氟尿嘧啶联合用药作为代表药物，进行药敏测试。根据每种药物的最大血药浓度(PPC)来设定药敏筛选的浓度。顺铂的PPC为6.3μg/mL，吉西他滨的PPC为25μg/mL，奥沙利铂的PPC为1.0μg/mL，5-氟尿嘧啶的PPC为2.08μg/mL。
通过实施例4分离获得来源于鼻咽癌患者肿瘤组织的原代肿瘤细胞，按照实施例6成功构建体外无支架鼻咽癌类器官模型。接种3天后对形成的无支架类器官3D细胞球随机分为7组：顺铂、吉西他滨、顺铂+吉西他滨联合用药、奥沙利铂、5-氟尿嘧啶，奥沙利铂+5-氟尿嘧啶联合用药组及对照组。每个给药组设定5个给药浓度梯度，为0％、25％、50％、100％、200％PPC，每个浓度设置8个复孔。分别在给药第3、5、7天进行细胞ATP测定，计算药物对细胞活性的抑制率，根据细胞ATP测定结果对测试药物的敏感性进行评价。药物敏感性评价依据生物荧光肿瘤体外药敏检测技术(ATP-TCA)的药敏评价标准：强敏感：IC50<25％及IC90<100％PPC；中度敏感：IC50<25％及IC90>100％PPC；轻度敏感：IC50>25％及IC90<100％PPC；耐药：IC50>25％及IC90>100％PPC。药物敏感性评价的结果见表1所示。
表1基于无支架鼻咽癌类器官的药敏检测结果
该患者体外类器官3D模型药敏结果显示，给药7天除奥沙利铂外，均显示强敏感性。吉西他滨联合顺铂的给药方案是肺癌的一线用药方案，有报道对鼻咽癌敏感，已用于鼻咽癌治疗。吉西他滨+顺铂联合给药组，3天即显示强敏感性，提示该患者可能对其最为敏感，推荐吉西他滨与顺铂联合用药作为该患者的首选治疗药物。体外类器官药敏筛选结果与该患者的临床治疗效果反馈一致，患者显著受益。
本文中应用了具体个例对发明构思及应用进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种培养鼻咽癌无支架3D类器官的方法，其特征在于，是将分离的鼻咽癌肿瘤细胞接种到鼻咽癌类器官专用培养基中，经离心后置于37℃，体积浓度为5％的CO2培养箱中进行培养，每隔2-3天更换一次无支架培养基；
所述鼻咽癌肿瘤细胞是由鼻咽癌肿瘤组织经预处理获得，预处理步骤为：
使用4℃预冷的组织洗涤液将鼻咽癌肿瘤组织清洗干净，在离心管内用灭菌眼科剪将组织剪成小块；加入10倍体积的组织消化液后，将离心管放置到37℃恒温箱内摇床，消化30分钟；用200目尼龙网筛过滤消化液中的细胞，滤液中加入5mL含体积浓度5％FBS的Keratinocyte-SFM培养基终止消化；剩余组织加入组织消化液进行二次消化，30分钟后过滤收集滤液，加入体积浓度5％FBS的Keratinocyte-SFM培养基终止消化；合并两次消化获得滤液，1000rpm，4℃，离心3min，弃上清，所得细胞进行活细胞计数；
所述鼻咽癌类器官专用培养基由以下组分组成，各组分在培养基中的终浓度或体积百分比如下：
EGF 10-30ng/mL、Noggin 100-500ng/mL、Y-27632 10-100μM、A83-01 0.5-1.5μM、SB202190 10-50μM、bFGF 0.5-50ng/mL、氢化可的松20-200ng/mL、Insulin 0.5-1.5μg/mL、青霉素/链霉素双抗1％、FBS 1-5％；Keratinocyte-SFM补充至所需体积；
所述组织洗涤液用PBS配制，其成分含量如下：青霉素/链霉素500U/mL，两性霉素B12.5mg/L；
所述组织消化液用Hank's溶液配制，其成分含量如下：Ⅰ型胶原质量浓度0.1％，Ⅳ型胶原质量浓度0.1％。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，各组分在培养基中的终浓度或体积百分比如下：
EGF 20ng/mL、Noggin 200ng/mL、Y-27632 10μM、A83-01 0.6μM、SB202190 10μM、bFGF5ng/mL、氢化可的松80ng/mL、Insulin 1μg/mL、青霉素/链霉素双抗1％、FBS 2％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肿瘤细胞接种的器皿为超低吸附U型细胞培养板。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离心条件为温度4℃，转速1000rpm/min，时间3分钟。
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