CN104862268A - 将人脂肪干细胞分离并诱导成胰岛β细胞的培养基及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种将人脂肪干细胞分离并诱导成胰岛β细胞的培养基及其使用方法。本发明设计了一套优选的培养基，它无需基因转染，故无基因改变和癌症风险，诱导步骤少，使用简单，诱导时间短，比现有技术减少30%的诱导时间，且安全无毒，诱导成功率高。并且自体脂肪间充质干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞后，自体移植后无排斥，无伦理问题，安全性高，具有广阔的临床应用前景。本发明简单易行，成本低廉，使用效果好。

Description

将人脂肪干细胞分离并诱导成胰岛β细胞的培养基及其使用方法

技术领域

本发明涉及生物科学技术领域，尤其是一种将人脂肪干细胞分离并诱导成胰岛β细胞的培养基及其使用方法。

背景技术

近十年糖尿病的发病率日益上升,正越来越严重的危害人类健康。但传统的治疗方法却未能有效而稳定地控制血糖,因此研究者试图改进糖尿病的治疗方法,转而将目光投向胰岛细胞移植。但是这一疗法却因细胞来源匾乏而受到限制。面对细胞来源的巨大缺口,目前最有希望的就是从脂肪间充质干细胞诱导分化出大量可供移植的胰岛样细胞。己经有研究报道,多种成体干细胞都可以被诱导分化为胰岛β样细胞。

传统的糖尿病治疗包括饮食治疗、运动治疗、药物治疗等几个方面，该类方法均能达到长期有用的效果。细胞疗法治疗糖尿病是从细胞水平进行修复、补充受损细胞，其效果是其他疗法所不能比拟的。这种治疗用的诱导细胞在体内微环境下具有再分化能力，能够分化出新的细胞及组织，达到不可比拟的医学价值。

研究表明脂肪间充质干细胞便于获取，体外增殖能力强。其生物学特性与脐带间充质干细胞相似，并可向神经，胰岛，肝，脂肪等多种细胞转化。由于脂肪组织在人体内储量丰富，获取简便，创伤小等特点。在组织工程、基因治疗、器官修复等方面都有着广阔的运用前景。

发明内容

本发明的目的是：提供一种将人脂肪干细胞分离并诱导成胰岛β细胞的培养基及其使用方法，它安全无毒，诱导成功率高。

本发明是这样实现的：将人脂肪干细胞分离并诱导成胰岛β细胞的培养基，包括DMEM培养基，其中激活素为3mmol/L，反式维甲酸为1umol/L，EGF为100ng/ml，bFGF为10ng/ml ，胰高血糖素样肽1为10ng/ml，尼克酰胺为10mmol/L。

将人脂肪间充质干细胞诱导成胰岛素分泌细胞的方法，将脂肪组织消化后，进行原代细胞培养及传代培养；将传3代的脂肪间充质干细胞，采用质量百分比为0.25% Trypsin-EDTA溶液消化收集细胞，制备细胞悬液，细胞计数板计数活细胞密度，并调整密度至1 X 10⁴/cm²，接种于24孔板内，制备细胞爬片；待细胞达到75%-85融合后，生长旺盛时用上述培养基进行诱导分化，诱导时间为7天，将诱导后的细胞进行鉴定。

所述的细胞鉴定方法为双硫腙染色反应，流式细胞术检测胰岛阳性细胞。

反式维甲酸在体内对中，外胚层的发育起重要的作用，一般常用于体外向神经细胞分化的实验中。最近有研究表明,反式维甲酸也参与内胚层的组织细胞分化，它在早期胚胎胰腺发育过程中是一个重要的信号分子。

激活素A是转化生长因子(Transforminggrowthfactor,TGF)β家族成员，其受体在胚胎和成体胰岛的a和δ细胞中表达；它对细胞的增殖、分化、凋亡都起着重要作用。

EGF可以促进有丝分裂活性，对一多种表皮细胞和上皮细胞，甚至是祖细胞的生长有刺激作用；参与损伤的修复。

GLP-1(胰高血糖素样肽1)可以剌激胰岛细胞增殖、分化，抑制胰岛细胞凋亡；而且可以促进胰岛素基因转录，促进细胞分泌胰岛素。

为了验证本发明的技术效果，申请人进行了如下实验：

1.Ⅰ糖尿病小鼠模型的制作

l)实验动物:雄性小鼠(sPF级),鼠龄8一12周,体重18一22克;

参与实验的小鼠共35只,随机分为2组,其中正常小鼠组为5只,参与模型制作的小鼠为30只;

2)用天平称量小鼠体重,并取尾血,用血糖仪测小鼠基础血糖值;

3)参与造模的小鼠予以禁食12h;

4)将链脉霉素（STZ）充分溶解于新鲜配制的0.lmol/L柠檬酸缓冲液(pH4.6)中,配制成质量分数为1%的STZ溶液;

5)按180mg/kg体重的剂量,予小鼠腹腔注射1%的STz溶液;

6)造模后第3d,第6d取尾血,用血糖检测仪检测小鼠血糖水平,均出现高血糖(非禁食血糖大于16.7mmol/L)者脚]认为造模成功,入选实验;

7)造模成功的糖尿病小鼠再随机分为3组,分别为细胞因子组(5只)(移植经诱导的细胞)脂肪干细胞组(5只)(移植未经诱导的细胞)单纯STZ造模组(5只)正常组(5只）"即本实验分组情况如下:细胞因子组(5只)、脂肪干细胞组(5只)、单纯STZ造模组(5只)、正常组(5只)。

2.  Ⅰ型糖尿病小鼠模型的制备情况

通过参照文献以及我们在预实验中的结果,我们采用了腹腔注射链霉素(180mg/kg体重)的剂量进行造模"根据我们在预实验中的结果,采用这个剂量造模既保证了造模的成功率,也保证了糖尿病小鼠的存活率"如果按照一般的标准(小鼠随机血糖大于11.1mmol/L即为造模成功),我们的小鼠造模成功率为100%"为了排除胰腺损伤后自发恢复的情况,我们采用了更高的纳入标准,即小鼠随机血糖大于16.7mmol/L即为造模成功"按照此标准,我们的造模成功率为90.00%(27/30)"正常C57BL/6j小鼠的血糖平均为(6.47士0.62)nunol/L;而造模后第3d的血糖为(21.0肚2.89)mmol/L,第6d为(28.62士2.21)mmol/L"小鼠在造模后除了出现血糖升高外,还出现多饮多尿,消瘦,脱毛,精神萎靡等症状

3.糖尿病小鼠血糖监测

接受诱导细胞移植的小鼠在术后72h内,血糖就开始下降平均血糖为(20.62士1.56)mmol/L，5只小鼠中有2只小鼠血糖在下降过程中出现波动,另外3只小鼠则血糖持续下降,5只小鼠的血糖在术后15天(第21天)稳定在6一8mmol/L,同时症状有所缓解;直至术后24天(第30天)小鼠依然存活状况良好。在实验第30天,将血糖恢复至正常的小鼠切除移植侧肾脏,小鼠的血糖在24h内迅速恢复到移植前的高血糖水平。

脂肪干细胞组的小鼠同样也在术后血糖开始下降,总体呈现下降趋势;在下降过程中,血糖出现波动;术后18天(第24天)血糖开始稳定,在10mmol/L附近波动;直至术后24天(第30天),全部小鼠存活,状态良好"在实验第30天,将血糖恢复至接近正常的小鼠切除移植侧肾脏,小鼠的血糖在24h内迅速恢复高血糖。

而单纯STZ组和正常组小鼠的血糖一直保持在高水平(在30mmol/L左右波动),直到实验结束所有小鼠均存活。

由于采用了以上技术方案，本发明设计了一套优选的培养基，它无需基因转染，故无基因改变和癌症风险，诱导步骤少，使用简单，诱导时间短，比现有技术减少30%的诱导时间，且安全无毒，诱导成功率高。并且自体脂肪间充质干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞后，自体移植后无排斥，无伦理问题，安全性高，具有广阔的临床应用前景。本发明简单易行，成本低廉，使用效果好。

具体实施方式

本发明的实施例1：将人脂肪干细胞分离并诱导成胰岛β细胞的培养基，包括DMEM培养基，其中激活素为3mmol/L，反式维甲酸为1umol/L，EGF为100ng/ml，bFGF为10ng/ml ，胰高血糖素样肽1为10ng/ml，尼克酰胺为10mmol/L；总体积为1000ml；上述各成分混匀后过滤除菌即可制成成品。

本发明的实施例2：将人脂肪间充质干细胞诱导成胰岛素分泌细胞的方法，

1）接收脂肪组织：用75%的酒精擦拭装脂肪组织采集瓶的容器外壁。

2）分装脂肪组织：用10ml移液管，于脂肪采集瓶先吸取下层红色液体弃掉，剩余上层脂肪混匀后进行分装，每一个T175培养瓶分装脂肪组织为50ml。

3）洗涤脂肪组织：除去红细胞；向T175培养瓶中加入100ml生理盐水注射液，拧紧盖子，剧烈晃动（或用振荡器振荡）3分钟以充分洗涤脂肪组织，接着静止2分钟，使不同相分离，吸去下层水相；重复以上操作三次，直到下层液较为清澈。

4）胶原酶I消化：加入等量新配制的预热〔提前半小时于37℃的恒温水浴锅)的胶原酶I溶液(0.1%胶原酶I配制方法：称取0.1g胶原酶I粉末溶解于100ml生理盐水注射液中，用之前37℃预热)，封口膜封口，剧烈晃动培养瓶5-10秒，置于恒温水浴锅中，37℃，消化60分钟，每隔10分钟剧烈晃动培养瓶30秒，直到看起来较为平滑。

5）分离基质血管组分(SVF)：将消化后的组织用40目细胞滤网分装到50ml的离心管中，室温500g离心10分钟，得到的沉淀即为SVF。

6）净化沉淀：离心SVF沉积于离心管底部，用移液管自上而下小心除去上层油脂和下层的胶原酶溶液；注意：在沉淀上方留下少量的溶液，以免扰动沉淀细胞。适量生理盐水重悬细胞，吹散，室温500g，10分钟离心。离心完毕，小心吸去上清液，不能直接倒掉。吸取时移液管头应该置于离心管的上部以便于彻底的出去油脂。10ml培养基悬浮细胞，然后将细胞汇总到50ml离心管中，过100目筛，再次室温400g，10分钟离心。

7）细胞种植：离心后加20ml培养基充分混匀。T75培养瓶中接种100ml抽脂脂肪量。

8）原代细胞培养：平置培养瓶，将培养瓶放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱。培养条件：37±0.5℃，二氧化碳体积分数为5±0.1%。培养基：DMEM（高糖）。

9）换液：原代培养第24小时，进行全量换液。此后每隔3天全量换液，放置二氧化碳恒温恒湿培养箱进行培养。

10）原代细胞收获：7天左右，原代培养的细胞克隆团的面积百分比到达90% 时，消化收获。

11）原代细胞收获：将培养瓶中培养基倒入50ml离心管中待用，在培养瓶中加入消化酶（消化酶为0.125%Trypsin-0.01%EDTA溶液， 溶液，使用前室温〔20-25℃）放置15-25min，每T75加入3ml消化酶溶液)，消化时间为30秒,加入待用培养基，移入50ml 离心管中，原培养瓶中加入4-5ml氯化钠注射-液冲洗瓶壁，加入离心管中定容至50ml， 移液管吹打悬浮后，100目无菌滤网过滤，过滤液收集到50ml离心管中，300g,10min离心洗涤。

12）原代细胞传代：观察单个离心管内余下细胞沉淀量，适当合并数个离心管中细胞沉淀至1个离心管中，加入适量培养基，轻轻吹打重悬浮细胞，定容至30ml，吹打混匀，取样计数。计数后300g,10min二次离心。去除上清液，在离心管中加入培养基适量，轻轻吹打重悬浮细胞，定容后接种至新的培养容器中，传代细胞密度为5000-6000个/cm²，即3.75-4.5X10⁵个cells/T75，按照4.5X10⁵个cells/T75进行传代。在培养容器上标示细胞代数与培养时间等信息。将培养容器放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱开始培养。培养条件：二氧化碳恒温恒湿培养箱。条件：37±0，5℃，二氧化碳体积分数为5±0，2%。培养至细胞融合达85%-90%。

13）细胞培养至第3代：细胞达60%一70%汇合后开始诱导，移出旧培养基,生理盐水洗涤2次,①用含,以添加了3nmol/L激活素A(ActivinA)、1umol/L全反式维甲酸(All-trans-retinoieaeid,ATRA)的DMEM（高糖）培养基诱导2d，②生理盐水洗涤2次,用含100ug/mL表皮生长因子(Epidermalgrowthfaetor,EGF)、10ug/mL碱性成纤维生长因子(Basiefibroblastgrowthfaetor,bFGF)的DMEM（高糖）诱导2d，③生理盐水洗涤2次,最后在DMEM（高糖）培养基中加入10ug/mLβ细胞调节素(Betacellculin,BTC)、10ug/ml胰高血糖素样肽l(Glueagon-LikePeptidel,GLP-1)和10mmol/L尼克酞胺Nicotinicamide,NIC)诱导3d。最终得到胰岛细胞。

本发明的实施例3：诱导后胰岛细胞鉴定

1、双硫腙染色对诱导生成的胰岛素分泌细胞进行鉴定

将50mgDTZ双硫腙溶于5ml二甲基亚砜中，混匀过滤除菌，备用。在细胞诱导7天后进行DTZ染色，染色时，取1ml诱导的细胞加到12孔培养板中，加入10ulDTZ染色液，于37℃培养箱中培养20分钟，吸取染色孔内少许细胞，PBS洗涤2次，显微镜下观察。胰岛素分泌细胞呈棕色。

2、流式细胞术检测胰岛阳性细胞：取诱导7天细胞，PBS洗涤3次离心，弃上清，用100ulPBS重悬细胞，加入10ulFITC标记的抗胰岛素抗体，室温下避光孵育30分钟，流式细胞仪分析阳性细胞率达81.2%

3、综上所述实验所得细胞能够分泌胰岛素，且流式检测胰岛阳性细胞率高达81.2%。故本实验诱导有效果明显，诱导率高等特点。

本发明所述并不限于具体实施方式中所述的实施例，本领域技术人员根据本发明的技术方案得出其他的实施方式，同样属于本发明的技术创新范围。显然本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术范围内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (3)

1.一种将人脂肪干细胞分离并诱导成胰岛β细胞的培养基，其特征在于：包括DMEM培养基，其中激活素为3mmol/L，反式维甲酸为1umol/L，EGF为100ng/ml，bFGF为10ng/ml ，胰高血糖素样肽1为10ng/ml，尼克酰胺为10mmol/L。

2.一种采用如权利要求1所述的培养基将人脂肪间充质干细胞诱导成胰岛素分泌细胞的方法，其特征在于：将脂肪组织消化后，进行原代细胞培养及传代培养；将传3代的脂肪间充质干细胞，采用质量百分比为0.25% Trypsin-EDTA溶液消化收集细胞，制备细胞悬液，细胞计数板计数活细胞密度，并调整密度至1 X 10⁴/cm²，接种于24孔板内，制备细胞爬片；待细胞达到75%-85融合后，生长旺盛时用上述培养基进行诱导分化，诱导时间为7天，将诱导后的细胞进行鉴定。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的细胞鉴定方法为双硫腙染色反应，流式细胞术检测胰岛阳性细胞。