JP6482036B2

JP6482036B2 - 人工組織及びその製造方法

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Publication number: JP6482036B2
Application number: JP2016563760A
Authority: JP
Inventors: 明石　満; 満明石; 典弥松▲崎▼; 倫明海野; 直昭坂田; 軍平吉松
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Current assignee: Tohoku University NUC; Osaka University NUC
Priority date: 2014-12-08
Filing date: 2015-12-07
Publication date: 2019-03-13
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Description

本発明は、人工組織及びその製造方法に関する。

膵島移植は、血糖の是正を図る重症糖尿病患者に対する有効な治療方法として認められている。膵島移植は、ドナー膵臓の膵ランゲルハンス島を分離抽出し、レシピエントに移植することにより行われるが、慢性的なドナー不足が解消されていないことに加え、移植された膵島は多くの素因により生着できずに脱落するという問題が指摘されている。膵島の生着を妨げる重要な要因に移植直後の虚血が挙げられている。

膵島移植の成功率を向上させるための様々な研究がなされている。その一つの方法として、血管新生因子等により移植された膵島に血管化を図る方法がある（非特許文献１〜３）。非特許文献１は、ＶＥＧＦなどの血管新生因子で膵島を培養し、血管新生を図ることを開示する。非特許文献２は、薬剤投与により血管新生因子を誘導し、膵島の血管新生を図る方法を開示する。非特許文献３は、間葉系幹細胞など、血管新生因子を分泌する細胞との共移植により血管新生を図る方法を開示する。

ＧｏｒｄｅｎＤＬ，ｅｔａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．１９９７Ｆｅｂ１５；６３（３）：４３６−４３ＳａｍｉｋａｎｎｕＢ，ｅｔａｌ．ＰｌｏｓＯｎｅ２０１３Ｄｅｃｅｍｂｅｒ，Ｖｏｌｕｍｅ８，Ｉｓｓｕｅ１２，ｅ８２６３９ＳａｋａｔａＮ，ｅｔａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．２０１０Ｍａｒｃｈ２７；８９（６）：６８６−６９３

本発明は、血管化された膵島を含む人工組織を提供する。

本発明は、一又は複数の実施形態において、膵島細胞、線維芽細胞および／または分化能を有する細胞、細胞外マトリックス及び血管内皮細胞を含み、前記線維芽細胞および／または分化能を有する細胞、前記細胞外マトリックス及び前記血管内皮細胞は、血管網構造が形成された三次元組織体を構成し、前記三次元組織体は、前記膵島細胞が複数個集合した膵島を含む人工組織に関する。

本発明は、一又は複数の実施形態において、線維芽細胞および／または分化能を有する細胞と、血管内皮細胞と、細胞外マトリックスとを培養することにより三次元組織体を形成すること、及び前記三次元組織体の形成と同時又はその後に膵島細胞を配置して培養することを含み、前記線維芽細胞および／または分化能を有する細胞、前記細胞外マトリックス及び前記血管内皮細胞は、血管網構造が形成された三次元組織体を構成し、前記膵島細胞が複数個集合した膵島を含む人工組織を製造する方法に関する。

本発明によれば、血管化された膵島を含む人工組織を提供できる。

図１は、実施例１〜３の人工組織及び比較例の膵島培養物の共焦点レーザ顕微鏡写真である。図２は、実施例１〜３、コントロール１〜３及び比較例におけるインスリン分泌量の測定結果を示すグラフであって、図２Ａは低グルコース培地（Ｌｏｗ）及び高グルコース培地（Ｈｉｇｈ）におけるインスリン分泌量を示し、図２Ｂは実施例１〜３及び比較例のインスリン分泌量の比（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｉｎｄｅｘ）を示す。図３は、マウスへの移植に用いた人工組織の切片の、ヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）染色像（Ａ）、インスリン免疫染色像（Ｂ）、およびＣＤ３１免疫染色像（Ｃ）である。図３Ｃの矢印はＣＤ３１染色陽性部位を示す。バーは１００μｍである。図４は、移植後１４日目の移植片の位相差顕微鏡像（Ａ）、ならびにインスリンおよびＣＤ３１免疫染色像（Ｂ）である。図５は、移植後１４日目の腹壁脂肪内の移植片の切片の、ヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）染色像（Ａ）、およびインスリン免疫染色像（Ｂ）である。

本発明は、膵島の生着を妨げる重要な要因である移植直後の虚血が、移植された膵島と移植部位との血管網の形成までに時間を要することにより生じるという観点から、血管化された膵島を移植することで移植された膵島と移植部位との血管網が早期に形成され、移植された膵島の血流が早期に回復されうる、との知見に基づく。また、本発明は、膵島を、線維芽細胞および／または分化能を有する細胞、血管内皮細胞及び細胞外マトリックスとともに培養することによって、血管化された膵島を得ることができる、との知見に基づく。

本発明によれば、一又は複数の実施形態において、移植部位と移植された膵島との血管網が早期に形成され、移植部位と移植された膵島との血流が早期に生じうることから、移植早期の虚血を回避でき、膵島の生着が向上することが期待できる。本発明によれば、一又は複数の実施形態において、従来の移植後に血管新生を促進する方法よりもより早い血流改善が期待できる。本発明によれば、一又は複数の実施形態において、最終的には移植効率の向上と移植成績の改善が期待できる。また、これらの結果、本発明によれば、一又は複数の実施形態において、さらに安全な移植部位でありながら血流に乏しく膵島が生着しにくい筋肉や皮下を現行の肝臓内移植に代わる有効な移植部位として使用することが可能になる。
本発明によれば、一又は複数の実施形態において、糖負荷によるインスリン分泌能に優れる人工組織を提供できる。

本発明において「人工組織」とは、膵島と血管網構造とを含む組織体をいう。本発明おいて「血管化された膵島」とは、血管網構造が形成された膵島又は血管形成された膵島をいい、好ましくは膵島の周囲に隣接するように血管網構造が形成された膵島をいい、より好ましくは膵島の周囲に形成された血管網構造を通じて血流の流入が可能な膵島をいう。本発明において「血管網構造」とは、血管内皮細胞によって形成された中空の管状構造をいい、好ましくは脈管ネットワークをいい、より好ましくは毛細血管網のような網目状のネットワークに形成された構造をいう。

本発明における人工組織は、一又は複数の実施形態において、膵島又は膵臓の機能的又は構造的なモデルとなりうるものをいう。本発明における人工組織は、一又は複数の実施形態において、膵島の機能を再現可能なモデル又は再現するためのモデル等を含みうる。また、本発明における人工組織は、一又は複数の実施形態において、膵島移植に用いることができる。

本発明において、細胞は、一又は複数の実施形態において、ヒト由来の細胞であってもよいし、ヒト以外の動物由来の細胞であってもよい。細胞は、一又は複数の実施形態において、間葉系幹細胞、胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞等の由来の細胞であってもよい。細胞は、一又は複数の実施形態において、培養細胞であってもよい。培養細胞としては、一又は複数の実施形態において、初代培養細胞、継代培養細胞、及び細胞株細胞等が挙げられる。

［人工組織］
本発明は、一又は複数の実施形態において、膵島細胞、線維芽細胞および／または分化能を有する細胞、細胞外マトリックス及び血管内皮細胞を含む人工組織（以下、「本発明の人工組織」）に関する。本発明の人工組織は、一又は複数の実施形態において、血管内皮細胞が、血管網構造を形成する。また、本発明の人工組織は、膵島細胞が複数個、好ましくは１０個又はそれ以上集合して膵島を形成する。したがって、本発明の人工組織は、一又は複数の実施形態において、線維芽細胞および／または分化能を有する細胞、細胞外マトリックス及び血管内皮細胞が、血管網構造が形成された三次元組織体を構成し、三次元組織体は、前記膵島細胞が複数個、好ましくは１０個又はそれ以上集合した膵島を含む。なお、線維芽細胞および／または分化能を有する細胞とは、線維芽細胞を意味する場合と、分化能を有する細胞を意味する場合と、線維芽細胞および分化能を有する細胞の両方を意味する場合がある。

膵島は、一又は複数の実施形態において、膵島細胞が複数個、好ましくは１０個以上集合することにより構成される膵島細胞の集合体という。本発明において「膵島細胞」は、一又は複数の実施形態において、インスリンやグルカゴン等を分泌可能な膵内分泌細胞をいい、好ましくはインスリンやグルカゴン等を分泌して血糖調節可能な膵内分泌細胞をいう。膵島は、一又は複数の実施形態において、膵島細胞の集合体であって、膵島細胞スフェロイドが挙げられ、好ましくはインスリンの分泌又はその誘導が可能であり、より好ましくは生体における膵島により近い機能を有し、さらに好ましくは生体の膵島と同等の機能を有する。膵島は、一又は複数の実施形態において、膵島細胞を１個以上、１０個以上、２０個以上、３０個以上、４０個以上、５０個以上、６０個以上又は７０個以上含む。上限は特に限定されないが、一又は複数の実施形態において、１０００個以下であってもよい。

膵島は、血管網構造を通じて容易に酸素や栄養素等を流入させる点から、一又は複数の実施形態において、血管網構造と接するように形成されており、好ましくは膵島を取り囲むように血管網構造が形成されている。

本発明の人工組織は、一又は複数の実施形態において、膵島を１個以上、５個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、２５個以上、３０個以上、又は４５個以上含む。上限は特に限定されないが、一又は複数の実施形態において、１０００個以下であってもよい。

細胞外マトリックスは、一又は複数の実施形態において、ｉｎｖｉｔｒｏ細胞培養において上記の役割を果たしうる物質や、人工的に合成された物質やその一部を含んでもよい。細胞外マトリックスの具体例としては、一又は複数の実施形態において、フィブロネクチン、ゼラチン、コラーゲン、ラミニン及びポリリジン等が挙げられる。細胞外マトリックスは、これらの例に限定されるものではなく、特開２００７−２２８９２１号公報（特許第４９１９４６４号）及び特開２０１２−１１５２５４号公報に開示のものが挙げられる。本発明の人工組織を生体に移植する場合には、細胞外マトリックスは、例えばフィブロネクチン、ゼラチン、コラーゲン、ラミニン及びポリリジン等の、生体に対して有意な毒性を示さない物質で構成されたものであることが望ましい。

細胞外マトリックスは、一種類であってもよいし、二種類以上であってもよい。細胞外マトリックスの組み合わせとしては、一又は複数の実施形態において、第１物質及び第１物質と相互作用する第２物質の組み合わせが挙げられる。第１物質と第２物質との組み合わせとしては、一又は複数の実施形態において、ＲＧＤ配列を有する高分子及びＲＧＤ配列を有する高分子と相互作用する高分子の組み合わせ、又は、正の電荷を有する高分子及び負の電荷を有する高分子の組み合わせが挙げられる。第１物質と第２物質との組み合わせの具体例としては、一又は複数の実施形態において、フィブロネクチンとゼラチン、フィブロネクチンとε−ポリリジン、フィブロネクチンとヒアルロン酸、フィブロネクチンとデキストラン硫酸、フィブロネクチンとヘパリン、及びラミニンとゼラチン等が挙げられる。

本発明の人工組織は、一又は複数の実施形態において、膵島細胞、線維芽細胞および／または分化能を有する細胞及び血管内皮細胞以外の細胞を含んでいてもよい。上記以外の細胞としては、一又は複数の実施形態において、肝細胞、腎細胞等の膵臓以外の臓器を構成する細胞等が挙げられる。

［人工組織の製造方法］
本発明は、一又は複数の実施形態において、線維芽細胞および／または分化能を有する細胞と、血管内皮細胞と、細胞外マトリックスとを培養することにより三次元組織体を形成すること、及び前記三次元組織体の形成と同時又はその後に膵島細胞を配置して培養することを含む、膵島を有する人工組織を製造する方法（以下、「本発明の製造方法」ともいう）に関する。本発明の製造方法によれば、線維芽細胞および／または分化能を有する細胞、前記細胞外マトリックス及び前記血管内皮細胞は、血管網構造が形成された三次元組織体を構成し、前記三次元組織体は、前記膵島細胞が１０個又はそれ以上集合することにより構成された膵島を含む人工組織を製造することができる。

本発明の製造方法によれば、一又は複数の実施形態において、膵島と血管網構造とを含む人工組織を製造することができる。本発明の製造方法によれば、一又は複数の実施形態において、膵島の周囲に血管網構造が形成された組織、好ましくは血管網構造を通じて膵島細胞に血流の流入が可能な組織を製造することができる。本発明の製造方法によれば、本発明の人工組織を容易に製造することができる。

分化能を有する細胞としては、一又は複数の実施形態において、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などの幹細胞が例示される。分化能を有する細胞は、例えば線維芽細胞に分化しうる細胞であってもよく、他の細胞に分化しうる細胞であってもよい。

本発明の製造方法は、線維芽細胞および／または分化能を有する細胞、血管内皮細胞、及び細胞外マトリックスを培養して三次元組織体を形成することを含む。

三次元組織体の形成は、一又は複数の実施形態において、細胞を細胞外マトリックスを含む被膜で被覆し、被覆された細胞を三次元に配置して培養することにより行うことができる（被覆細胞を用いた方法）。また、そのほかの方法としては、細胞（１層）と細胞外マトリックスとを交互に積層して培養することが挙げられる（ＬＢＬによる方法）。被覆細胞を用いた方法とＬＢＬによる方法とを組み合わせて行ってもよい。被覆細胞を用いた方法は、一又は複数の実施形態において、実施例、及び特開２０１２−１１５２５４号等に開示された方法等に基づき作製できる。ＬＢＬによる方法は、一又は複数の実施形態において、特開２００７−２２８９２１号公報（特許第４９１９４６４号）に開示された方法等に基づき作製できる。

本発明の製造方法は、三次元組織体の形成と同時又はその後に膵島細胞を配置して培養することを含む。膵島細胞の配置は、一又は複数の実施形態において、三次元組織体の形成と同時に、線維芽細胞および／または分化能を有する細胞と混合して配置してもよいし、三次元組織体の形成後に三次元組織体上に配置してもよい。

三次元組織体の形成は、一又は複数の実施形態において、線維芽細胞および／または分化能を有する細胞を培養して細胞層を形成した後、形成した細胞層上に血管内皮細胞を配置し培養して１層の血管内皮細胞層を形成し、ついで線維芽細胞および／または分化能を有する細胞と膵島細胞とを混合して血管内皮細胞層上に配置し培養することにより行うことができる。その他の方法としては、線維芽細胞および／または分化能を有する細胞を培養して細胞層を形成した後、細胞層上に血管内皮細胞を配置し培養して１層の血管内皮細胞層を形成し、ついで血管内皮細胞層上に線維芽細胞および／または分化能を有する細胞を配置し培養して血管網構造が形成された積層体を形成した後、積層体上に膵島細胞を配置し培養することにより行うことができる。その他の方法としては、線維芽細胞および／または分化能を有する細胞と血管内皮細胞と膵島細胞を混合して培養することにより行うことができる。また、その他の方法としては、線維芽細胞および／または分化能を有する細胞と血管内皮細胞とを混合して培養した後、その上に膵島細胞を配置して培養することにより行うことができる。

本発明の製造方法は、一又は複数の実施形態として、膵島細胞として、膵島細胞が複数個、好ましくは１０個又はそれ以上集合した膵島を使用することを含む。膵島は、一又は複数の実施形態において、単離した膵島、及び膵島細胞を再構築したスフェロイド／塊等が挙げられる。本発明の製造方法は、一又は複数の実施形態において、線維芽細胞および／または分化能を有する細胞、血管内皮細胞、細胞外マトリックス、及び膵島を培養することを含む。

配置する膵島の個数は、一又は複数の実施形態において、１個以上、５個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、２５個以上、３０個以上、又は４５個以上である。上限は特に限定されないが、一又は複数の実施形態において、１０００個以下であってもよい。

以下に、本発明を好適な実施形態を示しながら詳細に説明する。但し、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではないことはいうまでもない。

（実施形態１）
まず、細胞外マトリックスを含む被膜で覆われた線維芽細胞（以下、「被覆線維芽細胞」ともいう）及び血管内皮細胞（以下、「被覆血管内皮細胞」ともいう）を準備する。細胞外マトリックスを含む被膜は、一又は複数の実施形態において、フィブロネクチン及びゼラチンを交互に積層することにより形成できる。

被覆線維芽細胞をセルカルチャーインサート等の基材上に配置して培養する。被覆線維芽細胞の配置は、被覆線維芽細胞が４層以上、好ましくは５層、８層又は１０層以上積層されるように行う。配置時の線維芽細胞の密度は、一又は複数の実施形態において、１×１０^２〜１×１０^９個／ｃｍ^３、１×１０^４〜１×１０^８個／ｃｍ^３又は１×１０^５〜１×１０^７個／ｃｍ^３である。
培養は、一又は複数の実施形態において、培地を添加して行う。培地は、一又は複数の実施形態において、Ｅａｇｌｅ’ｓＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）、ＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ培地（ＭＥＭ）、ＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌ培地、ＲＤＭＩ、及びＧｌｕｔａＭａｘ培地等が挙げられる。培地は、一又は複数の実施形態において、血清を添加した培地が好ましい。培養温度は、一又は複数の実施形態において、３７℃である。培養時間は、一又は複数の実施形態において、６〜２４時間である。

次に、形成された線維芽細胞の積層体の上に被覆血管内皮細胞を配置して培養する。被覆血管内皮細胞は、血管内皮細胞の層が１層形成されるように配置する。配置時の血管内皮細胞の密度は、一又は複数の実施形態において、１×１０^２〜１×１０^９個／ｃｍ^３、１
×１０^４〜１×１０^８個／ｃｍ^３又は１×１０^５〜１×１０^７個／ｃｍ^３である。培養条件は上述のとおりである。

ついで、血管内皮細胞の上に被覆線維芽細胞と単離した膵島との混合物を配置して培養する。配置する膵島の個数、被覆線維芽細胞の密度及び培養条件は上記のとおりである。これにより、膵島の周囲に毛細血管様構造が形成された人工組織が形成できる。

（実施形態２）
まず、被覆線維芽細胞及び被覆血管内皮細胞を準備する。被覆線維芽細胞及び被覆血管内皮細胞を混合し、セルカルチャーインサート等の基材上に配置して培養する。被覆線維芽細胞及び被覆血管内皮細胞の密度及び培養条件は実施形態１と同様である。これにより、血管網構造を有する積層体が形成される。

ついで、形成された積層体上に、単離した膵島を配置して培養する。配置する膵島の個数及び培養条件は実施形態１と同様である。これにより、膵島の周囲に毛細血管様構造が形成された人工組織が形成できる。

（実施形態３）
まず、細胞外マトリックスを含む被膜で覆われた間葉系幹細胞（以下、「被覆間葉系幹細胞」）を準備する。
ついで、被覆間葉系幹細胞、被覆血管内皮細胞及び単離した膵島を混合し、セルカルチャーインサート等の基材上に配置して培養する。被覆間葉系幹細胞の密度は、被覆線維亜細胞の密度と同様である。被覆血管内皮細胞の密度、膵島の個数及び培養条件は実施形態１と同様である。これにより、膵島の周囲に毛細血管様構造が形成された人工組織が形成できる。

本発明は、以下の一又は複数の実施形態に関しうる。
［１］膵島細胞、線維芽細胞および／または分化能を有する細胞、細胞外マトリックス及び血管内皮細胞を含み、
前記線維芽細胞および／または分化能を有する細胞、前記細胞外マトリックス及び前記血管内皮細胞は、血管網構造が形成された三次元組織体を構成し、
前記三次元組織体は、前記膵島細胞が複数個集合することにより構成された膵島を含む、人工組織。
［２］前記膵島は、１０個又はそれ以上の膵島細胞が集合することにより構成された膵島である、［１］記載の人工組織。
［３］前記膵島は、前記血管網構造と隣接する、［１］又は［２］に記載の人工組織。
［４］前記膵島を５個又はそれ以上含む、［１］から［３］のいずれかに記載の人工組織。
［５］線維芽細胞および／または分化能を有する細胞と、血管内皮細胞と、細胞外マトリックスとを培養することにより三次元組織体を形成すること、及び
前記三次元組織体の形成と同時又はその後に膵島細胞を配置して培養することを含み、
前記線維芽細胞および／または分化能を有する細胞、前記細胞外マトリックス及び前記血管内皮細胞は、血管網構造が形成された三次元組織体を構成し、
前記三次元組織体は、前記膵島細胞が複数個集合することにより構成された膵島を含む人工組織を製造する方法。
［６］前記線維芽細胞および／または分化能を有する細胞は、表面が細胞外マトリックスを含む被膜で覆われた細胞である、［５］記載の製造方法。
［７］前記血管内皮細胞は、表面が細胞外マトリックスを含む被膜で覆われた細胞である、［５］又は［６］に記載の製造方法。
［８］前記膵島細胞として、１０個又はそれ以上の膵島細胞が集合することにより構成された膵島を使用することを含む、［５］から［７］のいずれかに記載の製造方法。
［９］被膜で覆われた前記線維芽細胞および／または分化能を有する細胞、被膜で覆われた前記血管内皮細胞、及び前記膵島細胞を混合して培養することを含む、［５］から［８］のいずれかに記載の製造方法。
［１０］被膜で覆われた前記線維芽細胞および／または分化能を有する細胞及び被膜で覆われた前記血管内皮細胞を培養すること、及び前記培養により形成された細胞層上に前記膵島細胞を配置して培養することを含む、［５］から［８］のいずれかに記載の製造方法。
［１１］被膜で覆われた前記線維芽細胞および／または分化能を有する細胞を配置して培養してすること、前記培養により形成された細胞層上に被膜で覆われた前記血管内皮細胞を配置して培養すること、及び前記血管内皮細胞の上に、被膜で覆われた前記線維芽細胞および／または分化能を有する細胞と前記膵島細胞を混合して配置し培養することを含む、［５］から［８］のいずれかに記載の製造方法。
［１２］分化能を有する細胞として幹細胞が用いられる、請求項［５］から［１１］のいずれかに記載の製造方法。
［１３］［１］から［４］のいずれかに記載の人工組織を製造することを含む、［５］から［１２］のいずれかに記載の製造方法。

以下、実施例及び比較例を用いて本発明をさらに説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定して解釈されない。

実施例では以下の試薬、カルチャーインサート、培地及び細胞を使用した。
＜ヒトフィブロネクチン／トリス溶液＞
フィブロネクチン（ＢＦＮ）（Ｓｉｇｍａ製（Ｆ−２００６，５ｍｇ），ＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎｆｒｏｍＨｕｍａｎｐｌａｓｍａ）を５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝７．４）に溶解し、０．２ｍｇ／ｍｌのＦＮ／トリス溶液を調製した（５ｍｇに２５ｍｌを加える）。この溶液を更に５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝７．４）で５倍希釈することで０．０４ｍｇ／ｍＬのＦＮ／トリス溶液を調製した。以下、この溶液を「ＦＮトリス溶液」という。
分子量＝４５０ｋＤａ、水溶性、コラーゲン結合部位を有する。
＜ゼラチン／トリス溶液＞
ゼラチン（Ｗａｋｏ製，０７７−３１５５，５００ｇ）を５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝７．４）に溶解し、０．２ｍｇ／ｍｌに調製した。この溶液を更に５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝７．４）で５倍希釈することで０．０４ｍｇ／ｍＬのＧ／トリス溶液を調製した。以下、この溶液を「Ｇトリス溶液」という。
＜Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ＞
２−Ａｍｉｎｏ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−１，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌＨｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）（０１２−１７４５５，Ｗａｋｏ製）を５０ｍＭに調製後、ｐＨを７．４に調整してオートクレーブにより滅菌した。
＜カルチャーインサート＞
Ｃｏｒｎｉｎｇ製、３４７０、２４ｗｅｌｌ、材質：ＰＥＴ、ポアサイズ：０．４μｍ、ポア密度：１．６×１０^６／ｃｍ^２、底面積：０．３３ｃｍ２（その他のポアサイズ有り）
＜培地＞
ＤＭＥＭ，ｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅ：Ｗａｋｏ製，０４３−３００８５（１０％ＦＢＳ及び１％抗生物質を添加したもの）
血管内皮細胞培養キット：ＥＧＭ−２ＭＶ，Ｌｏｎｚａ製，ＣＣ−３２０２
＜細胞＞
ヒト皮膚由来線維芽細胞（ＮＨＤＦ）：Ｌｏｎｚａ製，ＣＣ−２５０９（新生児）
ヒト臍帯由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）：Ｌｏｎｚａ製，ＣＣ−２５１７
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）：Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ製，Ｃ−１２９７４
マウス膵島：国立大学法人東北大学・坂田直昭博士より提供

［被覆細胞の調製］
以下の手順でＮＨＤＦにＦＮ−Ｇ薄膜を作製した。ＮＨＤＦ（１×１０^７ｃｅｌｓ）にＦＮトリス溶液を１ｍｌ加え、１分間インキュベートし、４２０×ｇ（２５００ｒｐｍ）で１分間遠心分離を行い上澄みを除去した。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを１ｍｌ加えて１分間洗浄し、４２０×ｇ（２５００ｒｐｍ）で１分間遠心分離を行い上澄みを除去した。続いて、ＦＮトリス溶液に替えてＧトリス溶液を使用した以外は、同様の操作を行った。インキュベート及び洗浄を１ステップとして計９ステップ（（ＦＮ／Ｇ）_４ＦＮ）を行うことによりＮＨＤＦ表面にＦＮ−Ｇ薄膜を形成し、被覆ＮＨＤＦを調製した。
ＮＨＤＦに替えてＨＵＶＥＣ又はＢＭ−ＭＳＣを用いた以外は、同様にしてＦＮ−Ｇ薄膜の形成を行い、被覆ＨＵＶＥＣ又は被覆ＢＭ−ＭＳＣを調製した。

［人工組織の作製］
カルチャーインサート内に０．２ｍｇ／ｍＬＦＮ／トリス溶液を１００μＬ添加して１５分間以上インキュベートした後、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで洗浄することによってインサート表面にＦＮ下地膜を形成させた。
ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）に懸濁した被覆ＮＨＤＦを４×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌでＦＮ下地膜を形成したインサートに播種し、培地を添加した（内側：０．３ｍＬ、外側：１ｍＬ）。１〜２時間３７℃でインキュベートした後、インサートの外側に培地をさらに１ｍＬ添加してインサートの内側と外側の培地をつなげた。２４時間培養して積層組織（４層、ＮＨＤＦ組織）が得られた。
ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）に懸濁した被覆ＨＵＶＥＣを３×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌでＮＨＤＦ組織上に播種し、２４時間培養して積層組織（ＮＨＤＦ４層−ＨＵＶＥＣ１層）が得られた。
４×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの被覆ＮＨＤＦと、５０個／ｗｅｌｌの単離した膵島とを混合し、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）に懸濁して積層組織上に播種し、２４時間培養した。これにより、人工組織を得た。

得られた人工組織から分泌されるインスリン量の測定及び人工組織の組織観察を行った。
インスリン分泌量の測定は、異なる濃度のグルコース溶液を人工組織に負荷し、溶液中に分泌されるインスリン量をＥＬＩＳＡ法で測定することにより行った。まず、以下の手順で低グルコース培地（３．３ｍＭグルコース（６０ｍｇ／ｄｌ）でのプレインキュベーションを行った。
１０ｍＬの低グルコース培地で１時間インキュベートした後、５ｍＬの低グルコース培地で３回洗浄した。プレインキュベーション終了後、１０ｍＬの低グルコース培地で１時間培養した後、上清を回収した（サンプルＬ）。
上清を回収後、１０ｍＬの高グルコース培地（１６．５ｍＭグルコース（６０ｍｇ／ｄｌ）に培地を切り替え、１時間培養した後、上清を回収した（サンプルＨ）。
回収した各上清（サンプルＬ及びサンプルＨ）は液体窒素で凍結後、−８０℃で保存した。
上清を回収した後、人工組織をＰＢＳで洗浄し、組織切片作製用に１０％ホルマリンで３時間固定化（蛍光観察の場合、４％ＰＦＡで１５分間固定）してＨＥ及び免疫染色等で組織観察を行った。

回収した上清におけるインスリン分泌量は、マウス用インスリンエライザキットの添付書類に則り測定した。使用したエライザキットはシバヤギ社のレビスインスリン−マウス（ＡＫＲＩＮ−０３１）である。具体的には、抗体固層化プレートにビオチン結合抗インスリン抗体を配置し、さらにサンプルを配置した上で２時間常温でインキュベートした。ウェルを洗浄後、ペルオキシダーゼ・アビジン結合物を３０分常温のインキュベートで反応させ、洗浄後、３０分間発色液に反応させ、反応停止後にプレートリーダー（吸光度４５０ｎｍ、６２０ｎｍ）にかけた。得られたデータを標準濃度のデータに基づいて各サンプルのインスリン分泌量を計測した。
また、得られたインスリン分泌量に基づき、下記式ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｉｎｄｅｘ（ＳＩ：刺激指数）を算出した。
ＳＩ＝（高濃度グルコース負荷時に分泌されたインスリン量）／（低濃度グルコース負荷時に分泌されたインスリン量）

コントロールとして、膵島を播種しない以外は上記と同様にして、インスリン量の測定のための上清の回収及びインスリン量の測定を行った。

８×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの被覆ＮＨＤＦと３×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの被覆ＨＵＶＥＣとの混合物をＦＮ下地膜を形成したインサートに播種し、２４時間培養した。得られた積層組織上に、単離した膵島を５０個／ｗｅｌｌで播種し、１日培養して人工組織を得た。得られた人工組織を用いて、実施例１と同様にインスリン分泌量の測定及び組織観察を行った。

８×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの被覆ＢＭ−ＭＳＣと、３×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの被覆ＨＵＶＥＣと、５０個／ｗｅｌｌの単離した膵島を混合し、ＦＮ下地膜を形成したインサートに播種し、１日培養して人工組織を得た。得られた人工組織を用いて、実施例１と同様にインスリン分泌量の測定及び組織観察を行った。

（比較例）
未処理のインサートに対して膵島を播種した以外は、実施例１と同様にインスリン分泌量の測定及び組織観察を行った。

（コントロール１〜３）
膵島を使用しない以外は、実施例１〜３と同様に人工組織を作製した。

以上の結果を図１及び図２に示す。図１は、実施例１〜３の人工組織及び比較例の膵島培養物の共焦点レーザ顕微鏡写真である。図２は実施例１〜３、コントロール１〜３及び比較例におけるインスリン分泌量の測定結果を示すグラフであって、図２Ａは低グルコース培地（Ｌｏｗ）及び高グルコース培地（Ｈｉｇｈｔ）におけるインスリン分泌量を示し、図２Ｂはｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｉｎｄｅｘを示す。

図１の実施例１〜３の画像において米粒形にみえるのが膵島である（図１ａ，ｆ及びｇ）。図１に示すように、実施例１〜３の人工組織は、膵島の周囲に血管網構造が形成され、かつ組織内部及び表面に位置するいずれの膵島についても良好な形態が維持されていることが観察された。実施例１及び２の人工組織の膵島は、実施例３の人工組織と比較してより多くの数により構成されていることが観察された（図１ｂ−ｃ、ｇ−ｈ及びｋ−ｌ）。

図２Ａ及びＢに示すように、実施例１〜３の人工組織は、比較例１（膵島単独）よりもインスリン総分泌量は低下するものの、グルコース濃度変化に応答したインスリン分泌が行われることが確認できた。

本実験は、本発明の人工組織を生体に移植して、実際に生着し、インスリンを分泌するかどうかを調べることを目的とした。
実施例１に記載した方法に従って人工組織を得た。常法に従って人工組織の切片をヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）染色した結果を図３Ａに示す。さらに、常法に従って人工組織をインスリンおよびＣＤ３１に関して免疫染色した結果を、それぞれ図３Ｂおよび図３Ｃに示す。得られた人工組織の細胞層上にインスリンを分泌する膵島が認められ、細胞層に血管構造が認められた。

人工組織をマウスの腹壁脂肪内に移植した。手順は以下のとおりであった。
実施例１で説明得したのと同様にして２４ウェルのトランスウェルの上に人工組織を作成した。得られた人工組織の直径は６．５ｍｍであった。人工組織はＢＡＬＢ／ｃマウスの膵島１５０個を含んでいた。実施例１に記載した方法に従って、得られた人工組織にグルコース負荷をかけ、グルコース負荷に応答してインスリン分泌が増加することを確認した後、人工組織をマウスに移植した。

ストレプトゾトシンにて糖尿病に誘導した免疫不全マウス（ＳＣＩＤマウス）を吸入麻酔下で開腹し、精巣に付着する脂肪組織を広げ、その上にトランスウェルより膜ごと外した人工組織を留置し、最後に余った膜で人工組織を包み腹腔内に戻して閉腹して移植を完了した。

移植後１４日目のマウス腹壁脂肪内の移植片の移植片の位相差顕微鏡像を図４Ａに示す。得られた人工組織を常法に従って免疫染色（ＣＤ３１およびインスリン）した結果を図４Ｂに示す。図４Ｂにおいて、インスリン免疫染色陽性部分（膵島、緑色に染色）の周囲にＣＤ３１免疫染色陽性部分（血管、赤色に染色）が見られた（血管化膵島の形成）。

移植後１４日目のマウス腹壁脂肪内の移植片を切片化し、ＨＥ染色、およびインスリンについては抗マウスインスリン抗体を一次抗体とする免疫染色（染色はＤＡＢ染色）を行った。ＨＥ染色の結果を図５Ａに示す。インスリン免疫染色の結果を図５Ｂに示す。膵島は線維芽細胞および血管内皮細胞で構成された細胞層と一体化した状態で生着していた。細胞層内に血管網と内部の血流（赤血球）が確認された。また、膵島からのインスリン分泌も確認された。

本実験は、生体に移植されて生着した本発明の人工組織が、実際に血糖値を低下させるかどうかを調べることを目的とした。
トランスウェルにフィブロネクチンとゼラチンでコートしたＢＡＬＢ／ｃマウス間葉系幹細胞（ＭＳＣ）８×１０^５個とＨＵＶＥＣ１×１０^５細胞を撒き、２日間培養した。その上に分離したばかりのＢＡＬＢ／ｃマウス膵島１５０個を撒き、１日培養して人工組織を得た。糖尿病を誘導したＳＣＩＤマウスを吸入麻酔下で開腹し、左精巣に付着する脂肪織を広げ、トランスウェルより外した人工組織をメンブレンごと脂肪織に置き、余った脂肪織でこれを包み、腹のなかに戻した。腹壁皮膚を閉創し手術を終了した。対照群は１５０個の膵島を上記脂肪織に包んだものであった。膵島移植を４匹に、人工組織移植を１匹に行った。

人工組織移植群では、移植後１４日目には血糖値が正常化（２００ｍｇ／ｄＬ以下）し、その後２１日目には約１３０ｍｇ／ｄＬまで低下した。一方、膵島移植群では、移植２１日目においても血糖値は約３００ｍｇ／ｄＬよりも低下せず、正常化には至らなかった。

以上の結果より、本発明の人工組織はグルコース負荷に応答してインスリン分泌を増加させることができ、生体内に生着して十分なインスリンを分泌し、血糖値を正常化させることが確認された。

Claims

線維芽細胞および／または間葉系幹細胞と、血管内皮細胞と、細胞外マトリックスとを培養することにより三次元組織体を形成すること、及び
前記三次元組織体の形成後に膵島細胞を配置して培養することを含み、
前記線維芽細胞および／または間葉系幹細胞、前記細胞外マトリックス及び前記血管内皮細胞は、血管網構造が形成された三次元組織体を構成し、
前記三次元組織体は、前記膵島細胞が複数個集合することにより構成された膵島を含む人工組織を製造する方法であって、
細胞外マトリックスを含む被膜で覆われた前記線維芽細胞および／または間葉系幹細胞及び細胞外マトリックスを含む被膜で覆われた前記血管内皮細胞を培養すること、及び前記培養により形成された細胞層上に前記膵島細胞を配置して培養することを含む、方法。
線維芽細胞および／または間葉系幹細胞と、血管内皮細胞と、細胞外マトリックスとを培養することにより三次元組織体を形成すること、及び
前記三次元組織体の形成後に膵島細胞を配置して培養することを含み、
前記線維芽細胞および／または間葉系幹細胞、前記細胞外マトリックス及び前記血管内皮細胞は、血管網構造が形成された三次元組織体を構成し、
前記三次元組織体は、前記膵島細胞が複数個集合することにより構成された膵島を含む人工組織を製造する方法であって、
細胞外マトリックスを含む被膜で覆われた前記線維芽細胞および／または間葉系幹細胞を配置して培養すること、前記培養により形成された細胞層上に細胞外マトリックスを含む被膜で覆われた前記血管内皮細胞を配置して培養すること、及び前記血管内皮細胞の上に、細胞外マトリックスを含む被膜で覆われた前記線維芽細胞および／または間葉系幹細胞と前記膵島細胞を混合して配置し培養することを含む、方法。
前記膵島細胞として、１０個又はそれ以上の膵島細胞が集合することにより構成された膵島を使用することを含む、請求項１または２に記載の製造方法。