KR102184473B1 - 생물학적 조직에 혈관계를 부여하는 방법 - Google Patents

생물학적 조직에 혈관계를 부여하는 방법 Download PDF

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Abstract

시험관내에 있어서, 생물학적 조직에 혈관계를 부여하는 방법으로서, 생물학적 조직을 혈관 세포 및 간엽계 세포와 공배양하는 것을 포함하는, 상기 방법. 상기 방법에 의해, 혈관계가 부여된 생물학적 조직. 상기의 생물학적 조직을 비인간 동물에 이식하고, 혈관망이 구축된 조직 또는 장기로 분화시키는 것을 포함하는, 조직 또는 장기의 제작 방법. 상기의 생물학적 조직을 인간 또는 비인간 동물에 이식하고, 혈관망이 구축된 조직 또는 장기로 분화시키는 것을 포함하는, 조직 또는 장기의 재생 또는 기능 회복 방법. 상기의 생물학적 조직을 비인간 동물에 이식하고, 혈관망이 구축된 조직 또는 장기로 분화시키는 것을 포함하는, 비인간 키메라 동물의 제작 방법. 상기의 생물학적 조직, 상기 방법으로 제작된 조직 및 장기, 그리고 상기 방법으로 제작된 비인간 키메라 동물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개를 사용하여, 약제를 평가하는 방법. 상기 방법에 의해, 혈관계가 부여된 생물학적 조직을 포함하는, 재생 의료용 조성물.

Description

생물학적 조직에 혈관계를 부여하는 방법 {METHOD FOR PROVIDING VASCULAR SYSTEM IN BIOLOGICAL TISSUE}
본 발명은, 생물학적 조직에 혈관계를 부여하는 방법에 관한 것이며, 보다 상세하게는, 다능성 간세포(幹細胞) 등으로부터 유도한 조직이나, 개체로부터 분리된 정상 조직이나 암조직 등의 조직으로부터, 혈관망을 갖는 삼차원 조직을 제작하는 방법에 관한 것이다.
최근, 개체로부터 분리된 정상/암조직이나, 다능성 간세포로부터 유도한 조직을 이용하여, 새로운 의약품을 개발하기 위한 창약 스크리닝이나, 상실된 장기의 기능을 보충하는 재생 의료를 실현화하는 것이 주목받고 있다.
다능성 간세포 등으로부터 삼차원 조직을 유도하는 시도로서는, 간장, 췌장이나 신경 등의 영역에 있어서, 스페로이드상의 소형 조직을 형성하여 세포의 분화 유도를 실시하는 연구가 보고되고 있다 (비특허문헌 1 ： Takayama K, et al. Biomaterials. 2013 Feb ； 34 (7) ： 1781-9. 비특허문헌 2 ： Saito H, et al. PLoS ONE. 2011 ； 6 (12) ： e28209, 비특허문헌 3 ： Eiraku M, et al. Nature 2011, 472, 51-56). 그러나, 어느 방법으로 유도된 조직도, 혈관 구조가 존재하지 않는다. 혈관 구조는, 이식한 후에 조직이 생존하기 위해서 필요한 산소 및 영양소 등을 조직 내부에 송달하는 역할을 가지고 있을 뿐만 아니라, (내부에 혈액이 유입되기 이전에도,) 혈관을 수반하는 삼차원적인 조직 구조나 세포 극성을 재현하는 것이 세포의 분화·증식·유지에 중요하다고 생각되고 있다. 따라서, 혈관을 갖지 않는 조직은 단순히 이식 후에 정착하지 않고 내부가 괴사하는 것 뿐만 아니라, 혈관화에 수반되는 조직의 성숙화가 달성되지 않아, 충분한 기능을 발휘하는 것이 곤란했다.
그래서, 삼차원적인 조직에 혈관 구조를 부가하는 것을 목적으로 하여, 개체로부터 분리된 췌도 등의 조직을, 담체 (족장 (足場) 재료) 에 파종하여, 혈관 내피 세포나 선유아 세포 등과 공배양을 실시하는 방법 등이 고안되어 있다 (비특허문헌 4 ： Kaufman-Francis K, et al. PLoS ONE 2012, 7 (7) ： e40741).
그러나, 족장 재료에 의한 공간적 배치의 제약이 존재하여 세포 거동이 크게 영향을 받는 점에서, 생체 조직과 같은 정밀한 구조를 구축하는 것이 곤란하여, 적정한 세포간의 상호 작용이 재현되지 않는다. 따라서, 조직 중의 세포의 성숙이나 증식이 저해되거나, 기능적인 혈관망의 재구성이 지연되기 때문에 이식 후의 정착이 나쁘다는 등의 문제가 생겨 버린다. 또한, 이식 등에 사용할 때에, 족장 재료가 이물질 반응을 일으켜 염증 등을 초래하는 것도 큰 문제점이라고 생각된다.
이상과 같이, 산업 응용이나 재생 의료 응용을 상정했을 때에는, 혈관망을 구비한 삼차원 조직의 재구축이 요망되고 있음에도 불구하고, 족장 재료에 의존하지 않고, 시험관내 (in vitro) 에 있어서 조직을 이용하여 혈관을 구비한 조직체를 구축하는 방법은, 여전히 확립되어 있지 않은 것이 현상황이다.
Takayama K, et al. Biomaterials. 2013 Feb ； 34 (7) ： 1781-9. Saito H, et al. PLoS ONE. 2011 ； 6 (12) ： e28209 Eiraku M, et al. Nature 2011, 472, 51-56 Kaufman-Francis K, et al. PLoS ONE 2012, 7 (7) ： e40741
간장·췌장·신장·장관·폐장 등의 질환에 대한 의약품 개발이나 재생 의료의 실현을 목표로 하기 위해서는, 혈관화를 수반하는 삼차원적인 조직 구조나 세포 극성을 재현하는 것이 필수이다. 즉, 다능성 간세포로부터 유도된 조직이나 개체로부터 분리된 조직의 기능을 최대화하기 위해서는, 혈관망의 재구축을 가능하게 하는 삼차원 조직체의 형성이 필요하다.
한편, 본 발명자들은, 다른 세포 계보의 시공간적인 상호 작용을 활용함으로써, 「장기의 재구성에 기초하는 장기 세포의 분화 유도」 를 실현화한 혁신적인 삼차원 배양 기술을 확립하고 있다 (Nature, 499 ： 481-484, 2013, WO2013/047639 ： 조직 및 장기의 제작 방법). 즉, 장기 발생의 초기 프로세스에 필수인 장기 세포와 혈관 세포와 간엽계 세포의 세포간 상호 작용을 재현화함으로써 입체적인 장기의 원기 (장기의 종) 를 유도하여, 혈관망을 갖는 기능적인 장기의 창출을 가능하게 하는 기반 기술을 확립하고 있다. 그러나, 본법에 있어서는, 장기 세포를 대상으로 하고 있고, 소형 조직 (조직) 을 사용함으로써, 혈관망을 갖는 삼차원 조직 원기의 창출이 가능한지는 미해명이었다.
본 발명에서는, 조직을 대상으로 하여, 족장 재료에 의존하지 않고, 시험관내 (in vitro) 에 있어서 혈관을 구비한 조직체를 구축하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 장기의 근원이 되는 장기 세포와, 혈관 내피 세포 및 간엽계 세포와 조밀한 세포간 상호 작용을 가짐으로써, 자율적인 조직 구조의 구축과 세포 분화를 수반하는 입체 조직 형성이 진행되는 것을 알아냈다 (Nature, 499 ： 481-484, 2013, WO2013/047639 ： 조직 및 장기의 제작 방법). 그러나, 조직을 대상으로 하여, 혈관망의 부가가 가능한지는 밝혀지지 않았다.
본 발명은, 이와 같은 기관 발생의 조기 프로세스를 인위적으로 재현함으로써, 조직을 대상으로 하여, 시험관 내에서 혈관망을 수반하는 입체 조직을 인위적으로 제작하고자 시도하는 것이다. 또한, 배양계에서 유도된 입체 조직을 생체 내에 이식함으로써 혈류를 개시시켜, 조직 기능의 성숙·유지를 실현화하는 것이 가능한 혈관계가 부가된 입체 조직의 작성을 실시하는 것이다.
본 발명자들은, 개체로부터 분리된 조직 (10 ∼ 3,000 ㎛ 정도까지) 이나, 다능성 간세포로부터 유도한 조직 (10 ∼ 3,000 ㎛ 정도까지) 을, 적절한 혼합 비율로 혈관 세포 및 간엽계 세포와 공배양했다. 입체 조직의 유도에는, 하기 방법을 채용했다.
1. 마트리겔 등의 지지체 상에서, 조직과 혈관·간엽계 세포를 공배양함으로써, 삼차원 조직을 형성한다.
2. 저면에 세포가 모이는 형상의 플레이트 상에서 조직과 혈관·간엽계 세포를 공배양함으로써, 삼차원 조직을 형성한다.
상기에 기재된 방법에 의해, 단기간 배양을 실시함으로써, 미소 혈관 구조를 부가한 입체적인 조직을 시험관 내에서 유도할 수 있었다.
또한, 배양계에서 유도된 입체 조직을 생체 내에 이식함으로써, 기능적인 혈관망의 재구성을 유도함으로써 혈액 관류를 개시시키는, 성체 조직과 동등한 고도로 질서있는 조직 구조를 갖는 조직·장기를 제작하는 것에 성공했다.
이와 같이 조직으로부터, 세포간 상호 작용에 의한 자율적인 조직화를 유도하여, 조직·장기의 삼차원적인 재구축을 시도하는 수법은 과거에는 존재하지 않아, 신규성이 매우 높은 방법이라고 생각된다.
본 발명의 요지는 이하와 같다.
(1) 시험관내에 있어서, 생물학적 조직에 혈관계를 부여하는 방법으로서, 생물학적 조직을 혈관 세포 및 간엽계 세포와 공배양하는 것을 포함하는, 상기 방법.
(2) 족장 (足場) 재료를 사용하지 않고, 생물학적 조직을 혈관 세포 및 간엽계 세포와 공배양하는 (1) 에 기재된 방법.
(3) 생물학적 조직을 혈관 세포 및 간엽계 세포와 공배양함으로써, 생물학적 조직에 혈관계가 부여되어, 생물학적 조직의 기능이 유지 및/또는 향상되는 (1) 또는 (2) 에 기재된 방법.
(4) (1) ∼ (3) 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해, 혈관계가 부여된 생물학적 조직.
(5) (4) 에 기재된 생물학적 조직을 비인간 동물에 이식하여, 혈관망이 구축된 조직 또는 장기로 분화시키는 것을 포함하는, 조직 또는 장기의 제작 방법.
(6) (4) 에 기재된 생물학적 조직을 인간 또는 비인간 동물에 이식하여, 혈관망이 구축된 조직 또는 장기로 분화시키는 것을 포함하는, 조직 또는 장기의 재생 또는 기능 회복 방법.
(7) (4) 에 기재된 생물학적 조직을 비인간 동물에 이식하여, 혈관망이 구축된 조직 또는 장기로 분화시키는 것을 포함하는, 비인간 키메라 동물의 제작 방법.
(8) (4) 에 기재된 생물학적 조직, (5) 에 기재된 방법으로 제작된 조직 및 장기, 그리고 (7) 에 기재된 방법으로 제작된 비인간 키메라 동물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개를 사용하여, 약제를 평가하는 방법.
(9) (4) 에 기재된 생물학적 조직을 포함하는, 재생 의료용 조성물.
(10) 조직 또는 장기를 제작하기 위해서 사용되는 (9) 에 기재된 조성물.
(11) 조직 또는 장기의 재생 또는 기능 회복을 실시하기 위해서 사용되는 (9) 에 기재된 조성물.
(12) 생체에 이식한 후, 생물학적 조직이 혈관망을 갖는 조직 또는 장기로 분화되는 (9) ∼ (11) 중 어느 한 항에 기재된 조성물.
본 발명에 의해, 개체로부터 분리된 정상 조직이나 암조직, 다능성 간세포 등으로부터 유도한 조직 등에 대해, 적절한 환경하에서 혈관 세포와 간엽계 세포의 공배양을 실시함으로써, 시험관 내에서 혈관망을 부여한 입체적인 조직체를 구축하는 것이 가능해졌다. 조직의 성숙·유지·수복 등에 필수인 혈관망이 부여됨으로써, 고기능성의 조직이 재구축되어, 창약 스크리닝이나 재생 의료에 유익한 조직체를 제조하기 위한 기반 기술이 되는 것이 기대된다.
종래, 다능성 간세포로부터 분화 유도에 의해 얻어진 조직체는, 성체 조직을 구성하고 있는 기능 세포와 비교해서 미성숙인 분화 단계에서 멈추어 있었다. 이것은, 종래의 분화 유도법에 있어서는 기능 세포의 종말 분화가 유도되고 있지 않은 것이 원인이다.
본 발명에 의해, 혈관망이 부가된 조직이 재구축 가능해지고, 인간 기능 세포의 종말 분화의 유도법의 확립이 기대되는 점에서 (예를 들어, 혈관 구조에 대한 세포 극성의 재구성 등) 인간 기능 세포의 창출 기술로서 가치가 높다.
한편, 개체로부터 추출한 장기에서 유래하는 조직은 분리 직후에 기능이 현저하게 저하되고, 그것들을 유지하는 것이 곤란했다. 본 발명에 의해 조직에 혈관망을 부여함으로써, 기능의 향상·유지가 달성되면, 혈관계가 존재하지 않기 때문에, 종래의 조직 이식 의료에 의해 효과가 불충분했던 환자에 대해 (예를 들어, 췌도 이식 치료 등), 비약적인 치료 효과를 갖는 이식 수법을 제공할 수 있는 가능성이 있다. 또, 여러가지 장기의 기능을 시험관 내, 내지, 생체 내에 있어서 최대화하는 것이 가능해져, 창약 스크리닝을 실시하는데 있어서 유익한 기반 기술이 되는 것이 기대된다.
또한, 본 발명에 의해 혈관계를 갖는 입체적인 인간 조직 구조체를 재구축하는 것이 가능하다. 따라서, 지금까지의 기술에서는 전혀 달성되어 있지 않았던, 혈관계가 적절히 배치된 혈류를 갖는 조직·장기를 제작하는 것이 가능해진다. 이로써, 약제의 효과 발현과 혈관과의 관련성 등, 현존하는 평가계에서는 해석이 곤란했던, 의약품의 효과를 평가하는 전혀 새로운 해석계를 제공할 수 있는 것이라고 기대된다.
또, 장기 세포와, 혈관 내피 세포 및 간엽계 세포의 조밀한 세포간 상호 작용을 가짐으로써, 자율적인 조직 구조의 구축과 세포 분화를 수반하는 입체 조직 형성을 진행시키는 방법 (Nature, 499 ： 481-484, 2013, WO2013/047639) 에 대한 우위성으로서는, 이하를 들 수 있다.
1. 증폭이 곤란한 세포 (예를 들어, 췌 β 세포, 신사구체 상피·요세관 상피 세포, 간세포, 장관 상피 세포, 폐포 상피 세포, 종양 세포, 영양 외배엽 세포, iPS 세포 유래 내배엽 세포, iPS 세포 유래 중배엽 세포, iPS 세포 유래 외배엽 세포, iPS 세포 유래 조직간·전구 세포 등) 로 구성되는 조직 (예를 들어, 췌도, 신사구체, 간조직, 장관음와, 폐포, 종양 조직, 영양 외배엽 조직, iPS 세포 유래 내배엽 세포 유래 스페로이드, iPS 세포 유래 중배엽 세포 유래 스페로이드, iPS 세포 유래 외배엽 세포 유래 스페로이드, iPS 세포 유래 조직간·전구 세포 유래 스페로이드 등)) 에도 혈관계를 부여할 수 있다.
2. 보다 큰 조직에 혈관계를 부여할 수 있다. Nature, 499 ： 481-484, 2013, WO2013/047639 의 방법으로 제작할 수 있는 조직은 단리된 세포를 사용한 경우 뿐이지만, 본원 발명의 방법에서는 세포가 아니고, 10 ∼ 3,000 ㎛ 정도의 크기의 조직에 혈관계를 부여할 수 있는 것이 확인되고 있다.
3. iPS 세포 등의 간세포에서 유래하는 소형의 조직에 혈관계를 부여함으로써, 생체 조직의 발생 과정과 유사 환경을 재현할 수 있고, 효율적으로 목적으로 하는 조직을 구성하는 기능 세포로의 분화 유도를 달성할 수 있다.
본 발명에 의해, 개체로부터 분리된 정상 조직이나 암조직, 다능성 간세포 등으로부터 유도한 조직을 혈관 세포와 간엽계 세포와 공배양함으로써, 시험관 내에서 혈관망을 부여한 입체적인 조직체를 구축하는 것이 가능해졌다. 이 기술은, 인간 기능 세포의 창출, 장기 이식, 창약 스크리닝, 약제의 효과 발현과 혈관의 관련성 등을 평가하는 새로운 해석계 등에 대한 응용이 가능하다.
본 명세서는, 본원의 우선권의 기초인 일본 특허출원, 일본 특허출원 2013­153056 의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.
도 1a 는, 췌도 조직에 대한 혈관망의 부여를 나타낸다. A) LIVE/DEAD (등록상표) Cell Imaging Kit 를 사용한 마우스 췌도용 배지의 검증 (녹 ： 생존 세포, 적 ： 사멸 세포).
도 1b 는, 췌도 조직에 대한 혈관망의 부여를 나타낸다. B) A) 의 정량 데이터.
도 1c 는, 췌도 조직에 대한 혈관망의 부여를 나타낸다. C) 마우스 췌도 (색 없음), 혈관 내피 세포 (녹), 간엽계 간세포 (적) 를 사용한 3 차원 조직 구축 과정의 타임 랩스 이메이징.
도 1de 는, 췌도 조직에 대한 혈관망의 부여를 나타낸다. D) 배양 24 시간 후의 마우스 췌도. E) 공배양 24 시간 후의 마우스 췌도, 혈관 내피 세포, 간엽계 간세포. E') E) 에서 창출한 3 차원 조직의 면역 조직학적 해석 (녹 ： 인슐린, 적 ： 인간 CD31).
도 1f 는, 췌도 조직에 대한 혈관망의 부여를 나타낸다. F) LIVE/DEAD (등록상표) Cell Imaging Kit 를 사용한 마우스 췌도 세포의 생사 판정 (녹 ： 생존 세포, 적 ： 사멸 세포).
도 1g 는, 췌도 조직에 대한 혈관망의 부여를 나타낸다. G) F) 의 정량 데이터.
도 1h 는, 췌도 조직에 대한 혈관망의 부여를 나타낸다. H) 공배양을 실시한 마우스 췌도로부터의 인슐린 방출 농도의 증강.
도 1i 는, 췌도 조직에 대한 혈관망의 부여를 나타낸다. I) 시험관 내에 있어서의 당부하 시험.
도 1ja 는, 췌도 조직에 대한 혈관망의 부여를 나타낸다. J-1) 혈관 내피 세포 및 간엽계 간세포와의 공배양에 의해 발현이 현저하게 증강하는 유전자군.
도 1jb 는, 췌도 조직에 대한 혈관망의 부여를 나타낸다. J-2) J-1) 의 계속.
도 1jc 는, 췌도 조직에 대한 혈관망의 부여를 나타낸다. J-3) J-2) 의 계속.
도 2a 는, 소형 혈관화 췌도의 제작을 나타낸다. A) 저면에 조직이 모이는 배양 기재를 사용한 소형 혈관화 췌도의 자율적 형성 (마우스 췌도수를 변경한 경우라도 혈관화 조직이 형성된다).
도 2b 는, 소형 혈관화 췌도의 제작을 나타낸다. B) 혈관 내피 세포수, 간엽계 간세포수의 조건 검토.
도 2c 는, 소형 혈관화 췌도의 제작을 나타낸다. C) 소형 혈관화 췌도 형성 과정의 타임 랩스 이메이징 (공배양에 의한 세포의 형태 변화, 마우스 췌도 (청), 혈관 내피 세포 (녹), 간엽계 간세포 (적)).
도 2d 는, 소형 혈관화 췌도의 제작을 나타낸다. D) 제작된 소형 혈관화 췌도, 마우스 췌도 (적), 혈관 내피 세포 (녹), 간엽계 간세포 (색 없음).
도 2e 는, 소형 혈관화 췌도의 제작을 나타낸다. E) 소형 혈관화 췌도의 조직학적 해석, 마우스 췌도 (적), 혈관 내피 세포 (녹), 간엽계 간세포 (색 없음), 마우스 CD31 (청).
도 3ab 는, 혈관화 조직의 이식에 의한 기능의 검증을 나타낸다. A) 혈관화 췌도 이식 부위의 매크로 이메이징 (황색의 화살표가 혈액의 유입을 나타낸다). B) 췌도 단체 이식 부위 (대조군) 의 매크로 이메이징.
도 3cd 는, 혈관화 조직의 이식에 의한 기능의 검증을 나타낸다. C) 혈관화 췌도 내부로의 혈액 환류, 마우스 췌도 (녹), 혈관 내피 세포 (색 없음), 간엽계 간세포 (색 없음), 덱스트란 (적). D) 이식 췌도 주위로의 혈액 환류, 마우스 췌도 (녹), 혈관 내피 세포 (색 없음), 간엽계 간세포 (색 없음), 덱스트란 (적).
도 3e 는, 혈관화 조직의 이식에 의한 기능의 검증을 나타낸다. E) 당뇨병 모델 마우스를 사용한 신피막하에의 혈관화 췌도 이식, 혈당 추이.
도 3f 는, 혈관화 조직의 이식에 의한 기능의 검증을 나타낸다. F) 당뇨병 모델 마우스의 혈당 추이.
도 3g 는, 혈관화 조직의 이식에 의한 기능의 검증을 나타낸다. G) 당뇨병 모델 마우스의 체중 추이.
도 3h 는, 혈관화 조직의 이식에 의한 기능의 검증을 나타낸다. H) 당뇨병 모델 마우스의 생존률.
도 3i 는, 혈관화 조직의 이식에 의한 기능의 검증을 나타낸다. I) 생체 내에 있어서의 당부하 시험.
도 3jk 는, 혈관화 조직의 이식에 의한 기능의 검증을 나타낸다. J) CW 에 이식한 혈관화 췌도의 조직학적 해석. K) CW 에 이식한 췌도의 조직학적 해석.
도 3l 은, 혈관화 조직의 이식에 의한 기능의 검증을 나타낸다. L) 신피막하에 이식한 혈관화 췌도의 조직학적 해석, 인슐린 (녹), 라미닌 (적), DAPI (청).
도 3m 은, 혈관화 조직의 이식에 의한 기능의 검증을 나타낸다. M) 신피막하에 이식한 췌도의 조직학적 해석, 인슐린 (녹), 라미닌 (적), DAPI (청).
도 4 는, 신사구체에 대한 혈관망의 부여를 나타낸다. A) 24 웰 디쉬를 사용한 마우스 신사구체, 혈관 내피 세포, 간엽계 간세포 유래 3 차원 조직의 자율적 형성. B) 저면에 세포가 모이는 배양 기재를 사용한 마우스 신사구체, 혈관 내피 세포, 간엽계 간세포 유래 3 차원 조직의 자율적 형성 (마우스 신사구체 (녹), 혈관 내피 세포 (적), 간엽계 간세포 (청) 를 사용한 3 차원 조직의 타임 랩스 이메이징). C) 24 웰 디쉬를 사용한 배양 24 시간 후의 혈관화된 삼차원 마우스 신사구체 조직의 육안 이미지. D) 96 웰 디쉬를 사용한 배양 24 시간 후의 혈관화된 삼차원 마우스 신사구체 조직의 육안 이미지. E) 혈관화 신사구체 이식 부위의 혈관화 및 생착의 확인. F) 혈관화 신사구체 이식 부위의 라이브 이메이징 (마우스 신사구체 (적), 인간 혈관 내피 세포 (녹), 마우스 혈관 내피 세포 (청)).
도 5 는, 종양 조직에 대한 혈관망의 부여를 나타낸다. A) 24 웰 디쉬를 사용한 인간 췌장 종양 조직 (적), 혈관 내피 세포 (녹), 간엽계 간세포 (색 없음) 유래 3 차원 조직의 자율적 형성. B) 24 웰 디쉬를 사용한 배양 24 시간 후의 마우스 췌장암 조직, 혈관 내피 세포, 간엽계 간세포로부터 자율적으로 형성된 3 차원 조직의 랩스 이메이징. C) 혈관화 조직의 형성에 의한 암 간세포 마커 (CD44) 의 발현 증강.
도 6 은, 간조직에 대한 혈관망의 부여를 나타낸다. A) 마우스 간조직 (녹), 혈관 내피 세포 (적), 간엽계 간세포 (색 없음) 유래 3 차원 조직 형성 과정의 타임 랩스 이메이징. B) 저면에 세포가 모이는 배양 기재를 사용한 마우스 간조직 (녹), 혈관 내피 세포 (적), 간엽계 간세포 (색 없음) 유래 3 차원 조직의 자율적 형성. C) 혈관화 간조직 이식 부위의 매크로 이메이징. D) 혈관화 간조직 내부에서의 혈관계의 재구성.
도 7 은, 장조직에 대한 혈관망의 부여를 나타낸다. A) 마우스 장조직 (적), 혈관 내피 세포 (녹), 간엽계 간세포 (색 없음) 를 사용한 3 차원 조직 형성 과정의 타임 랩스 이메이징. B) 저면에 세포가 모이는 배양 기재를 사용한 장조직 (적), 혈관 내피 세포 (녹), 간엽계 간세포 (색 없음) 유래 3 차원 조직의 자율적 형성. C) 혈관화 장조직 이식 부위의 매크로 이메이징. D) 혈관화 장조직 이식 부위의 생체내 라이브 이메이징 (마우스 장조직 (적), 혈관 내피 세포 (녹), 간엽계 간세포 (색 없음)).
도 8 은, 폐조직에 대한 혈관망의 부여를 나타낸다. A) 마우스 폐조직 (적), 혈관 내피 세포 (녹), 간엽계 간세포 (색 없음) 를 사용한 3 차원 조직의 자율적 형성. B) 혈관화 폐조직 이식 부위의 매크로 이메이징. C) 혈관화 폐조직 이식 부위의 생체내 라이브 이메이징 (마우스 폐조직 (적), 혈관 내피 세포 (녹), 간엽계 간세포 (색 없음), 마우스 CD31 (청)).
도 9 는, iPS 세포 유래 내배엽 조직에 대한 혈관망의 부여를 나타낸다. A) 인간 iPS 세포 유래 내배엽 세포 스페로이드에 대한 응용 방법 개략. B) 인간 iPS 세포 유래 소형 내배엽 조직, 혈관 내피 세포, 간엽계 간세포를 사용한 3 차원 조직의 자율적 형성. C) 인간 iPS 세포 유래 소형 내배엽 조직 (색 없음), 혈관 내피 세포 (적), 간엽계 간세포 (색 없음) 로부터 구축된 3 차원 조직의 형광 화상 관찰.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은, 시험관내에 있어서, 생물학적 조직에 혈관계를 부여하는 방법으로서, 생물학적 조직을 혈관 세포 및 간엽계 세포와 공배양하는 것을 포함하는, 상기 방법을 제공한다.
본 명세서에 있어서, 「생물학적 조직」 이란, 복수의 세포에 의해 구축되는 구조체를 말하며, 개체로부터 분리된 정상·이상 조직이나 암조직, 다능성 간세포 (인공 다능성 간세포 (iPS 세포), 배성 간세포 (ES 세포) 등), 조직간·전구 세포, 분화 세포 등으로부터 유도한 조직) 등을 예시할 수 있다. 생물학적 조직은, 주로 인간 유래의 것을 사용하면 되지만, 인간 이외의 동물 (예를 들어, 실험 동물, 애완 동물, 사역 동물, 경주마, 투견 등에 이용되는 동물, 구체적으로는, 마우스, 래트, 토끼, 돼지, 개, 원숭이, 소, 말, 양, 닭, 상어, 가오리류, 은상어, 연어, 새우, 게 등) 유래의 생물학적 조직을 사용해도 된다.
본 명세서에 있어서, 「혈관계」 란, 혈관 내피 세포 및 그 지지 세포로 이루어지는 구조를 말하며, 혈관계는, 조직을 유지할 뿐만 아니라, 그 성숙화 과정에 있어서도 중요한 역할을 담당하고 있다. 혈관 구조는, 이식한 후에 조직이 생존하기 위해서 필요한 산소 및 영양소 등을 조직 내부에 송달하는 역할을 가지고 있을 뿐만 아니라, (내부에 혈액이 유입되기 이전에도,) 혈관을 수반하는 삼차원적인 조직 구조나 세포 극성을 재현하는 것이 세포의 분화·증식·유지에 중요하다고 생각되고 있다. 따라서, 혈관을 갖지 않는 조직은 단순히, 이식 후에 정착하지 않고 내부가 괴사하는 것 뿐만 아니라, 혈관화에 수반하는 조직의 성숙화가 달성되지 않아, 충분한 기능을 발휘하는 것이 곤란했다.
본 명세서에 있어서, 「혈관계를 부여한다」 및 「혈관화」 란, 혈관 내피 세포 및 지지 세포로 이루어지는 혈관계가, 대상으로 하는 조직과 직접 통합하는 것을 말하며, 혈관계가 부여된 생물학적 조직을 생체에 이식하면, 혈관의 성숙화가 관찰되고, 호스트 혈관과 접속하여, 혈관 관류가 개시되고, 혈관망을 갖는 기능적인 조직·장기로의 유도가 가능해진다.
혈관 세포는, 혈관 조직으로부터 분리할 수 있지만, 혈관 조직으로부터 분리된 세포로 한정되는 일은 없고, iPS 세포나 ES 세포 등의 전능성 혹은 다능성을 갖는 세포로부터 분화 유도된 것이어도 된다. 혈관 세포로서는, 혈관 내피 세포가 바람직하고, 본 명세서에 있어서, 「혈관 내피 세포」 란, 혈관 내피를 구성하는 세포, 또는 그러한 세포로 분화될 수 있는 세포 (예를 들어, 혈관 내피 전구 세포, 혈관 내피 간세포 등) 를 말한다. 어느 세포가 혈관 내피 세포인지의 여부는, 마커 단백질, 예를 들어, TIE2, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, CD31 이 발현되고 있는지의 여부를 조사함으로써 확인할 수 있다 (상기 마커 단백질 중 어느 하나 혹은 복수가 발현되고 있으면 혈관 내피 세포라고 판단할 수 있다). 또, 혈관 내피 전구 세포의 마커로서는, c-kit, Sca-1 등이 보고되어 있고, 이들의 마커의 발현에 의해, 혈관 내피 전구 세포인 것을 확인할 수 있다 (S Fang, et al. PLOS Biology. 2012 ； 10 (10) ： e1001407.). 당업자간에 사용되고 있는 용어 중, 내피 세포 (endothelial cell), 제대 정맥 (umbilical vein) 내피 세포, 내피 전구세포 (endothelial progenitor cell), 내피 전구체 세포 (endothelial precursor cell), 혈관 전구세포 (vasculogenic progenitor), 혈관모세포 (hemangioblast) (HJ. Joo, et al. Blood. 25 ； 118 (8) ： 2094-104. 2011)) 등은 본 발명에 있어서의 혈관 내피 세포에 포함된다. 혈관 세포는, 주로 인간 유래의 것을 사용하지만, 인간 이외의 동물 (예를 들어, 실험 동물, 애완 동물, 사역 동물, 경주마, 투견 등에 이용되는 동물, 구체적으로는, 마우스, 래트, 토끼, 돼지, 개, 원숭이, 소, 말, 양, 닭, 상어, 가오리류, 은상어, 연어, 새우, 게 등) 등의 동물 유래의 혈관 세포를 사용해도 된다. 혈관 세포는, 제대혈, 제대 혈관, 신생아 조직, 간장, 대동맥, 뇌, 골수, 지방 조직 등에서 얻어진다.
본 명세서에 있어서, 「간엽계 세포」 란, 주로 중배엽에서 유래하는 결합직에 존재하고, 조직으로 기능하는 세포의 지지 구조를 형성하는 결합직 세포인데, 간엽계 세포로의 분화 운명이 결정되어 있지만, 아직 간엽계 세포로 분화되어 있지 않은 세포도 포함하는 개념이다. 본 발명에 있어서 사용하는 간엽계 세포는, 분화된 것이어도, 미분화인 것이어도 되지만, 미분화 간엽계 세포를 사용하는 것이 바람직하다. 어느 세포가 미분화 간엽계 세포인지의 여부는, 마커 단백질, 예를 들어, Stro-1, CD29, CD44, CD73, CD90, CD105, CD133, CD271, 네스틴 (Nestin) 이 발현되고 있는지의 여부를 조사함으로써 확인할 수 있다 (상기 마커 단백질 중 어느 하나 혹은 복수가 발현되고 있으면 미분화 간엽계 세포라고 판단할 수 있다.). 또, 전항의 마커 모두 발현되고 있지 않은 간엽계 세포는 분화 간엽계 세포라고 판단할 수 있다. 당업자간에 사용되고 있는 용어 중, 간엽계 줄기 세포 (mesenchymal stem cell), 간엽계 전구세포 (mesenchymal progenitor cell), 간엽계 세포 (mesenchymal cell) (R. Peters, et al. PLoS One. 30 ； 5 (12) ： e15689. (2010)) 등은 간엽계 세포에 포함된다. 간엽계 세포는, 주로 인간 유래의 것을 사용하지만, 인간 이외의 동물 (예를 들어, 실험 동물, 애완 동물, 사역 동물, 경주마, 투견 등에 이용되는 동물, 구체적으로는, 마우스, 래트, 토끼, 돼지, 개, 원숭이, 소, 말, 양, 닭, 상어, 가오리류, 은상어, 연어, 새우, 게 등) 유래의 간엽계 세포를 사용해도 된다.
혈관 세포 및 간엽계 세포와 공배양하는 생물학적 조직의 크기는, 10 ∼ 500 ㎛ 정도의 크기이면 되지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 100 ∼ 300 ㎛ 정도의 크기이며, 보다 바람직하게는, 100 ∼ 150 ㎛ 정도의 크기이다.
공배양에 사용하는 혈관 세포와 간엽계 세포는, 각각, 150 ㎛ 정도의 크기의 생물학적 조직 1 개당, 2 x 102 ∼ 1 x 105 개 정도이면 되고, 바람직하게는, 2 x 102 ∼ 5 x 104 개 정도이며, 보다 바람직하게는, 1 x 104 개 정도이다.
공배양에 있어서의 혈관 세포와 간엽계 세포의 배양비는, 생물학적 조직에 혈관계가 부여되는 범위 내이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직한 세포의 수 비는, 혈관 세포 ： 간엽계 세포 = 10 ∼ 3 ： 3 ∼ 1 이다.
공배양에 있어서의 생물학적 조직의 수는, 생물학적 조직에 혈관계가 부여되는 범위 내이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직한 조직수로서는, 1 x 104 개의 혈관 세포 및 간엽계 세포의 혼합물에 대해, 직경 100 ∼ 150 ㎛ 정도의 크기의 생물학적 조직이 1 ∼ 100 개이다.
또, 혈관 세포와 간엽계 세포의 어느 일방 또는 양방은, 혈관 세포로부터 분비되는 인자, 간엽계 세포로부터 분비되는 인자, 혈관 세포와 간엽계 세포의 양방이 존재함으로써 분비되는 인자 등의 물질로 대체할 수도 있다.
혈관 세포로부터 분비되는 인자, 간엽계 세포로부터 분비되는 인자, 및 혈관 세포와 간엽계 세포의 양방이 존재함으로써 분비되는 인자 등의 물질의 예로서는, FGF2, FGF5, BMF4, BMP6, CTGF, 안지오포이에틴2, 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 14, 폰 빌데브란트 (von Willebrand) 인자 등을 예시할 수 있지만, 이들로 한정되는 일은 없다.
이들의 물질의 첨가량으로서는, FGF2 에 대해서는, 세포 1 x 106 개당, 10 ∼ 100 ng/㎖ 가 적당하고, 20 ng/㎖ 정도가 바람직하고, BMF4 에 대해서는, 세포 1 x 106 개당, 10 ∼ 100 ng/㎖ 가 적당하고, 20 ng/㎖ 정도가 바람직하다.
배양 시에 사용하는 배지는, 생물학적 조직에 혈관계가 부여되는 것이면 어떠한 것이어도 되지만, 혈관 세포 (특히, 혈관 내피 세포) 배양용의 배지, 생물학적 조직 배양용의 배지, 상기 2 개의 배지를 혼합한 것 등을 사용하는 것이 바람직하다. 혈관 세포 (특히, 혈관 내피 세포) 배양용의 배지는 어떠한 것을 사용해도 되지만, hEGF (재조합 인간 상피 세포 성장 인자), VEGF (혈관 내피 세포 성장 인자), 하이드로코르티손, bFGF, 아스코르브산, IGF1, FBS, 항생제 (예를 들어, 겐타마이신, 안포테리신 B 등), 헤파린, L-글루타민, 페놀레드 (Phenolred), BBE 의 적어도 1 종을 함유하는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 혈관 내피 세포 배양용의 배지로서는, EGM-2 BulletKit (Lonza 사 제조), EGM BulletKit (Lonza 사 제조), VascuLife EnGS Comp Kit (LCT 사 제조), 인간 내피-SFM 기저 성장 배지 (Invitrogen 사 제조), 인간 미소 혈관 내피 세포 증식 배지 (TOYOBO 사 제조) 등을 사용할 수 있다. 생물학적 조직 배양용의 배지는 어떠한 것을 사용해도 되지만, 췌도 조직용 배지로서는, RPMI1640 (Wako) 또는 EGM (등록상표) BulletKit (등록상표)) (Lonza CC-4133) 중에, 10 ％ 소 태아 혈청 (BWT Lot.S-1560), 20 mmol/ℓ L-글루타민 (Gibco), 100 ㎍/㎖ 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco) 을 첨가한 것이 바람직하고, 신조직 (예를 들어, 신사구체) 용 배지로서는, RPMI1640 (Wako) 중에, 20 ％ 소 태아 혈청 (BWT Lot. S-1560), 100 ㎍/㎖ 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco), 인슐린-트랜스페린-셀레늄X (GIBCO) 를 첨가한 것을 첨가한 것이 바람직하고, 장조직 (예를 들어, crypt 단편) 용 배지로서는, RPMI1640 (Wako) 중에, 20 ％ 소 태아 혈청 (BWT Lot. S-1560), 100 ㎍/㎖ 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco), 인슐린-트랜스페린-셀레늄X (GIBCO) 를 첨가한 것이 바람직하고, 간조직용 배지로서는, DMEM/F12 (invitrogen) 중에, 10 ％ 소 태아 혈청 (ICN Lot. 7219F), 2 mmol/ℓ L-글루타민 (GIBCO), 100㎍/㎖ 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco), 10 mmol/ℓ 니코틴아미드 (SIGMA), 50 μmol/ℓ 2-머캅토에탄올, 1 x 10＾7 mol/ℓ 6.5 ％ 덱사메타손 (SIGMA), 2.6 x 10＾4 M L-아스코르브산 2-포스페이트 세스퀴마그네슘 염 수화물 (SIGMA), 5 mmol/ℓ HEPES (DOJINDO), 효모에서 발현된 1 ㎍/㎖ 인간 재조합체 인슐린 (Wako), Sf21 곤충 세포에서 발현된 50 ng/㎖ 인간 재조합체 HGF (SIGMA), 20 ng/㎖ 마우스 악하선 (Mouse Submaxillary Gland) EGF (SIGMA) 가 바람직하고, iPS 세포 유래 내배엽 조직용 배지로서는, RPMI1640 (WAKO) 중에, 1 ％ B27 보충물 X50 (INVITROGEN 17504-044), 10 nG/ML BFGF 인간 재조합체 (WAKO 060-04543), 20 nG/ML BMP4 인간 재조합체 (R&D 314-BP) 를 첨가한 것이 바람직하고, iPS 세포 유래 간 내배엽 조직용 배지로서는, 간세포 전용 배지 키트 (HCMTM BulletKitTM lonza CC3198) 중에서 hEGF (재조합 인간 상피 세포 성장 인자) 를 제거한 것에, 0.1 μM 덱사메타손 (Sigma - Aldrich), 10 ng/㎖ 온코스타틴 (Oncostatin) M (R&D), 10 ng/㎖ HGF (PromoKine) 를 첨가한 것이 바람직하고, 암조직이나 폐조직용 배지로서는, 혈관용 배지와 동일한 것이 바람직하다.
생물학적 조직은, 겔 등의 지지체 상에 파종하여, 혈관 세포 및 간엽계 세포와의 공배양을 실시하는 것이 바람직하다. 지지체는, 0.5 ∼ 25 kPa 의 경도를 갖는 기재이면 되고, 그러한 기재로서는, 겔 (예를 들어, 원액 ∼ 4 배 희석 마트리겔 (등록상표), 아가로오스겔, 아크릴아미드겔, 하이드로겔, 콜라겐겔, 우레탄겔 등) 을 예시할 수 있지만, 그것에 한정되는 일은 없다.
또, 저면에 세포가 모이는 형상의 플레이트 상에서 생물학적 조직과 혈관 세포 및 간엽계 세포를 공배양해도 된다. 사용하는 플레이트는, 저면에 세포가 모이는 형상이면 특별히 한정되지 않지만, PrimeSurface (등록상표) 96 웰 U 플레이트 (스미토모 베이크라이트사 제조) 등을 사용할 수 있다.
배양 시의 온도는 특별히 한정되지 않지만, 30 ∼ 40 ℃ 로 하는 것이 바람직하고, 37 ℃ 로 하는 것이 더욱 바람직하다.
배양 기간은 특별히 한정되지 않지만, 12 ∼ 144 시간으로 하는 것이 바람직하고, 췌도 등의 성체 조직에 대한 혈관화는 12 ∼ 24 시간 정도로 하는 것이 더욱 바람직하고, iPS 세포 등에서 유래하는 조직에 대한 혈관화는 48 ∼ 72 시간 정도, 암조직에 대한 혈관화는 12 ∼ 72 시간 정도로 하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명 방법에 의해 혈관계가 부여된 생물학적 조직은, 복합 조직의 형성이 모두 세포·조직 자율적으로 생기는 것을 특징으로 하는 구조체일 수 있다. 또, 본 발명 방법에 의해 혈관계가 부여된 생물학적 조직은, 조직에 혈관계가 직접 통합 (즉, 부착, 연결, 혹은 연속) 하는 복합 조직일 수 있다.
본 발명 방법에 있어서, 생물학적 조직을 혈관 세포 및 간엽계 세포와 공배양함으로써, 족장 재료를 사용하지 않고, 생물학적 조직에 혈관계를 부여할 수 있다.
생물학적 조직을 혈관 세포 및 간엽계 세포와 공배양함으로써, 생물학적 조직에 혈관계가 부여되면, 생물학적 조직의 기능이 유지 및/또는 향상될 수 있다. 생물학적 조직의 기능의 유지·향상에 더하여, 이식 효율이 개선되어, 비약적인 치료 효과를 갖는 치료법을 제공할 수 있다.
또, 본 발명에 의해, 혈관계가 재구축 가능해지기 때문에 iPS 세포, ES 세포 등의 다능성 간세포에서 유래하는 조직으로부터 종말 분화 세포를 효율적으로 유도하는 방법의 확립으로 연결된다.
본 발명의 방법에 의해, 혈관계가 부여된 생물학적 조직은, 생체 내에 있어서 혈관계가 신속하게 기능하는 것이 가능한 복합 조직일 수 있다. 즉, 본 발명의 방법에 의해 혈관계가 부여된 생물학적 조직을 생체 (호스트) 에 이식하면, 족장 재료를 사용한 경우와 비교해서, 호스트 혈관과의 문합 ∼ 혈액의 유입까지의 시간이 대폭 단축될 수 있다 (예 ： 족장 재료를 사용한 경우 = 12 일 (Engineered blood vessel networks connect to host vasculature via wrapping-and-tapping anastomosis. Blood. 2011 Oct 27 ； 118 (17) ： 4740-9.), 본 발명의 방법 = 1-2 일 (후술하는 실시예 참조)).
본 발명의 방법에 의해 혈관계가 부여된 생물학적 조직을 비인간 동물에 이식함으로써, 이식된 조직에 혈관망이 구축되어, 혈관 관류가 개시되고, 고도로 질서있는 조직 구조를 갖는 조직이나 장기가 창출될 수 있다. 따라서, 본 발명은, 혈관 세포 및 간엽계 세포와의 공배양에 의해 혈관계가 부여된 생물학적 조직을 인간 또는 비인간 동물에 이식하고, 혈관망이 구축된 조직 또는 장기로 분화시키는 것을 포함하는, 조직 또는 장기의 제작 방법을 제공한다. 사용하는 비인간 동물로서는, 실험 동물, 애완 동물, 사역 동물, 경주마, 투견 등에 이용되는 동물, 구체적으로는, 마우스, 래트, 토끼, 돼지, 개, 원숭이, 소, 말, 양, 닭, 상어, 가오리류, 은상어, 연어, 새우, 게 등을 들 수 있다. 또, 사용하는 비인간 동물은, 면역 거절 반응을 회피하기 위해서, 면역 부전 동물인 것이 바람직하다.
혈관계가 부여된 생물학적 조직의 이식 부위는, 이식 가능하면 어느 부위여도 되지만, 두개 내, 장간막, 간장, 비장, 신장, 신피막하, 문맥 상 등을 예시할 수 있다. 두개 내에 이식하는 경우에는, 시험관내에서 제작한 1 ∼ 12 개 정도의 500 ㎛ 크기의 생물학적 조직을 이식하면 되고, 장간막에 이식하는 경우에는, 시험관내에서 제작한 1 ∼ 12 개 정도의 3 - 8 mm 크기의 생물학적 조직을 이식하면 되고, 문맥 상에 이식하는 경우에는, 시험관내에서 제작한 1 ∼ 12 개 정도의 3 - 8 mm 크기의 생물학적 조직을 이식하면 된다. 신피막에 이식하는 경우에는, 시험관내에서 제작한 1 ∼ 6 개 정도의 3 - 8 mm 크기의 생물학적 조직을 이식하면 되고, 간장·비장·신장·림프절·혈관 내에 이식하는 경우에는, 시험관내에서 제작한 100 ∼ 2000 개 정도의 100 ∼ 200 ㎛ 크기의 생물학적 조직을 이식하면 된다.
이상과 같이 하여 제작한 조직 및 장기는, 창약 스크리닝이나 재생 의료 등에 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명은, 혈관 세포 및 간엽계 세포와의 공배양에 의해 혈관계가 부여된 생물학적 조직을 인간 또는 비인간 동물에 이식하고, 혈관망이 구축된 조직 또는 장기로 분화시키는 것을 포함하는, 조직 또는 장기의 재생 또는 기능 회복 방법을 제공한다. 비인간 동물로서는, 실험 동물, 애완 동물, 사역 동물, 경주마, 투견 등에 이용되는 동물, 구체적으로는, 마우스, 래트, 토끼, 돼지, 개, 원숭이, 소, 말, 양, 닭, 상어, 가오리류, 은상어, 연어, 새우, 게 등을 들 수 있다.
또, 본 발명은, 혈관 세포 및 간엽계 세포와 공배양함으로써 혈관계가 부여된 생물학적 조직을 포함하는, 재생 의료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물을 생체 내에 이식하여, 조직 또는 장기를 제작할 수 있다. 또, 본 발명의 조성물을 생체 내에 이식하여, 조직 또는 장기의 재생 또는 기능 회복을 실시할 수 있다. 생체로서는, 인간 외에, 실험 동물, 애완 동물, 사역 동물, 경주마, 투견 등에 이용되는 동물, 구체적으로는, 마우스, 래트, 토끼, 돼지, 개, 원숭이, 소, 말, 양, 닭, 상어, 가오리류, 은상어, 연어, 새우, 게 등을 들 수 있다.
본 발명의 조성물이 생체에 이식된 후, 생물학적 조직은 혈관망을 갖는 조직 또는 장기로 분화될 수 있다. 그 혈관망에는 혈관 관류가 생길 수 있다. 혈관망에 혈관 관류가 생김으로써, 성체 조직과 동등 혹은 그것에 가까운 고도로 질서있는 조직 구조를 갖는 조직·장기를 창출하는 것이 가능해진다고 생각된다.
본 발명의 조성물에는, FGF2, HGF, VEGF 등의 조직 혈관화 촉진제, 이식에 수반되는 지혈용 젤라틴 스펀지 (상품명 ： 스폰젤, 아스테라스 주식회사), 및, 이식 조직의 고정에 사용하는 볼힐 (테이진 파마 주식회사)·베리프라스트 (CSL 베링 주식회사)·타코콤브 (CSL 베링 주식회사) 등의 조직 접착제 등을 첨가해도 된다.
또, 본 발명은, 혈관 세포 및 간엽계 세포와의 공배양에 의해 혈관계가 부여된 생물학적 조직을 비인간 동물에 이식하고, 혈관망이 구축된 조직 또는 장기로 분화시키는 것을 포함하는, 비인간 키메라 동물의 제작 방법도 제공한다. 혈관계가 부여된 생물학적 조직을 이식한 비인간 동물 (예를 들어, 마우스) 은, 혈관계가 부여된 생물학적 조직의 유래 생물종 (예를 들어, 인간) 의 생리 기능을 모방할 수 있다. 비인간 동물로서는, 실험 동물, 애완 동물, 사역 동물, 경주마, 투견 등에 이용되는 동물, 구체적으로는, 마우스, 래트, 토끼, 돼지, 개, 원숭이, 소, 말, 양, 닭, 상어, 가오리류, 은상어, 연어, 새우, 게 등을 들 수 있다. 비인간 동물은, 면역 거절 반응을 회피하기 위해서, 면역 부전 동물인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은, 상기의 방법에 의해 혈관계가 부여된 생물학적 조직, 혈관계가 부여된 생물학적 조직으로부터 제작된 조직 및 장기, 및 혈관계가 부여된 생물학적 조직이 이식된 비인간 키메라 동물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 이용하여, 약제를 평가하는 방법도 제공한다. 약제의 평가로서는, 예를 들어, 약물 대사의 평가 (예를 들어, 약물 대사 프로파일의 예측), 약효 평가 (예를 들어, 의약품으로서 유효한 약제를 스크리닝하는 것, 약제의 효과와 혈관의 관련성 등의 의약품의 효과를 확인하는 것 등), 독성 평가, 약물 상호 작용 평가 등을 들 수 있다.
약물 대사의 평가는, 혈관계가 부여된 생물학적 인간 조직, 혈관계가 부여된 생물학적 조직으로부터 제작된 인간 조직 및 장기, 및 혈관계가 부여된 생물학적 인간 조직이 이식된 비인간 키메라 동물에 있어서, 의약품의 후보 화합물을 투여한 후의 생물 시료를 채취·해석함으로써, 인간형의 약물 대사 프로파일을 취득할 수 있다. 이로써 종래의 기술에서는 달성이 매우 어려웠던 인간에서의 의약품의 분포·대사·배설 과정을 예측하는 것이 가능해져, 안전하고 효과가 있는 의약품의 개발을 비약적으로 가속할 수 있는 것이라고 기대된다.
의약품으로서 유효한 약제의 스크리닝은, 질병 환자로부터 수립한 세포·조직으로부터 유도된 조직을 대상으로 하여, 혈관계가 부여된 생물학적 조직, 혈관계가 부여된 생물학적 조직으로부터 제작된 조직 및 장기, 및 혈관계가 부여된 생물학적 조직이 이식된 비인간 키메라 동물을 이용하여, 신규의 의약품 후보 화합물을 투여함으로써 해석하는 것이 가능해진다. 이로써, 종래의 시험관내 시험에서 불충분했던, 실제 인간에 투여했을 때의 약효의 예측 정밀도를 대폭 개선할 수 있는 가능성이 기대된다.
약제의 효과와 혈관의 관련성의 확인은, 혈관계가 부여된 생물학적 조직, 혈관계가 부여된 생물학적 조직으로부터 제작된 조직 및 장기, 및 혈관계가 부여된 생물학적 조직이 이식된 비인간 키메라 동물을 대상으로 하여, 임의의 약제를 투여 후, 혈관 근방의 조직 중의 약제의 농도 분포나, 세포에 대한 목적으로 하는 효과를 측정함으로써 취득할 수 있다.
예를 들어, 종양 조직에 있어서는, 임상 상 재발이나 전이의 원인이 된다고 여겨지는 암 간세포 등을 표적으로 하는 것이 중요한 치료 전략이라고 생각되고 있다. 한편, 암 간세포는 혈관 근방에 존재하고 있는 경우에는 혈관 투과성이 저하되기 때문에 항암제가 침윤되기 어려운 점이나, 혈관으로부터 떨어져 있는 경우에는 항암제의 확산이 불충분한 점 등이 알려져 있고, 그것들을 표적으로 하는 약제의 개발에는, 혈관을 기점으로 한 3 차원적인 종양 조직을 재구성하여, 평가에 사용하는 것이 중요했다. 본법을 사용함으로써, 종래 전혀 달성할 수 없었던 혈관과의 세포·조직 극성에 기초하는 약효 평가가 가능해져, 보다 치료 효과가 높은 약제의 개발을 실시하는 것이 가능해진다.
독성 평가는, 혈관계가 부여된 생물학적 조직, 혈관계가 부여된 생물학적 조직으로부터 제작된 조직 및 장기, 및 혈관계가 부여된 생물학적 조직이 이식된 비인간 키메라 동물을 이용하여, 피험물질을 투여한 후에, 조직 장해 마커 등을 측정함으로써, 장해 예측의 정밀도 향상이 가능해진다.
항암제를 비롯한 독성의 문제가 되는 의약품의 개발은, 약물 독성을 평가하기 위해서 막대한 비용과 장기의 개발 기간을 필요로 하는 것이 문제가 되고 있었다. 그래서, 혈관화 조직을 이용하여 생체 내를 모방한 미소 환경을 만들어냄으로써, 지금까지의 평가가 곤란했던 조직을 대상으로 한 독성 시험이 이용 가능해진다. 즉, 혈관과 질환 세포나, 정상 세포에 대한 독성 평가를 실시함으로써, 새로운 의약품의 연구 개발이 비약적으로 신속화되는 것이 기대된다.
약물 상호 작용 평가는, 혈관계가 부여된 생물학적 조직, 혈관계가 부여된 생물학적 조직으로부터 제작된 조직 및 장기, 및 혈관계가 부여된 생물학적 조직이 이식된 비인간 키메라 동물을 이용하여, 복수의 약제를 투여한 후에, 그 후의 각 약제의 분포·대사·배설 과정 등의 약물 동태나 독성 평가, 약효 평가를 행함으로써 실시할 수 있다.
종래의 다능성 간세포의 분화 유도법에서는, 얻어지는 세포의 기능 레벨은 성체 조직의 기능 세포와 비교해서 미숙한 단계에서 멈추어 있었다. 본 발명에 의해, 다능성 간세포 등으로부터 유도한 조직으로부터 종말 분화된 기능 세포를 얻을 수 있으면, 혁신적인 분화 유도 기술로서, 인간 기능 세포의 공업적 제조를 향한 중요한 기반 기술이 된다. 예를 들어, 본 발명에 의해 인위적으로 제작된 인간 간장 조직으로부터 인간 간(肝)세포나 인간 간(肝) 간세포(幹細胞)를 분리함으로써, 창약 개발에 있어서 필요한 인간 성숙 간세포를 대량으로 제조하는 것이 가능해진다.
또, 암조직이나 정상 조직 등에 입체적인 혈관망을 부여함으로써, 창약 개발에 있어서의 과제였던 약제의 효과 발현과 혈관과의 공간적 배치의 상관 등, 완전히 새로운 시점에서 약효를 평가하는 혁신적인 스크리닝 기술이 되는 것이 기대된다.
종래, 당뇨병 등을 대상으로 한 이식 의료는, 뇌사 도너 등에서 유래하는 개체로부터 추출한 췌도 조직 등을 이식하는 조직 이식 요법이 주체였다. 그러나, 조직 이식 요법은, 혈관계를 갖지 않기 때문에 이식 후의 생착이 현저하게 낮아, 치료 효과가 한정적인 것이 과제로 되어 있었다. 본 발명에 의해, 이와 같은 문제가 해결 가능한, 혈관계를 부여한 이식재를 제공하는 것이 가능해진다. 혈관망을 부여한 치료용의 인간 조직·장기를 공업적으로 제조하는 것이 가능해지면, 높은 치료 효과를 기대할 수 있는 새로운 이식용 조직·장기를 제공할 수 있어, 혁신적인 의료 기술이 되는 것이 기대된다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
〔실시예 1〕췌도 조직에 대한 혈관망의 부여
〔방법〕
1. 마우스 췌도의 단리법
마우스 췌도의 단리는 주로 Dong 들의 방법에 따라 실시했다 (문헌명 ： A protocol for islet isolation from mouse pancreas). 디에틸에테르 (Wako) 를 사용하여 마취한 C57BL/6J 마우스 (닛폰 SLC) 의 복부를 70 ％ 에탄올로 소독한 후, 개복하고, 총 담관과 십이지장의 결합부인 파터 팽대부를 결찰했다. 그 후, 담낭관과 간관의 합류부에 27G 주사 바늘을 삽입하고, 한크스 완충액 (HBSS, GIBCO) 으로 조제한 콜라게나아제 XI 액 (1,000 U/㎖) (Sigma, cat. No. C7657) 을 3 ㎖ 주입하고, 췌장 전체에 콜라게나아제 XI 액을 충전했다. 췌장을 잘라, 콜라게나아제 XI 액이 든 50 ㎖ 튜브에 넣어 37.5 ℃ 에서 15 분간 진탕했다. 췌장을 소화 후, 빙랭해 둔 HBSS (CaCl2 1 mM 을 함유한다) 를 25 ㎖ 첨가하여 세정, 원심 (290 g, 30 초간, 4 ℃) 후, 상청을 제거했다. 재차, 세정, 원심을 실시한 후, HBSS 를 15 ㎖ 첨가하고, 70 ㎛ 메시의 셀 스트레이너를 사용하여 여과하고, 잔존물을 독자적으로 조제한 배지 (EGM (등록상표) BulletKit (등록상표) (Lonza CC-4133) 를 기초로 췌도의 배양용으로 독자 개변한 것) 를 사용하여 페트리디슈에 전체량을 옮겼다.
2. 마우스 췌도의 선별법
1 에서 단리한 마우스 췌도를 실체 현미경하에서 관찰하면, 등색으로 구상의 마우스 췌도 (직경 ： 150 ∼ 250 ㎛) 를 확인할 수 있다. 이것을 피펫만으로 췌도용 배지에 채취해 갔다.
3. 마우스 췌도의 초대 배양법
독자적으로 조제한 배지 (EGM (등록상표) BulletKit (등록상표)) (Lonza CC-4133) 중에, 10 ％ 소 태아 혈청 (BWT Lot. S-1560), 20 mmol/ℓ L-글루타민 (Gibco), 100 ㎍/㎖ 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco) 을 첨가한 것을 사용하여 37 ℃, 5 ％ CO2 의 인큐베이터 내에서 배양했다.
4. 세포 배양
정상 인간 제대 정맥 내피 세포 (Normal Human umbilical vein endothelial cell ： HUVEC) (Lonza CC-2517) 는, HUVEC 배양용으로 조제된 전용의 배지 (EGM (등록상표) BulletKit (등록상표)) (Lonza CC-4133) 를 사용하여, 보증 계대 횟수 (5 회) 이내의 계대 횟수로 배양했다. 인간 간엽계 간세포 (human Mesenchymal Stem Cell ： hMSC) (Lonza PT-2501) 는, hMSC 배양에 조제된 전용의 배지 (MSCGMTM BulletKit (등록상표)) (Lonza PT-3001) 를 사용하여, 보증 계대수 (5 회) 이내의 계대 횟수로 배양했다. 각각의 세포는 37 ℃, 5 ％ CO2 의 인큐베이터 내에서 배양했다.
5. 레트로바이러스 벡터에 의한 형광 표식
모든 유전자 재조합 실험은, 요코하마 시립 대학 DNA 재조합 위원회의 양해를 얻은 후에, P2 레벨 안전 캐비넷 내에서 시행했다.
바이러스 벡터 pGCDΔNsamEGFP 및 pGCDΔNsamKO 의 산출은 이하의 방법으로 실시했다. 293 GPG/pGCDΔNsamEGFP 세포 (Masafumi Onodera 씨에게 제공) 및 293GPG/pGCDΔNsamKO 세포 (Masafumi Onodera 씨에게 제공) 를, 폴리-L-리신으로 코팅한 디쉬에 파종하고, 전용으로 조제한 배지 (293GPG 배지로 나타낸다) 를 사용하여 배양했다. 즉, DMEM (SIGMA) 중에 10 ％ 소 태아 혈청 (Gibco), 2 mmol/ℓ L-글루타민 (Gibco), 1 × 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco), 1 ㎍/㎖ 테트라사이클린 히드로클로라이드 (SIGMAT-7660), 2 ㎍/㎖ 퓨로마이신 (SIGMAP-7255), 0.3 mg/㎖ G418 (SIGMA A-1720) 을 함유하는 것을 사용했다. 배양은 37 ℃, 10 ％ CO2 의 인큐베이터 내에서 배양했다. 약 80 ％ 콘플루엔트 상태까지 배양한 후, 배지를 293GPG 배지로부터 테트라사이클린 히드로클로라이드, 퓨로마이신, G418 을 뺀 배지 (293GP 배지로 나타낸다) 로 치환했다 (제 0 일로 한다). 제 3 일에서 배지를 교환한 후, 제 4 일로부터 바이러스를 배지마다 회수하고, 다시 293GP 배지로 채웠다. 회수한 배지를 0.45 ㎛ 필터로 여과하여 일시적으로 4 ℃ 에서 보관했다. 상기의 순서로 제 7 일까지 회수한 것을 6000G, 4 ℃, 16 시간 원심하고, 펠릿에 400 ㎕ 의 Stempro (invitrogen) 를 첨가하고, 4 ℃, 72 시간 진탕 후, 이 -80 ℃ 에서 회수·보존했다. (100 배 농축 바이러스 용액으로 나타낸다).
HUVEC 를 30 ∼ 50 ％ 콘플루엔트 상태가 될 때까지 배양하고, 배지에 프로타민 (Sigma) 을 종농도 0.4 ㎛/㎖ 가 되도록 첨가하고, HUVEC 에는 pGCDΔNsamEGFP 를 첨가했다. 37 ℃, 5 ％ CO2 의 인큐베이터 내에서 4 시간 감염시켜, PBS 로 2 회 세정 후, 배지를 신선한 것으로 교환하고, 다시 37 ℃, 5 ％ CO2 인큐베이터 내에서 배양했다. 이 조작을 4 회 반복하여, 세포를 형광 표식했다.
6. 마우스 췌도용 배지의 검토
RPMI1640 (Wako) 과 내피 세포용 배지 (EGM (등록상표) BulletKit (등록상표)) (Lonza CC-4133) 각각을 사용하여 췌도용 배지를 조제했다. 각 배지에서 충전해 둔 PrimeSurface (등록상표) 96 웰 U 플레이트 (스미토모 베이크라이트) 의 1 웰에 마우스 췌도를 1 개 정치(靜置)하고, 37 ℃ 의 인큐베이터 내에서 배양했다. 그 후, LIVE/DEAD (등록상표) Cell Imaging Kit (라이프 테크놀로지스·재팬) 를 20 ㎕ 첨가하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 의 인큐베이터 내에서 15 분간 배양하고, 공초점 현미경 (LEICA TCS-SP5) 을 사용하여 관찰했다.
7. 24 웰 평저 플레이트를 사용한 인간 혈관 구조를 갖는 3 차원 조직의 제작
시간 경과적 관찰용으로서, EGFP-HUVEC 를 2.0 × 106 개 세포, hMSC 를 4.0 × 105 개 세포의 세포수로 혼합하고, 950 rpm 으로 5 분간 원심을 실시했다. 그 후, 상청을 제거하여 20 ㎕ 의 췌도용 배지로 현탁하고, 겔을 고정하여 (마트리겔 (BD) 과 췌도용 배지를 1 ： 1 의 비율로 혼합한 용액을 1 웰마다 300 ㎕ 씩 넣어, 37 ℃, 5 ％ CO2 의 인큐베이터 내에 10 분 이상 정치하여 굳혔다), 마우스 췌도 300 개를 정치해 둔 24 웰 평저 플레이트 (BD) 의 1 웰에 세포를 파종했다. 파종 후, 37 ℃ 의 인큐베이터 내에 10 분간 정치했다. 10 분 후, 췌도용 배지를 1 ㎖ 웰의 벽을 따라 조용히 첨가하고, 37 ℃ 의 인큐베이터에서 1 일간 배양했다.
8. 96 웰 U 플레이트를 사용한 인간 혈관 구조를 갖는 3 차원 조직의 제작
췌도용 배지를 충전해 둔 PrimeSurface (등록상표) 96 웰 U 플레이트 (스미토모 베이크라이트) 의 1 웰에 마우스 췌도를 정치하고, 그곳에 HUVEC, hMSC 를 파종했다. 그 후, 37 ℃ 의 인큐베이터에서 1 일간 배양했다.
9. 실체 현미경을 사용한 세포 공배양의 시간 경과적 관찰
실체 현미경으로의 시간 경과적 변화를 추적하기 위해서 공배양을 실시했다. PrimeSurface (등록상표) 96 웰 U 플레이트의 1 웰에 마우스 췌도 10 개를 정치하고, 그곳에 HUVEC 를 1.0 × 104 개 세포, hMSC 를 1.0 × 103 개 세포의 세포수로 파종했다. 파종 후, 실체 현미경 (LeicaDFC300FX) 에 플레이트를 설치하여, 세포 공배양에 의한, 형태 변화를 관찰했다.
10. 트랜스 웰 플레이트를 사용한 췌도 세포 생존률의 검증
24 웰 트랜스 웰 플레이트의 저면부에, 마우스 췌도를 30 개 정치했다. 인서트를 다른 24 웰 플레이트 내에 넣고, HUVEC 를 1 x 105 개 세포 파종한 것, hMSC 를 2 x 104 개 세포 파종한 것, HUVEC 를 1 x 105 개 세포, MSC 를 2 x 104 개 세포 혼합하여 파종한 것을, 마우스 췌도를 정치한 24 웰 플레이트에 넣고, 이들을, 37 ℃, 5 ％ CO2 의 인큐베이터 내에서 하룻밤 배양했다. 배양 후, 마우스 췌도를 정치한 24 웰 플레이트에 LIVE/DEAD (등록상표) Cell Imaging Kit (라이프 테크놀로지스·재팬) 를 200 ㎕ 첨가하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 의 인큐베이터 내에서 15 분간 배양하고, 그 후, 공초점 현미경 (LEICA TCS-SP5) 을 사용하여 관찰했다.
11. 96 웰 U 플레이트를 사용한 췌도 세포 생존률의 검증
8 에서 제작한 3 차원 조직의 배지 중에, LIVE/DEAD (등록상표) Cell Imaging Kit (라이프 테크놀로지스·재팬) 를 20 ㎕ 첨가하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 의 인큐베이터 내에서 15 분간 배양하고, 그 후, 공초점 현미경을 사용하여 관찰했다.
12. 트랜스 웰 플레이트를 사용한 인슐린 분비량의 측정
24 웰 트랜스 웰 플레이트의 저면부에, 마우스 췌도를 100 개 정치했다. 인서트를 다른 24 웰 플레이트 내에 넣고, HUVEC 를 1 x 105 개 세포, hMSC 를 2 x 104 개 세포 혼합하여 파종한 것과, 세포를 파종하지 않은 것을, 마우스 췌도를 정치한 24 웰 플레이트에 넣고, 이들을, 37 ℃, 5 ％ CO2 의 인큐베이터 내에서 하룻밤 배양했다. 배양 후, 마우스 췌도를 정치한 24 웰 플레이트 중의 상청을 채취하고, 이것을 인슐린 측정 키트 (시바야기, cat. No. AKRIN-011H) 로 측정했다.
13. 시험관 내에 있어서의 당부하 시험
글루코오스 불함 RPMI1640 (Wako) 을 췌도용 배지에 조제하고, 글루코오스를 첨가함으로써 글루코오스 저농도 배지 (60 mg/100 ㎖) 와 고농도 배지 (360 mg/100 ㎖) 를 제작했다. 마우스 췌도 100 개가 정치되어 있는 24 웰 트랜스 웰 플레이트의 인서트에 글루코오스 저농도 배지를 충전하고, HUVEC 가 1 × 105 세포, hMSC 가 2 × 104 세포 혼합 파종되어 있는 웰에 인서트를 옮겨, 37 ℃, 5 ％ CO2 의 인큐베이터 내에서 1 시간 배양했다. 그 후, 인서트 내의 배지를 글루코오스 고농도 배지로 치환하고, 다른 웰에 인서트를 옮겨, 인큐베이터 내에서 1 시간 배양했다. 배양 후, 인서트와 웰 중의 상청을 채취하고, 이것을 인슐린 측정 키트 (시바야기) 로 측정했다.
14. 실험 동물
이식 동물로서 사용한 NOD/SCID 마우스 (Sankyo Labo Service Co., Tokyo, Japan) 는, SPF 환경하에서 주간 10 시간·야간 14 시간의 명암 주기로 사육했다. 실험 동물의 사육은 요코하마 시립 대학 의학부 동물 실험 센터에 위탁하고, 또 본학이 정하는 윤리 규정을 준수하여 실험을 실시했다.
15. 계속 관찰용 두부 관찰창 (Cranial Window) (CW) 마우스의 제작
CW 마우스의 제작은 주로 Yuan 들의 방법에 따라 실시했다 (문헌명 ： Vascular permeability and microcirculation of gliomas and mammary carcinomas transplanted in rat and mouse cranial windows.). 마취는 케타라르 (Sankyo Yell Yakuhin Co., Tokyo, Japan) 90 mg/kg, 자일라진 (Sigma Chemical CO., St. Louis, MO, USA) 9 mg/kg 을 멸균 처리한 PBS 로 1 개체 200 ㎕ 의 투여량이 되도록 조정하고, 복강 주사에 의해 실시했다 (케타라르·자일라진 혼합 마취). 케타라르는 마약 관리법에 따라 사용했다. 마취 후, 전동 바리캉으로 두부(頭部)의 털을 제거하고, 70 ％ 에탄올로 NOD/SCID 마우스 두부를 소독하고, 두부 피부를 절개하여, 두개골 표면의 골막을 면봉에 의해 제거한 후, 치과용 마이크로 드릴 (Fine Sciencd Tools, USA) 을 사용하여 두개골을 원형으로 깎아, 신중하게 제거했다. 계속해서 핀셋을 사용하여 경막을 박리했다. 출혈했을 때에는, 스폰젤 (Astellas Co., Tokyo, Japan) 을 사용하여 지혈을 실시했다. 출혈이 보이지 않는 것을 확인한 후, 생리 식염수 (Otuka Pharmaceutical Co., Tokyo, Japan) 로 뇌 표면을 채우고, 직경 7 mm 의 특주 원형 슬라이드 글라스 (MATSUNAMI, Osaka, Japan) 를 표면에 올리고, 코트레 플라스틱 파우더 (Yoshida, Tokyo, Japan) 와 아론 알파 (Toagosei CO., Tokyo, Japan) 를 시멘트상이 되도록 혼합한 접착제에 의해 강고하게 봉입했다. CW 제작으로부터 1 주간 경과 후, 수술부에 출혈이나 염증이 보이지 않는 마우스를 사용했다.
16. 당뇨병 모델 마우스의 제작
SCID Ins-TRECK-Tg 마우스 (토쿄도 임상의학 종합 연구소에서 제공) 에, 디프테리아톡신 (DT) 을 투여함으로써, 당뇨병 모델 마우스를 제작했다. DT 1 ㎍/kg 을 생리 식염수로, 1 개체 200 ㎕ 의 투여량이 되도록 조제하고, 복강 주사에 의해 투여했다. 투여 후, 매일 17 시에 평상 혈당과 체중의 계측을 실시하고, 3 일 이상 연속으로 평상 혈당치가 300 mg/㎗ 를 기록한 것을, 당뇨병 모델 마우스로서 사용했다. 혈당치 계측은, 꼬리 정맥으로부터 혈액을 채취하여, 글루테스트 neo 센서 (등록상표) (파나소닉 토쿄) 로 계측을 실시했다.
17. CW 마우스에의 이식
15 에서 제작한 CW 마우스의, 두부 관찰창의 글라스를 제거함으로써, 뇌 표면을 노출시켜 이식을 실시했다. 사용하는 CW 마우스는, 뇌 표면의 출혈, 염증이나 감염 등이 보이지 않는 마우스를 사용했다. 마취 후, 두부 관찰창 주변을, 70 ％ 에탄올로 소독하고, 특주 원형 슬라이드 글라스와 아론 알파의 경계선으로부터, 18 G 의 바늘끝을 침입시켜, 뇌 표면을 손상시키지 않고 특주 원형 슬라이드 글라스를 박리하여, 뇌 표면을 노출시켰다. 그 후, 생리 식염수로 세정을 실시하고, 뇌 표면의 중심 부근에 이식 조직을 정치하고, 특주 원형 슬라이드 글라스를 올려놓았다. 이 때, 간극이 남지 않도록, 글라스와 뇌 표면의 사이를, 생리 식염수로 채운 후에, 제작 시와 동일하게, 코트레 플라스틱 파우더와 아론 알파에 의한 접착제로 봉입을 실시했다.
18. 신피막하에의 이식
16 에서 제작한 당뇨병 모델 마우스에 대해, 실험 동물용 마취 장치 (시나노 제작소) 를 사용하여, 이소플루란으로 마취를 실시했다. 마취 후, 마우스 배측(背側)의 좌반신을 전동 바리캉으로 털을 제거하고, 70 ％ 에탄올로 소독한 후, 1.5 ∼ 2 cm 절개에 의해 신장을 노출시켰다. 신장 노출 후, 고정시켜 신장복측의 피막을 일부 절개하고, 개구부로부터 피막하에 7 에서 제작한 3 차원 조직을 이식했다. 이식 후, 신장을 체내에 되돌려, 근막과 피부의 봉합을 실시했다.
19. 공초점 현미경에 의한 CW 이식 마우스에 이식한 조직의 추미 정점 관찰
17 에서, CW 에 이식한 3 차원 조직의 관찰을 실시했다.
이식한 CW 마우스에, 11 에서 사용한 것과 동일하게, 케타라르·자일라진 혼합 마취로 마취를 실시하고, CW 마우스를 25 × 60 mm 마이크로 커버 글라스 (MATSUNAMI) 의 위에, 두부 관찰창과 수평이 되도록 앙와위 고정하고, 공초점 현미경 (LEICA TCS-SP5) 을 사용하여 이식한 혈관망을 가진 3 차원 조직의 형태 변화를 관찰했다.
19-1. 마우스 혈류의 가시화
이식한 숙주 마우스측으로부터의 혈류의 가시화를 실시하기 위해, 15 와 동일한 마취를 실시하고, 플루오레센 이소티오-시아네이트-덱스트란 (Flourescen isothio-cynate-dextran) (SIGMA USA) 을 생리 식염수에 의해 조제한 형광 색소를 마우스 체중 20 g 에 대해 100 ㎕, 마우스 꼬리 정맥으로부터 29G 의 마이젝터를 사용하여, 투여했다. 그 후 19 와 동일한 방법으로 관찰을 실시했다.
19-2. 숙주측 혈관 내피 세포의 가시화
이식한 세포에 만들어지는 혈관망 중, 숙주 유래 혈관을 가시화하기 위해, 15 와 동일한 마취를 실시하고, 마우스 꼬리 정맥으로부터 29G 의 주사기로, Alexa-Flour647anti-mouseCD31 (Biolegend) 항체를, 마우스 체중 20 g 에 대해 100 ㎕ 투여했다. 그 후 19 와 동일한 방법으로 관찰을 실시했다.
20. 정상 췌도 조직의 가시화
Pdx-DsRed 마우스 (Douglous Melton 씨로부터 제공), CAG-GFP 마우스 (닛폰 에스엘시) 를 사용함으로써, 정상 췌도 조직 내의 구조를 가시화했다. 실험 동물용 마취 장치를 사용하여, 이소플루란으로 마취를 걸었다. 마우스 배측을 전동 바리캉에 의해 털을 제거한 후, 0.5 ∼ 1 cm 절개를 실시하고, 비장을 외부에 노출시킴으로써, 비장 부근에 접착되어 있는 췌장의 노출을 실시했다. 노출 후 10 cm 디쉬 저면부에 췌장이 붙도록, 마우스를 유지했다. 유지한 상태에서, 37 ℃ 까지 냉각시킨 1.5 ％ 아가로오스겔 용액을 디쉬에 주입함으로써, 췌장을 노출한 상태의 마우스를 고정시켰다. 고정시킨 마우스를 공초점 현미경에 의해, 정상 췌도 조직을 관찰했다.
21. 생체 내에 있어서의 당부하 시험
글루코오스 용액 3 g/kg 을 생리 식염수로, 1 개체 200 ㎕ 의 투여량이 되도록 조제하고, 복강 주사에 의해 투여했다. 투여 후, 15 분마다 꼬리 정맥으로부터 혈액을 채취하고, 글루테스트 neo 센서 (등록상표) (파나소닉 토쿄) 로 혈당치를 계측했다.
22. 동결 절편의 제작
이식 후 샘플의 적출을 실시한 후, PBS 로 세정하여 4 ％ 파라포름알데히드 (PFA) 로 1 일 고정했다. 그 후, 10, 20 ％ 의 각 농도의 스크로오스 용액으로 샘플이 침강할 때까지 스크로오스 치환을 실시하고, 20 ％ 스크로오스 용액 중의 샘플이 침강 후, 30 ％ 스크로오스 용액으로 1 일 스크로오스 치환을 실시했다. 치환 후의 샘플을 O. C. T. 화합물 (Funakoshi Co) 에 포매하고, 4 ℃ 에서 10 분간 침투시킨 후에, 액체 질소 위에 띄운 알루미늄 호일제의 대에 올려놓아, 동결했다.
크라이오스탯트 (Leica CM1950) 에 의해 5 ㎛ 로 박절하여, 슬라이드 글라스 (MATSUNAMI) 에 접착시켰다. 동결 절편을 바람에 건조시켜 동결 절편으로서 사용했다.
23. 파라핀 절편의 제작
이식 후 샘플의 적출을 실시한 후, PBS 로 세정을 실시하여 4 ％ PFA 로 1 일 고정했다. 고정 후 PBS 로 3 회 세정하여 50, 70, 80, 90, 95, 100 ％ 의 각 농도의 에탄올로 1 시간씩 탈수를 실시하고, 100 ％ 에탄올로 1 시간 탈수 후, 새로운 100 ％ 에탄올로 1 일 탈수를 실시했다. 탈수 후, 자일렌으로 1 시간씩 3 회 치환을 실시하고, 65 ℃ 로 설정한 파라핀 포매용 항온조 내에서, 파라핀 ： 자일렌 = 1 ： 1 혼합 용액에 1 시간 침투시키고, 파라핀에 2 시간 3 회씩 침투시켰다. 침투 후 파라핀에 포매하여 파라핀 블록을 제작했다.
제작한 파라핀 블록을 미크로톰에 의해 5 ㎛ 로 박절하고, 파라핀 절편으로서 사용했다.
24. HE (헤마톡실린/에오신 (Haematoxylin/Eosin)) 염색
수도물로 2 분 동결 절편을 세정하고, 탈 OCT 를 실시했다. 이온 교환수로 세정 후, 헤마톡실린 (Wako) 으로 9 분간 핵 염색을 실시했다. 이온 교환수로 염색액을 떨어뜨려, 수도물에 10 분간 담가 물 우려냄을 실시했다. 그 후, 이온 교환수로 세정 후, 에오신 (무토우 화학) 으로 10 분간 세포질 염색을 실시했다. 여분의 에오신을 이온 교환수로 떨어뜨린 후, 상승 에탄올 계열로 탈수하여, 자일렌으로 투철 처리하고, 봉입했다.
파라핀 절편을, 100 ％ 자일렌으로, 5 분간 3 회씩 침투시켜, 100, 90, 80, 70, 60, 50 ％ 에탄올에 3 분씩 담그고, 탈파라핀을 실시하여 친수시켰다. 그 후, 상기의 동결 절편과 마찬가지로, 이온 교환수로 세정 후, HE 염색을 실시했다.
25. 면역 조직 화학 염색
각 절편의 탈 OCT·탈파라핀 후, 절편을 PBS 로 5 분간 3 회 세정하고, 4 ％ PFA 로 10 분간, 4 ℃ 에서 고정을 실시했다. 그 후, PBS 로 5 분간 3 회 세정하고, 2 차 항체 작성 동물 (goat) 의 정상 혈청을 10 ％ 함유하는 블로킹 용액을 사용하여, 조직을 4 ℃ 에서 하룻밤 블로킹했다. 다음으로, PBS 로 200 배 희석한 1 차 항체를 첨가하여 4 ℃ 에서 하룻밤 반응시킨 후, PBS 로 5 분간, 3 회 세정을 실시했다. 1 차 모노클로날 항체로서, 항마우스/모르모트 인슐린 항체, 항인간/마우스 CD31, 항마우스/래트 CD31, 항인간/마우스 Collagen4, 항인간/래빗 라미닌 (Laminin) 항체, 항마우스/래빗 카스파아제 (caspase)-3 항체를 조합하여 사용했다. 또한, PBS 로 500 배 희석한 2 차 항체를 첨가하고, 실온의 차광 조건하에서 1 시간 반응시킨 후, PBS 로 5 분간 3 회 세정하고, 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 디히드로클로라이드 (DAPI, invitrogen) 가 첨가되어 있는 봉입제로 봉입하고, 형광 현미경으로 관찰과 촬영을 실시했다. 2 차 항체 (Molecular probe) 로서, Alexa 488, 555 표식 염소 항래빗 IgG(H＋L) 항체, Alexa 488, 555, 647 표식 염소 항래트 IgG(H＋L) 항체, Alexa 488, 555 표식 염소 항모르모트 IgG(H＋L) 항체, Alexa 488, 555, 647 표식 염소 항마우스 IgG(H＋L) 항체를 조합하여 사용했다.
26. 전체 마운트 (Whole mount) 법에 의한 면역 조직학적인 해석
창출된 혈관화 췌도를 회수하고, 4 ％ PFA 용액에 넣어 1 일 고정을 실시하고, PBS 로 10 분간의 세정을 3 회 실시했다. 고정 후, 3 ％ BSA 가 함유된 0.1 ％ Triton-PBS 용액에 넣어 실온 환경에서 1 시간 블로킹을 실시했다. 블로킹 후 0.1 ％ Triton-PBS 용액으로 10 분간의 세정을 3 회 실시하고, 0.1 ％ Triton-PBS 용액으로 희석한 1 차 항체액에 이식편을 넣어 4 ℃ 에서 1 일 반응시켰다. 반응 후, 0.1 ％ Triton-PBS 용액으로 10 분간의 세정을 3 회 실시하고, 0.1 ％ Triton-PBS 용액으로 희석한 2 차 항체액에 이식편을 넣어 실온 환경에서 4 시간 반응시켰다. 반응 후, 0.1 ％ Triton-PBS 용액으로 10 분간의 세정을 3 회 실시하고, DAPI 가 함유된 봉입재를 첨가하여, 공초점 현미경을 사용하여 관찰했다.
〔결과〕
1. 마우스 췌도, 혈관 내피 세포, 간엽계 간세포의 공배양에 의한 3 차원 조직의 창출
췌도 세포의 생존률을 지표로 배지의 검증을 실시했다 (도 1A). 배양 72 시간 후, 각 조건의 췌도 면적당 사멸 세포 수는, RPMI1640 배지를 사용한 췌도에서는 14 개 세포/㎟, RPMI1640 과 내피 세포용 배지의 혼합 배지에서는 1.8 개 세포/㎟, 내피 세포용 배지에서는 0.8 개 세포/㎟ 존재하고 있었다 (도 1B).
방법 7 과 같이 배양을 실시했다. 배양 개시 직후의 상태에서는, 췌도 주변에 세포가 산재하고 있고, 육안으로 확인 가능한 3 차원 조직은 확인할 수 없었다. 그러나, 배양 개시 4 시간 후에는, 세포끼리의 상호 작용이 개시되어, 산재하고 있던 세포가 밀집을 개시하여, 배양이 진행된 8 시간 후에는, 세포가 췌도를 덮도록 응집하여, 서서히 3 차원적인 구조를 구축해 갔다. 그리고, 배양 24 시간 후에는, 자율적인 조직화가 더욱 진행되어, 혈관화된 3 차원 조직을 구축했다 (도 1C 상단, 1E). 한편, 공배양을 실시하지 않고 췌도만을 배양했을 때에는, 혈관화는 물론, 3 차원 조직의 형성도 확인되지 않았다 (도 1D).
또, 방법 8 과 같이 배양을 실시함으로써, 저면에 세포·조직이 모이는 배양기재 중에서 혈관화된 3 차원 조직의 소형화를 도모했다 (도 2). 마우스 췌도 조직 1, 5, 10, 20 개를 각각 HUVEC, MSC 와 공배양을 실시한 결과, 배양 개시 24 시간 후에는 3 차원 조직을 구축하고, 48 시간 후도 형태가 유지되어 있었다 (도 2A). 또한, 혈관화된 3 차원 조직의 구축에 최소한 필요한 HUVEC, MSC 의 세포수를 검토했다 (도 2B). 마우스 췌도가 10 개일 때는, HUVEC 가 1.0 x 104 개 세포, MSC 가 1 x 103 개 세포로 공배양을 실시하면, 배양 개시 2 시간 후에는, 세포간 접착에 의해, 산재하고 있던 세포가 응집을 개시했다. 배양이 진행된 9 시간 후에는, 세포가 췌도를 덮도록 응집하여, 3 차원 조직을 구축했다 (도 2C 좌측). 세포의 형태 변화를 추적하기 위해, 형광 표식한 마우스 췌도와, 각종 세포를 사용하여 공배양 실험을 실시했다 (도 1A 하단, 2C 우측, 2D). Pdx-DsRed 마우스로부터 단리된 췌도 (도 1A, 2D ： 적, 2C ： 청), 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein) (GFP) 을 도입한 HUVEC (도 1A, 2C, 2D ： 녹), MSC (도 2C ： 적) 를 공배양하고, 공초점 현미경으로 세포 형태를 관찰한 결과, 배양 개시 직후에서는, HUVEC 는 치우침 없이 췌도 주변에 산재하고 있는 것이 확인되었다. 또한, HUVEC 는 췌도 조직에 직접 부착되어 있을 뿐만 아니라, 일부에는 췌도 내부에 있어서의 혈관 내피 세포와 연결되어 있는 것이 나타났다 (도 2E).
이상으로부터, 마우스 췌도, HUVEC, MSC 의 3 종류의 세포를 적절한 조건하에서 공배양함으로써, 혈관화된 3 차원 조직이 자율적으로 창출되는 것이 판명되었다.
2. 혈관 내피 세포, 간엽계 간세포와의 공배양에 의한 마우스 췌도 기능의 향상
방법 10 과 같이 배양을 실시하고, 각 조건에서의 마우스 췌도 세포의 생존률을 비교했다 (도 1F 생존 세포 ： 녹, 사멸 세포 ： 적). 배양 24 시간 후, 각 조건의 췌도 면적당 사멸 세포 수는, 췌도 단독 배양에서는 53 개 세포/㎟, HUVEC 와의 공배양에서는 14 개 세포/㎟, MSC 와의 공배양에서는 2 개 세포/㎟, HUVEC 와 MSC 의 공배양에서는 0.1 개 세포/㎟ 존재하고 있었다 (도 1G). 이상의 점에서, HUVEC 와 MSC 와 공배양을 실시함으로써, 마우스 췌도 세포의 생존률이 향상되는 것이 나타났다.
또, 방법 12 와 같이 배양을 실시하여, 마우스 췌도로부터 분비된 인슐린량을 측정했다 (도 1H). 배양 개시 24 시간 후, 췌도 단독으로 배양했을 경우와 비교해서, HUVEC, MSC 와 공배양한 마우스 췌도에서는, 인슐린 분비량이 증가했다. 시험관 내에 있어서 당부하 시험을 실시한 결과, 췌도 단독 배양군에서는 1.37 배, 공배양군에서는 1.97 배로 인슐린 분비량이 증가했다 (도 1I). 이와 같은 췌도의 기능 향상에 기여하는 분자군을 특정하는 목적으로, 마이크로 어레이 해석에 의해 HUVEC 및 MSC 의 공배양 전후에 있어서의 망라적으로 유전자 발현의 변화를 해석했다. 그 결과, 공배양함으로써 발현이 2 배 이상 증강하는 유전자로서, 214 의 후보 유전자가 추출되었다 (도 1J). 이상으로부터, HUVEC·MSC 와 공배양을 실시함으로써 여러가지 유전자의 발현 변동이 야기되어, 마우스 췌도 기능이 향상되는 것이 시사되었다.
3. 혈관화 췌도 이식에 의한 추미 정점 관찰
결과 1 에서 창출된 혈관화 췌도를, 마우스에 이식하여, 조직의 형태 변화를 추적했다 (도 3). 또, 조직 창출에 있어서의, 혈관화의 필요성을 검토하기 위해서, 마우스 췌도 단독을 마우스에 이식하여, 비교했다. 17 의 방법을 사용하여, 두부 관찰창 (CW) 마우스에 이식을 실시하여, 19 의 방법을 사용하여 형태 변화를 추적했다.
마우스 췌도 단독을 이식 후, 마우스 두부에서는, 이식 후 2 일째까지, 육안적인 변화는 보여지지 않고, 이식 췌도에 대한 혈액 관류 등은 볼 수 없었지만, 이식 후 일수가 경과함에 따라, 생존하고 있는 췌도가 감소되어 갔다 (도 3B). 또, 형광 표식을 사용하여, 세포 형태 변화를 관찰한 결과, 이쪽도 동일하게 변화는 볼 수 없었지만, 서서히 이식 췌도가 감소되어 갔다. 또한, 혈류의 가시화를 실시한 결과, 이식 후 7 일째에 있어서, 췌도 내부로의 혈액 관류는 존재하지 않았다 (도 3D 췌도 ： 녹, 혈류 ： 적). 그러나, 혈관화 췌도를 이식한 마우스 두부에서는, 이식 후 2 일째에, 이식 지점 전체에 대해 혈액 관류가 실시되고 있었다 (도 3A). 또, 공초점 현미경을 사용하여 관찰한 결과, 이식 후 7 일째에 있어서, 이식 췌도 내부로의 혈액 관류가 확인되었다 (도 3C 췌도 ： 녹, 혈류 ： 적).
이들의 결과로부터, 혈관화 췌도를 이식함으로써, 이식 췌도 내부에 대한 조기 혈류 재개를 유발하여, 이식 후의 췌도 생존률이 향상된 것이 나타났다.
4. 혈관화 췌도 이식에 의한 당뇨병 치료 효과의 검증
췌도 5 개의 조건으로 공배양한 혈관화 췌도 40 개를, 당뇨병 모델 마우스의 신피막하에 이식하여, 치료 효과를 측정했다 (도 3E). 이식 후 1 일에 혈당 강하가 보여지고, 이식 2 주간 이후는 정상 혈당치가 안정적으로 유지되어 있었다 (도 3F). 또한, 대폭적인 체중 증가가 보여지고 (도 3G), 생존률은 향상되었다 (도 3H). 생체 내에 있어서의 당부하 시험을 실시한 결과, 정상 마우스와 거의 변함없는 인슐린 분비 응답을 나타냈다 (도 3I).
이상의 점에서, 혈관화 췌도를 이식함으로써, 당뇨병 치료 효과가 나타났다.
5. 혈관화 췌도의 조직학적 해석
공배양 1 일 후의 혈관화 췌도를 조직학적, 면역 조직학적으로 해석했다. HE 염색을 실시한 결과, 중심 괴사가 없고, HUVEC, MSC 와 인접하고 있는 췌도 조직이 관찰되었다 (도 2E 상측). 또한, 면역 염색을 실시하고, 인슐린 항체를 사용하여 췌도 (1E' ： 녹, 2E ： 적) 를, 인간 혈관 내피 세포 항체를 사용하여 HUVEC (1E' ： 적, 2E ： 녹) 를, 마우스 혈관 내피 세포 항체를 사용하여 마우스 혈관 (2E ： 청) 을, 각각 염색했다 (도 1E', 2E 하측). 인슐린 양성의 췌도 내부에 HUVEC 의 존재를 확인하고, 또한, HUVEC 와 마우스 혈관이 접합하고 있었다.
또, 두부 관찰창에 이식 후 30 일째의 혈관화 췌도 (도 3J), 췌도 (도 3K) 를 각각 조직학적, 면역 조직학적으로 해석했다. HE 염색을 실시한 결과, 뇌 조직 상에 생착되어 있는 췌도가 확인되었다. 또, 면역 염색을 실시한 결과, 혈관화 췌도에서는 인슐린 양성 지점에 있어서, 인간 혈관 내피 세포가 존재하고, 또한, 세포외 기질인 라미닌, 콜라겐 IV 를 분비하는 안정적인 인간 혈관인 것을 알아냈다. 그러나, 췌도 단독 이식을 한 췌도 내부에서는, 혈관 내피 세포의 존재는 볼 수 없었다.
또한, 신피막하에 이식 후 28 일째의 혈관화 췌도 (도 3L), 췌도 (도 3M) 를 각각 조직학적, 면역 조직학적으로 해석했다. HE 염색을 실시한 결과, 신장 실질과 피막간에 존재하고 있는 췌도가 확인되었다 (도 3L 좌측 아래, 3M 좌측 아래). 또한, 면역 염색을 실시하고, 인슐린 항체를 사용하여 췌도 (녹) 를, 라미닌 항체를 사용하여 혈관 내피 세포 (적) 를 각각 염색했다 (도 3L 우측 아래, 3M 우측 아래). 혈관화 췌도에서는, 인슐린 양성의 췌도 내부에 있어서, 라미닌 양성의 혈관 내피 세포의 발현을 확인했다. 그러나, 췌도 단독 이식을 한 췌도 내부에서는, 혈관 내피 세포의 존재는 볼 수 없었다.
이상의 점에서, 혈관화 췌도는, 조직학적, 면역 조직학적인 시점에서, 인간 혈관을 수반한 췌도 조직인 것을 나타냈다.
〔실시예 2〕신사구체에 대한 혈관망의 부여
〔방법〕
1. 마우스 사구체의 단리법
디에틸에테르 (Wako) 를 사용하여 마취한 C57BL/6-Tg 마우스 (닛폰 SLC) 의 복부를 70 ％ 에탄올로 소독한 후, 개복하여, 신장을 적출했다. 적출한 신장으로부터 신피막을 제거하고, 생리 식염수로 씻은 후, 메스로 신장을 둥글게 잘랐다. 신우와 수질을 가위로 제거하여, 피질을 회수했다. 빙상에서 회수한 피질을 민스하고, 100 ㎛ 메시의 셀 스트레이너를 사용하여 소 혈청으로부터의 0.1 ％ 알부민 (BSA, SIGMA) 이 함유된 한크스 완충액 (HBSS, GIBCO) 을 조금씩 첨가하면서 여과했다. 플로우 스루를 70 ㎛ 메시의 셀 스트레이너를 사용하여 여과하고, 마지막에 플로우 스루를 40 ㎛ 메시의 셀 스트레이너를 사용하여 여과했다. 40 ㎛ 메시의 셀 스트레이너에 남은 세포 덩어리를 0.1 ％ BSA 가 함유된 한크스 완충액을 사용하여 회수했다. 또한, 회수한 것을 100 ㎛ 메시의 셀 스트레이너로 여과했다.
2. 마우스 사구체의 선별법
1 에서 단리한 마우스 사구체를 실체 현미경하에서 관찰하면, 구상의 마우스 사구체 (직경 ： 50 ∼ 100 ㎛) 를 확인할 수 있다. 이것을 피펫만으로 사구체용 배지에 회수했다.
3. 마우스 사구체의 초대 배양법
RPMI1640 (Wako) 중에, 20 ％ 소 태아 혈청 (BWT Lot. S-1560), 100 ㎍/㎖ 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco), 인슐린-트랜스페린-셀레늄X (Insulin-Transferrin-SeleniumX) (GIBCO) 를 첨가한 것을 사용하여 37 ℃, 5 ％ CO2 의 인큐베이터 내에서 배양했다.
4. 세포 배양
정상 인간 제대 정맥 내피 세포 (Normal Human umbilical vein endothelial cell ： HUVEC) (Lonza CC-2517) 는, HUVEC 배양용으로 조제된 전용의 배지 (EGM (등록상표) BulletKit (등록상표)) (Lonza CC-4133) 를 사용하여, 보증 계대 횟수 (5 회) 이내의 계대 횟수로 배양했다. 인간 간엽계 간세포 (human Mesenchymal Stem Cell ： hMSC) (Lonza PT-2501) 는, hMSC 배양에 조제된 전용의 배지 (MSCGMTM BulletKit (등록상표)) (Lonza PT-3001) 를 사용하여, 보증 계대수 (5 회) 이내의 계대 횟수로 배양했다. 각각의 세포는 37 ℃, 5 ％ CO2 의 인큐베이터 내에서 배양했다.
5. 혈관계를 갖는 3 차원 조직의 제작
시간 경과적 관찰용으로서, 사구체용 배지를 충전해 둔 PrimeSurface (등록상표) 96 웰 U 플레이트 (스미토모 베이크라이트) 의 1 웰에 마우스 사구체 1, 5, 10 개를 정치하고, 그곳에 HUVEC 를 5 × 104 개 세포, hMSC 를 5 × 103 개 세포의 세포수로 파종했다. 그 후, 37 ℃ 의 인큐베이터에서 1 일간 배양했다. 또, 24 웰 플레이트의 1 웰에 마우스 사구체 100 개를 정치하고, 그곳에 HUVEC 를 2 × 106 개 세포, hMSC 를 2 × 105 개 세포의 세포수로 파종했다.
6. 실체 현미경을 사용한 시간 경과적 관찰
실체 현미경으로의 시간 경과적 변화를 추적하기 위해서 공배양을 실시했다. 24 웰 플레이트의 1 웰에 마우스 사구체 20 개를 정치하고, 그곳에 HUVEC 를 2 × 106 개 세포, hMSC 를 2 × 105 개 세포의 세포수로 파종했다. 파종 후, 실체 현미경 (LeicaDFC300FX) 에 플레이트를 설치하여, 세포 공배양에 의한, 형태 변화를 관찰했다.
7. 실험 동물
이식 동물로서 사용한 NOD/SCID 마우스 (Sankyo Labo Service Co., Tokyo, Japan) 는, SPF 환경하에서 주간 10 시간·야간 14 시간의 명암 주기로 사육했다. 실험 동물의 사육은 요코하마 시립 대학 의학부 동물 실험 센터에 위탁하고, 또 본학이 정하는 윤리 규정을 준수하여 실험을 실시했다.
8. CW 마우스에의 이식
제작한 CW 마우스의, 두부 관찰창의 글라스를 제거함으로써, 뇌 표면을 노출시켜 이식을 실시했다. 사용하는 CW 마우스는, 뇌 표면의 출혈, 염증이나 감염 등이 보이지 않는 마우스를 사용했다. 마취 후, 두부 관찰창 주변을, 70 ％ 에탄올로 소독하고, 특주 원형 슬라이드 글라스와 아론 알파의 경계선으로부터, 18G 의 바늘끝을 침입시켜, 뇌 표면을 손상시키지 않고 특주 원형 슬라이드 글라스를 박리하여, 뇌 표면을 노출시켰다. 그 후, 생리 식염수로 세정을 실시하고, 뇌 표면의 중심 부근에 이식 조직을 정치하여, 특주 원형 슬라이드 글라스를 올려놓았다. 이 때, 간극이 남지 않도록, 글라스와 뇌 표면의 사이를, 생리 식염수로 채운 후에, 제작 시와 마찬가지로, 코트레 플라스틱 파우더와 아론 알파에 의한 접착제로 봉입을 실시했다.
9. 공초점 현미경에 의한 CW 이식 마우스에 이식한 조직의 추미 정점 관찰
8 에서, CW 에 이식한 3 차원 조직의 관찰을 실시했다.
이식한 CW 마우스에, 11 에서 사용한 것과 마찬가지로, 케타라르·자일라진 혼합 마취로 마취를 실시하고, CW 마우스를 25 × 60 mm 마이크로 커버 글라스 (MATSUNAMI) 의 위에, 두부 관찰창과 수평이 되도록 앙와위 고정하고, 공초점 현미경 (LEICA TCS-SP5) 을 사용하여 이식한 혈관망을 가진 3 차원 조직의 형태 변화를 관찰했다.
〔결과〕
1. 마우스 사구체, 혈관 내피 세포, 간엽계 간세포의 공배양에 의한 혈관화 3 차원 조직의 창출
방법 6 과 같이 배양을 실시했다. 배양 개시 직후 상태에서는, 사구체 주변에 세포가 산재하고 있고, 육안 확인 가능한 3 차원 조직은 확인할 수 없었다. 그러나, 배양 개시 4 시간 후에는, 세포끼리의 상호 작용이 개시되어, 산재하고 있던 세포가 밀집을 개시하여, 배양이 진행된 8 시간 후에는, 세포가 사구체를 덮도록 응집하여, 서서히 3 차원적인 구조를 구축해 갔다. 그리고, 배양 24 시간 후에는, 자율적인 조직화가 더욱 진행되어, 혈관화된 3 차원 조직을 구축했다 (도 4A, 4B). 한편, 공배양을 실시하지 않고 사구체만을 배양했을 때에는, 혈관화는 물론, 3 차원 조직의 형성도 확인되지 않았다 (도 4C).
또, 방법 5 와 같이 배양을 실시함으로써, 저면에 세포·조직이 모이는 배양기재 중에서 혈관화된 3 차원 조직의 소형화를 도모했다 (도 4C). 마우스 사구체 5, 10, 15 개를 각각 HUVEC, MSC 와 공배양을 실시한 결과, 배양 개시 24 시간 후에는 3 차원 조직을 구축했다. 세포의 형태 변화를 추적하기 위해, 형광 표식한 마우스 사구체와, 각종 세포를 사용하여 공배양 실험을 실시했다 (도 4B, 4C, 4D). 마우스로부터 단리된 사구체 (녹), Kusabira Orange (KO) 를 도입한 HUVEC (도 4B, 4C, 4D, ： 적), MSC (도 4B, 4D, ： 청) 를 공배양하고, 공초점 현미경으로 세포 형태를 관찰한 결과, 배양 개시 직후에서는, HUVEC 는 치우침 없이 사구체 주변에 산재하고 있는 것이 확인되었다.
이상으로부터, 마우스 사구체, HUVEC, MSC 의 3 종류의 세포를 적절한 조건하에서 공배양함으로써, 혈관화된 3 차원 조직이 자율적으로 창출되는 것이 판명되었다.
2. 혈관화 사구체 이식에 의한 추미 정점 관찰
결과 1 에서 창출된 혈관화 사구체를, 마우스에 이식하고, 조직의 형태 변화를 추적했다 (도 4E). 8 의 방법을 사용하여, 두부 관찰창 (CW) 마우스에 이식을 실시하고, 9 의 방법을 사용하여 형태 변화를 추적했다.
혈관화 사구체를 이식한 마우스 두부에서는, 이식 후 3 일째에, 이식 지점 전체에 대해 혈액 관류가 실시되고 있었다 (도 4E). 또한, 공초점 현미경을 사용한 이식 후 10 일째에 있어서의 라이브 관찰의 결과로부터, 이식 후도 사구체 구조가 유지되고 있었을 뿐 아니라, 사구체 내부에 있어서의 마우스 혈관이 그 주위에 있어서 인간 혈관 (HUVEC) 과 직접 문합하여, 내부를 혈액이 교통하고 있는 것이 분명해졌다 (도 4F). 이들의 결과로부터, 혈관화 사구체를 이식함으로써, 이식 사구체 내부에 대한 조기 혈류 재개를 확인하여, 효율적으로 생착하는 것이 나타났다.
〔실시예 3〕종양 조직에 대한 혈관망의 부여
〔방법〕
1. 인간 췌장 종양 조직의 회수
비만성 랑게르한스섬 세포 증식증 환자로부터 절제된 인간 췌장 종양 조직을 클린 벤치 환경하에서 PBS 에 의한 세정을 실시하고, HBSS 배지를 넣은 6 cm 디쉬로 옮겨 1 mm 로 분할하여 세절 후, 이후의 실험에 사용했다.
2. 인간 췌장 종양 조직에 대한 혈관망 부여
1 mm 로 분할하여 절단한 인간 췌장 종양 조직을 피펫만으로 20 개 회수하고, EGFP-HUVEC 를 2 x 106, MSC 를 2 x 105 의 세포수로 혼합하여 950 rpm 으로 원심 후, 상청을 제거하여 EGM 배지 1 ㎖ 로 현탁하여 미리 마트리겔을 넣은 24 웰 플레이트에 파종하여 공초점 현미경에 의한 형태 변화의 추적을 실시했다.
3. 마우스 췌장암 조직의 회수
췌장암의 다단계 발암을 재현하는 것이 가능하게 되어 있는 췌장암 모델 마우스 (Pdx1-cre ； LSL-KrasG12D ； CDKN2A-/- ： NCI 로부터 구입) 로부터 췌장암 조직을 회수하고, PBS 에 의해 세정을 실시하여 클린 벤치 환경하에서 HBSS 배지를 넣은 6 cm 디쉬로 옮겼다. 회수한 암조직을 1 mm 로 분할하여 세절 후, 이후의 실험에 사용했다.
4. 마우스 췌장암 조직에 대한 혈관망 부여
1 mm 로 분할하여 세절한 췌장암 조직을 20 개 회수하고, EGFP-HUVEC 를 2 x 106 개 세포, MSC 를 2 x 105 개 세포의 세포수로 혼합하여 950 rpm 의 속도로 5 분간 원심을 실시했다. 원심 후 상청을 제거하여 EGM (등록상표) BulletKit (등록상표) (LonzaCC-4133) 배지를 1 ㎖ 첨가하여 미리 마트리겔을 넣은 24 웰 플레이트에 파종하고, 37 ℃ 의 인큐베이터에 넣어 매일 배지 교환을 실시하여, 4 일간 배양했다.
24 웰 플레이트는 EGM 배지와 BD MatrigelTM 기저막 매트릭스 (닛폰 BD 356234) 를 1 ： 1 로 혼합하여 제작한 용액 300 ㎕ 를 24 웰 플레이트의 1 웰에 첨가하여 10 분간, 37 ℃ 의 인큐베이터 내에 넣어 고정했다.
〔결과〕
1. 인간 췌장 종양 조직의 혈관화
공초점 현미경에 의한 관찰의 결과, 공배양에 의해 1 mm 로 분할하여 세절한 인간 췌장 조직 주변에 혈관망을 구축하면서, 24 - 48 시간 정도에서, 자율적으로 혈관화된 3 차원 조직을 창출하는 것을 확인했다 (도 5A).
2. 마우스 췌장암 조직의 혈관화
1 mm 로 분할하여 절단한 췌장암 조직을 HUVEC, MSC 와 24 웰 플레이트에 고상화된 마트리겔 상에서 공배양함으로써, 혈관화된 3 차원 조직을 창출하는 것에 성공했다 (도 5B, 상단). 대조 실험으로서, 1 mm 로 분할하여 췌장암 조직만을 고상화된 마트리겔 상에서 배양을 실시해도, 3 차원 조직의 형성이나 혈관화는 확인되지 않고, 특필할 변화는 볼 수 없었다 (도 5B, 하단).
4 일간 배양 후, 형성된 혈관화 3 차원 조직의 유전자 발현을 정량 PCR 에 의해 해석을 실시했다. 그 결과, 중요한 암 간세포 마커로서 알려지는 CD44 의 유전자 발현이 단독 배양군과 비교해서, 1.6 배 정도의 발현 레벨이 향상되는 것이 판명되었다 (도 5C).
이로써, 종래 시험관내에 있어서 유지하는 것이 곤란했던 암 간세포가 증폭되어 있는 것이 시사되었다. 종래의 평면 배양에서는, 생체 내에 투여했을 때의 반응성과 크게 상이한 환경이기 때문에, 항암제의 유효성을 사전에 평가하는 계로서의 이용은 곤란했다. 본법을 사용함으로써, 혈관계도 포함하여 생체 내에 있어서의 암조직에 있어서의 반응성을 양호하게 재현할 수 있는 것이 기대되고, 새로운 항암제를 개발할 때의 약제 스크리닝계로서의 이용이 많이 기대되는 배양 기술이다.
〔실시예 4〕간조직에 대한 혈관망의 부여
〔방법〕
1. 마우스 간조직의 분리법
디에틸에테르 (Wako) 를 사용하여 마취한 C57BL/6-Tg 마우스 (닛폰 SLC) 의 복부를 70 ％ 에탄올로 소독한 후, 개복하여, 경심강적 관류를 실시했다. 간장을 적출하여, 생리 식염수로 씻은 후, 가위로 간장을 민스했다. 민스한 간장을 100 ㎛ 메시의 셀 스트레이너를 사용하여 소 혈청으로부터의 0.1 ％ 알부민 (BSA, SIGMA) 이 함유된 한크스 완충액 (HBSS, GIBCO) 을 조금씩 첨가하면서 여과했다. 플로우 스루를 70 ㎛ 메시의 셀 스트레이너를 사용하여 여과했다. 70 ㎛ 메시의 셀 스트레이너에 남은 세포 덩어리를 0.1 ％ BSA 가 함유된 한크스 완충액을 사용하여 회수했다.
2. 마우스 간조직의 초대 배양법
DMEM/F12 (invitrogen) 중에, 10 ％ 소 태아 혈청 (ICN Lot. 7219F), 2 mmol/ℓ L-글루타민 (GIBCO), 100 ㎍/㎖ 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco), 10 mmol/ℓ 니코틴아미드 (SIGMA), 50 μmol/ℓ 2-머캅토에탄올, 1 x 10＾7 mol/ℓ 6.5 ％ 덱사메타손 (SIGMA), 2.6 x 10＾4 M L-아스코르브산 2-포스페이트 세스퀴마그네슘 염 수화물 (SIGMA), 5 mmol/ℓ HEPES (DOJINDO), 효모에서 발현된 1 ㎍/㎖ 인간 재조합체 인슐린 (Wako), Sf21 곤충 세포에서 발현된 50 ng/㎖ 인간 재조합체 HGF (SIGMA), 20 ng/㎖ 마우스 악하선 EGF (SIGMA) 를 첨가한 것을 사용하여 37 ℃, 5 ％ CO2 의 인큐베이터 내에서 배양했다.
3. 세포 배양
정상 인간 제대 정맥 내피 세포 (Normal Human umbilical vein endothelial cell ： HUVEC) (Lonza CC-2517) 는, HUVEC 배양용으로 조제된 전용의 배지 (EGM (등록상표) BulletKit (등록상표)) (Lonza CC-4133) 를 사용하여, 보증 계대 횟수 (5 회) 이내의 계대 횟수로 배양했다. 인간 간엽계 간세포 (human Mesenchymal Stem Cell ： hMSC) (Lonza PT-2501) 는, hMSC 배양에 조제된 전용의 배지 (MSCGMTM BulletKit (등록상표)) (Lonza PT-3001) 를 사용하여, 보증 계대수 (5 회) 이내의 계대 횟수로 배양했다. 각각의 세포는 37 ℃, 5 ％ CO2 의 인큐베이터 내에서 배양했다.
4. 혈관망을 갖는 3 차원 조직의 제작
시간 경과적 관찰용으로서, 간조직용 배지를 충전해 둔 PrimeSurface (등록상표) 96 웰 U 플레이트 (스미토모 베이크라이트) 의 1 웰에 마우스 간조직 2 개를 정치하고, 그곳에 HUVEC 를 5 × 104 개 세포, hMSC 를 5 × 103 개 세포의 세포수로 파종했다. 그 후, 37 ℃ 의 인큐베이터에서 1 일간 배양했다.
5. 실험 동물
이식 동물로서 사용한 NOD/SCID 마우스 (Sankyo Labo Service Co., Tokyo, Japan) 는, SPF 환경하에서 주간 10 시간·야간 14 시간의 명암 주기로 사육했다. 실험 동물의 사육은 요코하마 시립 대학 의학부 동물 실험 센터에 위탁하고, 또 본학이 정하는 윤리 규정을 준수하여 실험을 실시했다.
6. CW 마우스에의 이식
8 에서 제작한 CW 마우스의, 두부 관찰창의 글라스를 제거함으로써, 뇌 표면을 노출시켜 이식을 실시했다. 사용하는 CW 마우스는, 뇌 표면의 출혈, 염증이나 감염 등이 보이지 않는 마우스를 사용했다. 마취 후, 두부 관찰창 주변을, 70 ％ 에탄올로 소독하고, 특주 원형 슬라이드 글라스와 아론 알파의 경계선으로부터, 18G 의 바늘끝을 침입시켜, 뇌 표면을 손상시키지 않고 특주 원형 슬라이드 글라스를 박리하여, 뇌 표면을 노출시켰다. 그 후, 생리 식염수로 세정을 실시하고, 뇌 표면의 중심 부근에 이식 조직을 정치하여, 특주 원형 슬라이드 글라스를 올려놓았다. 이 때, 간극이 남지 않도록, 글라스와 뇌 표면의 사이를, 생리 식염수로 채운 후에, 제작 시와 마찬가지로, 코트레 플라스틱 파우더와 아론 알파에 의한 접착제로 봉입을 실시했다.
7. 공초점 현미경에 의한 CW 이식 마우스에 이식한 조직의 추미 정점 관찰
6 에서, CW 에 이식한 3 차원 조직의 관찰을 실시했다.
이식한 CW 마우스에, 11 에서 사용한 것과 마찬가지로, 케타라르·자일라진 혼합 마취로 마취를 실시하고, CW 마우스를 25 × 60 mm 마이크로 커버 글라스 (MATSUNAMI) 의 위에, 두부 관찰창과 수평이 되도록 앙와위 고정하고, 공초점 현미경 (LEICA TCS-SP5) 을 사용하여 이식한 혈관망을 가진 3 차원 조직의 형태 변화를 관찰했다.
〔결과〕
1. 마우스 간조직, 혈관 내피 세포, 간엽계 간세포의 공배양에 의한 3 차원 조직의 창출
방법 4 와 같이 배양을 실시했다. 배양 개시 직후의 상태에서는, 간조직 주변에 세포가 산재하고 있고, 육안 확인 가능한 3 차원 조직은 확인할 수 없었다. 그러나, 배양 개시 4 시간 후에는, 세포끼리의 상호 작용이 개시되어, 산재하고 있던 세포가 밀집을 개시하여, 배양이 진행된 8 시간 후에는, 세포가 간조직을 덮도록 응집하여, 서서히 3 차원적인 구조를 구축해 갔다. 그리고, 배양 24 시간 후에는, 자율적인 조직화가 더욱 진행되어, 혈관화된 3 차원 조직을 구축했다 (도 6A, 6B). 한편, 공배양을 실시하지 않고 간조직만을 배양했을 때에는, 혈관화는 물론, 3 차원 조직의 형성도 확인되지 않았다 (도 6B).
또, 방법 4 와 같이 배양을 실시함으로써, 저면에 세포·조직이 모이는 배양 기재 중에서 혈관화된 3 차원 조직의 소형화를 도모했다 (도 6A). 마우스 간조직을 각각 HUVEC, MSC 와 공배양을 실시한 결과, 배양 개시 24 시간 후에는 3 차원 조직을 구축했다. 세포의 형태 변화를 추적하기 위해, 형광 표식한 마우스 간조직과, 각종 세포를 사용하여 공배양 실험을 실시했다 (도 6A). 마우스로부터 단리된 간조직 (도 6A, ： 적, 6B, 6D ： 녹), 녹색 형광 단백질 (GFP) 을 도입한 HUVEC (도 6B), MSC 를 공배양하여, 공초점 현미경으로 세포 형태를 관찰한 결과, 배양 개시 직후에서는, HUVEC 는 치우침 없이 간조직 주변에 산재하고 있는 것이 확인되었다.
이상으로부터, 마우스 간조직, HUVEC, MSC 의 3 종류의 세포를 적절한 조건하에서 공배양함으로써, 혈관화된 3 차원 조직이 자율적으로 창출되는 것이 판명되었다.
2. 혈관화 간조직 이식에 의한 추미 정점 관찰
결과 1 에서 창출된 혈관화 간조직을, 마우스에 이식하여, 조직의 형태 변화를 추적했다 (도 6C). 6 의 방법을 사용하여, 두부 관찰창 (CW) 마우스에 이식을 실시하고, 7 의 방법을 사용하여 형태 변화를 추적했다.
혈관화 간조직을 이식한 마우스 두부에서는, 이식 후 3 일째에, 이식 지점 전체에 대해 혈액 관류가 실시되어 있었다 (도 6C). 또, 공초점 현미경을 사용하여 관찰한 결과, 이식 간조직 내부로의 혈액 관류가 확인되었다 (도 6D).
이들의 결과로부터, 혈관화 간조직을 이식함으로써, 이식 간조직 내부에 대한 조기 혈류 재개를 유발한 것이 나타났다.
〔실시예 5〕장조직에 대한 혈관망의 부여
〔방법〕
1. 마우스 장조직의 단리법
디에틸에테르 (Wako) 를 사용하여 마취한 C57BL/6-Tg 마우스 (닛폰 SLC) 의 복부를 70 ％ 에탄올로 소독한 후, 개복하여, 소장구측 약 20 cm 를 잘라버렸다. 잘라버려진 소장 내강을 생리 식염수 50 ㎖ 로 세정 후, 세로 절개를 가하여 점막을 노출하고 약 5 cm 의 세편으로 했다. 이어서 2mM 에틸렌디아민테트라아세트산 (Ethylenediaminetetraaceticacid) (EDTA, 도진 화학 연구소) 와 0.5 mM 디티오트레이톨 (Dithiothreitol) (DTT, SIGMA CHEMICALCOMPANY) 을 함유하는 PBS 중에서, 37 ℃·20 분 처리했다. 그 상청을 100 ㎛ 메시의 셀 스트레이너를 통과시켜, PBS 로 3 회 세정했다. 마지막에 플로우 스루를 40 ㎛ 메시의 셀 스트레이너를 사용하여 여과했다. 40 ㎛ 메시의 셀 스트레이너에 남은 세포 덩어리를 0.1 ％ BSA 가 함유된 한크스 완충액을 사용하여 회수했다.
2. 마우스 장조직의 초대 배양법
RPMI1640 (Wako) 중에, 20 ％ 소 태아 혈청 (BWT Lot. S-1560), 100 ㎍/㎖ 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco), 인슐린-트랜스페린-셀레늄X (GIBCO) 를 첨가한 것을 사용하여 37 ℃, 5 ％ CO2 의 인큐베이터 내에서 배양했다.
3. 세포 배양
정상 인간 제대 정맥 내피 세포 (Normal Human umbilical vein endothelial cell ： HUVEC) (Lonza CC-2517) 는, HUVEC 배양용으로 조제된 전용의 배지 (EGM (등록상표) BulletKit (등록상표)) (Lonza CC-4133) 를 사용하여, 보증 계대 횟수 (5 회) 이내의 계대 횟수로 배양했다. 인간 간엽계 간세포 (human Mesenchymal Stem Cell ： hMSC) (Lonza PT-2501) 는, hMSC 배양에 조제된 전용의 배지 (MSCGMTM BulletKit (등록상표)) (Lonza PT-3001) 를 사용하여, 보증 계대수 (5 회) 이내의 계대 횟수로 배양했다. 각각의 세포는 37 ℃, 5 ％ CO2 의 인큐베이터 내에서 배양했다.
4. 혈관망을 갖는 3 차원 조직의 제작
시간 경과적 관찰용으로서, 장조직용 배지를 충전해 둔 PrimeSurface (등록상표) 96 웰 U 플레이트 (스미토모 베이크라이트) 의 1 웰에 마우스 장조직 20 개를 정치하고, 그곳에 HUVEC 를 5 × 104 개 세포, hMSC 를 5 × 103 개 세포의 세포수로 파종했다. 그 후, 37 ℃ 의 인큐베이터에서 1 일간 배양했다.
5. 실체 현미경을 사용한 세포 공배양의 시간 경과적 관찰
실체 현미경으로의 시간 경과적 변화를 추적하기 위해서 공배양을 실시했다. 24 웰 플레이트의 1 웰에 마우스 장조직을 정치하고, 그곳에 HUVEC 를 2 × 106 개 세포, hMSC 를 2 × 105 개 세포의 세포수로 파종했다. 파종 후, 실체 현미경 (LeicaDFC300FX) 에 플레이트를 설치하고, 세포 공배양에 의한, 형태 변화를 관찰했다.
6. 실험 동물
이식 동물로서 사용한 NOD/SCID 마우스 (Sankyo Labo Service Co., Tokyo, Japan) 는, SPF 환경하에서 주간 10 시간·야간 14 시간의 명암 주기로 사육했다. 실험 동물의 사육은 요코하마 시립 대학 의학부 동물 실험 센터에 위탁하고, 또 본학이 정하는 윤리 규정을 준수하여 실험을 실시했다.
7. CW 마우스에의 이식
제작한 CW 마우스의, 두부 관찰창의 글라스를 제거함으로써, 뇌 표면을 노출시켜 이식을 실시했다. 사용하는 CW 마우스는, 뇌 표면의 출혈, 염증이나 감염 등이 보이지 않는 마우스를 사용했다. 마취 후, 두부 관찰창 주변을, 70 ％ 에탄올로 소독하고, 특주 원형 슬라이드 글라스와 아론 알파의 경계선으로부터, 18G 의 바늘끝을 침입시켜, 뇌 표면을 손상시키지 않고 특주 원형 슬라이드 글라스를 박리하여, 뇌 표면을 노출시켰다. 그 후, 생리 식염수로 세정을 실시하여, 뇌 표면의 중심 부근에 이식 조직을 정치하고, 특주 원형 슬라이드 글라스를 올려놓았다. 이 때, 간극이 남지 않도록, 글라스와 뇌 표면의 사이를, 생리 식염수로 채운 후에, 제작 시와 마찬가지로, 코트레 플라스틱 파우더와 아론 알파에 의한 접착제로 봉입을 실시했다.
8. 공초점 현미경에 의한 CW 이식 마우스에 이식한 조직의 추미 정점 관찰
7 에서, CW 에 이식한 3 차원 조직의 관찰을 실시했다.
이식한 CW 마우스에, 11 에서 사용한 것과 마찬가지로, 케타라르·자일라진 혼합 마취로 마취를 실시하고, CW 마우스를 25 × 60 mm 마이크로 커버 글라스 (MATSUNAMI) 의 위에, 두부 관찰창과 수평이 되도록 앙와위 고정하고, 공초점 현미경 (LEICA TCS-SP5) 을 사용하여 이식한 혈관망을 가진 3 차원 조직의 형태 변화를 관찰했다.
〔결과〕
1. 마우스 장조직, 혈관 내피 세포, 간엽계 간세포의 공배양에 의한 3 차원 조직의 창출
방법 4 와 같이 배양을 실시했다. 배양 개시 직후의 상태에서는, 장조직 주변에 세포가 산재하고 있고, 육안 확인 가능한 3 차원 조직은 확인할 수 없었다. 그러나, 배양 개시 4 시간 후에는, 세포끼리의 상호 작용이 개시되어, 산재하고 있던 세포가 밀집을 개시하여, 배양이 진행된 8 시간 후에는, 세포가 장조직을 덮도록 응집하여, 서서히 3 차원적인 구조를 구축해 갔다. 그리고, 배양 24 시간 후에는, 자율적인 조직화가 더욱 진행되어, 혈관화된 3 차원 조직을 구축했다 (도 7A, 7B). 한편, 공배양을 실시하지 않고 장조직만을 배양했을 때에는, 혈관화는 물론, 3 차원 조직의 형성도 확인되지 않았다 (도 7B).
또, 방법 4 와 같이 배양을 실시함으로써, 저면에 세포·조직이 모이는 배양기재 중에서 혈관화된 3 차원 조직의 소형화를 도모했다 (도 7B). 마우스 장조직을 각각 HUVEC, MSC 와 공배양을 실시한 결과, 배양 개시 24 시간 후에는 3 차원 조직을 구축했다. 세포의 형태 변화를 추적하기 위해, 형광 표식한 마우스 장조직과, 각종 세포를 사용하여 공배양 실험을 실시했다 (도 7B). 마우스로부터 단리된 장조직 (도 7B ： 적), 녹색 형광 단백질 (GFP) 을 도입한 HUVEC (도 7B), MSC 를 공배양하여, 공초점 현미경으로 세포 형태를 관찰한 결과, 배양 개시 직후에서는, HUVEC 는 치우침 없이 장조직 주변에 산재하고 있는 것이 확인되었다.
이상으로부터, 마우스 장조직, HUVEC, MSC 의 3 종류의 세포를 적절한 조건하에서 공배양함으로써, 혈관화된 3 차원 조직이 자율적으로 창출되는 것이 판명되었다.
2. 혈관화 장조직 이식에 의한 추미 정점 관찰
결과 1 에서 창출된 혈관화 장조직을, 마우스에 이식하여, 조직의 형태 변화를 추적했다 (도 7C). 6 의 방법을 사용하여, 두부 관찰창 (CW) 마우스에 이식을 실시하고, 7 의 방법을 사용하여 형태 변화를 추적했다.
혈관화 장조직을 이식한 마우스 두부에서는, 이식 후 3 일째에, 이식 지점 전체에 대해 혈액 관류가 실시되어 있었다 (도 7C). 또, 공초점 현미경을 사용하여 관찰한 결과, 이식 후 3 일째에 있어서, 이식 장조직 내부로의 혈액 관류가 확인되었다 (도 7D).
이들의 결과로부터, 혈관화 장조직을 이식함으로써, 이식 장조직 내부에 대한 조기 혈류 재개를 유발한 것이 나타났다.
〔실시예 6〕폐조직에 대한 혈관망의 부여
〔방법〕
1. 마우스 폐조직의 분리법
디에틸에테르 (Wako) 를 사용하여 마취한 C57BL/6-Tg 마우스 (닛폰 SLC) 의 복부를 70 ％ 에탄올로 소독한 후, 개복하여, 폐를 적출했다. 생리 식염수로 씻은 후, 가위로 폐를 민스했다. 민스한 폐를 100 ㎛ 메시의 셀 스트레이너를 사용하여 소 혈청으로부터의 0.1 ％ 알부민 (BSA, SIGMA) 이 함유된 한크스 완충액 (HBSS, GIBCO) 을 조금씩 첨가하면서 여과했다. 플로우 스루를 40 ㎛ 메시의 셀 스트레이너를 사용하여 여과했다. 40 ㎛ 메시의 셀 스트레이너에 남은 세포 덩어리를 0.1 ％ BSA 가 함유된 한크스 완충액을 사용하여 회수했다.
2. 세포 배양
정상 인간 제대 정맥 내피 세포 (Normal Human umbilical vein endothelial cell ： HUVEC) (Lonza CC-2517) 는, HUVEC 배양용으로 조제된 전용의 배지 (EGM (등록상표) BulletKit (등록상표)) (Lonza CC-4133) 를 사용하여, 보증 계대 횟수 (5 회) 이내의 계대 횟수로 배양했다. 인간 간엽계 간세포 (human Mesenchymal Stem Cell ： hMSC) (Lonza PT-2501) 는, hMSC 배양에 조제된 전용의 배지 (MSCGMTM BulletKit (등록상표)) (Lonza PT-3001) 를 사용하여, 보증 계대수 (5 회) 이내의 계대 횟수로 배양했다. 각각의 세포는 37 ℃, 5 ％ CO2 의 인큐베이터 내에서 배양했다.
3. 혈관망을 갖는 3 차원 조직의 제작
시간 경과적 관찰용으로서, 폐조직용 배지를 충전해 둔 PrimeSurface (등록상표) 96 웰 U 플레이트 (스미토모 베이크라이트) 의 1 웰에 마우스 폐조직 20 개를 정치하고, 그곳에 HUVEC 를 5 × 104 개 세포, hMSC 를 5 × 103 개 세포의 세포수로 파종했다. 그 후, 37 ℃ 의 인큐베이터에서 1 일간 배양했다. 또, 24 웰 플레이트의 1 웰에 마우스 폐조직을 정치하고, 그곳에 HUVEC 를 2 × 106 개 세포, hMSC 를 2 × 105 개 세포의 세포수로 파종했다.
4. 실체 현미경을 사용한 세포 공배양의 시간 경과적 관찰
실체 현미경으로의 시간 경과적 변화를 추적하기 위해서 공배양을 실시했다. 24 웰 플레이트의 1 웰에 마우스 폐조직 20 개를 정치하고, 그곳에 HUVEC 를 2 × 106 개 세포, hMSC 를 2 × 105 개 세포의 세포수로 파종했다. 파종 후, 실체 현미경 (LeicaDFC300FX) 에 플레이트를 설치하고, 세포 공배양에 의한, 형태 변화를 관찰했다.
5. 실험 동물
이식 동물로서 사용한 NOD/SCID 마우스 (Sankyo Labo Service Co., Tokyo, Japan) 는, SPF 환경하에서 주간 10 시간·야간 14 시간의 명암 주기로 사육했다. 실험 동물의 사육은 요코하마 시립 대학 의학부 동물 실험 센터에 위탁하고, 또 본학이 정하는 윤리 규정을 준수하여 실험을 실시했다.
6. CW 마우스에의 이식
8 에서 제작한 CW 마우스의, 두부 관찰창의 글라스를 제거함으로써, 뇌 표면을 노출시켜 이식을 실시했다. 사용하는 CW 마우스는, 뇌 표면의 출혈, 염증이나 감염 등이 보이지 않는 마우스를 사용했다. 마취 후, 두부 관찰창 주변을, 70 ％ 에탄올로 소독하고, 특주 원형 슬라이드 글라스와 아론 알파의 경계선으로부터, 18G 의 바늘끝을 침입시켜, 뇌 표면을 손상시키지 않고 특주 원형 슬라이드 글라스를 박리하여, 뇌 표면을 노출시켰다. 그 후, 생리 식염수로 세정을 실시하고, 뇌 표면의 중심 부근에 이식 조직을 정치하여, 특주 원형 슬라이드 글라스를 올려놓았다. 이 때, 간극이 남지 않도록, 글라스와 뇌 표면의 사이를, 생리 식염수로 채운 후에, 제작 시와 마찬가지로, 코트레 플라스틱 파우더와 아론 알파에 의한 접착제로 봉입을 실시했다.
7. 공초점 현미경에 의한 CW 이식 마우스에 이식한 조직의 추미 정점 관찰
6 에서, CW 에 이식한 3 차원 조직의 관찰을 실시했다.
이식한 CW 마우스에, 11 에서 사용한 것과 마찬가지로, 케타라르·자일라진 혼합 마취로 마취를 실시하고, CW 마우스를 25 × 60 mm 마이크로 커버 글라스 (MATSUNAMI) 의 위에, 두부 관찰창과 수평이 되도록 앙와위 고정하고, 공초점 현미경 (LEICA TCS-SP5) 을 사용하여 이식한 혈관망을 가진 3 차원 조직의 형태 변화를 관찰했다.
〔결과〕
1. 마우스 폐조직, 혈관 내피 세포, 간엽계 간세포의 공배양에 의한 3 차원 조직의 창출
방법 6 과 같이 배양을 실시했다. 배양 개시 직후의 상태에서는, 폐조직 주변에 세포가 산재하고 있고, 육안 확인 가능한 3 차원 조직은 확인할 수 없었다. 그러나, 배양 개시 4 시간 후에는, 세포끼리의 상호 작용이 개시되어, 산재하고 있던 세포가 밀집을 개시하여, 배양이 진행된 8 시간 후에는, 세포가 폐조직을 덮도록 응집하여, 서서히 3 차원적인 구조를 구축해 갔다. 그리고, 배양 24 시간 후에는, 자율적인 조직화가 더욱 진행되어, 혈관화된 3 차원 조직을 구축했다 (도 8A). 한편, 공배양을 실시하지 않고 폐조직만을 배양했을 때에는, 혈관화는 물론, 3 차원 조직의 형성도 확인되지 않았다 (도 8A).
또, 방법 4 와 같이 배양을 실시함으로써, 저면에 세포·조직이 모이는 배양 기재 중에서 혈관화된 3 차원 조직의 소형화를 도모했다 (도 2). 마우스 폐조직, HUVEC, MSC 와 공배양을 실시한 결과, 배양 개시 24 시간 후에는 3 차원 조직을 구축했다. 세포의 형태 변화를 추적하기 위해, 형광 표식한 마우스 폐조직과, 각종 세포를 사용하여 공배양 실험을 실시했다 (도 8A). 마우스로부터 단리된 폐조직 (도 8A ： 적), 녹색 형광 단백질 (GFP) 을 도입한 HUVEC (도 8A ： 녹), MSC 공배양하여, 공초점 현미경으로 세포 형태를 관찰한 결과, 배양 개시 직후에서는, HUVEC 는 치우침 없이 폐조직 주변에 산재하고 있는 것이 확인되었다.
이상으로부터, 마우스 폐조직, HUVEC, MSC 의 3 종류의 세포를 적절한 조건하에서 공배양함으로써, 혈관화된 3 차원 조직이 자율적으로 창출되는 것이 판명되었다.
2. 혈관화 폐조직 이식에 의한 추미 정점 관찰
결과 1 에서 창출된 혈관화 폐조직을, 마우스에 이식하여, 조직의 형태 변화를 추적했다 (도 8B). 16 의 방법을 사용하여, 두부 관찰창 (CW) 마우스에 이식을 실시하고, 7 의 방법을 사용하여 형태 변화를 추적했다.
혈관화 폐조직을 이식한 마우스 두부에서는, 이식 후 3 일째에, 이식 지점 전체에 대해 혈액 관류가 실시되어 있었다 (도 8B). 또, 공초점 현미경을 사용하여 관찰한 결과, 이식 후 7 일째에 있어서, 이식 폐조직 내부로의 혈액 관류가 확인되었다 (도 8C).
이들의 결과로부터, 혈관화 폐조직을 이식함으로써, 이식 폐조직 내부에 대한 조기 혈류 재개를 유발한 것이 나타났다.
〔실시예 7〕iPS 세포 유래 내배엽 조직에 대한 혈관망의 부여
〔방법과 결과〕
1. iPS 의 분화 유도
미분화 상태를 유지한 채로 증식한 iPS 세포 (토쿄 대학, 나카우치 박사로부터 공여. TkDA3 클론. 피부 선유아 세포로부터 수립.) 를 세정 배지 (DMEM/F12 라이프 테크놀로지스 11320) 로 1 번 세정하고, 100 mm 디쉬 1 매에 대해 1 ㎖ 의 배양 세포 분리액 (후나코시 AT104) 을 첨가하고, 세포를 50 ㎖ 원심관에 회수하여, 900 rpm 5 분 원심 조작을 실시했다. 세포수를 카운트한 후, 마트리겔 코트를 실시한 60 mm 디쉬 1 매에 1.5 X 106 개 세포의 세포수로 파종했다. 마트리겔 코팅은, BD MatrigelTM 기저막 매트릭스 (닛폰 BD 356234) 를 DMEM (라이프 테크놀로지스 11965118) 으로 30 배로 희석하고, 60 mm 디쉬에 2 ㎖ 를 첨가하여 2 시간 실온에서 정치했다. 이 때의 배양액은 iPS 배양 배지에 ROCK 저해제 Y-27632 (calbiochem 688000) 를 첨가한 배양액을 사용했다. 37 ℃ 의 인큐베이터에서 24 시간 배양하여, 세포를 접착시킨 후, 배양액을 분화 유도 배지로 교환했다. 분화 유도 배지는, RPMI-1640 (와코 준야쿠 189-02025) 에 B-27 (등록상표) Supplement Minus Insulin (라이프 테크놀로지스 0050129SA) 을 1/100 희석, 액티빈 A (Activin A) (아지노모토) 를 100 ng/㎕ 로 첨가한 것을 사용했다. 배지 교환을 2 일에 1 번 실시하면서, 6 일간 배양을 실시하고, 배체 내배엽 (Definitive Endoderm) 으로 분화 유도를 실시했다. 내배엽 계열로의 분화도는 정량 PCR 과 면역 염색에 의해 확인을 실시했다.
2. iPS 세포 유래 내배엽 조직의 제작
배체 내배엽으로 분화 유도를 실시한 인간 iPS 세포를 EZSPHERETM (아사히 글라스 4810-900 6 웰-편평 바닥) 의 1 웰에 1.0 X 106 개 세포의 세포수로 파종했다. 배양액은 간세포 전용 배지 키트 (HCMTM BulletKitTM Lonza CC3198) 와 EGM (등록상표) BulletKit (등록상표) (Lonza CC-4133) 를 1 ： 1 로 혼합한 것을 사용했다. 37 ℃ 의 인큐베이터에서 2 일에 1 번, 반량의 배지 교환을 실시하면서 8 일간 배양하고, 50 ∼ 500 ㎛ 의 직경을 갖는 입체적인 내배엽 조직을 제조했다.
3. 96 웰 U 플레이트를 사용한 인간 혈관 구조를 갖는 3 차원 조직의 제작
2 의 iPS 세포 유래 내배엽 조직용 배지를 충전해 둔 PrimeSurface (등록상표) 96 웰 U 플레이트 (스미토모 베이크라이트) 의 1 웰에 iPS 세포 유래 내배엽 조직 1 ∼ 20 개를 정치하고, 그곳에 HUVEC 를 1.0 × 104 개 세포, hMSC 를 1.0 × 103 개 세포의 세포수로 파종했다. 그 후, 37 ℃ 의 인큐베이터에서 4 일간 배양했다.
그 결과, 내배엽 조직은 인간 혈관 내피 세포, 간엽계 간세포와 공배양함으로써, 자율적으로 삼차원적인 조직을 유도하는 것이 분명해졌다 (도 9B). 유도된 조직 중에는, 인간 혈관 내피 세포가 관강형의 구조를 형성하고, 혈관화된 조직이 형성되는 것이 판명되었다 (도 9C). 이와 같은 삼차원 조직 형성은 iPS 세포 유래 내배엽 조직 단독 배양군에서는, 전혀 확인되지 않은 점에서, 본법을 사용하는 것이 혈관화 조직의 제작에 필수인 것이 나타났다 (도 9B).
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로서 본 명세서에 받아들이는 것으로 한다.
본 발명에 의해 혈관계가 부여된 생물학적 조직은, 인간 기능 세포의 창출, 장기 이식, 창약 스크리닝, 약제의 효과 발현과 혈관의 관련성 등을 평가하는 새로운 해석계 등에 대한 응용이 가능하다.

Claims (12)

  1. 시험관내 (in vitro) 에 있어서, 생물학적 조직에 혈관계를 부여하는 방법으로서, 생물학적 조직을 혈관 세포 및 미분화 간엽계 세포와 공배양하는 것을 포함하고, 겔 지지체 상 또는 저면에 세포가 모이는 형상의 플레이트 상에서 생물학적 조직과 혈관 세포 및 미분화 간엽계 세포를 공배양함으로써, 삼차원 조직을 형성하는, 상기 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    생물학적 조직을 혈관 세포 및 미분화 간엽계 세포와 공배양함으로써, 생물학적 조직에 혈관계가 부여되어, 생물학적 조직의 기능이 유지 및/또는 향상되는 방법.
  3. 제 1 항에 기재된 방법에 의해, 혈관계가 부여된 생물학적 조직.
  4. 제 3 항에 기재된 생물학적 조직을 비인간 동물에 이식하여, 혈관망이 구축된 조직 또는 장기로 분화시키는 것을 포함하는, 조직 또는 장기의 제작 방법.
  5. 제 3 항에 있어서, 생물학적 조직을 인간 또는 비인간 동물에 이식하여, 혈관망이 구축된 조직 또는 장기로 분화시키는 것을 포함하는 조직 또는 장기의 재생 또는 기능 회복 방법에 사용되는 생물학적 조직.
  6. 제 3 항에 기재된 생물학적 조직을 비인간 동물에 이식하여, 혈관망이 구축된 조직 또는 장기로 분화시키는 것을 포함하는, 비인간 키메라 동물의 제작 방법.
  7. 제 3 항에 기재된 생물학적 조직, 제 4 항에 기재된 방법으로 제작된 조직 및 장기, 그리고 제 6 항에 기재된 방법으로 제작된 비인간 키메라 동물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개를 사용하여, 약제를 평가하는 방법.
  8. 제 3 항에 기재된 생물학적 조직을 포함하는, 재생 의료용 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서,
    조직 또는 장기를 제작하기 위해서 사용되는 조성물.
  10. 제 8 항에 있어서,
    조직 또는 장기의 재생 또는 기능 회복을 실시하기 위해서 사용되는 조성물.
  11. 제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    생체에 이식한 후, 생물학적 조직이 혈관망을 갖는 조직 또는 장기로 분화되는 조성물.
  12. 삭제
KR1020167004061A 2013-07-23 2014-07-15 생물학적 조직에 혈관계를 부여하는 방법 KR102184473B1 (ko)

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Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2013153056 2013-07-23
JPJP-P-2013-153056 2013-07-23
PCT/JP2014/068808 WO2015012158A1 (ja) 2013-07-23 2014-07-15 生物学的組織に血管系を付与する方法

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