CN104894066B - 肝源性表达ng2的干细胞群作为种子细胞在体外3‑d培养重建人工肝脏中的应用及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了肝源性表达NG2的干细胞群(NG2⁺HSC)作为种子细胞在体外3‑D培养重建人工肝脏中的应用及方法，具体是将NG2⁺HSC注入全肝去细胞天然生物支架中，然后加入能使NG2⁺HSC重建为人工肝脏的培养基，模拟体内肝组织器官发育生成的微环境体外三维(3‑D)培养重建肝脏器官，本发明的培养方法简单，成本低，培养时间短，21天即能形成完成的肝脏器官样轮廓，并且培养获得的人工肝脏器官具有正常肝组织类似的肝小叶结构，同时肝脏功能性蛋白也随着培养时间的延长而增加，并且对硬化肝脏和急性肝衰竭具有修复和功能恢复作用，能作为肝移植供体使用，对临床治疗终末期肝病具有重要意义。

Description

肝源性表达NG2的干细胞群作为种子细胞在体外3-D培养重建 人工肝脏中的应用及方法

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及肝源性表达神经-胶质抗原2阳性细胞群(NG2⁺HSC)作为种子细胞通过条件培养基微环境在体外3-D培养诱导NG2⁺HSC重建肝脏器官中的应用，还涉及利用NG2⁺HSC重建肝脏器官的方法。

背景技术

终末期肝病(End-stage liver diseae,ESLD)包括肝硬化(Liver cirrhosis)和急性肝衰竭(Acute liver failure)死亡率高，严重危害人类健康。而当前唯一有效治疗手段是肝移植，但是肝移植又受到供体匮乏原因故难以广泛应用。因此，寻找有效的肝脏功能替代技术是解决这一问题的关键。目前借助体外等暂时辅助或替代肝脏等人工肝脏方法，例如生物型人工肝脏(Bioartificial liver,BAL)和物理型人工肝脏，虽然能够清除因肝衰竭产生或增加的各种有害物质，补充需肝脏合成或代谢的蛋白质等必须物质，改善患者水、电解质及酸碱平衡等内环境，但BAL只是暂时改善了晚期肝病患者症状，始终无法实现肝脏功能的全部替代。虽然近年发展的天然去细胞肝脏支架已取得进步，但由于缺乏有效的种子细胞以及诱导其生成功能性全肝器官的微环境，故使最大程度仿造原有肝脏器官以达到制成工程化的新器官的目的至今世界科学家们未能如愿以偿。

为此，急需提供一种生成功能性全肝的种子细胞，通过科学培养，能够生成工程化的新型肝脏样器官。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供生成功能性全肝的种子细胞即NG2⁺HSC，该细胞经培养后能够发育为类肝样组织，并具有肝脏结构和功能；本发明的目的之二在于提供利用NG2⁺HSC细胞群在体外重建人工肝脏的方法。

为实现上述发明目的，经研究，本发明提供如下技术方案：

1、肝源性表达神经胶质抗原2的干细胞群NG2⁺HSC作为种子细胞在体外3-D培养重建人工肝脏中的应用。

本发明所指的肝源性表达神经胶质抗原2的干细胞群是表达神经-胶质抗原2(Neuro-glia antigen2，NG2)的肝源性干细胞/祖先细胞(Hepatic stem/progenitorcells，HSC)(简称为NG2⁺HSC)，NG2⁺HSC可以来源于胚胎期未发育成熟的肝脏，也可以来源于成体肝脏，来源于成体肝脏的表达神经胶质抗原2的干细胞群制备方法见公开号为102899291A的中国专利，也可以使用现有技术中的其他方法分离，即只要肝源性的具有发育学特性和干细胞潜能的NG2阳性细胞群同样能够实现本发明目的。

2、肝源性表达神经胶质抗原2的干细胞群NG2⁺HSC作为种子细胞在体外3-D培养重建人工肝脏的方法，包括如下步骤：将NG2⁺HSC注入全肝去细胞生物支架(Wholedecellualrized liver scaffold，WDLS)中，然后加入能使NG2⁺HSC重建为人工肝脏的条件培养基，模拟肝组织器官发育的微环境体外3-D培养，诱导NG2⁺HSC生成(重建)人工肝脏。

本发明中的WDLS可以按照本领域现有的方法制备，优选的，所述WDLS按如下方法制备：

(1)取离体全肝供体，然后从腹主动脉灌注生理盐水洗出红细胞；

(2)从门静脉和肝动脉同时灌注无菌双蒸水开始去除细胞成分；

(3)从门静脉和肝动脉同时灌注SDS-Trypsin-EDTA混合液继续去除细胞成分；所述SDS-Trypsin-EDTA混合液中含SDS，胰酶和EDTA；

(3)从门静脉和肝动脉灌注无菌双蒸水洗出SDS-Trypsin-EDTA混合液；

(4)从门静脉和肝动脉灌注无菌1×PBS，恢复生理状态，制得全肝去细胞生物支架。

更优选的，按如下步骤制备全肝去细胞生物支架：

(1)取离体全肝供体，然后以速度为5mL/min体内腹主动脉灌注生理盐水0.5小时；

(2)以5mL/min速度从门静脉和肝动脉同时灌注无菌双蒸水2小时；

(3)以5mL/min速度从门静脉和肝动脉同时灌注SDS-Trypsin-EDTA混合液48小时，所述SDS-Trypsin-EDTA混合液中含质量分数为1％的SDS，质量分数为0.005％的胰酶和质量分数为0.002％的EDTA；

(4)以5mL/min速度从门静脉和肝动脉同时灌注无菌双蒸水6小时；

(5)以5mL/min速度从门静脉和肝动脉同时灌注无菌1×PBS 1.5小时，制得全肝去细胞生物支架。

本发明中，能使成体肝脏NG2⁺HSC通过体外3-D诱导培养重建为人工肝脏的条件培养基均可实现，优选的，所述能使成体肝脏NG2⁺HSC通过体外3-D诱导培养重建为人工肝脏的条件培养基包括CM1培养基，CM2培养基和CM3培养基；

所述CM1培养基(诱导内皮细胞分化和维持其生长)为含有内皮细胞生长因子(Endothelial cell growth supplements，ECGS)、细胞破碎并去除细胞碎片的哺乳动物发育期肝脏滤液和DMEM完全培养液的混合液，所述细胞破碎并去除细胞碎片的哺乳动物发育期肝脏滤液和DMEM完全培养液的体积比为1:4；

所述CM2培养基(诱导肝前体细胞分化和维持其生长)为含有肝细胞生长因子(Hepatic growth factor，HGF)、碱性成纤维生长因子(Fibroblast growth factor，bFGF)、牛胰岛素、人转铁蛋白、左旋甲状腺素、亚硒酸钠、腐胺、孕激素、细胞破碎并去除细胞碎片的哺乳动物发育期肝脏滤液和DMEM完全培养液的混合液，所述细胞破碎并去除细胞碎片的哺乳动物发育期肝脏滤液和DMEM完全培养液的体积比为1:4；

所述CM3培养基(诱导成熟肝细胞分化和维持其生长)为含有肝细胞生长因子、碱性成纤维生长因子(Pepnotech,cat.no.100-188)、抑瘤素(Oncostatin)M、地塞米松、细胞破碎并去除细胞碎片的哺乳动物发育期肝脏滤液和DMEM完全培养液的混合液，所述细胞破碎并去除细胞碎片的哺乳动物发育期肝脏滤液和DMEM完全培养液的体积比为1:4；

所述DMEM完全培养液包括如下组分：100U/mL青霉素-G，100μg/mL链霉素，5mM L-谷氨酰胺，1×非必须氨基酸(原液为100×)，1×丙酮酸钠(原液为100×)和25mM HEPES。

更优选的，所述CM1培养基中，内皮细胞生长因子的浓度为20ng/mL；

所述CM2培养基中，肝细胞生长因子的浓度为10ng/mL，碱性成纤维生长因子的浓度为5ng/mL，牛胰岛素的浓度为0.5mg/mL，人转铁蛋白的浓度为0.5mg/mL，左旋甲状腺素的浓度为40μg/mL，亚硒酸钠的浓度为34μg/mL，腐胺的浓度为0.5μg/mL，孕激素的浓度为6μg/mL；

所述CM3培养基中，肝细胞生长因子的浓度为100ng/ml，碱性成纤维生长因子的浓度为50ng/mL、抑瘤素M的浓度为20ng/mL、地塞米松的浓度为0.1μM。

使用本发明的条件培养基成本较低、经济适用，培养周期短，21天即能形成完整的肝脏器官样轮廓。

进一步，本发明CM1培养基，CM2培养基和CM3培养基中由于使用胚胎期哺乳动物肝脏滤液，为防止培养基中其他细胞的增殖，特别是胚胎干细胞或祖先细胞的繁殖，因此需要将细胞破碎破坏细胞的增殖特性，然后过滤去除细胞碎片制得细胞破碎并去除细胞碎片的哺乳动物发育期肝脏滤液，去除后检测OX43和OX44阳性造血干细胞、Thy-1阳性肝脏胚胎肝细胞，如果上述细胞呈阴性，表明滤液中不含有干细胞和祖先细胞，可以用于培养。根据哺乳类肝脏器官发育成熟的理论基础，本发明中胚胎期哺乳动物肝脏滤液由以下方法制备：取哺乳动物发育期肝样组织，匀浆，过滤，收集滤液，然后将滤液反复冻融至少3次，每次至少30mim，最后固液分离，收集液体，得细胞破碎并去除细胞碎片的哺乳动物发育期肝脏滤液；哺乳动物发育期肝样组织优选为7到15天哺乳动物胚胎期肝样组织，反复冻融的温度优选为在-80℃和39℃条件下反复冻融3次；固液分离优选为用0.45μm滤膜过滤。

进一步，本发明中利用使成体肝脏NG2⁺HSC体外3-D培养重建人工肝脏的培养基和体外模拟体内肝组织器官发育微环境，使成体肝脏NG2⁺HSC进行营养和气体交换，符合哺乳类动物发育的自然规律，并通过不同方向轻微运动培养，模拟胎儿(培养物)随着母体(胎盘)的运动(自动摇动装置)而运动，同时直接吸收周围的营养(CM1培养基，CM2培养基和CM3培养基)(母体胎盘中的羊水)，为了能够实现重复，工业化培养，将肝组织生成环境控制如下：将注入成体肝脏NG2⁺HSC的肝去细胞生物支架于CM1培养基中，在37℃、体积分数为5％CO₂条件下分阶段动态培养，第一阶段1～7天，使用CM1培养基培养，第二阶段8～14天，使用CM2培养基培养，第三阶段15～21天，使用CM3培养基培养，每三天换培养基一次；培养过程中白天水平旋转培养，转速为20～40rpm/min，晚上采用纵向旋转和水平旋转相结合的3-D旋转培养，转速小于20rpm/min。

为了使培养物近似人类的生物钟，优选的所述水平旋转培养为每天8:00am～22:00pm，速率40～42rpm/min；所述3-D旋转培养为每天22:00pmm～8:00am，速率小于20rpm/min。

进一步，所述NG2⁺HSC注入WDLS的方法为分别从门静脉和下腔静脉将NG2⁺HSC缓慢注入WDLS中，在电脑系统监控下分两步法进行，每次至少3～5×10⁵，间隔时间为30min。

本发明的有益效果在于：本发明提供了能够生成功能性全肝的种子细胞(NG2⁺HSC)，通过模拟肝组织器官发育成熟微环境条件，通过体外3-D培养，诱导NG2⁺HSC生成人工肝脏，该方法符合哺乳类动物发育的自然规律，即胎儿(培养物)随着母体的运动(自动摇动装置)而运动，同时直接吸收周围的营养(CM1培养基，CM2培养基和CM3培养基)(母体胎盘中的羊水)，具有成本较低、经济适用、操作简单、省时、大众化等优点，克服了现有技术中采用的生物反应器(Bioreactor,BR)的价格昂贵，体积庞大，系统复杂，容易污染等弊端。利用本发明的方法培养形成的肝脏样组织仅需3周时间，比近期报道采用BR方法体外诱导间充质干细胞(Meschymal stem cells,MSC)在去细胞肝脏生物支架形成的肝样组织(需要4周时间)节省1周时间。另外，本发明方法在WDLS中的NG2⁺HSC在第9天时就显示了完整的肝叶样轮廓，21天时形成了完整的肝脏器官样轮廓，且组织切片(H&E)染色显示具有肝脏器官样组织，例如具有与正常肝组织类似的肝小叶结构。除此之外，体外3-D培养形成的类肝样组织其功能性肝脏蛋白(白蛋白)随着培养时间的延长而增加。将体外3-D培养21天的人工肝类肝样器官采用异位辅助肝移植方法植入肝硬化小鼠体内后，我们发现对肝硬化小鼠具有明显的修复作用，表明本发明制得的人工肝脏具有肝脏的结构和功能，能够作为肝移植供体使用，对临床治疗终末期肝病具有重要临床价值。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1为成年小鼠全肝去细胞支架去细胞过程中各阶段照片(白光下)。(a为体内腹主动脉灌注0.9％生理盐水后离体；b为灌注去离子水2h、紧接SDS-Trypsin-EDTA混合液24h；c为灌注SDS-Trypsin-EDTA混合液48h，d为灌注去离子水6h、紧接PBS灌注1.5h最终获取的全肝去细胞支架(WDLS)；e为放大d显示的清晰去细胞后的管道网络系统。

图2为NG2⁺HSC在CM1条件培养基中分化为内皮细胞和管腔样结构，采用抗小鼠血管性血友病因子(von Willebrand factorv，vWf)单克隆抗体的免疫荧光方法，在CM1培养基中2-D培养24小时分化为内皮细胞(细箭头表示)和管腔样结构(宽箭头表示)。

图3为NG2⁺HSC在条件培养基中分化为成熟肝细胞的动态照片。NG2⁺HSC在条件培养基诱导下，1小时内即可分化为超过87％的功能性肝细胞的预实验((1)～(3)二维培养在CM1中，从0min、5min、10min；(4)～(6)二维培养在CM2中，从20min、30min、40min；(7)～(8)二维培养在CM3中，从50min到60min下照片(白光下)；(9)最后阶段培养的免疫荧光双染色。

图4为WDLS-NG2⁺HSC在三种条件培养基(CM1,CM2,CM3)中不同时间体外培养状况(箭头所示)。

图5为WDLS-NG2⁺HSC培养物在条件培养基微环境下生成人工肝脏和肝脏功能蛋白分析结果(A为第0天到第9天的培养状况，尤其第9天时形成了肝叶样轮廓(白光+荧光)，B为第0天和第21天时形成了全肝样轮廓，C为组织切片对21天的培养物进行H&E染色和培养物上清功能蛋白Western blot分析，C中b表示培养物具有与正常组织类似结构，C中a表示肝小叶形成(以箭头表示)，C中c表示培养物上清功能蛋白Western blot分析，显示随着培养时间的延长，培养物上清功能蛋白(Alb表示白蛋白)分泌增加)。

图6为异位辅助肝移植手术将体外生成的人工肝脏植入二乙基亚硝胺(Diethylnitrosamine，DEN)诱导的小鼠肝硬化模型后对硬化肝脏的修复和功能恢复作用。A异位辅助肝移植手术过程：a为暴露肾脏(圈内所示)，b为摘除肾脏后(圈内所示)，c为端-端吻合将WDLS-NG2⁺HSC与肾脏动-静脉相接，WDLS门静脉接受体肾动脉(宽箭头表示)，WDLS下腔静脉接肾静脉(细箭头表示)，d为受体血流进WDLS瞬间(圈内所示)，e为充血后5min(圈内所示)；B体内运作4周后通过Masson染色检测肝纤维化(阳性为蓝色)：(1)为新鲜肝组织组，(2)为DEN+PBS组，(3)为DEN+单独WDLS组，(4)为DEN+单独NG2⁺HSC治疗组，(5)为DEN+WDLS-NG2⁺HSC治疗组，(6)为对各组进行定量分析结果；C通过ELASA检测肝功能：a为尿素酶含量，b为Cyp450含量。

图7为原位辅助肝移植手术。A：将WDLS-NG2⁺HSC体外3-D培养21天的人工肝脏植入70％肝切除(左叶、中叶切除)的急性肝衰小鼠模型，受体血流进入人工肝脏瞬间情况(端-侧吻合)；B：WDLS-NG2⁺HSC体外3-D培养3天的培养物植入30-40％肝切除(左叶切除)的急性肝损伤小鼠模型体内(端-侧吻合)，2周后可见有血运的类肝叶样结构(圆圈中所示)。

图8为哺乳类动物肝脏发育成熟示意图；A为小鼠；B为人类。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

本发明的构思是在采用天然WDLS的基础上，以公开号为102899291A的中国专利从成年小鼠肝脏分离纯化表达神经-胶质抗原2的成体肝源性干细胞(以下简称NG2⁺HSC)作为种子细胞，通过模拟肝组织器官发育生成的微环境自制的三种条件培养基(分别为CM1，CM2，CM3，以下称为“培养微环境”)，在体外3-D培养，诱导NG2⁺HSC生成(重建)具有结构与功能人工肝脏器官，再通过原位和异位辅助肝移植将体外3-D培养生成的类肝脏样组织或器官植入ESLD动物模型，验证替换ESLD肝脏的可能性。

实施例1、成年小鼠天然全肝去细胞生物支架(WDLS)的获得

本实施例使用的主要材料和试剂如下：

灌注泵，超净台，输液针，0.9％生理盐水，1％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.005％胰酶，0.002％EDTA混合液(0.25％胰酶:0.02％EDTA＝1:1，Hyclone，cat.no.J110831)，去离子无菌双蒸水(ddH₂O)，1×PBS磷酸盐缓冲液(0.01M PBS，北京中杉金桥生物技术公司，cat.no.ZLI-9062)。

采用体外灌注获得WDLS，具体步骤如下：

(1)取小鼠离体肝脏，然后以5mL/min速度门静脉和肝动脉同时灌注0.9％生理盐水600mL以洗出红细胞，灌注时间约0.5小时；

(2)将肝脏以5mL/min速度门静脉和肝动脉同时灌注无菌双蒸水(ddH₂O)，以开始溶解细胞成分，并去除细胞成分，时间约2小时；

(3)以速度为5mL/min门静脉和肝动脉同时灌注SDS-Trypsin-EDTA混合液，灌注时间约48小时，以更大强度去除所有细胞成分，其中SDS-Trypsin-EDTA混合液为用ddH₂O配制的含质量成分为1％SDS，0.005％胰酶和0.002％EDTA；

(4)以5mL/min速度，用ddH₂O同时灌注门静脉和肝动脉6小时洗出SDS-Trypsin-EDTA混合液；

(5)采用无菌1×PBS，以5mL/min速度同时门静脉和肝动脉灌注1.5小时，使WDLS保持在生理状态，制得WDLS。本实施例的方法是根据学术界现有制备去细胞支架基础上改进得到，改进方法获得的WDLS具备完整肝脏宏观及微观管道网络结构及胞外基质(Extracellular matrix，ECM)成分(图1)。

实施例2、分离培养种子细胞(NG2⁺HSC)

目前并无能够重建具有结构与功能肝脏器官的理想的种子细胞。尽管学术界采用成体肝细胞和最看好的间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSC)，但是肝细胞的体外长期培养已被证明存活不佳和MSC缺乏大量分化为功能性肝细胞潜能，使这些细胞应用均受到限制。本发明选择NG2⁺HSC作为种子细胞，分离方法见公开号为102899291A的中国专利。经研究发现将NG2⁺HSC在条件培养基诱导下，不仅可快速(大约1h)分化为大量的功能性肝细胞(图3)，还可分化为内皮细胞(图2)和肝脏支持细胞例如星型细胞。结果证明了NG2⁺HSC具有较强的多向分化潜能，为体外3-D培养重建功能性人工肝脏奠定了理论基础。

实施例3、条件培养基(培养微环境)诱导NG2⁺HSC生成具有器官结构和功能性的人工肝脏

本实施例使用的试剂盒材料如下：24孔培养板(Therom,cat.no.142475)，摇床(40～240rmp/min)，37℃、5％CO₂培养箱，条件培养基(CM1,CM2,CM3)，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素(Cellgro，cat.no.30-001-CI)，5000U/mL青霉素，5000μg/mL链霉素，DMEM/F12(Gibco-BRL，cat.no.11330)，ECGS(Endothelial cell growth supplements)(Pepnotech,cat.no.100-20C)，HGF(R&D,cat.no.294-HG-005/CF)，bFGF(Pepnotech,cat.no.100-188)，牛胰岛素(Sigma，cat.no.I6634)，人转铁蛋白(Sigma，cat.no.T1147)，左旋甲状腺素(Sigma，cat.no.T6397)，亚硒酸钠(Sigma，cat.no.S9133)，腐胺(Sigma，cat.no.P5780)，孕激素(Sigma，cat.no.7556)，Oncostatin M，地塞米松，非必需氨基酸，L-谷氨酰胺。

建立“培养微环境”，即制备三种条件培养基(Conditioned mediums,CMs)，分别为CM1培养基，CM2培养基，CM3培养基，具体步骤如下：

1)去除胚胎期小鼠肝脏中的干细胞和祖先细胞：

a.解剖显微镜下分别取出7到15天胚胎期小鼠(E7-E15)肝样组织，每期五只胚胎小鼠，混匀后用匀浆器实施缓慢研磨，过滤，收集滤液；

b.将滤液在-80℃和39℃条件下反复冻融3次，每次各30mim，然后用0.45μm滤膜过滤，收集滤液；

c.用免疫荧光方法检测过滤液中OX43和OX44阳性造血干细胞、Thy-1阳性肝脏胚胎干细胞，若检测结果呈阴性，表明胚胎期小鼠肝脏中的干细胞和祖先细胞已去除；

2)采用蛋白试剂盒检测蛋白含量，控制总蛋白含量在50～-100mg/mL范围内；

3)配制CM1，CM2和CM3培养基

CM1培养基：向细胞破碎并去除细胞碎片的哺乳动物发育期肝脏滤液和DMEM完全培养液体积比为1:4的混合溶液中加入内皮细胞生长因子终浓度为20ng/mL；

CM2培养基：向细胞破碎并去除细胞碎片的哺乳动物发育期肝脏滤液和DMEM完全培养液体积比为1:4混合溶液中加入HGF、bFGF，牛胰岛素、人转铁蛋白、左旋甲状腺素、亚硒酸钠、腐胺、孕激素至HGF终浓度为10ng/mL，bFGF终浓度为5ng/mL，牛胰岛素终浓度为0.5mg/mL，人转铁蛋白终浓度为0.5mg/mL，左旋甲状腺素终浓度为40μg/mL，亚硒酸钠终浓度为34μg/mL，腐胺终浓度为0.5μg/mL，孕激素终浓度为6μg/mL；

CM3培养基：向细胞破碎并去除细胞碎片的哺乳动物发育期肝脏滤液和DMEM完全培养液体积比为1:4的混合溶液中加入HGF、bFGF，抑瘤素(Oncostatin)M、地塞米松、非必需氨基酸和L-谷氨酰胺至HGF终浓度为100ng/mL，bFGF终浓度为50ng/mL，Oncostatin M终浓度为20ng/mL，地塞米松终浓度为0.1μM，非必需氨基酸质量分数为1％和L-谷氨酰胺终浓度为5mM。

然后利用配制的CM1，CM2和CM3培养基体外3-D培养具有器官结构和功能性的人工肝脏，具体方法如下：

首先在计算机系统监控下，利用三步法分别从门静脉和下腔静脉将NG2⁺HSC分2-3次缓慢注入WDLS中，每次至少3～5×10⁵，间隔15-30min；然后将注入NG2⁺HSC的WDLS(以下称为WDLS-NG2⁺HSC)放入24孔培养板中(图4)，加入500μl CM1培养基，放入3-D培养装置内在37℃、CO₂培养箱中培养一周(第1～7天)，每天8:00am～22:00pm以40-42rpm/min在水平方向低速旋转培养16个小时，22:00pm～8:00am采用纵向旋转和水平旋转相结合的3-D旋转培养8小时，转速小于20rpm/min，每两天补加200μL CM1培养基；培养进入第二周后(第8天)，改换500μLCM2培养基，培养方式于条件与第一周相同(第8-14天)；培养进入第三周后(第15天)，改换500μL CM3培养基，培养方式与条件与第一周相同，剂量与方式与第一周相同，持续7天(8-14天)；培养进入第三周后(第15天)，改换500μL CM3培养基，剂量与方式与第一周相同(第15～21天)，培养21天后终止培养，获得具有器官结构和功能性的人工肝脏，然后于白光和荧光显微镜下观察组织学结构，并分析上清肝脏功能蛋白。结果显示，培养至第9天形成了肝叶样轮廓(图5中A)，培养至第21天形成了全肝样轮廓(图5中B)，对21天的培养物进行H&E染色和培养物上清功能蛋白分析，显示培养物具有与正常肝组织(图5中C(a))类似结构(图5中C(b))如有肝小叶中央静脉(the central vein,CV)形成(箭头所示)，随着培养时间的延长，培养物上清功能蛋白(Alb表示肝脏白蛋白)分泌增加(图5中C(c))，表明NG2⁺HSC在特定培养微环境中可形成具有器官结构和功能的人工肝脏，表现了很有临床应用潜力的种子细胞。

实施例4、人工肝脏体内肝损伤修复、替代的可行性

本实施例主要采用两种手术，即原位(图7中A)和异位辅助肝移植(图6中A)。本实施例使用的主要材料和试剂如下：1％戊巴比妥纳(0.05g/kg腹腔注射)，安尔碘消毒液，注射器(1ml,5ml,20ml)，0.9％生理盐水，PE管(外径：0.3mm,内径：0.2mm)，代针丝线(11/0，9/0,5/0)，核酸液(nuclear dye)，浆染液(pulp dye)，分色液(color liquid)，复染液(complex dye)，洗液(flushing liquid)。

将无菌麻醉小鼠，切除肾脏，然后将体外3-D培养获得的人工肝脏植入DEN-诱导的小鼠肝硬化模型的切除肾脏区域，通过门静脉动脉化方式和端-端吻合技巧将人工肝脏的门静脉与受体肾动脉连接，将人工肝脏的下腔静脉与受体肾静脉连接，连接成功通血后(图6中A(a-e))体内维持4周后检测受体肝功能。结果显示人工肝脏治疗组的肝纤维化程度(图6中B(5))明显轻于单纯NG2⁺HSC静脉注射治疗组(图6中B(4))(图6中B(4)-(6))，同时血清肝功检测也显示了类似结果(图6中C)，证明了利用本发明方法培养的人工肝脏对硬化肝脏具有功能恢复作用。

将WDLS-NG2⁺HSC体外3-D培养3天的培养物以端-侧吻合原位辅助肝移植方式植入30-40％肝切除急性肝衰小鼠模型，2周后发现植入体形成了类肝叶样组织(图7中B箭头所示)，其中一叶有较均匀的血运分布，存活较佳(图7中B圆圈中所示)，表明本发明方法无论在体外“培养微环境”还是体内损伤微环境均能诱导NG2⁺HSC生成(重建)人工肝脏，故具有作为临床肝移植供体使用的潜力。

最后说明两点：(1)我们研制的三种条件培养基(CM1、CM2、CM3)的制备是根据哺乳类动物肝脏发育成熟的理论基础(见图8)，花费了大量时间进行科学研究证明而获得的，相关文章即将发表；(2)以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1.肝源性表达神经胶质抗原2的干细胞群NG2⁺HSC作为种子细胞在体外3-D培养重建人工肝脏的方法，其特征在于，包括如下步骤：将NG2⁺HSC注入全肝去细胞生物支架中，然后加入能使NG2⁺HSC重建为人工肝脏的条件培养基，模拟肝组织器官发育的微环境体外3-D培养，诱导NG2⁺HSC生成人工肝脏；

所述微环境为在37℃、体积分数为5% CO₂条件下分阶段动态培养，第一阶段1～7天，使用CM1培养基培养，第二阶段8～14天，使用CM2培养基培养，第三阶段15～21天，使用CM3培养基培养，每三天换培养基一次；培养过程中白天水平旋转培养，转速为20~40 rpm/min，晚上采用纵向旋转和水平旋转相结合的3-D旋转培养，转速小于20 rpm/min；

所述CM1培养基为含有内皮细胞生长因子、细胞破碎并去除细胞碎片的哺乳动物发育期肝脏滤液和DMEM完全培养液的混合液，所述细胞破碎并去除细胞碎片的哺乳动物发育期肝脏滤液和DMEM完全培养液的体积比为1:4；

所述CM2培养基为含有肝细胞生长因子、碱性成纤维生长因子、牛胰岛素、人转铁蛋白、左旋甲状腺素、亚硒酸钠、腐胺、孕激素、细胞破碎并去除细胞碎片的哺乳动物发育期肝脏滤液和DMEM完全培养液的混合液，所述细胞破碎并去除细胞碎片的哺乳动物发育期肝脏滤液和DMEM完全培养液的体积比为1:4；

所述CM3培养基为含有肝细胞生长因子、碱性成纤维生长因子、抑瘤素M、地塞米松、细胞破碎并去除细胞碎片的哺乳动物发育期肝脏滤液和DMEM完全培养液的混合液，所述细胞破碎并去除细胞碎片的哺乳动物发育期肝脏滤液和DMEM完全培养液的体积比为1:4；

所述DMEM完全培养液包括如下组分：100U/mL 青霉素-G，100 µg/mL 链霉素，5 mM L-谷氨酰胺，1×非必须氨基酸，1×丙酮酸钠和25 mM HEPES。

2.根据权利要求1所述肝源性表达神经胶质抗原2的干细胞群NG2⁺HSC作为种子细胞在体外3-D培养重建人工肝脏的方法，其特征在于，所述全肝去细胞生物支架的制备方法如下：

（1）取离体全肝供体，然后从腹主动脉灌注生理盐水洗出红细胞；

（2）从门静脉和肝动脉同时灌注无菌双蒸水去除细胞成分；

（3）从门静脉和肝动脉同时灌注SDS-Trypsin-EDTA混合液继续去除细胞成分；所述SDS-Trypsin-EDTA混合液中含SDS，胰酶和EDTA；

（4）从门静脉和肝动脉灌注无菌双蒸水洗出SDS-Trypsin-EDTA混合液；

（5）从门静脉和肝动脉灌注无菌1×PBS，恢复生理状态，制得全肝去细胞生物支架。

3.根据权利要求2所述肝源性表达神经胶质抗原2的干细胞群NG2⁺HSC作为种子细胞在体外3-D培养重建人工肝脏的方法，其特征在于，所述全肝去细胞生物支架的制备方法如下：

（1）取离体全肝供体，然后以速度为5mL/min体内腹主动脉灌注生理盐水0.5小时；

（2）以5mL/min速度从门静脉和肝动脉同时灌注无菌双蒸水2小时；

（3）以5mL/min速度从门静脉和肝动脉同时灌注SDS-Trypsin-EDTA混合液48小时，所述SDS-Trypsin-EDTA混合液含质量分数为1%的SDS，质量分数为0.005%的胰酶和质量分数为0.002%的EDTA；

（4）以5mL/min速度从门静脉和肝动脉同时灌注无菌双蒸水6小时；

（5）以5mL/min速度从门静脉和肝动脉同时灌注无菌1×PBS 1.5小时，制得全肝去细胞生物支架。

4.根据权利要求1所述肝源性表达神经胶质抗原2的干细胞群NG2⁺HSC作为种子细胞在体外3-D培养重建人工肝脏的方法，其特征在于：

所述CM1培养基中，内皮细胞生长因子的浓度为20 ng/mL；

所述CM2培养基中，肝细胞生长因子的浓度为10 ng/mL，碱性成纤维生长因子的浓度为5 ng/mL，牛胰岛素的浓度为0.5 mg/mL，人转铁蛋白的浓度为0.5 mg/mL，左旋甲状腺素的浓度为40 μg/mL，亚硒酸钠的浓度为34 μg/mL，腐胺的浓度为0.5 μg/mL，孕激素的浓度为6μg/mL；

所述CM3培养基中，肝细胞生长因子的浓度为100ng/ml，碱性成纤维生长因子的浓度为50 ng/mL、抑瘤素M的浓度为20 ng/mL、地塞米松的浓度为0.1 μM。

5.根据权利要求1或4所述肝源性表达神经胶质抗原2的干细胞群NG2⁺HSC作为种子细胞在体外3-D培养重建人工肝脏的方法，其特征在于，所述细胞破碎并去除细胞碎片的哺乳动物发育期肝脏滤液由以下方法制备：取哺乳动物胚胎肝脏发育期肝样组织，匀浆，过滤，收集滤液，然后将滤液反复冻融至少3次，每次至少30 min，最后固液分离，收集液体，得细胞破碎并去除细胞碎片的哺乳动物发育期肝脏滤液。

6.根据权利要求1所述肝源性表达神经胶质抗原2的干细胞群NG2⁺HSC作为种子细胞在体外3-D培养重建人工肝脏的方法，其特征在于：所述水平旋转培养为每天8:00am~22:00pm；所述3-D旋转培养为每天22:00pmm~8:00am。

7.根据权利要求1所述肝源性表达神经胶质抗原2的干细胞群NG2⁺HSC作为种子细胞在体外3-D培养重建人工肝脏的方法，其特征在于：所述NG2⁺HSC注入全肝去细胞生物支架的方法为分别从门静脉和下腔静脉将NG2⁺HSC缓慢注入全肝去细胞生物支架中，在电脑系统监控下分两步法进行，每次至少3~5×10⁵，间隔时间为30 min。