CN104546915B

CN104546915B - 一种治疗骨性关节炎的组合物的制备方法

Info

Publication number: CN104546915B
Application number: CN201510084846.2A
Authority: CN
Inventors: 张怡; 芦慧颖; 刘艳青
Original assignee: Sunny Stem Cell Ltd By Share Ltd
Current assignee: Sunny Stem Cell Ltd By Share Ltd
Priority date: 2015-02-16
Filing date: 2015-02-16
Publication date: 2018-12-11
Anticipated expiration: 2035-02-16
Also published as: CN104546915A

Abstract

一种治疗骨性关节炎的组合物的制备方法，涉及一种组合物、其制备方法及其应用。本发明提供一种治疗骨性关节炎的组合物、其制备方法及其应用。该组合物的有效成分包括间充质干细胞和细胞因子，细胞因子由富含FGF2的血浆和富含VEGF的血浆。方法：一、富血小板血浆制备；二、富FGF2因子血浆制备；三、富VEGF因子血浆制备；四、将富FGF2因子血浆和富VEGF因子血浆混合，将混合后的血浆在25～60mmHg氧分压下平衡，加入间充质干细胞，即得到治疗骨性关节炎的组合物。在组合物制备过程中，采用了与人类关节内氧分压相似的供氧环境，促进了干细胞的适应能力，起到更好的骨性关节炎修复作用。用于制备治疗骨性关节炎药物。

Description

一种治疗骨性关节炎的组合物的制备方法

技术领域

本发明涉及一种组合物、其制备方法及其应用。

背景技术

骨性关节炎(Osteoarthritis，OA)是一种老年人常见、多发性、退行性疾病，其典型病理特征为关节软骨破坏、软骨下骨结构改变以及骨赘发生等。目前我国60岁以上老人中，就有55％的人患有骨性关节炎，患病率随年龄的增加逐年上升趋势。随着中国逐渐进入老龄化社会，以及中国人平均寿命的延长，现约有1.2亿人正在经受着骨性关节炎的折磨。由于局部血供不良以及自身骨髓干细胞病变，通常骨性关节炎患者的自身再生修复能力有限，如不靠治疗干预，无法实现关节的修复和功能的恢复。药物治疗和手术也只能一定程度缓解病情，不能起到再生修复的功能，大部分患者到晚期都不可避免的要手术行人工关节置换。近年来，以间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)为基础的再生医学(Regenerative Medicine)手段成为研究治疗骨性关节炎热点，其应用前景非常广阔。

MSCs是一类具有自我更新、增殖和多向分化潜能的干细胞，体外贴壁呈成纤维样细胞，可以分化为骨、软骨和脂肪细胞，可以分泌大量具有免疫调节、造血支持、促进血管生成、趋化组织损伤修复等生物活性的细胞因子和生长因子。因此MSCs是组织工程化骨和软骨构建中重要的种子细胞。然而试验研究表明，多数情况下，由于体内情况的改变，MSCs在体内的存活和分化能力有限，MSCs注射后一周在体内的存活率非常低(Toma et al.,2002,Circulation 105:93–98.Human mesenchymal stem cells differentiate to acardiomyocyte phenotype in the adult murine heart.Volker et al.,2010.NephronExp Nephrol2010；114:e107-e116.Poor Cell Survival Limits the Beneficial Impactof Mesenchymal Stem Cell Transplantation on Acute Kidney Injury.)，低的存活率可能有多种原因，但是缺乏血运、无血液中营养因子是其中主要的原因之一。如果植入的细胞没有达到预期的存活目的，则其未来的定植和分化就无从谈起。

文献中采用的提高间充质干细胞体内存活率的方法有体外调节细胞培养状态和基因工程化细胞两种。采用基因工程改造的细胞如转入抗凋亡基因Bcl-2，虽然可以使得细胞的生存率提高到原来的1.2倍，但是由于基因改造的风险和滞后性，无法自自体间充质细胞治疗中世纪采用。而体外细胞培养状态的调节是在细胞体外培养过程中，调节细胞生长环境，以期在细胞移植后可以有更强的存活能力，比如在培养大鼠MSCs时增加Stromal-derived factor 1alpha(SDF-1alpha)，在培养MSCs加入Lipopolysaccharides，采用无氧24-36小时培养MSCs等均可一定程度上提高骨髓MSCs的存活率。但所有这些方法都是细胞体在外条件下进行，而且输入的时候，细胞的悬浮液没有经过脱氧处理，当细胞注射入体内后，由于复杂的炎症、营养环境，会改变细胞的生理状态而无法完全实现体外获得的实验结果。

发明内容

本发明提供一种治疗骨性关节炎的组合物、其制备方法及其应用。

本发明治疗骨性关节炎的组合物的有效成分包括间充质干细胞和细胞因子，所述组合物中间充质干细胞的浓度为5×10⁵～5×10⁷个/mL，所述细胞因子由富含FGF2的血浆和富含VEGF的血浆按体积比1:3～10制成。

上述治疗骨性关节炎的组合物的制备方法，按以下步骤进行：

一、富血小板血浆制备：

将20～120mL外周血分装在50mL离心管中，于200～400g、4℃条件下离心10～30min，去掉下层红细胞，保留上层血小板血浆，混匀后，于500～1000g条件下二次离心10～30min，去掉部分上层血浆，将剩余血浆和下层血小板混合均匀，从而得到富集2～7倍的富血小板血浆；

二、富FGF2因子血浆制备：

在步骤一制备的富血小板血浆中无菌添加120～150IU/mL人凝血酶和12～15mg/mL CaCl₂，在20～37℃恒温培养箱中培养1～6小时，将上述培养物经800～1500g、4℃离心10～30min，其上清液即为FGF2浓度在40～80pg/mL的富FGF2因子血浆；

三、富VEGF因子血浆制备：

在步骤一制备的富血小板血浆中无菌添加10～30IU/mL人凝血酶和1～3mg/mLCaCl₂，在20～37℃恒温培养箱中培养中72～144小时，将上述培养物经800～1500g、4℃离心10～30min，其上清液即为VEGF浓度在150～350pg/mL的富VEGF因子血浆；

四、将富FGF2因子血浆和富VEGF因子血浆按体积比1:3～10的比例混合，将混合后的血浆在25～60mmHg氧分压下，37℃平衡4～8小时，然后向平衡后的混合血浆中加入间充质干细胞，混合血浆中间充质干细胞的浓度为5×10⁵～5×10⁷个/mL，即得到治疗骨性关节炎的组合物。

上述组合物用于治疗骨性关节炎。

上述治疗骨性关节炎的组合物在制备治疗骨性关节炎药物的应用。

本发明的有益效果：

1、本发明突出的特点就是间充质干细胞和细胞生长因子相结合，间充质干细胞在25-60mmHg氧分压环境培养，细胞因子也在相同的氧分压中平衡。本发明适用于哺乳动物治疗方法，如人，或者宠物马、狗、猫的骨性关节炎治疗，适合月运动损伤性关节炎，或者退行性关节炎治疗,关节可以是各种大、小关节。

2、细胞因子的获得方法简单和应用方便

本发明组合物中的细胞因子获取方法采用的是将血小板α颗粒激活后释放获得的富FGF2和VEGF细胞因子，比起采用人重组FGF2、人重组VEGF配制的方法成本低廉、制作工艺简单。此富细胞因子的血浆可以在干细胞培养的同时开始制备，在移植之前与干细胞进行混合处理，方便使用。

3、本组合物中的间充质干细胞可以快速适应关节环境并实现表面附着。本发明不仅将对间充质干细胞进行低氧驯化处理，而且也事先将富细胞因子血浆在低氧状态下预先平衡4-8小时，使得间充质干细胞在组合物中维持了其驯化后的状态，组合物移植后，其中的间充质干细胞更快地适应了骨性关节炎的缺氧的关节环境，并且加快了在缺氧环境中的贴壁速度。

4、本组合物可以促进间充质干细胞在骨性关节炎微环境中存活。本组合物应用后，达到提高了间充质干细胞在骨性关节炎环境中的生存时间。干细胞活性是其起作用的最基本要求，如果干细胞在关节腔内存活时间越长，其起到的对骨性关节炎的治疗作用越显著。

5、本组合物可以促进间充质干细胞在骨性关节炎微环境中集落形成数量，从而实现干细胞在炎症环境下可以顺利定植、成活、扩增，确保了骨性关节炎的修复。

6、本组合物中间充质干细胞可以顺利分化成软骨组织，有利于干细胞对骨性关节炎造成的软骨损伤的修复作用。

附图说明

图1为不同组别组合物中干细胞贴壁率；图2为第一组和第二组的细胞活率对比；图3为细胞培养过程中细胞形态图；图4为细胞培养第14天Alcian蓝染色结果；图5为第一组和第二组克隆形成能力对比图；图6为第一组和第二组集落对比图；图7为损伤对照组动物切片；图8为修复组动物切片。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式治疗骨性关节炎的组合物的有效成分包括间充质干细胞和细胞因子，所述组合物中间充质干细胞的浓度为5×10⁵～5×10⁷个/mL，所述细胞因子由富含FGF2的血浆和富含VEGF的血浆按体积比1:3～10制成。

所述间充质干细胞可以为骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞，脐带间充质干细胞、脐带血间充质干细胞，羊膜间充质干细胞，胎盘间充质干细胞，或宫内膜来源的间充质干细胞。

富细胞因子血浆可以调节关节炎性微环境、减少疼痛的同时，还提供了共移植的间充质干细胞的生存的营养，促进其在体内有效定植和生存，延长干细胞在体内的再生、微环境调节作用。在组合物制备过程中，采用了与人类关节内氧分压相似的供氧环境25-60mmHg，促进了干细胞的适应能力，从而起到更好的骨性关节炎的修复作用。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述富含FGF2的血浆中FGF2浓度为40～80pg/mL。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：所述富含VEGF的血浆中VEGF浓度为150～350pg/mL。其它与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：所述组合物中间充质干细胞的浓度为1×10⁷个/mL。其它与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：所述细胞因子由富含FGF2的血浆和富含VEGF的血浆按体积比1:5～8制成。其它与具体实施方式一至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式治疗骨性关节炎的组合物的制备方法，按以下步骤进行：

一、富血小板血浆制备：

二、富FGF2因子血浆制备：

三、富VEGF因子血浆制备：

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式六不同的是：步骤二中添加140～150IU/mL人凝血酶和14～15mg/mL CaCl₂，在37℃恒温培养箱中培养1～1.5小时。其它与具体实施方式六相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式六或七不同的是：步骤三中添加14～27IU/mL人凝血酶和1.4～2.7mg/mL CaCl₂，在37℃恒温培养箱中培养120～140小时。其它与具体实施方式六或七相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式六至八之一不同的是：步骤四中将混合后的血浆在40mmHg氧分压下，37℃平衡6小时。其它与具体实施方式六至八之一相同。

具体实施方式十：本实施方式治疗骨性关节炎的组合物在制备治疗骨性关节炎药物的应用。

实施例1：

本实施例治疗骨性关节炎的组合物的制备方法，按以下步骤进行：

一、富血小板血浆制备：

将80mL静脉血分装在50mL离心管中，于300g、4℃条件下离心30min，去掉下层红细胞，保留上层血小板血浆，混匀后，于800g条件下二次离心15min，然后去掉部分上层血浆，将剩余血浆和下层血小板混合均匀，从而得到富集5倍的富血小板血浆；

二、富FGF2因子血浆制备：

在步骤一制备的富血小板血浆中无菌添加140IU/mL人凝血酶和14mg/mL CaCl₂，在37℃恒温培养箱中培养1小时，以便激活血小板释放FGF2因子，将上述培养物经1000g、4℃离心20min，其上清液即为富FGF2因子血浆，FGF2含量采用人碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)定量检测试剂盒，利用酶联免疫(ELISA)技术进行检测，其FGF2浓度为65pg/mL；

三、富VEGF因子血浆制备：

在步骤一制备的富血小板血浆中无菌添加20IU/mL人凝血酶和2mg/mL CaCl₂，在30℃恒温培养箱中培养中105小时，以便激活血小板释放VEGF因子，将上述培养物经1000g、4℃离心20min，其上清液即为富VEGF因子血浆，VEGF含量的测定采用人血管内皮生长因子(VEGF)定量检测试剂盒，利用酶联免疫(ELISA)技术进行检测，其VEGF浓度为260pg/mL；

四、将富FGF2因子血浆和富VEGF因子血浆按体积比1:7的比例混合，将混合后的血浆在40mmHg氧分压下，37℃平衡5小时，然后向平衡后的混合血浆中加入间充质干细胞，混合血浆中间充质干细胞的浓度为5×10⁶个/mL，即得到治疗骨性关节炎的组合物。

所述间充质干细胞的培养、传代、扩增的环境为40mmHg氧分压的二氧化碳培养箱。

本实施例的组合物需要在制备之后1～4小时内使用。

步骤二和三中富血小板血浆激活前后细胞因子变化情况如表1所示。

表1富血小板血浆激活前后细胞因子变化情况

间充质干细胞制备如下：

1、干细胞分离、培养、扩增

取脐带、胎盘、宫内膜、脂肪或羊膜组织，将血管剥离后，通过75％酒精消毒处理，生理盐水清洗2次，置于洁净的离心管内，采用手术剪剪至0.5～2mm³的块，加入2～3倍体积的DMEM混匀，然后离心(4℃，1300rpm、6分钟)去掉上清液，反复清洗2～3次，并去掉上清液。将组织块直接接种到T75培养瓶中，加入无血清培养液后放在三气培养箱中37℃培养，控制氧气分压在20～60mmHg内培养；或者采用酶消化法，将组织块于0.05％～0.2％(重量/体积百分比)胰酶或胶原酶消化后，4℃、1300rpm离心6分钟，收集单细胞悬液接种到T75培养瓶中，加入无血清培养液后放25～60mmHg氧分压、5％CO₂培养条件下，37℃培养，每隔2～3天更换新鲜培养基，待到细胞长到70％～80％融合度后，用胰酶37℃进行消化3分钟，加入等量PBS或者生理盐水稀释消化后的细胞于50mL离心管中，离心5min，离心速度为1000～2000rpm，最佳在1200～1500rpm，弃上清液，将细胞重悬于新的培养基，按照1:3～6的传代比例，传代到新的培养瓶中，继续在25～60mmHg氧分压、37℃、无血清培养基中培养，干细胞生长周期为2～3周。干细胞融合度达到60％～80％后，将培养物在氧分压25～60mmHg、37℃条件下，0.025％胰酶消化2～3min，消化后回收单细胞悬液，以1000～2000rpm离心速度离心6分钟，弃上清，收集干细胞。

2、干细胞质量检测

采取形态观测法，确定的间充质干细胞为长梭形并成漩涡形生长，贴壁性能良好。

细胞数量和活性可以通过台盼蓝拒染法进行。

间充质干细胞的鉴定采用流式细胞仪方法，检测干细胞表面抗原表达，干细胞表面标志CD105≥95％，CD73≥95％,CD90≥95％，CD14≤2％，CD45≤2％，CD34≤2％，CD79a≤2％，HLA-DR≤2％。

鲎试剂法检测细胞中内毒素水平≤0.5EU/mL。

细胞样本中的污染情况，可以采用细菌培养法，检测样本中的厌氧菌、需氧菌、霉菌为阴性。

实验过程中的检测方式如下：

(1)组合物氧分压测定

细胞培养过程的氧分压控制由控制输入的CO₂和N₂浓度，达到控制三气培养箱氧分压在20-60mmHg。富细胞因子血浆和最后组合物中的氧分压测定是利用血气分析仪上的O₂气敏电极，并在隔绝空气的状态下对样本氧分压进行测定，样本放置时间应小于30分钟，以免暴露在空气中平衡。

(2)间充质干细胞贴壁情况检查

干细胞在注射到损伤区域短时间贴壁并定植是修复成功的关键，如果不能在短时间贴壁就会影响，本发明将不同处理组别的组合物放置在关节微环境中进行观察，通过不同时间，将悬浮细胞去除，剩余细胞采用结晶紫染色固定后，进行计数，统计贴壁率。

不同组别组合物中干细胞贴壁率如图1所示，图1中—●—表示组别1：间充质干细胞(150mmHg氧分压)+富细胞因子血浆(150mmHg氧分压)，—○—表示组别2：间充质干细胞(40mmHg氧分压)+富细胞因子血浆(40mmHg氧分压)，—▲—表示组别3：间充质干细胞(40mmHg氧分压)+富细胞因子血浆(150mmHg氧分压)。

本实验研究表明，间充质干细胞在关节微环境中的贴壁速度和贴壁率和细胞培养过程的氧分压和细胞微环境中的氧分压关系非常大，当间充质干细胞在低氧分压环境培养且在低氧处理的富细胞因子血浆环境中，其贴壁速度快，在1个小时内可以贴壁65.6％，而在3个小时后可以达到90％以上的平均贴壁率(组别2)，相比同样培养的细胞在高氧分压微环境的关节微环境中平均贴壁率1小时内仅为37.7％，3小时为79％(组别3)，相比在高氧分压条件下培养获得的间充质干细胞则3小时平均贴壁率为60.7％(组别1)。本发明的一大特点是不仅将对间充质干细胞进行低氧驯化处理，而且也事先将富细胞因子血浆在低氧状态下预先平衡4-8小时，使得间充质干细胞在组合物中维持了其驯化后的状态，组合物移植后，其中的间充质干细胞更快地适应了骨性关节炎的缺氧的关节环境，并且加快了在缺氧环境中的贴壁速度。

(3)细胞活率

干细胞活率的检测采用台盼蓝拒染法。

将间充质干细胞计数后分成2等份，分别如下处理后进行细胞活率测定：

第一组，干细胞悬于关节炎家兔关节液中，第二组，干细胞悬于经过FGF2调节液和VEGF调节液处理后的关节炎家兔的关节液中，两组细胞悬液在25度下每隔1小时取样进行活率检测，被台盼蓝染成蓝色的为死细胞，

细胞活率％＝(细胞总数-蓝色细胞数)/细胞总数*100％

第一组和第二组的细胞活率对比如图2，图2中—●—表示第一组，—▲—表示第二组。研究表明，在含有富FGF-2和VEGF血浆的关节液中间充质干细胞活率高且维持时间长，在180小时后，其细胞平均活性仍能达到82.7％(第二组)，在对照第一组中180小时后细胞平均活性则已经下降至65.7％。

(4)软骨分化检验

向关节炎家兔膝关节注射0.3mL浓度50pg/mL FGF2的富集血小板血浆、或者注射0.3mL浓度150pg/mL VEGF的富血小板血浆，3天后无菌抽取其关节液，分别配成含10％FGF2关节液的DMEM培养基或含10％VEGF关节液的DMEM培养基。将培养箱氧气含量调至30mmHg，首先将间充质干细胞在含FGF2的关节液的DMEM培养基中培养4天，然后在含VEGF的关节液的DMEM培养基中培养4天，将细胞用胰酶消化，以4×10⁴个/cm²的密度接种于24孔板的6个孔中，培养基换成成软骨分化培养基，每隔3天换一次新鲜的成软骨分化培养基，培养至14天后，Alcian蓝染色，细胞生长成球状并被染成蓝色，表明干细胞被诱导分化成为软骨细胞。图3记录了细胞培养过程中，第0天、7天和14天时间的细胞形态，图4为第14天Alcian蓝染色结果。

该实验是模拟关节炎家兔关节微环境的体外实验，目的是检测本组合物治疗关节炎后，在关节炎微环境下的间充质干细胞是否可以有效分化成软骨细胞，从而起到软骨修复的目的。本实验研究结果表明，在经过本组合物中细胞因子的调节，组合物中的间充质干细胞可以顺利分化成为软骨细胞，有利于干细胞对骨性关节炎造成的软骨损伤的修复作用。

(5)克隆形成能力测定

干细胞形成集落能力是鉴定间充质干细胞以及其扩增能力的方法，采用稀释法进行。将干细胞消化、离心、重悬、计数后分成两组进行克隆形成能力测定：

第一组取600个间充质干细胞悬于8mL含10％关节炎家兔关节液的DMEM培养基中，接种于9cm培养皿中，混匀，置于培养箱中培养14天，观察细胞克隆形成情况；

第二组取600个细胞悬于8mL含70pg/mL FGF2、120pg/mL VEGF血浆和10％关节炎家兔关节液的DMEM培养基中，接种于9cm培养皿中，混匀，置于培养箱中培养14天。

10个细胞团即认为是1个克隆。培养完成后，用龙胆紫染色，计细胞克隆数：

细胞克隆形成率＝克隆数/接种细胞数×100％。

第一组和第二组克隆形成能力对比如图5。两组集落对比图如图6。

本实验结果表明第二组的干细胞克隆形成率明显高于第一组干细胞，这说明添加富细胞因子的关节微环境更适合间充质干细胞的存活、定植、扩增，从而证明了本治疗关节软骨修复的组合物对关节软骨损伤的修复能力比普通没有富细胞因子辅助的干细胞治疗方法更加优越。本组合物可以促进间充质干细胞在骨性关节炎微环境中集落形成数量，从而实现干细胞在炎症环境下可以顺利定植、成活、扩增，确保了骨性关节炎的修复。

为了确定本发明的组合物的有效性，进行如下实验：

1、体重3kg家兔，用5％硫喷妥钠按25mg/kg剂量行兔耳缘静脉麻醉，维持时间约30min。实验兔进入麻醉状态后，将其仰卧手术床上,固定四肢,暴露双侧后腿,使其处于伸直位,取其右后膝关节进行手术，剃毛，常规消毒、铺巾。取膝关节前正中切口，约3～4cm中部皮肤切开6cm长切口，用骨钻对其胫骨顶端关节软骨行部分半月板切除术，建立骨性关节炎后软骨损伤模型，冲洗关节腔,逐层关闭膝关节,缝合皮肤。术后实验兔送入苏醒室观察,待醒后送回动物房,自由进食、活动。动物模型建立完成的第1～3天，在损伤关节腔中注入0.5mL组合物，其中组合物中含有40～80pg/mL FGF2血浆0.1mL，150-350pg/mL VEGF血浆0.5mL，脐带间充质干细胞8×10⁵个，动物送回动物房，自由进食、活动。组合物注射完成后4～8周，将家兔麻醉后处死，去损伤修复关节进行组织切片和HE染色分析，左后膝关节同样进行损伤但未注射组合物的家兔作为实验对照组。

2、取80mL静脉血，获得浓缩5倍后得到的富集血小板血浆，经过140IU/mL凝血酶、14mg/mL CaCl₂、在37℃、1小时激活血小板释放FGF2因子，经检测此血浆中富含FGF₂73.5pg/mL；浓缩5倍后得到的富集血小板血浆经过18IU/mL凝血酶、1.8mg/mL CaCl₂、在37℃、100小时培养后激活血小板释放VEGF因子，酶联免疫法检测VEGF含量286.1pg/mL VEGF；0.1mL的上述富FGF2血浆、0.9mL上述富VEGF血浆充分混合后，放置在2％～5％O₂、5％CO₂、37℃培养箱中，平衡8小时待用。吸脂20mL，经过无菌生理盐水洗涤、分离、脂肪间充质干细胞培养、扩增、传代至P3代，待P3代脂肪干细胞在培养瓶中达到70％融合度后，转移到5％O₂、5％CO₂、37℃培养箱中继续培养脂肪间充质干细胞6小时，然后在5％O₂、5％CO₂、37℃培养箱用胰酶消化并收集干细胞，将其悬浮在经低氧平衡的细胞因子混合液中配成关节炎治疗组合物。将此组合物吸入注射器，在X-ray的引导下，缓慢注入损伤的膝关节腔内。

损伤对照组动物切片如图7，修复组动物切片如图8。

本实验结果表明，经过本组合物的对关节损伤动物进行修复治疗，关节软骨有明显改善，关节平滑度增加，关节损伤部位可看到纤维性修复和新增干细胞分化，而对照家兔关节软骨表面仍可见大量滑膜组织增生和绒毛状突起，但没有软骨修复迹象。因此体内试验充分证明了本组合物在软骨损伤修复和软骨再生中的作用。

本实验是采用脂肪干细胞的举例，本组合物使用的干细胞可以是但不限于脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、羊膜间充质干细胞等。

Claims

1.一种治疗骨性关节炎的组合物的制备方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：

一、富血小板血浆制备：

二、富FGF2因子血浆制备：

在步骤一制备的富血小板血浆中无菌添加120～150IU/mL人凝血酶和12～15mg/mLCaCl₂，在20～37℃恒温培养箱中培养1～6小时，将上述培养物经800～1500g、4℃离心10～30min，其上清液即为FGF2浓度在40～80pg/mL的富FGF2因子血浆；

三、富VEGF因子血浆制备：

在步骤一制备的富血小板血浆中无菌添加10～30IU/mL人凝血酶和1～3mg/mL CaCl₂，在20～37℃恒温培养箱中培养中72～144小时，将上述培养物经800～1500g、4℃离心10～30min，其上清液即为VEGF浓度在150～350pg/mL的富VEGF因子血浆；

2.根据权利要求1所述的一种治疗骨性关节炎的组合物的制备方法，其特征在于步骤二中添加140～150IU/mL人凝血酶和14～15mg/mL CaCl₂，在37℃恒温培养箱中培养1～1.5小时。

3.根据权利要求1所述的一种治疗骨性关节炎的组合物的制备方法，其特征在于步骤三中添加14～27IU/mL人凝血酶和1.4～2.7mg/mL CaCl₂，在37℃恒温培养箱中培养120～140小时。

4.根据权利要求1所述的一种治疗骨性关节炎的组合物的制备方法，其特征在于步骤四中将混合后的血浆在40mmHg氧分压下，37℃平衡6小时。