CN105754937A - 一种促进软骨分化的细胞共培养体系及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种促进软骨分化的细胞共培养体系，由滑膜间充质干细胞和半月板细胞组成，所述滑膜间充质干细胞与所述半月板细胞的比例为1：(0.33?3)，其中滑膜间充质干细胞为原代培养的第2到5代细胞，半月板细胞为原代培养的第2到5代细胞；该体系还可以与脱矿皮质骨和BMP?4?PBS溶液共同组成半月板移植体系；本发明还提供了一种细胞共培养体系在同种异体或者异种异体动物半月板移植中的应用；该细胞共培养体系高效促进成软骨的分化，提高半月板移植手术的成功率。

Description

一种促进软骨分化的细胞共培养体系及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种细胞共培养的体系及其制备方法，具体涉及一种特定比例的两类种子细胞共同培养，可以促进种子细胞相互相软骨分化的细胞培养体系及其制备方法。
背景技术
半月板是膝关节的重要结构，功能如下：1.加强膝关节的协调性；2.传递载荷；3.维护关节稳定；4.吸收震荡；5.润滑关节；6.减少接触应力；7.防止膝关节过伸与过屈。半月板承载的膝关节力学功能是导致半月板损伤成为最常见的运动创伤的原因。如果膝关节失去半月板的保护会导致过早的、进行性的关节软骨退变，最终导致膝关节骨性关节炎的发生。
为了避免半月板缺失后膝关节退变的发生，重建半月板切除后的膝关节的力学秩序并恢复其半月板的生理功能是所有患者和临床工作者的呼声，其最好的解决方法就是植入新的半月板重建膝关节力学秩序恢复半月板功能。
人类半月板与其他哺乳类动物相似，呈外侧厚而内侧较薄的楔形，表面光滑而富有光泽，质地坚韧弹性尚佳。半月板是纤维软骨组织，由软骨细胞和基质组成。
对于半月板切除的患者，为了恢复半月板的功能，防止出现进一步的软骨损伤或骨关节炎半月板的移植和替代就成为了此类患者的最终选择。现有的临床治疗方案包括胶原半月板假体，同种异体半月板移植等，前者因为操作复杂临床失败率较高未能成为治疗的标准化方案，而同种异体半月板移植又因为供体来源及受体匹配等原因无法在临床广泛应用。寻找适合的植入物成为了半月板移植和替代的研究热点。
近年来，随着材料学、细胞生物学、分子生物学等基础学科的迅速发展，以干细胞为基础的组织工程技术已显示出良好的发展前景，并且成为当今生物学和医学关注的研究热点。组织工程半月板指利用天然或人工合成的有机或无机材料加入种子细胞通过一定条件复合培育而成的一种特殊半月板组织。其研究领域包括种子细胞、支架材料、细胞因子等方面。
组织工程半月板应用的种子细胞包括纤维软骨细胞(半月板细胞)、滑膜间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、软骨细胞等。
半月板细胞属于纤维软骨细胞,其理应是作为种子细胞的最佳选择，但半月板细胞属于终末分化细胞，体外培养中出现凋亡及去分化现象。在实验室操作中发现半月板细胞培养周期长，生长缓慢，且对体外环境的要求较高，单纯半月板细胞很难在支架上生长。
滑膜间充质干细胞(每1000个有核细胞孵育)体外培养形成的克隆数量是骨髓干细胞的100倍。与人骨髓来源干细胞和脂肪来源干细胞比较，发现滑膜来源干细胞更易于向软骨细胞分化，所用的诱导时间最短，而且分化成软骨细胞的比例最高。
细胞共培养是在体外模拟体内多种细胞相互作用的内环境，探究细胞间相互作用对其它生理过程的影响的一种方法。共培养技术在组织工程学领域被应用主要有以下两方面目的：通过两种细胞的共培养使之产生同一种细胞；或者通过共培养形成两种或两种以上细胞类型共存的组织并且相互维持帮助对方的生长。
试验证明，单独的半月板细胞和滑膜间充质干细胞都无法较为理想的促进组织工程中半月板支架的移植成功。
因此以细胞相互作用的机制为基础，寻找到共培养体系中可以促进细胞生长的因素，对组织工程半月板建立有重要意义。但目前尚无对半月板细胞和滑膜间充质干细胞之间的共培养体系进行优化的研究，以满足其在组织工程半月板中的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种促进软骨分化的细胞共培养体系，由滑膜间充质干细胞和半月板细胞组成，所述滑膜间充质干细胞与所述半月板细胞的比例为1：(0.33-3)，其中滑膜间充质干细胞为原代培养的第2到5代细胞，半月板细胞为原代培养的第2到5代细胞。
由于动物体外培养干细胞的提取操作过程特点，容易混杂进血细胞等杂细胞，故通过传代法，选用较为均一的第2代细胞及以后代次细胞作为共培养使用。同时由于干细胞及原代半月板细胞无法在体外培养的条件下一直保持自身细胞的特性，故选用5代以前的细胞进行使用。
本发明还提供了一种细胞共培养体系，所述滑膜间充质干细胞与所述半月板细胞的细胞数量比例为1：3。
当滑膜间充质干细胞与所述半月板细胞的比例为1：3时，GAG(软骨糖胺多糖)是构成透明软骨一种主要的细胞外基质。在共培养体系成软骨诱导第3、5、7和14天时利用DMMB(1，9-二甲基亚甲蓝)试剂检测GAG含量。比例为1:3的共培养组与其它组相比，GAG分泌量在所有时间点均最高，说明此时成软骨分化能力最强。
共培养后SMSCs(滑膜间充质干细胞)的成软骨分化能力增强，而且比例为1:3的共培养组成软骨分化能力最强。
本发明还提供了一种细胞共培养体系，所述滑膜间充质干细胞和所述半月板细胞均来源于哺乳动物的滑膜间充质干细胞。
本发明还提供了一种细胞共培养体系，其中哺乳动物为大鼠、猪或人。
本发明还提供了一种含有所述细胞共培养体系的半月板移植体系，其特征在于，该半月板移植物还包括脱矿皮质骨半月板支架和BMP-4水合培养液。
骨形态发生蛋白(BMP)是TGF-β超家族的成员，最初被发现是由于其具有体内异位诱导新骨形成作用。众所周知,BMP家族所有成员均具有诱导成骨的作用而在诱导成软骨方面则仅有BMP-2、BMP-4、BMP-6，BMP-7有比较突出的表现。BMP-2和BMP-4具有相同的分子构成，在大多数理化条件下BMP-4比BMP-2更稳定。发明人的前期研究结果也证实BMP-4具有诱导滑膜间充质干细胞成软骨的作用。
BMP-4的PBS溶液能够与脱矿皮质骨半月板支架发生水合效应，不仅使半月板支架由于吸收溶液，具有了与正常动物半月板相近的强度，也在随后半月板移植体系时，增加有BMP-4，诱导细胞共培养体系成软骨的形成。
本发明还提供了一种半月板移植体系，所述脱矿皮质骨来源于牛的股骨或者胫骨。
选择牛的股骨或者胫骨，也是根据所需所需移植到的动物所需的半月板强度所决定的。
本发明还进一步提供一种半月板移植体系，所述BMP-4水合培养液的浓度为1-8μg/L,溶剂为PBS溶液。
本发明还提供了一种细胞共培养体系的制备方法，包括以下步骤：
1)从所用动物体内获取滑膜间充质干细胞，进行原代培养，培养到第2-5代时，细胞形态均一，为密集生长的呈旋涡状或平行排列的梭形贴壁细胞，细胞流式图确认为纯度大于90％的滑膜间充质干细胞，则获得了共培养用滑膜间充质干细胞；
2)从所用动物体内获取半月板细胞，进行原代培养，培养到第2-5代，细胞流式图确认为纯度大于90％的半月板细胞，则获得了共培养用半月板细胞；
3)共培养用滑膜间充质干细胞和半月板细胞在合适的培养基内进行培养，培养比例为1：(0.3-3)，37℃，5％CO2的条件下培养，90分钟后，更换为软骨诱导培养基进行培养，获得所述细胞共培养体系。
所述软骨细胞培养基可以为大鼠间充质干细胞成软骨诱导培养基、大鼠间充质干细胞成骨诱导培养基、大鼠间充质干细胞成脂诱导培养基等，也可以是其他动物的软骨诱导培养基，视所培养动物细胞和移植动物的物种而定，所述培养基可以自制或者购买市售产品。
其中步骤3)中滑膜间充质干细胞和半月板细胞的细胞数量的培养比例优选为1:3。
本发明还提供一种半月板移植体系的制备方法，包括以下步骤：
a)从猪体内获取滑膜间充质干细胞，进行原代培养，培养到第2-5代时，细胞形态均一，为密集生长的呈旋涡状或平行排列的梭形贴壁细胞，细胞流式图确认为纯度大于90％的滑膜间充质干细胞，则获得了共培养用滑膜间充质干细胞；
b)从猪内获取半月板细胞，进行原代培养，培养到第2-5代，细胞流式图确认为纯度大于90％的半月板细胞，则获得了共培养用半月板细胞；
c)共培养用滑膜间充质干细胞和半月板细胞在合适的培养基内进行培养，培养比例为1：(0.3-3)，37℃，5％CO2的条件下培养，更换为软骨诱导培养基进行培养1-3天，获得所述细胞共培养体系；
d)利用牛的股骨或者胫骨制备脱矿皮质骨半月板支架，所述脱矿皮质骨上的空隙为5-50μm，使用1-8ug/L的BMP-4的PBS溶液进行水合，所得水合牛脱矿皮质骨半月板支架的弹性模量为5.279±0.288MPa，硬度为0.341±0.0110Mpa，接近正常猪半月板要求；
f)将水合后的牛脱矿皮质骨半月板支架与c)中细胞共培养体系进行共培养，得到所述半月板移植体系。
弹性模量为5.279±0.288MPa，硬度为0.341±0.0110MPa，此数据为植入物制备完成后的测量数据。
在组织半月板移植中，所述细胞共培养体系还是要联合半月板支架共同使用的，制备好的冻干脱矿皮质骨支架包装好后用等离子低温消毒柜进行消毒。用2μgBMP-4蛋白加入500ml无菌PBS溶液制成BMP-4--PBS溶液备用。术前30分钟打开无菌包装置于手术台上用BMP-4--PBS溶液进行水合。水合超过30分钟达到饱和即可进行手术使用。制备好的冻干脱矿皮质骨支架包装好后用等离子低温消毒柜进行消毒。制备好1-8μg/L的BMP-4--PBS溶液备用。术前30分钟打开无菌包装置于手术台上用BMP-4--PBS溶液进行水合。水合超过30分钟达到饱和即可进行手术使用。
本发明还提供所述的细胞共培养体系在同种异体或者异种异体动物半月板移植中的应用。
本发明还提供所述的半月板移植体系在同种异体或者异种异体动物半月板移植中的应用。
附图说明
图1：流式细胞检测SMSCs与MCs共培养后细胞增殖；
横坐标为cell cycle为细胞周期，纵坐标为percentage为细胞数量的比例；
图2：利用(G2+M+S)/G1*100％用于计算细胞增殖率；
横坐标groups为分组，纵坐标为G2+M+S/G1*100％为细胞增殖率；
图3：SMSCs与MCs共培养后细胞增殖的荧光强度图；
横坐标day为天数，纵坐标fluorescence intensity为荧光强度。
具体实施方案
实施例1
从SPF级5周龄雄性Sprague Dawley(SD)大鼠上获取滑膜间充质干细胞，用PBS溶液清洗细胞2次，在25cm2培养皿上铺板，加入3ml DMEM培养基(含10％FBS，1％penicillin–streptomycin)；
为了进一步分离成滑膜来源干细胞，将细胞传代3次，去除不贴壁的A型的巨噬样细胞，剩下的即为滑膜见充质干细胞(SMSCs)，生长到80％融合率时，传代，细胞流式图确认为细胞纯度大于90％。
本研究中滑膜间充质干细胞均采用P2-P5代细胞进行试验。
从SPF级5周龄雄性Sprague Dawley(SD)大鼠上获取半月板细胞，用PBS溶液清洗细胞2次，在25cm2培养皿上铺板，加入3ml DMEM培养基(含10％FBS，1％penicillin–streptomycin)；生长到80％融合率时，传代，细胞流式图确认为细胞纯度大于90％。本研究中半月板细胞均采用P2-P5代细胞进行试验。
使用滑膜间充质干细胞(SMSCs)与半月板细胞(MCs)进行共培养，在开始共培养前，SMSCs与MCs分别用DiI和DiO染料进行标记，37℃、5％CO2的条件下孵育30min，之后PBS洗去多余染料，两种细胞按照3:1、1:1与1:3三种比例共培养，单纯SMSCs或MCs作为对照。共培养3天时，荧光显微镜下观察共培养体系中两种细胞生长情况良好，SMSCs呈长梭形，MCs呈多角形，并且共培养组细胞形态与单纯培养组细胞形态无明显差异。
实施例2
流式细胞检测实施例1中SMSCs与MCs共培养后细胞增殖情况
在开始共培养前，使用CFDA SE荧光探针对SMSCs进行标记，之后PBS重悬三次，以洗去浮色。无标记的MCs与荧光标记的SMSCs用低糖DMEM培养基以不同的比例混合均匀，按照30 000个细胞/cm2密度接入培养皿。相同密度下的单纯MCs以及荧光标记的单纯SMSCs作为共培养组中MCs与SMSCs的对照。共培养第3天时，利用流式细胞术检测共培养体系中MCs与SMSCs各自的细胞周期的细胞比例(图1)，其中G2+M+S/G1用于计算细胞增殖率(图2)。如图2显示，共培养组中MCs的G2+M+S/G1比值与单纯MCs组相比(22.43±3.58％)升高；比例为1:1的共培养组中SMSCs的G2+M+S/G1比值为37.13±1.84％，同时比例为1:3的共培养组中SMSCs的G2+M+S/G1比值为40.4±0.95％，均高于单纯SMSCs组(34.14±1.38％)。因此，流式细胞分析结果显示共培养体系中MCs细胞均出现增殖，而SMSCs在比例为1:1与1:3的共培养组中出现增殖。流式细胞检测SMSCs与MCs共培养后细胞增殖情况。图1：使用CFDA SE荧光探针对SMSCs进行标记，与未标记荧光的MCs共培养，三天时进行流式细胞分选及周期检测，相同密度下的单纯MCs以及荧光标记的单纯SMSCs作为共培养组中MCs与SMSCs的对照。图2：利用(G2+M+S)/G1*100％用于计算细胞增殖率。
实施例3
assay检测实施例1中SMSCs与MCs共培养后细胞增殖情况
SMSCs与MCs共培养不同时间点进行Alamar blue assay，根据试剂盒操作步骤，对细胞进行染色后37℃孵育3小时，然后在荧光分光光度计下进行荧光强度的对比。如图3结果显示，比例为1:1的共培养组在第10天和14天时细胞数量均高于其它组。所有共培养组在第5天和第10天时细胞数量高于单纯MCs组，而比例为1:1或3:1共培养组中细胞数量与单纯SMSCs组无明显差异。而且随着培养时间延长，所有共培养组和单纯SMSCs组细胞数目高于单纯MCs组。
实施例4
共培养不同时间点细胞外基质形成
GAG(软骨糖胺多糖)是构成透明软骨一种主要的细胞外基质。在共培养体系成软骨诱导第3、5、7和14天时利用DMMB试剂检测GAG含量。比例为1:3的共培养组与其它组相比，GAG分泌量在所有时间点均最高。所有共培养组与单纯MCs组GAG分泌量均高于单纯SMSCs组。另外，在细胞培养14天时利用阿尔新蓝染色检测GAG含量，结果发现比例为1:3的共培养组GAG含量与单纯MCs组相当，明显高于其它组。另外，所有共培养组与单纯MCs组GAG分泌量均高于单纯SMSCs组。这些结果表明共培养后SMSCs的成软骨分化能力增强，而且比例为1:3的共培养组成软骨分化能力最强。
实施例5
将小型猪手术中取材的半月板及滑膜组织进行取材，经处理后进行消化，培养出原代的半月板细胞及滑膜间充质干细胞。将细胞传代，第2代细胞开始冻存，用于后续移植实验。移植同时使用流失细胞仪对小型猪滑膜间充质干细胞进行纯度检测，其中纯度均为90％以上的，通过观察激光共聚焦显微镜下滑膜间充质干细胞的形态评价细胞生长情况，选用P2-P5代的滑膜间充质干细胞和半月板细胞进行共培养。
脱矿皮质骨的的制备方法：牛胫骨及股骨去除关节部分，去除肌肉、骨膜及骨髓，仅保留股骨干中段和胫骨平台下方无松质骨的管状长骨部分，用骨分割机将骨管切割成骨片，选取较平整骨片作为制备组织工程半月板的材料。脱钙完全后用蒸馏水冲洗过夜，再将骨片用双氧水冲洗，再用蒸馏水冲洗，冲洗后去除骨组织表面的杂质保留骨片备用。因脱钙骨片有弧度，质地较软。质地和平整程度均无法达到用高精度机床修整程度，故将骨片进行压平修整并硬化。先用夹具将柔软的脱钙骨片放入-80℃冰箱中冻存。从冰箱中拿出冷冻好的骨片立刻放入低温负压冷冻干燥机中冷冻干燥。
冷冻干燥后的脱矿皮质骨片应平整且硬度可达到精工数控机床加工的要求。放置于粗加工机床内进行初始加工，将骨片修整磨平。最后用高精度数控机床以数字三维模型作为模板修整冷冻干燥后的脱矿皮质骨制作成为脱矿皮质骨半月板支架。
制备好的冻干脱矿皮质骨支架包装好后用等离子低温消毒柜进行消毒。用2μgBMP-4蛋白加入500ml无菌PBS溶液制成BMP-4--PBS溶液备用。术前48小时打开无菌包装置于超净台无菌平皿上加入BMP-4--PBS溶液进行水合30分钟，水合完成后将平皿中的溶液用移液管吸出。将制备好的5×106的1ml滑膜间充质干细胞混悬液和1.5×107的1ml半月板细胞混悬液均匀铺于脱矿皮质骨支架上，加入基础培养基，置于37℃的CO2培养箱中48小时，得到半月板移植体系。术前取出使用。
实施例6
将实施例5所制备的半月板移植体系进行猪半月板移植手术
固定动物后进行诱导麻醉，全麻后，仰卧位气管插管。屈膝45度沿膝关节髌骨内侧纵行切口切开皮肤及肾筋膜，沿髌骨内侧缘下方切开关节囊，分离脂肪带，将内侧脂肪垫切除，沿股骨内髁内缘切开膝关节暴露至滑车，将髌骨向膝关节外侧推出，于内侧关节囊处分离内侧副韧带，将内测副韧带从股骨止点下方2-3mm处切断，膝关节屈曲外翻显露内侧半月板，将半月板沿滑膜缘完整切除后备用，在移植物前角后角及周边用缝线编织代用，在半月板前角及后角止点处打骨道，并在内侧关节囊穿线备用，将移植物前后角骨栓拉入骨道，半月板边缘用关节囊穿线导入。前后角骨桥打结固定，关节囊周围缝线打结固定，用涤纶编织线缝合内侧副韧带，并与周边组织加固缝合，冲洗关节，逐层缝合伤口。术后不固定膝关节，动物笼内饲养，可在笼内自由活动。术后连续3天分别给予青霉素160万单位肌肉注射。
实施例7
半月板移植手术结束后，分别在6周，3个月，6个月分别对半月板及其移植物进行取出手术，以便跟踪所植入半月板及移植物的移植状况和评估工作。
表1：实验动物分组及处杀时间(单位：条腿)
支架组为只移植脱矿皮质骨支架，支架+BMP-4组为水合型脱矿皮质骨支架。自体半月板则是猪自体半月板移植。
本实验植入用组织工程半月板需要猪半月板细胞及滑膜干细胞作为种子细胞，在安排动物手术时先进行空白对照和单纯支架组，术中无菌取下半月板和滑膜组织，于手术台上剪碎后开始进入细胞培养周期，传代后作为组织工程半月板种子细胞使用。
术后6周，伤口愈合良好，膝关节活动度正常。单纯支架组：移植的半月板组织与周围关节囊部分愈合。膝关节未见明显关节积液，1个膝关节滑膜中度增生，覆盖移植的半月板组织，1个膝关节滑膜轻度增生，半月板移植物的大小和形态较移植时无明显改变，无明显半月板外凸。BMP-4+支架组：移植的半月板与关节囊部分愈合。膝关节滑膜均轻度增生，未见关节积液，半月板组织大小及形态较移植时无明显改变，无明显半月板外凸。组织工程半月板组：移植半月板与关节囊部分愈合。膝关节滑膜均轻度增生，未见关节积液，半月板组织大小及形态较移植时无明显改变，无明显半月板外凸。自体半月板移植组：半月板与关节囊部分愈合。膝关节滑膜均轻度增生，未见关节积液，半月板组织大小及形态较移植时无明显改变，无明显半月板外凸。
术后3个月，伤口愈合良好，膝关节活动度正常。单纯支架组：半月板组织与关节囊紧密愈合，关节腔无明显积液，1个膝关节滑膜中度增生，移植物部分吸收。其余3膝关节滑膜轻度增生，移植物表面被光滑的滑膜覆盖，轻度半月板外凸。BMP-4+支架组：半月板组织与关节囊紧密愈合，关节腔无明显积液，膝关节滑膜基本正常，移植物表面被光滑的滑膜覆盖，轻度半月板外凸。组织工程半月板组：半月板组织与关节囊紧密愈合，关节腔无明显积液，膝关节滑膜基本正常，移植物表面被光滑的滑膜覆盖，轻度半月板外凸。自体半月板移植组：半月板组织与关节囊紧密愈合，关节腔无明显积液，膝关节滑膜基本正常，移植物表面被光滑的滑膜覆盖，轻度半月板外凸。
术后6个月，伤口愈合良好，膝关节活动度正常。单纯支架组：2个半月板体部有部分撕裂的表现，撕裂部分为体部，从而导致形状不规则，组织强度尚可，边缘愈合良好。另两个半月板愈合较好无撕裂，表面被滑膜覆盖。4例均轻度半月板外凸。BMP-4+支架组：1例出现半月板撕裂，撕裂部分于体部，半月板组织与关节囊紧密愈合，另外3例半月板良好，关节腔无明显积液，膝关节滑膜基本正常，移植物表面被光滑的滑膜覆盖，轻度半月板外凸。组织工程半月板组：4例半月板组织与关节囊紧密愈合，关节腔无明显积液，无半月板撕裂，膝关节滑膜基本正常，移植物表面被光滑的滑膜覆盖，轻度半月板外凸。自体半月板移植组：半月板组织与关节囊紧密愈合，关节腔无明显积液，膝关节滑膜基本正常，移植物表面被光滑的滑膜覆盖，轻度半月板外凸。
组织学评估
术后6周，单纯支架组：表现为异物反应，半月板被滑膜包裹，周围有炎性细胞浸润，以淋巴细胞为主；滑膜增生较明显，增生的组织中以滑膜细胞和成纤维细胞为主；组织再生不明显，但滑膜缘有细胞长入的趋势，无细胞长入，分泌少量的蛋白多糖(TB异染)无胶原分泌。BMP-4+支架组：半月板被滑膜覆盖，部分半月板滑膜缘有极少量炎症细胞浸润，以淋巴细胞为主；滑膜缘细胞有长入的趋势，无蛋白多糖及II型胶原分泌，少量I型胶原分泌。组织工程半月板组：半月板被滑膜覆盖，部分半月板滑膜缘有极少量炎症细胞浸润，以淋巴细胞为主；滑膜缘细胞有长入，面积约占半月板横截面的五分之一，密度略低于正常半月板，半月板内部有少量细胞，少量蛋白多糖及II型胶原分泌，少量I型胶原分泌。自体半月板移植组：半月板被滑膜覆盖，部分半月板滑膜缘有极少量炎症细胞浸润，以淋巴细胞为主；滑膜缘细胞有长入的趋势，占半月板横截面的五分之一，少量蛋白多糖及II型胶原分泌，少量I型胶原分泌。
术后3个月，单纯支架组：滑膜反应减轻，但仍有少量以淋巴细胞为主的炎症细胞浸润，半月板有细胞长入，呈稀疏分布，类似于软骨细胞，形成弥散的软骨岛，密度明显小于正常半月板，有蛋白多糖分泌，少量II型胶原表达。BMP-4+支架组：滑膜反应已不明显，多数半月板仍以滑膜覆盖为主，半月板有少量细胞长入，主要分布在滑膜缘，分布面积不超过横截面的五分之一，有少量蛋白多糖及I、II、III型胶原表达。组织工程半月板组：滑膜反应已不明显，多数半月板仍以滑膜覆盖为主，半月板有细胞长入，主要分布在滑膜缘，分布面积超过横截面的三分之一，组织中心部有散在软骨岛样活细胞群，中心部分纤维规整，有蛋白多糖及I、II、III型胶原表达。自体半月板移植组：滑膜反应已不明显，多数半月板仍以滑膜覆盖为主，半月板有细胞长入，超过切片全面的一半，未长入部分无活细胞，有蛋白多糖及I、II、III型胶原表达。
术后6个月,单纯支架组：滑膜反应不明显，半月板滑膜缘有极少量淋巴细胞浸润，撕裂半月板亦有细胞长入，撕裂处组织排列紊乱，有淋巴细胞，长入的细胞主要分布在移植半月板组织的上下表面，少量细胞长入半月板内部，分布稀疏。细胞分布的区域有蛋白多糖及I、II、III型胶原表达，但以II型胶原为主。BMP-4+支架组：滑膜反应不明显，半月板滑膜缘有极少量淋巴细胞浸润，撕裂半月板亦有细胞长入，撕裂处组织排列紊乱，有淋巴细胞，长入的细胞主要分布在移植半月板组织的上下表面，少量细胞长入半月板内部，但分布稀疏。细胞分布的区域有蛋白多糖及I、II、I II型胶原表达，以II型胶原为主。组织工程半月板组：半月板的细胞已完全长入，组织特点及细胞表型接近于正常半月板，细胞表型为纤维软骨细胞，但细胞数量及细胞周围基质分泌较少。自体半月板移植组：半月板的细胞已完全长入，组织特点及细胞表型接近于正常半月板，细胞表型为纤维软骨细胞，细胞数量及细胞周围基质分泌较少。
取材时切下小块半月板组织进行纳米压痕生物力学测试，每块组织检查5个点取平均数进行比较，画出力量形变散点图。利用纳米压痕仪器微观探头，对软骨缺损修复进行微观扫描，获取修复组织的微观形貌图。取正常半月板组织作为对照组。
所有四组术后弹性模量随植入时间的延长都有向正常半月板接近的趋势，在各个时间段内各组间没有明显差异。术后6个月时植入物的弹性模量与正常半月板差距已经很接近了(见表2)。
表2：弹性模量(单位：MP n＝5)
所有四组术后硬度都有随植入时间延长向正常半月板接近的趋势，在各个时间段内各组间没有明显差异。(见表3)。
表3：硬度(单位：MP n＝5)
文中的表2和表3的数据是在半月板植入后从动物标本取下的植入物生物力学数据。植入物植入体内后会经过体内的降解-吸收-坏死-细胞长入-重新构建的过程演变，所以在植入初期生物力学特性会比植入前大幅下降，而随着植入时间延长重新构建逐步完成植入物的硬度及弹性模量会逐步增加。植入物制备完成后的初始强度弹性模量要高于正常半月板组织的目的是防止植入物早期出现损伤。
而且根据手术后动物的表现和手术取出的移植物的弹性模量和硬度，均表示本发明中的细胞共培养体系有利于成软骨的生长，所采用的移植物硬度随植入时间延长向正常半月板接近的趋势，因此该组织工程半月板移植物可应用于同种异体或者异种异体动物半月板移植中。
以上旨在进一步说明本发明，并不对本发明的范围加以限制。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。

Claims (10)

1.一种促进软骨分化的细胞共培养体系，由滑膜间充质干细胞和半月板细胞组成，其特征在于，所述滑膜间充质干细胞与所述半月板细胞的比例为1：(0.33-3)，其中滑膜间充质干细胞为原代培养的第2到5代细胞，半月板细胞为原代培养的第2到5代细胞。
2.如权利要1所述的细胞共培养体系，其特征在于，所述滑膜间充质干细胞与所述半月板细胞的细胞数量比例为1：3。
3.如权利要求1所述的细胞共培养体系，其特征在于，其中所述滑膜间充质干细胞和所述半月板细胞均来源于哺乳动物的滑膜间充质干细胞。
4.如权利要求3的细胞共培养体系，其特征在于，其中哺乳动物为大鼠、猪或人。
5.一种含有权利要求1所述细胞共培养体系的半月板移植体系，其特征在于，该半月板移植体系还包括脱矿皮质骨半月板支架和BMP-4水合培养液，所述BMP-4水合培养液的浓度为1-8μg/L溶剂为PBS溶液。
6.如权利要求5所述的半月板移植体系，其特征在于，所述脱矿皮质骨来源于牛的股骨或者胫骨。
7.如权利要求1所述的细胞共培养体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)从所用动物体内获取滑膜间充质干细胞，进行原代培养，培养到第2-5代时，细胞形态均一，为密集生长的呈旋涡状或平行排列的梭形贴壁细胞，细胞流式图确认为纯度大于90％的滑膜间充质干细胞，则获得了共培养用滑膜间充质干细胞；
2)从所用动物体内获取半月板细胞，进行原代培养，培养到第2-5代，细胞流式图确认为纯度大于90％的半月板细胞，则获得了共培养用半月板细胞；
3)共培养用滑膜间充质干细胞和半月板细胞在合适的培养基内进行培养，细胞数量的培养比例为1：(0.3-3)，37℃，5％CO2的条件下培养，更换为软骨诱导培养基进行培养1-3天，获得所述细胞共培养体系。
8.如权利要求7所述的细胞共培养体系的制备方法，其特征在于，步骤3)中滑膜间充质干细胞和半月板细胞的细胞数量的培养比例为1:3。
9.如权利要求5所述的半月板移植体系的制备方法，包括以下步骤：
a)从猪体内获取滑膜间充质干细胞，进行原代培养，培养到第2-5代时，细胞形态均一，为密集生长的呈旋涡状或平行排列的梭形贴壁细胞，细胞流式图确认为纯度大于90％的滑膜间充质干细胞，则获得了共培养用滑膜间充质干细胞；
b)从猪内获取半月板细胞，进行原代培养，培养到第2-5代，细胞流式图确认为纯度大于90％的半月板细胞，则获得了共培养用半月板细胞；
c)共培养用滑膜间充质干细胞和半月板细胞在合适的培养基内进行培养，培养比例为1：(0.3-3)，37℃，5％CO2的条件下培养，更换为软骨诱导培养基进行培养1-3天，获得所述细胞共培养体系；
d)利用牛的股骨或者胫骨制备脱矿皮质骨半月板支架，所述脱矿皮质骨上的孔隙为5-50μm，使用1-8ug/L的BMP-4的PBS溶液进行水合，所得水合牛脱矿皮质骨半月板支架的弹性模量为5.279±0.288MPa，硬度为0.341±0.0110MPa，接近正常猪半月板要求；
f)将水合后的牛脱矿皮质骨半月板支架与c)中细胞共培养体系进行共培养，得到所述半月板移植体系。
10.含有权利要求1所述的细胞共培养体系在同种异体或者异种异体动物半月板移植中的应用。
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