CN111514374A

CN111514374A - 一种基于共培养系统构建的组织工程软骨促进软骨修复的方法

Info

Publication number: CN111514374A
Application number: CN202010333276.7A
Authority: CN
Inventors: 张雨; 蒋青; 陈东阳; 秦江辉
Original assignee: Nanjing Drum Tower Hospital
Current assignee: Nanjing Drum Tower Hospital
Priority date: 2020-04-24
Filing date: 2020-04-24
Publication date: 2020-08-11

Abstract

本发明涉及一种基于共培养系统构建的组织工程软骨促进软骨修复的方法，从膝关节非负重区获取少量软骨组织，进行原代软骨细胞的分离、培养；从新鲜足月健康的脐带组织Wharton’s胶中，进行脐带间充质干细胞的分离、培养；用健康成年猪膝关节软骨组织，通过湿法粉碎脱细胞，在真空负压环境下冷冻干燥获得脱细胞软骨细胞外基质取向支架；以脱细胞软骨细胞外基质取向支架为共培养载体，将原代软骨细胞、脐带间充质干细胞混合，通过细胞悬液滴种法将细胞种植于干燥的支架载体中，孵育构建共培养组织，将共培养组织移植至膝关节负重区全层软骨缺损处，用于关节软骨修复。

Description

一种基于共培养系统构建的组织工程软骨促进软骨修复的方法

技术领域

本发明涉及医学软骨组织工程技术领域，具体涉及一种基于共培养系统构建的组织工程软骨促进软骨修复的方法。

背景技术

软骨组织因缺乏血管、淋巴管导致其一旦损伤几乎不能自愈，随着时间的推移，将继发骨性关节炎，目前临床尚缺乏一种有效的策略能够修复或逆转损伤的软骨。组织工程联合种子细胞、生物材料和细胞因子构建组织工程软骨，为软骨的修复与再生带来新的希望。然而，软骨细胞来源受限，对于大面积软骨缺损几乎无法提供足量的软骨组织进行软骨细胞的分离提取，体外扩增又极易发生去分化而失去表型，间充质干细胞诱导成软骨分化后很难维持其软骨生物学表型，而发生肥大或钙化，导致纤维软骨或新生软骨钙化，软骨修复失败。共培养系统通过改善细胞微环境，优化种子细胞软骨生物学特性，获得高质量软骨组织的再生与修复。其作用机制主要体现在两方面：1、间充质干细胞对软骨细胞的营养作用，间充质干细胞可分泌一些细胞因子促进软骨细胞增殖，延缓甚至逆转软骨细胞的退变；2、软骨细胞通过分泌细胞因子诱导间充质干细胞成软骨分化，并稳定在软骨生物学表型的状态，避免直接添加诱导因子导致的成软骨分化后的肥大或钙化。但是，有研究发现不同成分构建的共培养系统得到的结果也不同，甚至矛盾。有学者分别应用牛骨髓、脂肪及滑膜组织来源的间充质干细胞与人原代软骨细胞以Pellet形式共培养，结果发现间充质干细胞并没发生成软骨分化，而仅是软骨细胞的增殖活性提高，细胞外基质成分分泌增加。还有学者将人骨髓和脂肪组织来源间充质干细胞与原代软骨细胞以Pellet形式共培养后，结果发现促进了软骨细胞的增殖，且诱导了间充质干细胞的成软骨分化。由于，不同共培养系统中其构成成分，如种子细胞、支架材料和细胞因子等不尽不同，其构建的细胞微环境也有所差异，而细胞微环境对细胞的生长、分化、增殖及代谢具有重大的影响。因此，如何选择共培养系统的构成成分，构建适宜的细胞微环境，实现定向调控细胞的生物学行为是非常重要的，需要更广泛和深入的探究。

从组织工程软骨种子细胞方面讲：种子细胞多来源于两类细胞，即软骨细胞和间充质干细胞。软骨组织来源受限，很难提供足量的软骨组织分离软骨细胞进行软骨缺损的修复，而体外传代扩增后又极易发生去分化而失去表型，最终新生组织以纤维软骨为主，其组织学与生物力学特性明显降低，导致修复失败。间充质干细胞具有多项分化潜能，来源广泛，在软骨的再生与修复中具有潜在的应用价值。但是，细胞活性与功能状态受到患者身体健康状况的影响。另外，传统的诱导方法通过机械性地添加单一诱导因子(如TGF-β3)短时间的作用，诱导其分化成软骨后不能很好地稳定在软骨细胞功能状态，进一步发生细胞肥大或钙化，体内新生组织多以纤维软骨或钙化软骨替代透明软骨，不能够发挥透明软骨的功能，导致修复失败。因此，理想的软骨组织工程种子细胞的应该来自更倾向于分化成软骨细胞的间充质干细胞或具有最佳软骨表型的种子细胞，同时尽可能给机体带来最小的伤害。

从组织工程细胞支架方面讲：细胞支架作为种子细胞的载体和软骨细胞外基质的临时替代物，在软骨修复过程中能够促进细胞的黏附、增殖和细胞外基质的分泌。当前应用于软骨组织工程的支架材料主要包括天然生物材料、合成材料及天然-人工复合材料，天然材料总体来讲具有良好的细胞生物相容性，但其生物力学性能较差，体内降解速度难以把控，很难与组织再生速度相匹配。合成材料来源广泛，可大量生产，具有很好的力学性能，体内降解速度可调可控，但是生物相容性较差，降解产物具有细胞毒性。理想的天然-人工复合材料应具备天然材料和合成材料各自的优点，但目前对天然材料与人工材料的交联耦合技术缺乏，两种材料很难获得较好的整合，主要体现在两种材料仅是物理空间上的“复合”，而非生物理化特性上的“复合”。因此，目前仍然缺乏一种在理化成分、空间结构及生物力学方面与天然软骨组织相匹配的软骨组织工程支架，作为种子细胞的载体，促进软骨的再生与修复。

从细胞因子方面讲：传统的方法通过在细胞培养液中添加一定量的成软骨分化诱导因子，作用于间充质干细胞一定时间后，能够诱导其分化成软骨，具有软骨细胞的功能特性。但是，间充质干细胞的定向分化调节机制复杂，细胞生物学行为受到周围微环境的影响，简单的添加某一种或几种诱导因子是远远不够的，且诱导因子的浓度、作用时间和环境都很难把控。体内外结果发现，诱导后的间充质干细胞易发生肥大或钙化，最终以纤维软骨或钙化软骨填充软骨缺损处，组织生物力学与软骨组织不匹配，纤维软骨力学较差，新生软骨不耐磨，很快再次发生软骨损伤，钙化软骨出现，导致缺损处软骨组织很少，关节的缓冲减震作用较差，骨髓水肿，关节软骨很快出现新的损伤。

发明内容

本发明的目的是一种基于共培养系统构建的组织工程软骨促进软骨修复的方法，原代软骨细胞与脐带Wharton’s胶间充质共培养在具有结构和成分双重仿生的脱细胞软骨细胞外基质取向支架构建共培养系统构建组织工程软骨，解决了软骨修复中软骨细胞来源受限，避免体外扩增后发生退变而失去表型的问题；稳定脐带间充质干细胞分化成软骨状的细胞态，避免发生肥大或钙化，导致纤维软骨或钙化软骨替代透明软骨的问题。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：

一种基于共培养系统构建的组织工程软骨促进软骨修复的方法，包括以下步骤：

1)在无菌条件下,从膝关节非负重区活动软骨组织处，进行原代软骨细胞的分离、培养；从新鲜足月健康的脐带组织Wharton’s胶中，应用微组织块培养法分离、培养脐带间充质干细胞，并传代扩增至P3代细胞；

2)用健康成年猪膝关节软骨组织，通过湿法粉碎脱细胞，在真空负压环境下冷冻干燥获得脱细胞软骨细胞外基质取向支架；

3)以脱细胞软骨细胞外基质取向支架为共培养载体，将原代软骨细胞、脐带间充质干细胞这两种细胞以一定比例混合，通过细胞悬液滴种法将细胞种植于干燥的支架载体中，孵育培养一段时间构建共培养组织；将共培养组织移植至关节软骨缺损处，用于关节软骨修复。

步骤1)中，所述的原代软骨细胞为将膝关节非负重区软骨组织剪碎后，添加Ⅱ型胶原酶，在孵育箱中搅拌下进行消化2h，制备成细胞悬液并放置培养皿中，添加细胞培养液，放置温箱，培养获得原代软骨细胞，待细胞融合至80％后，胰酶消化收集备用。

步骤1)中，所述的脐带间充质干细胞为在无菌条件下将新鲜足月健康的脐带组织清理血迹、动静脉血管、筋膜及脂肪组织，获得Wharton’s胶组织块，剪碎为1mm³大小的微组织块，在培养皿中添加含血清培养基，放置温箱，应用微组织块培养法分离、培养脐带间充质干细胞。

步骤2)中，所述的支架为将天然软骨通过成微丝处理、去细胞处理和固化和/或强化处理得到。

步骤3)中，原代软骨细胞、脐带间充质干细胞两种细胞以50:50的质量比例混合。

步骤3)中，细胞悬液的浓度为：每200μl细胞悬液含有10⁶个细胞。

步骤3)中，孵育培养方法为：将种植细胞的支架载体放置温箱孵育2h后向温箱内添加细胞培养基以保持细胞支架潮湿，促进细胞粘附于支架中，在温箱内共培养3周，构建共培养组织。

温箱条件为5％CO₂，37℃；添加细胞培养基5ml，细胞培养基以质量分数计包括成分：10％FBS，DMEM/F12，1％谷氨酰胺，1％Vitamin C，1％青霉素和1％链霉素。

本发明在研究过程中发现：

培养下原代软骨细胞不需传代扩增，保留了最佳的软骨表型，为模拟构建软骨微环境奠定了良好的细胞基础；

脱细胞软骨细胞外基质取向支架具有成分和结构双重仿生的优势，成分上保留了大量的软骨细胞外基质成分(如Ⅱ型胶原纤维蛋白)，具有很好的生物相容性，促进软骨细胞粘附、生长，很好地维持软骨细胞生物学表型，空间结构上重建了软骨组织的天然取向结构，为引导种子细胞及细胞外基质定向分布提供结构基础，为模拟构建软骨微环境奠定了良好的细胞外成分和空间结构基础；

脐带间充质干细胞具有较好的细胞活性和极低的免疫原性，来源于废弃的脐带组织，来源广泛且无伦理学争议，不会给受试者带来机体损害，同时具有更好的分化成软骨的潜能，更适合作为软骨组织工程的种子细胞。因此，我们应用软骨表型最好的原代软骨细胞与脐带间充质干细胞共培养在具有成分和结构双重仿生的取向支架上，构建组织工程软骨。结果显示，该共培养系统中脐带间充质干细胞成功诱导分化成软骨细胞，同时原代软骨细胞的增殖活性明显提高，将共培养组织移植修复膝关节负重区全层软骨缺损，6月结果可见软骨缺损处已被新生组织完全填充，从影像学、组织学及生物力学方面分析，较对照组更接近正常软骨组织。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1.在种子细胞问题方面：对于软骨组织来源受限，软骨细胞体外扩增易去分化而失去表型，本发明应用有限的软骨组织体外分离培养获得原代软骨细胞，不进行体外扩增，以保留最佳的软骨表型。对于间充质干细胞的来源，本发明利用产后废弃的脐带组织，从Wharton’s胶中分离获得脐带间充质干细胞，不需从受体中获得，不会对受体造成损害，细胞的活性和功能状态也不会因为受体身体健康状况不佳而受到影响。研究发现，脐带间充质干细胞具有更好的成软骨分化潜能，具有很好的软骨修复潜能。在避免传统方法诱导其分化成软骨后导致的细胞肥大或钙化问题，本发明应用软骨表型最佳的原代软骨细胞与脱细胞软骨细胞外基质取向支架模拟构建软骨微环境，通过微环境取代细胞因子对间充质干细胞进行持续定向的成软骨分化调控，以获得稳定的成软骨分化状态。另外，通过与间充质干细胞共培养，弥补了原代软骨细胞数量的不足缺陷。

2.在细胞支架问题方面：本发明为了能够为种子细胞提供良好的生物相容的微环境，促进细胞粘附、生长、增殖、分化及代谢，同时满足一定的力学支撑，将天然软骨组织通过湿法粉碎脱细胞处理，去除免疫原性，在真空负压环境下冷冻干燥获得取向性空间结构。这在成分上最大程度的接近细胞外基质，为软骨再生奠定一定的物质基础，并且取向性结构更接近软骨组织天然空间结构，力学强度也明显提高。

3.以原代软骨细胞与脱细胞软骨细胞外基质取向支架模拟构建软骨微环境替代向培养液中单独添加的诱导因子，对脐带间充质干细胞进行持续定向的成软骨分化调控，以获得稳定的成软骨分化状态，避免了短暂单一的诱导因子作用后的细胞肥大或钙化的问题。

附图说明

图1：人脐带组织进行脐带间充质干细胞的分离、培养及鉴定流程图。

图2：原代软骨细胞的分离、获取及鉴定方法流程图。

图3：构建共培养系统的流程及培养获得的软骨组织块图。

图4：人脐带间充质干细胞显微镜下细胞形态图。

图5：原代软骨细胞显微镜下细胞形态图。

图6：hWJMSCs与pACs混合共培养体形态图。

图7：软骨修复效果图。

图8：H&E染色结果图。

图9：番红“O”染色结果图。

图10：影像学检测及评分图。

图11：人组织相容性抗原(HLA-ABC)免疫荧光染色图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围，如果应用于修复人关节软骨缺损，可将应用人来源原代软骨细胞替代实例中的山羊原代软骨细胞。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。实施例中未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

实施例1

1.种子细胞的分离、获取

人脐带间充质干细胞的分离、培养：获取新鲜足月健康的人脐带组织，在无菌条件下清理血迹、动静脉血管、筋膜及脂肪组织，获得Wharton’s胶组织块，用无菌剪刀剪碎大小学1*1*1mm微组织块，在培养皿中添加5ml含血清培养基(10％FBS，DMEM/F12，1％谷氨酰胺，1％Vitamin C，1％青霉素和1％链霉素)，放置温箱(5％CO₂，37℃)分离脐带间充质干细胞，应用微组织块培养法分离、培养人脐带间充质干细胞，并传代扩增至P3代细胞，用于构建共培养系统，倒置显微镜下细胞呈纤维细胞样形态。人脐带组织进行脐带间充质干细胞的分离、培养及鉴定流程见图1。

羊原代软骨细胞的获取：麻醉下，无菌手术操作，获取山羊膝关节非负重区软骨组织，在超净台剪碎后，添加Ⅱ型胶原酶在5％CO₂，37℃的孵育箱中磁珠搅拌作用下进行消化2h，取上清液，进行1500r/min离心，弃去上清液，将分离获得的细胞再次制备为细胞悬液，放置培养皿中，添加5ml细胞培养液(10％FBS，DMEM/F12，1％谷氨酰胺，1％Vitamin C，1％青霉素和1％链霉素)，放置温箱(5％CO₂，37℃)，培养获得原代软骨细胞，待细胞融合至80％后，胰酶消化收集备用，倒置显微镜下细胞呈类圆形细胞形态。原代软骨细胞的分离、获取及鉴定方法流程见图2。

2.脱细胞软骨细胞外基质取向支架的制备

用健康成年猪膝关节软骨组织，通过湿法粉碎脱细胞，真空负压环境下冷冻干燥获得脱细胞软骨细胞外基质取向支架，具体详见[CN200810057373.7]。

3.软骨组织工程共培养系统的构建

以脱细胞软骨细胞外基质取向支架为共培养载体，将两种细胞以50:50比例混合，共10⁶个细胞制备200μl细胞悬液，通过细胞悬液滴种法将细胞种植于干燥的支架中，放置温箱(5％CO₂，37℃)孵育2h，用培养基保持细胞支架潮湿，促进细胞粘附于支架中。2h后添加5ml细胞培养基(10％FBS，DMEM/F12，1％谷氨酰胺，1％Vitamin C，1％青霉素和1％链霉素)放置温箱(5％CO₂，37℃)，体外共培养3周构建共培养组织。将两种细胞等比例混合制备细胞悬液，滴种在干燥无菌的脱细胞软骨细胞外基质取向支架中，构建共培养系统的步骤，以及培养获得的软骨组织块见图3。组织块形成后，将共培养组织移植至软骨缺损处，应用生物蛋白胶固定于软骨缺损处，进行软骨修复。

实施例2

1.人脐带间充质干细胞(hWJMSCs)的分离培养与鉴定

新鲜的足月产健康人脐带来自本院产科，经过患者知情同意，在无菌条件下去除血液后，置于DMEM/F12培养基培养皿中剔除动静脉血管。用培养基再次清洗数次，剪为1mm³大小组织块，以适当的密度接种于直径15cm的培养皿中，加5.0ml DMEM/F12(含10％胎牛血清)培养基，置于37℃，5％CO2饱和湿度的培养箱内培养。次日加入10.0ml相同培养基，继续培养3～5d更换培养基，10～14d后剔除组织块。待细胞贴壁融合至80％时，用0.25％胰蛋白酶-EDTA消化收集细胞，按1:3的比例传代至第3代备用。倒置显微镜下细胞形态如图4。

2.原代软骨细胞(pACs)的分离培养与鉴定

成年雄性健康山羊购自北京市养殖场，待手术的山羊在手术实施前禁食12h，禁水4h，右膝关节备皮。实验动物在速眠新II(剂量为0.15ml/kg)肌肉注射麻醉后联合盐酸丁卡因(1mg/kg)膝关节局部浸润麻醉，仰卧固定于手术台上将右侧膝关节剪毛及消毒，铺巾，取膝关节内侧切口切开皮肤，沿髌旁内侧入路切开关节囊，将髌骨连同髌韧带一起推向外侧，充分暴露股骨内、外侧髁，用手术刀片削取膝关节透明软骨薄片，并暂时保存在DMEM/F12细胞培养液中。待软骨组织获取足量后，由助手逐层缝合膝关节关节囊、皮下筋膜和皮肤。术后肌肉注射青霉素160万单位/d，连续5d，预防感染发生。术后实验动物圈养，自由活动。同时，软骨组织在超净台无菌条件下应用Hanks液充分洗去表面血迹，转移至青霉素小瓶，眼科剪将软骨组织充分剪碎，加入Ⅱ型胶原酶约10ml和磁珠2个，在37℃，5％CO₂条件下的孵育箱中和磁力搅拌器的带动下消化约2小时。将上悬液移至试管中，以1200r/min，离心5min，弃去上清液，用软骨细胞培养液(10％FBS，DMEM/F12，1％谷氨酰胺，1％Vitamin C，1％青霉素和链霉素)稀释重悬细胞，转移至25cm2细胞培养瓶中，补充细胞培养液至5ml，放置在37℃，5％CO₂条件下的孵育箱中培养。待细胞贴壁融合至80％时备用。倒置显微镜下细胞形态如图5。

3.hWJMSCs与pACs混合共培养体的构建

取实验室已经制备的ACECM取向支架，直径为6mm，厚度为1mm，经过⁶⁰Co照射消毒备用。实验分为5组，把hWJMSCs与PACs按不同比例(hWJMSCs:PACs分别为100:0，75:25，50:50，25:75和0:100)混合均匀后滴种在ACECM取向支架上共培养，每个支架复合细胞共10⁶。细胞滴种时细胞悬液浓度为10⁶株/100μl，滴种后支架放置在37℃，5％CO₂条件下的孵育箱中2h，待细胞在支架中贴壁生长后，向培养管中加入5ml细胞培养液(10％FBS，DMEM/F12，1％谷氨酰胺，1％Vitamin C，1％青霉素和链霉素)中共培养1W和3W，其中每3天半量换液一次。培养3W后，准备移植。大体形态观如图6。

4.共培养系统构建组织工程软骨体内修复山羊膝关节负重区全层软缺损

以健康成年雄性山羊为实验对象，膝关节负重区股骨髁处造全层软骨缺损为实验模型，实验共分为6组，实验组(hWJMSCs:pACs为50:50混合共培养组，co-culture group,CC)，条件对照组(单纯ACECM取向支架组，ACECM group,AC；微骨折组，microfracturegroup,MF；ACECM取向支架复合hhWJMSCs，ACECM+hWJMSCs group,ACUC；ACECM取向支架复合pACs组,ACECM+pACs,ACAC)，空白对照组(单纯全层关节软骨损伤组，blank controlgroup,BC)每组3只山羊。在术后6、12个月后以过量麻药处死实验动物，取材进行大体形态学、组织学、分子生物学、影像学检测和生物力学检测综合系统评价并比较各组软骨修复效果。

动物实验方法

实验动物模型的建立，即空白对照组的实施：第一天术前准备：手术器械消毒、缝针缝线、角膜环钻及手术纱布:高温高压消毒；山羊禁食24小时，禁水4小时，肌肉注射青霉素80万单位，右膝关节备皮。第二天手术实施：(1)术前麻醉实验动物均在术前30分钟肌肉注射阿托品0.3mg，按速眠新2号(0.15ml/kg)与50mg盐酸丁卡因(2mg/Kg)麻醉，然后侧卧固定于手术台上,术者洗手，消毒,铺巾。手术方法：穿无菌手术衣，于髌骨表面皮肤正中做纵行切口约5.0cm长，切开皮下，延皮下向内侧关节囊钝性分离，切开部分股内侧肌和内侧关节囊，进入关节腔。将髌骨向外侧脱位，暴露股骨内外髁。检查膝关节腔无积液或粘连，关节软骨平坦、色泽正常后，用直径6mm环钻在双髁上做直径6mm、深1.0-2.0mm全层软骨缺损，同时滴注生理盐水，防止局部过热导致周围软骨组织坏死。手术时注意深度，防止破坏软骨下骨。缺损造好后，用纱布沾无菌生理盐水清洗伤口，髌骨复位。术毕,缝合关节囊和皮肤。

微骨折组修复实验方法：以同样的方法建立出实验模型的基础上，在缺损处用直径约1mm无菌注射器针头均匀钻孔4个，深度约2cm，以见到鲜血流出并充满全层软骨缺损处为标准。清理伤口，髌骨复位。术毕,缝合关节囊和皮肤。

支架组修复实验方法：以同样的方法建立出实验模型的基础上，用无菌纱布清理缺损处，并用生理盐水冲洗关节腔，再取干净无菌纱布压于软骨缺损处准备植入支架。由助手打开生物蛋白胶封闭剂，无菌条件下把生物胶主体和催化剂的溶剂与粉剂分别混合均匀后用无菌注射器分别抽取适量各自混合液交给手术者，术者按1:1混合两试剂后均匀的铺在干净的软骨缺损处，迅速放置已准备好的猪脱细胞ECM取向支架，整理支架边缘使其与缺损更紧密的吻合固定。固定约10分钟后，待胶剂粘合强度达到最大后，复位羊膝关节髌骨，缓慢被动过伸过屈膝关节5次，行髌骨脱位暴露膝关节缺损处，观察支架有无移位、破坏等，支架位置无明显改变，固定较牢固。再次髌骨复位，行较快速度过伸过屈膝关节10次后重复观察支架与缺损位置情况，无明显移位和破坏。生理盐水冲洗膝关节腔后，髌骨复位。逐层缝合关节囊、肌肉、浅筋膜和皮肤。术毕。

脐带干细胞+支架组修复实验方法：以同样的方法建立出实验模型的基础上，用无菌纱布清理缺损处，并用生理盐水冲洗关节腔，再取干净无菌纱布压于软骨缺损处准备植入支架。同上述方法将生物蛋白胶均匀地铺在干净的软骨缺损处，迅速放置已准备好的复合有hWJMSCs的ACECM取向支架，整理支架边缘使其与缺损更紧密的吻合固定。固定约10分钟后，待胶剂粘合强度达到最大后，复位羊膝关节髌骨，缓慢被动过伸过屈膝关节5次，行髌骨脱位暴露膝关节缺损处，观察支架有无移位、破坏等，支架位置无明显改变，固定较牢固。再次髌骨复位，行较快速度过伸过屈膝关节10次后重复观察支架与缺损位置情况，无明显移位和破坏。生理盐水冲洗膝关节腔后，髌骨复位。逐层缝合关节囊、肌肉、浅筋膜和皮肤。术毕。

原代软骨细胞+支架组修复实验方法：以同样的方法建立出实验模型的基础上，用无菌纱布清理缺损处，并用生理盐水冲洗关节腔，再取干净无菌纱布压于软骨缺损处准备植入支架。同上述方法将生物蛋白胶均匀地铺在干净的软骨缺损处，迅速放置已准备好的复合有pACs的ACECM取向支架，与上述同样方法检查固定移植物，并关闭手术切口。

共培养组修复实验方法：以同样的方法建立出实验模型的基础上，用无菌纱布清理缺损处，并用生理盐水冲洗关节腔，再取干净无菌纱布压于软骨缺损处准备植入支架。同上述方法将生物蛋白胶均匀地铺在干净的软骨缺损处，迅速放置已准备好的复合有hWJMSCs：pACs为50：50混合共培养的ACECM取向支架，与上述同样方法检查固定移植物，并关闭手术切口。

大体观见图7。在共培养组6个月的修复结果可见软骨缺损区已被新生组织完全填充，其他各组还有不同程度的缺损。9个月共培养组的修复区表面更加平整、饱满。检察修复股骨髁对应的半月板和胫骨平台，可见在共培养组中这两部分的软骨保留完整，无明显软骨损伤。

H&E染色结果见图8。共培养组新生组织表面较为光滑，与周围正常组织整合良好，新生组织软骨陷窝结构形成。

番红“O”染色结果见图9。共培养组新生组织番红“O”染色呈阳性，细胞外基质更为致密、均匀，细胞周围染色阳性更加明显。

影像学检测及评分(7.0T高分辨核磁共振)见图10。7.0T高分辨核磁共振对各组山羊膝关节行影像学检测结果，扫描参数为T2W1+脂肪抑制，每组结果以矢状位和冠状位呈现，白色箭头所指部位为膝关节股骨髁软骨损伤后修复部位。

人组织相容性抗原(HLA-ABC)免疫荧光染色见图11。共培养组修复区存在HLA-ABC免疫荧光染色阳性细胞，并呈现散在分布，而在正常组织区未发现染色阳性的细胞，这一结果表明，脐带干细胞作为种子细胞确实参与到了软骨组织的修复中。

因此，由原代软骨细胞和脐带间充质干细胞共培养在脱细胞软骨细胞外基质取向支架构建的共培养系统，在良好细胞微环境下通过细胞间相互作用，能够在趋近自然条件下成功诱导间充质干细胞分化成软骨，同时提高了原代软骨细胞的增殖活性。该共培养系统构建的组织工程软骨，移植动物体内修复全层软骨缺损，实现了更快更优质的软骨再生和修复。该共培养系统，一定程度上克服了单纯添加诱导因子来诱导干细胞成软骨分化带来的细胞肥大或钙化等问题，以及软骨细胞体外扩增面临的去分化困境。总的来说，该共培养系统即克服了基础问题又符合临床需求，有望成为未来软骨组织修复与再生最具前景的策略之一。

本发明通过共培养同时解决软骨组织工程种子细胞数量和质量问题，细胞数量方面，通过与来源丰富的脐带间充质干细胞共培养，大大降低了软骨细胞的数量，弥补了软骨组织来源受限，软骨细胞不足的问题；细胞质量方面，有限的软骨细胞不需进行体外扩增，保留了软骨细胞最佳表型，避免扩增后退变而失去表型，同时原代软骨细胞与脱细胞软骨细胞外基质取向支架构建软骨微环境，替代诱导因子的添加，定向持久调控脐带间充质干细胞成软骨分化，并稳定在软骨细胞功能状态，避免发生肥大或钙化。

本发明为软骨再生与修复搭建更高平台，实现更快修复。该共培养系统构成成分包括原代软骨细胞、脐带间充质干细胞及脱细胞软骨细胞外基质取向支架。原代软骨细胞和脱细胞软骨细胞外基质取向支架，本就是软骨组织的细胞和细胞外基质成分，且支架空间结构具有仿生天然软骨组织结构的特点，因此，在此基础上构建软骨组织其起点更高。脐带间充质干细胞具有增殖快、更易分化成软骨的特性，在软骨微环境下更易分化成软骨。该共培养系统在构建软骨组织方面具有独特的细胞、细胞外基质成分和空间结构方面的优势，能够获得质量更优，速度更快的软骨再生与修复。

在细胞来源和支架材料方面可进行替代，如原代软骨细胞可用扩增后的软骨细胞、骨关节炎软细胞，脐带间充质干细胞可用脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞和滑膜间充质干细胞等，但替换后的软骨细胞表型较差，其他组织来源的间充质干细胞的获得对受试者带来伤害，且细胞活性受到受试者自身健康状况的影响，难以达到原代软骨细胞的软骨表型和脐带间充质干细胞细胞活性。生物材料方面，可以有壳聚糖、蚕丝蛋白、藻酸钙、聚乳酸、聚乙酸乙酯等天然或合成材料替代脱细胞软骨细胞外基质材料，但这些材料均不能同时实现生化成分和空间结构的双重仿生，而脱细胞软骨细胞外基质取向支架可以在生化成分和空间结构上为软骨再生提供更高平台，促进软骨修复与再生。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，依据本发明的技术实质，对以上实施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等，均仍属于本发明技术方案的保护范围之内。

Claims

1.一种基于共培养系统构建的组织工程软骨促进软骨修复的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)在无菌条件下,从膝关节非负重区获取适量软骨组织，通过酶消化法进行原代软骨细胞的分离、培养；从新鲜足月健康的脐带组织Wharton’s胶中，应用微组织块培养法分离、培养脐带间充质干细胞，并传代扩增至P3代细胞；

3)以脱细胞软骨细胞外基质取向支架为共培养载体，将原代软骨细胞、脐带间充质干细胞以一定比例混合，通过细胞悬液滴种法将细胞种植于干燥的支架载体中，孵育培养一段时间构建共培养组织；将共培养组织移植至关节软骨缺损处，用于关节软骨修复。

2.根据权利要求1所述的基于共培养系统构建的组织工程软骨促进软骨修复的方法，其特征在于：步骤1)中，所述的原代软骨细胞为将膝关节非负重区软骨组织剪碎后，添加Ⅱ型胶原酶，在孵育箱中搅拌下进行消化，制备成细胞悬液并放置培养皿中，添加细胞培养液，放置温箱，培养获得原代软骨细胞，待细胞融合至80％后，胰酶消化收集备用。

3.根据权利要求1所述的基于共培养系统构建的组织工程软骨促进软骨修复的方法，其特征在于：步骤1)中，所述的脐带间充质干细胞为在无菌条件下将新鲜足月健康的脐带组织清理血迹、动静脉血管、筋膜及脂肪组织，获得Wharton’s胶组织块，剪碎为微组织块，在培养皿中添加含血清培养基，放置温箱，应用微组织块培养法分离、培养脐带间充质干细胞。

4.根据权利要求1所述的基于共培养系统构建的组织工程软骨促进软骨修复的方法，其特征在于：步骤2)中，所述的支架为将天然软骨通过成微丝处理、去细胞处理和固化和/或强化处理得到。

5.根据权利要求1所述的基于共培养系统构建的组织工程软骨促进软骨修复的方法，其特征在于：步骤3)中，原代软骨细胞、脐带间充质干细胞两种细胞以50:50的质量比例混合。

6.根据权利要求1所述的基于共培养系统构建的组织工程软骨促进软骨修复的方法，其特征在于：步骤3)中，细胞悬液的浓度为：每200μl细胞悬液含有10⁶个细胞。

7.根据权利要求1所述的基于共培养系统构建的组织工程软骨促进软骨修复的方法，其特征在于：步骤3)中，孵育培养方法为：将种植细胞的支架载体放置温箱，在支架饱和培养液的状态下孵育2h促进细胞粘附于支架中，然后添加培养基在温箱内共培养3周，构建共培养组织。

8.根据权利要求7所述的基于共培养系统构建的组织工程软骨促进软骨修复的方法，其特征在于：温箱条件为5％CO₂，37℃；添加细胞培养基5ml，细胞培养基以质量分数计包括成分：10％FBS，DMEM/F12，1％谷氨酰胺，1％Vitamin C，1％青霉素和1％链霉素。