CN111558086A - 一种含有翻译调节肿瘤蛋白的软骨修复材料及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了含有翻译调节肿瘤蛋白(TCTP)的软骨修复材料的制备方法及其在治疗关节软骨损伤中的应用。本发明构建的软骨修复材料含有TCTP，因此具有较强的促进软骨细胞增殖的作用，而且该材料具有3D复合体结构，很好的模拟了软骨细胞在体内生存的微环境，含TCTP的软骨修复材料为软骨细胞的生长和代谢提供了适宜的微环境，保证软骨细胞快速增殖。本发明的修复材料选用胶原海绵和海藻酸钠组合作为支架，其具有生物可吸收，无毒的特性，具有很好的组织相溶性和细胞吸附性，对软骨损伤修复具有显著的促进作用。

Description

一种含有翻译调节肿瘤蛋白的软骨修复材料及其制备方法与 应用
技术领域
本发明属于细胞技术领域，具体涉及一种含有翻译调节肿瘤蛋白的软骨修复材料以及制备方法和应用。
背景技术
关节软骨损伤是一种多见于膝关节等负重关节的常见多发病，常引起关节肿痛及畸形等，目前尚无理想的治疗方法，软骨组织工程作为新兴的治疗方法用于治疗关节软骨损伤。软骨组织工程三要素包括：细胞，支架和生长因子，目前，细胞类型包括：干细胞和各类分化细胞；生长因子包括：激素和各类细胞生长因子；常用的细胞支架包括：人工合成可降解聚合物以及透明质酸类支架。
转化生长因子-β3(TGF-β3)和骨形态发生蛋白-6(BMP-6)作为最常见的生长因子，具有起效快、短期疗效显著的特点，但TGF-β3和BMP-6具有促分化作用，会不同程度的改变软骨细胞的状态和活力，不能很好修复软骨损伤。激素具有快速起效的作用效果，但因其副作用较大，长期治疗效果欠佳。透明质酸在临床被广泛应用，但透明质酸存在提取流程繁冗，价格昂贵，且复合胶原水凝胶制作步骤繁琐的缺点。此外，人工合成可降解聚合物具有亲水性差，细胞吸附力弱以及可能会引起无菌性炎症的缺点。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供了翻译调节肿瘤蛋白在制备治疗关节软骨损伤产品中的应用以及一种含有翻译调节肿瘤蛋白的软骨修复材料。
本发明一方面提供了一种软骨修复材料，所述软骨修复材料是由翻译调节肿瘤蛋白、海藻酸钠、胶原海绵以及软骨细胞制备而成，且形成具有3D结构的复合物。
本发明中之所以选择翻译调节肿瘤蛋白(TCTP)，是因为TCTP是一种常表达于肿瘤细胞和大肠杆菌的蛋白因子，具有显著促进软骨细胞增殖的作用。海藻酸钠是从褐藻或细菌中提取出的天然高分子多糖，类似于细胞外基质中的糖胺聚糖(GAG)，但具有来源丰富、价格低廉、快速成形、对生物体无毒害以及制作简单的优点。医用胶原海绵是一种商业化胶原海绵，具有缓释药物、可吸收降解、安全性高的特点。本发明将构建的TCTP-海藻酸钠-胶原海绵-软骨细胞3D复合物进行体外培养，并将其植入关节软骨损伤区域进行修复。此条件下，软骨细胞可以很好的扩增并形成软骨，动物实验中，本发明将体外培养的3D复合物植入大鼠损伤关节软骨区域进行6周和12周的修复，结果显示大鼠损伤区域的软骨细胞II型胶原和糖胺聚糖AGG表达量显著增加，预示着本发明制备的3D复合物对损伤软骨进行了很好的修复。
本发明另一方面提供了一种本发明所述的软骨修复材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将离体的动物软骨放入消化液中消化；
(2)将步骤(1)获得的消化液过滤，离心，获得原代软骨细胞；
(3)将原代软骨细胞制备成单细胞悬液后，培养传代至3～4代；
(4)将含有海藻酸钠和翻译调节肿瘤蛋白的软骨细胞悬液注入胶原海绵中，即可获得本发明的软骨修复材料。
优选地，所述步骤(1)中消化的具体步骤为：将离体的动物软骨移入I型胶原酶消化液中，37℃消化30分钟；然后再将其放入含有I型胶原酶和D型胶原酶的消化液中，37℃消化4-6小时。
优选地，所述步骤(2)中过滤采用45μm的滤膜过滤。
优选地，所述步骤(2)中获得原代软骨细胞的具体步骤为：用DMEM高糖完全培养基重悬离心细胞，并于37℃，5％CO2条件下培养，隔天更换新鲜培养基，获得原代软骨细胞。
优选地，所述步骤(3)的具体操作如下：在原代细胞中加入胰酶，制备成单细胞悬液，将悬液离心，以2×105/mL的密度转入新的培养瓶中，将软骨细胞培养传代至3～4代。
优选地，所述步骤(4)中海藻酸钠的浓度为4％(w/v)。
优选地，所述步骤(4)中翻译调节肿瘤蛋白的浓度为10～50μg/mL。
优选地，所述步骤(4)中翻译调节肿瘤蛋白的浓度为20μg/mL。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明构建的软骨修复材料由于含有TCTP，因此具有较强的促进软骨细胞增殖的作用，且该材料较好的模拟了软骨细胞体内生长的微环境。本发明的修复材料选用胶原海绵和海藻酸钠组合作为支架，其具有生物可吸收，无毒的特性，具有很好的组织相溶性和细胞吸附性，对软骨损伤修复具有显著的促进作用。
附图说明
图1为SD大鼠原代关节软骨细胞贴壁后状态示意图(标尺：100μm)。
图2为SD大鼠原代关节软骨细胞加入胰酶后收缩变圆示意图(标尺：100μm)。
图3为TCTP各浓度对软骨细胞活性的影响示意图。
图4为采用检测软骨细胞糖胺聚糖AGG分泌的经典方法---阿利新蓝染色法检测TCTP各浓度对软骨细胞糖胺聚糖AGG分泌的影响示意图。
图5为本发明构建的TCTP-海藻酸钠-胶原海绵-软骨细胞3D复合物体外培养14天后的冰冻切片经H&E染色、阿尔新蓝染色、番红固绿染色分别检验软骨细胞的生长状态、软骨细胞分泌的糖胺聚糖AGG的含量以及形成新生软骨组织的示意图(标尺：50μm)。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。如无特殊说明，本发明涉及到的所有试剂与耗材均通过商业途径获得。
以下实施例中使用的试剂和材料来源如下：
医用胶原蛋白海绵：国械注准：20143642302，无锡贝迪生物工程股份有限公司，规格：25×10×5mm。海藻酸钠：青岛明月海藻集团有限公司。DMEM高糖完全培养基，货号：105640；胰酶，货号：25300054；胎牛血清：货号：10100147，青-链霉素，货号：15070063，均由Gibco公司提供。翻译调节肿瘤蛋白(TCTP)，货号：ICA962Mu01，1mg，上海联迈生物工程有限公司(LMAIBio)，0.1％BSA稀释，-80℃保存。
实施例1构建TCTP-海藻酸钠-胶原海绵-软骨细胞3D复合物
1、新生SD大鼠原代关节软骨细胞分离
取新生SD大鼠3只，无菌环境下麻醉并处死后，用无菌手术刀片和眼科镊分离股骨头和胫骨，剔除软组织，将分离处的膝关节软骨放入1×PBS缓冲液，清洗两次；将分离的关节软骨移入I型胶原酶(0.7mg/mL)消化液中，在37℃恒温水浴箱振荡消化30分钟，之后，弃掉粘稠状溶液。将消化掉肌肉组织的关节软骨放入含有I型胶原酶(0.7mg/mL)和D型胶原酶(3mg/mL)的消化液中，将组织块吹散，反复消化，37℃恒温水箱振荡消化4-6小时，收集消化液并用45μm的滤膜过滤，滤液在1000g转速下离心10分钟，收集沉淀，用DMEM高糖培养基重悬细胞，并按照2×105/mL的密度接种在10cm的培养皿中，加入10mL DMEM高糖培养基，于37℃，5％CO2培养箱中进行培养。隔天，弃掉培养基，用无菌PBS清洗细胞3次，换入新的DMEM高糖培养基，DMEM高糖完全培养基含有10％澳洲胎牛血清和1％青霉素/链霉素，可看到贴壁的原代软骨细胞成圆形或多边形(图1)。平均每只SD大鼠可分离得到原代软骨数目为107。
2、原代软骨细胞消化传代
预先将操作台灭菌，并将胰酶及无菌器材放入操作台，从培养箱内取出细胞，用移液管将培养皿内培养液吸出，并加入PBS液清洗细胞2次，缓慢平摇，以充分洗去细胞上残余的培养液，再加入胰酶2mL，覆盖细胞表面。将培养皿置于倒置显微镜下观察细胞形态。约1～2分钟后，可见细胞由贴壁逐渐收缩变为悬浮状态(图2)，立刻加入4mL的DMEM高糖完全培养基终止消化。用移液管轻轻吹打细胞，使其成为单细胞悬液。将悬液离心，计数并按照2×105/mL的密度至新的75cm2培养瓶中，将软骨细胞培养传代至3～4代，用于后续各项实验，将剩余活性好的细胞进行冻存，以便后续实验使用。
3、翻译调节肿瘤蛋白(TCTP)浓度的筛选
为了进一步确定TCTP对软骨细胞的最佳作用浓度，设计MTS实验和细胞微团块培养及阿尔新蓝染色实验，MTS步骤实验如下：将传代至3～4代的软骨细胞重悬至浓度2×104/mL，取一个96孔板，每孔加入0.2mL细胞悬液，次日，将培养基弃掉，加入分别含TCTP浓度为0,10,20,50μg/mL的DMEM高糖完全培养基，培养48小时后，进行MTS法检测TCTP对软骨细胞的毒害作用和细胞活力影响(图3)。细胞微团块培养及阿尔新蓝染色实验如下：将传代至3～4代的软骨细胞重悬至浓度为10-7的细胞悬液，取一个12孔板，吸取20μL细胞悬液滴入孔中央，待4小时后，细胞贴壁，此时，加入含TCTP浓度分别为0,10,20,50μg/mL的DMEM高糖完全培养基，每三天换液一次，培养14天后，弃掉培养基，PBS洗涤3次，用4％多聚甲醛固定，每孔加入0.3％阿尔新蓝染液，染色30分钟，移去染液，PBS洗涤3次，晾干，拍照，进行分析(图4)，由图3、4可知，TCTP对软骨细胞的最佳作用浓度为20μg/mL。
4、3D培养体系的构建
用4％(w/v)灭菌的海藻酸钠溶液配制TCTP浓度为20μg/mL，原代软骨细胞用胰酶消化后，用上述含TCTP的4％海藻酸钠溶液重悬细胞，制成密度为1×108/mL的细胞悬液，吹打均匀，准备一个2×2×2mm3的胶原海绵(医用胶原海绵由无锡贝迪生物工程股份有限公司提供)，将其浸入102mM无菌CaCl2溶液中，静置3分钟后，沿着胶原海绵的各个面缓慢注射20μL制备好的细胞悬液。海藻酸钠、TCTP、胶原海绵与软骨细胞很快凝结成一个具有一点硬度的3D复合物，待复合物静置3分钟后，将其移入含有完全培养基的12孔板中，在37℃，5％CO2的培养箱中培养14天，培养结束后，复合物经过固定、包埋和脱水，将其制作冰冻切片并进行H&E，番红固绿和阿尔新蓝染色。
结果如图5所知，本发明构建的TCTP-海藻酸钠-胶原海绵-软骨细胞3D复合物体外培养14天后的冰冻切片，H&E显示，软骨细胞在所述3D复合物中舒展并在TCTP作用下，呈现出良好的生长状态；阿尔新蓝染色显示，软骨细胞分泌出大量的糖胺聚糖AGG，使细胞完全被包裹在细胞外基质中；番红固绿染色提示，已经有代表新生软骨组织形成的红色区域出现，表明该3D复合物具有较强的形成软骨的能力。证实软骨细胞附着在藻酸盐-胶原海绵支架上，经TCTP持续作用可以生成软骨。
实施例2验证本发明所述软骨细胞3D复合物对损伤关节软骨的修复效果
1、建立6周龄SD大鼠关节软骨损伤模型
无菌条件下将6周龄SD大鼠用甲苯噻嗪(5mg/kg)和麻醉氯胺(40mg/kg)进行麻醉，在体视显微镜下，将大鼠右后肢皮肤沿髌骨内侧缘切开，显露股四头肌，髌骨，髌腱。从髌骨内侧缘(保留0.5cm软组织以利用缝合)切开至胫骨，注意不要向内侧或外侧剥离过多，以防损伤内侧副韧带或髌韧带，以免引起严重并发症。接着分离髌骨和髌韧带下方的髌下脂肪垫及其它软组织，以显露股骨内侧髁和股骨外侧髁。此时，两骨髁的光滑面与髌骨相连，髁间窝清晰地显现。用22G手术针插入股骨髁间窝2mm处。此时一个直径2mm，深度2mm关节软骨面缺损模型形成。
2、软骨细胞3D复合物促进损伤关节软骨修复
将实施例1制备的3D复合物植入6周龄SD大鼠关节软骨损伤区域进行修复，移植的作为实验组，未移植的作为对照组，此后对大鼠进行正常饲养。小鼠股骨远端分别在6周和12周后解剖获得。收集关节软骨损伤区域的组织，将组织研磨，检测两组实验的软骨组织中II型胶原和糖胺聚糖AGG的表达量，结果如表1所示：
表1：修复组和对照组中II型胶原和糖胺聚糖AGG的表达量
Figure BDA0002473397320000071
由表1可知，术后6周实验修复组织的II型胶原的平均含量为5.1μg/mL，对照组为3.5μg/mL，术后12周实验修复组织的II型胶原含量为7.0μg/mL，对照组为4.9μg/mL，术后6周实验修复组织的糖胺聚糖AGG的含量为8.9μg/mL，对照组为6.6μg/mL，术后12周实验修复组织的糖胺聚糖AGG含量为11.2μg/mL，对照组为8.2μg/mL，可见，与对照组相比，经过本发明制备的3D复合物的治疗修复组中大鼠的II型胶原和糖胺聚糖AGG显著提高，说明该组中大鼠的损伤软骨得到了很好的修复。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.翻译调节肿瘤蛋白在制备治疗关节软骨损伤产品中的应用。
2.一种软骨修复材料，其特征在于，所述软骨修复材料是由翻译调节肿瘤蛋白、海藻酸钠、胶原海绵以及软骨细胞制备而成，且形成具有3D结构的复合物。
3.一种如权利要求2所述的软骨修复材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将离体的动物软骨放入消化液中消化；
(2)将步骤(1)获得的消化液过滤，离心，获得原代软骨细胞；
(3)将原代软骨细胞制备成单细胞悬液后，培养传代至3～4代；
(4)将含有海藻酸钠和翻译调节肿瘤蛋白的软骨细胞悬液注入胶原海绵中，即可获得本发明的软骨修复材料。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中消化的具体步骤为：将离体的动物软骨移入I型胶原酶消化液中，37℃消化30分钟；然后再将其放入含有I型胶原酶和D型胶原酶的消化液中，37℃消化4-6小时。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中过滤采用45μm的滤膜过滤。
6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中获得原代软骨细胞的具体步骤为：用含20％澳洲胎牛血清，1％青霉素/链霉素的DMEM高糖完全培养基重悬离心细胞，并于37℃，5％CO2条件下培养，隔天更换新鲜培养基，获得原代软骨细胞。
7.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)的具体操作如下：在原代细胞中加入胰酶，制备成单细胞悬液，将悬液离心，以2×105/mL的密度转入新的培养瓶中，将软骨细胞培养传代至3～4代。
8.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中海藻酸钠的浓度为4％(w/v)。
9.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中翻译调节肿瘤蛋白的浓度为10～50μg/mL。
10.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中翻译调节肿瘤蛋白的浓度为20μg/mL。
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