DE60026586T2

DE60026586T2 - Zellulare matrix

Info

Publication number: DE60026586T2
Application number: DE60026586T
Authority: DE
Inventors: Karl Peter MÜLLER; Peter Behrens; Bruno Giannetti; Jüergen ROHWEDEL; Martin Russlies
Original assignee: Verigen AG
Current assignee: Verigen AG
Priority date: 1999-12-20
Filing date: 2000-12-19
Publication date: 2007-01-11
Anticipated expiration: 2020-12-20
Also published as: US6623963B1; EP1255577B1; ATE319489T1; DE60026586D1; WO2001045764A1; AU2018801A; EP1255577A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Matrix, die unter anderem geeignet ist für das Stützen, Zurückhalten und/oder das Wachstum von lebenden Zellen, in einer Form, die beispielsweise für Zelltransplantation geeignet ist. Insbesondere betrifft sie eine wiederhergestellte Kollagenmatrix, die für Zellwachstum geeignet ist, wie etwa das Wachstum von Chondrozytenzellen, zur Verwendung bei der Transplantation von Chondrozytenzellen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Verletzungen des Knorpels des Knies oder anderer Gelenke resultieren oftmals aus abnormalen mechanischen Belastungen, welche die Gewebematrix deformieren. Die an das Gelenk angelegten Belastungen können das Kollagennetzwerk in der Matrix aufbrechen und die Steifigkeit des Gewebes verringern.
Knorpelverletzungen sind schwierig zu behandeln, da Gelenkknorpel, der beschädigt worden ist, eine begrenzte Kapazität zur Regeneration hat. Typ II Kollagen ist das Hauptstrukturprotein der extrazellulären Matrix in Gelenkknorpel. Typ II Kollagen ist ähnlich wie andere Typen an Kollagen aus drei Kollagenpolypeptiden gebildet, die eine Dreifachhelixkonfiguration bilden. Die Polypeptide sind miteinander verschlungen und besitzen an jedem Ende Telopeptidregionen, die für eine Vernetzung zwischen den Kollagenpolypeptiden sorgen. Kollagenmatrices enthalten in ihrem natürlichen Zustand zahlreiche vernetzte Dreifachhelices und die individuellen Moleküle haben ein Molekulargewicht von etwa 300.000 Dalton. Typ II Kollagen wird fast ausschließlich in Tierknorpel angetroffen, während andere Kollagentypen in Tierhäuten, Membranen und Knochen angetroffen werden.
Ein übermäßiger Abbau von Typ II Kollagen in den äußeren Schichten von artikulären Oberflächen von Gelenken wird auch durch Osteoarthritis hervorgerufen. Das Kollagennetzwerk wird dementsprechend geschwächt und entwickelt danach eine Auffaserung, wobei Matrixsubstanzen wie etwa Proteoglycane verloren gehen und letztlich vollständig verdrängt werden. Eine derartige Auffaserung von geschwächtem osteoarthritischen Knorpel kann bis in den kalkhaltigen Knorpel herab und in den unter dem Knorpel liegenden Knochen hinein reichen (Kempson, G. E. et al., Biochim. Biophys. Acta 1976, 428, 741; Roth, V. und Mow, V. C., J. Bone Joint Surgery, 1980, 62A, 1102; Woo, S. L.-Y. et al., in Handbook of Bioengineering (Hrsg. R. Skalak und S. Chien), McGraw-Hill, New York, 1987, Seiten 4.1–4.44).
Ein Verfahren zur Regenerationsbehandlung von Knorpel wäre nützlich um Arthritis und andere Gelenkerkrankungen zu behandeln, und könnte während eines früheren Stadiums einer Gelenkschädigung durchgeführt werden, wodurch sich die Zahl von Patienten, welche extensivere Vorgehensweisen wie etwa chirurgischen künstlichen Gelenkersatz benötigen, verringern würde. Mit derartigen präventiven Behandlungsverfahren würde sich auch die Zahl von Patienten, die eine Osteoarthritis entwickeln, verringern.
Verfahren zum Züchten und Verwenden von Chondrozytenzellen sind von Brittberg, M. et al. (New Engl. J. Med. 1994, 331, 889) beschrieben worden. Autologe Transplantate unter Verwendung von Zellen, die mit diesen Verfahren gezüchtet worden sind, sind ebenfalls offenbart. Zusätzlich untersuchten Kolettas et al. die Expression von für Knorpel spezifischen Molekülen, wie etwa von Kollagenen und Proteoglycanen, unter Langzeit-Zellkultivierung (J. Cell Science 1995, 108, 1991). Sie fanden heraus, dass trotz morphologischer Veränderungen während einer Kultivierung in Monoschichtkulturen (Aulthouse, A. et al., In Vitro Cell Dev. Biol., 1989, 25, 659; Archer, C. et al., J. Cell. Sci. 1990, 97, 361; Hänselmann, H. et al., J. Cell Sci. 1994, 107, 17; Bonaventure, J. et al., Exp. Cell Res. 1994, 212, 97), im Vergleich zu von verschiedenen Wissenschaftlern getesteten Suspensionskulturen, die über Agarosegelen, Alginatkügelchen oder als Spinnerkulturen (wobei eine runde Zellmorphologie beibehalten wird) gezüchtet wurden, derartige Morphologien den Chondrozyten nicht veränderten – exprimierte Marker wie etwa die Kollagentypen II und IX und die großen aggregierenden Proteoglycane, Aggrecan, Versican und Linkprotein veränderten sich nicht (Kolettas, E. et al., J. Cell Science 1995, 108, 1991).
Zusätzlich wurden Chondrozytenzellen von Donoren in vitro gezüchtet, wobei Neoknorpel gebildet wurde, der Tieren implantiert wurde (Adkisson et al., "A Novel Scaffold-Independent Neocartilage Graft for Articular Cartilage Repair", ICRS 2^nd Symposium International Cartilage Repair Society, 16.–18. November 1998). Weiterhin wurden Chondrozytenzellen auf die Knorpeloberfläche von osteochondralen Kernen angeimpft um eine Regenerierung von Knorpel zu versuchen (Albrecht et al., "Circumferential Seeding of Chondrocytes: Towards Enhancement of Integrative Cartilage Repair", ICRS 2^nd Symposium International Cartilage Repair Society, 16.–18. November 1998). Defekte von artikulären Oberflächen in Kniegelenken wurden mit verschiedenen kultivierten Chondrozyten behandelt (Stone et al., Operative Techniques in Orthopaedics 7(4), Seiten 305–311, Oktober 1997, und Minas et al., Operative Techniques in Orthopaedics 7(4), Seiten 323–333, Oktober 1997).
Membranen und bestimmte ihrer allgemeinen Eigenschaften sind in den nachfolgenden Literaturstellen beschrieben:
US Patent Nr. 5,837,278 – Geistlich et al. beschreiben eine Kollagen-enthaltende Membran, die resorbierbar ist und bei geführter Geweberegeneration verwendet wird. Die Membran hat eine Faserfläche, die das Wachstum von Zellen darauf gestattet, und eine glatte Fläche gegenüber der Faserfläche, welche die Adhäsion von Zellen daran inhibiert. Das Membranprodukt ist von einer natürlichen Kollagenmembran abgeleitet (aus der Haut oder aus Sehnen von Kälbern oder Ferkeln), und obwohl sie behandelt ist, wird beschrieben, dass sie ihre natürlichen Strukturmerkmale beibehält. Das Kollagen wird mit alkalischen Mitteln gereinigt um das Kollagen zu entfetten und um Substanzen abzubauen, und danach wird das gereinigte Kollagen angesäuert, gewaschen, getrocknet, entfettet und gegebenenfalls vernetzt. Die Fette werden verseift. Wie beschrieben enthält die Membran etwa 95 Gew.-% natives Kollagen.
PCT WO 96/25961 – Geistlich et al. beschreiben eine Matrix zur Rekonstruktion von Knorpelgewebe, welche aus Typ II Kollagen besteht, das gegebenenfalls vernetzt ist. Bei der Herstellung der Matrix wird Knorpel aus einem Tier entnommen und eingefroren, einer Größenverringerung unterzogen, entwässert, entfettet, gewaschen und mit alkalischen Materialien behandelt. Von Kollagen verschiedene, im Alkalischen lösliche Proteine werden denaturiert, zerstört, aufgelöst und eliminiert. Dialyse und Gefriertrocknen sind als mögliche Behandlungsschritte erwähnt. Das Matrixmaterial wird gepresst, so dass es eine gewünschte Form annimmt, und wird danach sterilisiert.
US Patent Nr. 4,424,208 – Wallace et al. beschreiben ein injizierbares Kollagenimplantatmaterial, umfassend partikelförmiges vernetztes Atelopeptidkollagen und rekonstituierte Atelopeptidkollagenfasern, dispergiert in einem wässrigen Träger. Der Atelopeptid-Form von Kollagen fehlt die native Telopeptid-Vernetzung. In dem im '208 Patent beschriebenen Verfahren wird Kollagen, das aus der Lederhaut (subepitheliale Hautschicht) von Rind oder Schwein erhalten wurde, durch Einweichen in einer milden Säure weich gemacht, epiliert, durch physikalische Behandlung wie etwa Mahlen zerkleinert, durch Behandlung mit einer Säure und einem proteolytischen Enzym solubilisiert (gelöst), mit einer alkalischen Lösung behandelt und von Enzym befreit. Die vernetzte Gelform von Kollagen wird durch strahlungsinduziertes oder chemisch indiziertes Vernetzen, wie etwa durch Zugabe von Glutaraldehyd, gebildet. Die Faserform von Kollagen wird stattdessen durch Neutralisierung der Lösung mit einem Puffer wie etwa Na₂HPO₄ hergestellt. Der Kollagengehalt des injizierbaren Implantats umfasst 5–30% faserförmiges Kollagen und 70–98% der vernetzten Gelform von Kollagen.
US Patent Nr. 4,488,911 – Luck et al. beschreiben die Bildung von Kollagenfasern, die den immunogenen Telopeptidanteil von nativem Kollagen nicht aufweisen. Die Telopeptidregion stellt in nativem Kollagen Vernetzungspunkte bereit. Gemäß der Beschreibung sind die Fasern, die vernetzt sein können, für die Verwendung als Schwämme, Prothesevorrichtungen, Filme, Membranen und Nähte. Gemäß dem in dem '911 Patent beschriebenen Verfahren wird Kollagen (nicht Typ II; Typ I und andere), das aus Sehnen, der Haut und aus Bindegewebe von Tieren wie etwa einer Kuh erhalten wird, in einer Essigsäurelösung dispergiert, durch einen Fleischwolf geführt, mit Pepsin behandelt um die Telopeptide zu spalten und das Kollagen zu solubilisieren, präzipitiert, dialysiert, durch Zugabe von Formaldehyd vernetzt, sterilisiert und lyophilisiert. Das '911 Patent gibt an, dass sein offenbartes Verfahren die Atelokollagenform von Kollagen ergibt, frei von nicht-Kollagen-Proteinen, wie etwa Glycosaminoglycanen und Lipiden. Weiterhin beschreibt es, dass das Kollagen als ein Gel verwendet werden kann, um beispielsweise eine Membran, einen Film oder einen Schwamm herzustellen, und dass der Vernetzungsgrad des Kollagens gesteuert werden kann um seine strukturellen Eigenschaften zu verändern.
Ungeachtet der vorstehenden Offenbarungen gehen die Anmelder davon aus, dass weiterhin ein Bedarf besteht für ein zufrieden stellendes und wirksames Gerüst für das Wachstum von Zellen, insbesondere das Wachstum von Chondrozytenzellen.
KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren nach Anspruch 1 und eine wiederhergestellte (rekonstituierte) biokompatible resorbierbare auf Typ II Kollagen basierende Matrix nach Anspruch 4, zur Verwendung beispielsweise als ein Gerüst, auf dem Zellen wie etwa Chondrozytenzellen kultiviert werden können, und ein Verfahren zum Herstellen der Matrix bereit. Weiterhin kann die Matrix als ein Blatt bzw. eine Lage verwendet werden um kleine Knorpelläsionen abzudecken, oder sie kann in Kombination mit von Chondrozyten verschiedenen Zellen (d.h. mit mesenchymalen Stammzellen) verwendet werden. Das Typ II Kollagen der Matrix der vorliegenden Erfindung ist solubilisiert durch Aufbrechen der Vernetzung des Kollagens mittels dessen Telopeptidregion in seine nicht vernetzte Atelokollagen-Form. Die Matrix kann eine Stützmatrix sein, welche ein Gerüst bereitstellt, auf dem Zellen gezüchtet und gehalten werden können.
Die erfindungsgemäße Matrix wird hergestellt durch die Wiederherstellung von tierischem Knorpelgewebe (Pferd, Schwein, Rind (oder Kalb), Ziege, Huhn oder Känguru) durch die Solubilisierung des Typ II Kollagens und die Entfernung von assoziierten Proteinen und Molekülen aus dem Gewebe, und durch nachfolgende Isolierung, Vernetzung und Lyophilisierung, um eine Vlies-ähnliche Matrix zu bilden.
Die erfindungsgemäße Matrixzusammensetzung wird als eine Basis zum Züchten und Anheften von lebenden Zellen daran, insbesondere von Chondrozytenzellen, verwendet. In dieser Ausführungsform heften sich Chondrozytenzellen an die Matrix an und wachsen im Wesentlichen so wie sie das in vivo machen.
Die vorliegende Erfindung stellt einen implantierbaren Gegenstand bereit, umfassend Chondrozytenzellen, die auf der Stützmatrix gehalten sind, und ein Verfahren zu dessen Herstellung. Sie ermöglicht Gewebereparatur, insbesondere die wirksame Behandlung von artikulärem Knorpel von Gelenkoberflächen, in einem Tier, durch die Transplantation eines implantierbaren Gegenstands, der entweder autologe oder homologe Chondrozytenzellen umfasst, welche auf der Stützmatrix gehalten oder mit ihr kombiniert sind.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die vorliegende Erfindung kann besser verstanden werden durch Bezugnahme auf die nachstehende Beschreibung, zusammen mit den beigefügten Figuren, welche die vorliegende Erfindung erläutern, und worin:
1 eine beispielhafte Pressvorrichtung zum Formen der Matrix in die blattähnliche Konfiguration gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt,
2 die zwei Komponenten der beispielhaften Pressvorrichtung von 1 zum Formen der Matrix in die blattähnliche Konfiguration gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt,
3 die Ergebnisse eines Elektrophoresegels wiedergibt, das die unterschiedlichen Größen der Ketten von Typ II Kollagen, welche in der Matrix der vorliegenden Erfindung verwendet werden, zeigt,
4 die Ergebnisse von zwei Elektrophoresegelen wiedergibt, welche die unterschiedlichen Größen von Banden für das in der Matrix der vorliegenden Erfindung verwendete Typ II Kollagen zeigen,
5 eine Rasterelektronenmikroskop-Aufnahme von Chondrozyten zeigt, die auf Kunststoffoberflächen gezüchtet wurden, und
6 eine Durchstrahlungselektronenmikroskop-Aufnahme von Chondrozyten zeigt, die auf der Matrix der vorliegenden Erfindung angeimpft wurden.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft eine wiederhergestellte Typ II Kollagenmatrix (nachstehend hierin "Gerüst" oder "Stützmatrix"), welche beispielsweise als eine Stützmatrix zum Stützen des Wachstums von Zellen wie etwa Chondrozytenzellen verwendet werden kann, und ein Verfahren zur Herstellung der Matrix. Nach Vernetzung hat die Matrix eine Vlies-ähnliche Konsistenz, die wenn mit Zellen beladen in eine Stelle im Körper implantiert werden kann, die einer Reparatur bedarf (z.B. geschädigtes Gewebe), und in eine passende Form zur Deponierung an dieser Stelle geformt werden kann. In ihrer nicht vernetzten Form hat die Matrix eine flüssige oder Gel-ähnliche Konsistenz. In der Vlies-ähnlichen Form ist die Matrix reversibel deformierbar, während sie vom Anwender gehandhabt wird, so dass ein implantierbares Gewebe, welches die Matrix umfasst, manipuliert werden kann um eine Implantation zu erleichtern; sie verbleibt danach an der Implantationsstelle.
Die Typ II Kollagenmatrix ist erhältlich durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1, durch Wiederherstellen von zuvor solubilisiertem (gelöstem) tierischem Knorpelgewebe aus einem Tier wie etwa Pferd, Schwein, Rind (oder Kalb), Ziege, Huhn oder Känguru. Das aus dem Tier erhaltene Knorpelgewebe wird mittels physikalischer und/oder chemischer Behandlung solubilisiert. Das Solubilisierungsverfahren umfasst eine Behandlung mit verschiedenen Puffern um Verunreinigungen zu entfernen und um die feste und flüssige Phase aufzutrennen; physikalische Behandlung um die feste und flüssige Phase aufzutrennen, wie etwa mittels Zentrifugation; und Behandlung mit einem proteolytischen Enzym, das die Vernetzung des Kollagens in seiner Telopeptidregion zu seiner im Wesentlichen nicht vernetzten Atelokollagen-Dreifachhelixform aufbricht.
Unter Wiederherstellen wird verstanden, dass die nicht vernetzte Atelokollagen-Form von Kollagen ihre Vernetzung zwischen den variablen Regionen entlang des Kollagenmoleküls, umfassend einige verbleibende Reste in der Telopeptidregion, wieder ausbildet. Infolgedessen verliert das Kollagen seine flüssige oder Gel-ähnliche Konsistenz und wird steifer, mit einem höheren Grad an struktureller Integrität, so dass es ein Gerüst für das Wachstum von Zellen daran sein kann.
Die 3 und 4 geben die Ergebnisse einer Gelelektrophoreseuntersuchung des Knorpels in unterschiedlichen Formen wieder, wobei vernetzte und nicht vernetzte Atelokollagen-Ketten gezeigt sind. Die 95 kDa Bande stellt das nicht vernetzte Atelokollagen dar, und die 190 kDa und 285 kDa Banden stellen verschiedene Grade an Vernetzung des Kollagens dar. Die 3 und 4 bestätigen, dass beim Verfahren zur Herstellung der Matrix der vorliegenden Erfindung Kollagen zu seinen nicht vernetzten Typ II Kollagen-Kettenbestandteilen aufgebrochen wird. Die in 3 gezeigten Banden stellen Alpha (Monomere) (95 kDa), Beta (Dimere) (190 kDa) und Gamma (Trimere) (285 kDa) von Typ II Kollagen α1(II)-Ketten dar. Der Immunblot von 4 bestätigt und beweist, dass die Natur der in 3 gezeigten Banden Typ II Kollagen ist.
Die Solubilisierungsbehandlungen entfernen von dem Kollagen auch tote Knorpelzellen, Proteoglycane, Glycosaminoglycane wie etwa Hyaluronsäure, und andere assoziierte Proteine und Moleküle. Die Behandlungen reinigen das Kollagen wirksam und ergeben mehr als 90% reines Kollagen. Das Kollagen kann danach wiederhergestellt werden, um eine ausreichende strukturelle Stabilität für die Verwendung als ein Gerüst bereitzustellen, indem das Kollagen mit Vernetzung versehen wird, und es kann danach lyophilisiert werden um eine Vlies-ähnliche Matrix zu bilden, auf der Zellen gezüchtet und gehalten werden können.
Alternativ kann die Matrixzusammensetzung aus rekombinant erzeugtem Typ II Kollagen hergestellt werden. Das im Wesentlichen reine, rekombinant erzeugte Typ II Kollagen ist nicht vernetzt, kann jedoch Telopeptidregionen aufweisen. Es ist löslich und kann zu einer Vlies-ähnlichen Matrix ausgebildet werden.
Die Matrix kann zwei glatte Oberflächenseiten aufweisen, oder eine ihrer Seiten kann eine raue Oberfläche aufweisen. Eine glatte Oberfläche auf der Matrix beeinträchtigt typischerweise das Einwachsen von Gewebe, während eine raue Oberfläche das Einwachsen von Zellen fördert. Die Oberflächeneigenschaften der Matrix können verändert werden, indem man einen Alkohol wie etwa Ethanol (in einer 10–30% Lösung) langsam in das Lyophilisationsgemisch zugibt.
Weiterhin kann die Konsistenz der Matrix von einer flüssigen oder Gel-ähnlichen Form zu einer festen, Vlies-ähnlichen, flexiblen Form variieren, in Abhängigkeit von einem Kontakt mit einem physiologisch kompatiblen Verdickungs- oder Geliermittel, Aussetzen an Wärme, oder durch eine chemische Reaktion wie etwa eine enzymatische Reaktion (d.h. Behandlung mit Pepsin), oder durch eine mit einem Vernetzungsmittel. Die resultierenden Eigenschaften der Matrix variieren entsprechend. Die Matrix sollte eine Festigkeit (F_max in Newton) von zwischen etwa 0,7 und etwa 1,3, bevorzugt von etwa 1,0 Newton aufweisen. Zusätzlich sollte die maximale Elastizität (F_max) etwa 4,6% bis etwa 5,6%, von etwa 0,176 bis etwa 0,184 N/mm², bevorzugt etwa 5,1% und etwa 0,18 N/mm² betragen. Diese Elastizitätsparameter spiegeln die Festigkeit der zu verwendenden Membran wieder.
Das Vernetzungsmittel kann ein biokompatibles Vernetzungsmittel auf Basis von Aldehyd sein, oder ein mehrwertiger Aldehyd wie etwa Glutaraldehyd. Das Vernetzungsmittel kann auch ein bifunktionelles Mittel sein, mit zwei Resten, welche mit der Stützmatrix und ihren Komponenten reagieren. Beispiele der Reste sind Aldehyde, Ketone, Acetale, Halbacetale; Reste, die für eine oxidative Kopplung zur Verfügung stehen, wie etwa Phenolgruppen; Chinone wie etwa Flavoide; Carboxylgruppen; und aktivierte Carbonsäuren. Ethyldimethylaminopropylcarbodiimid (EDC) kann ebenfalls als Vernetzungsmittel verwendet werden.
Bevorzugte Vernetzungsmittel sind chemische Verbindungen, die zwei Aldehydgruppen enthalten. Die Aldehydgruppen fördern eine Vernetzung durch Überbrückung von Lysinresten auf dem Telopeptidanteil des Typ II Kollagens. Ein besonders bevorzugtes Vernetzungsmittel ist das Bioflavonoid Cyanidanol. Der Typ des zu verwendenden Vernetzungsmittel wird bestimmt durch die Bewertung seiner Wirkung auf die Konsistenz und die physikalischen Eigenschaften der Matrix, und seine physiologische Kompatibilität mit dem Körperbereich, in den die Matrix und die Zellen implantiert werden sollen.
Vernetzung kann auch durch Erwärmen oder Behandeln der Zusammensetzung mit Strahlung bewerkstelligt werden. Zusätzlich kann eine Anwendung von Wärme oder Strahlung auf die Zusammensetzung den Vernetzungsgrad in einer Zusammensetzung, welche bereits chemisch vernetzt ist, beispielsweise durch zuvorige Zugabe einer Aldehyd-enthaltenden Verbindung, erhöhen. Die wärmeinduzierte Vernetzungszunahme kann auch verursachen, dass die Zusammensetzung weniger Gel-ähnlich und steifer wird.
Die Matrix der vorliegenden Erfindung ist besonders nützlich in schmalen oder engen Gelenken wie etwa der menschlichen Hüfte, in denen herkömmliche Kollagenmembranen nicht platziert werden können. Wenn ein enges Gelenk behandelt wird, kann die Matrix manipuliert werden um sie an der Stelle des Gelenks zu platzieren, und sie wird danach nach der Platzierung an der Stelle verbleiben. Die Matrix kann auch zusätzliche Typen von Zellen beinhalten, z.B. Osteozyten für eine Behandlung von Knochenschäden, zusammen mit einem geeigneten Enzym, welches das Wachstum stimuliert.
Die Gelform der mit Zellen wie etwa Chondrozytenzellen beladenen Matrix kann verwendet werden zum Einbau, wie etwa mittels Injektion, in enge Gelenke oder andere Bereiche, bei denen ein Einbau einer Vlies-ähnlichen Matrix (bei der die Kollagenmoleküle bereits vernetzt sind) schwierig oder unmöglich wäre. Wenn die Gel-ähnliche Matrix in eine Stelle im Körper injiziert wird, kann gleichzeitig ein Vernetzungsmittel an dieser Stelle injiziert werden um für eine Vernetzung im Typ II Kollagen der Matrix zu sorgen. Diese Vernetzung würde verursachen, dass die Matrix steifer würde, für eine höhere strukturelle Integrität und Stabilität an der Implantationsstelle. Jedes geeignete biokompatible Vernetzungsmittel, umfassend die vorstehend beschriebenen Mittel, sollte dazu geeignet sein vor der Implantation in den Körper in die Matrix aufgenommen zu werden, sowie diejenigen, die beispielsweise mit Typ I Kollagenmatrices verwendet werden.
Da Typ II Kollagen eine Hauptgerüstkomponente von nativem Knorpel bereitstellt, imitiert die Matrix der vorliegenden Erfindung daher natürliches Knorpelgewebe. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bildet die Stützmatrix zusammen mit Zellen wie etwa Chondrozytenzellen einen implantierbaren Gegenstand zur Platzierung in Tieren, für eine Reparatur einer Verletzung wie etwa einer Knorpelschädigung. Wenn die Differenzierung von Zellen durch eine umgebende Matrix gelenkt wird, sollte eine Redifferenzierung von Chondrozyten bei Wachstum auf einer Typ II Kollagenmatrix, wie bei der vorliegenden Erfindung, ein Optimum erreichen.
Chondrozytenzellen, die autolog oder homolog sein können, können auf der Stützmatrix gehalten werden, die für die Behandlung von Knorpeldefekten in Gelenken verwendet werden soll. Chondrozytenzellen können direkt auf der Stützmatrix gezüchtet werden, oder in Standardschalen, und/oder vor der Verwendung (typischerweise zwei bis drei Tage vorher) auf die Matrix geladen werden. Die mit Chondrozytenzellen beladene Stützmatrix, d.h. der implantierbare Gegenstand, wird durch ein Gelenkendoskop, oder durch minimal invasive chirurgische Techniken oder durch chirurgische Techniken am offenen Gelenk in das Gelenk eingeführt. Das erfindungsgemäße Implantationsverfahren sieht auch die Verwendung von geeigneten allogenen und xenogenen Chondrozytenzellen für die Reparatur eines Knorpeldefekts vor.
Die mit Zellen beladene Matrix (das Implantat) kann in verschiedene Techniken aufgenommen werden um eine Reparatur eines Körperdefekts oder -schadens zu bewirken oder zu stimulieren, unter Verwendung von verschiedenen Platzierungs- und Sicherungsvorrichtungen für die Implantation. Bestimmte dieser Techniken und Vorrichtungen sind in der US Patentanmeldung US-B 6,866,668 von Behrens et al. mit dem Titel "Methods, Instruments And Materials For Chondrocyte Cell Transplantation" und in WO-A-01/081610 gezeigt.
Somit lehrt die vorliegende Erfindung Verfahren und Systeme für die wirksame Reparatur oder Behandlung von Defekten in Gelenkknorpel und -knochen, osteochondralen Defekten, Haut- und Wunddefekten, und Defekten von Bändern, Gelenkscheiben und Bandscheiben. Diese Verfahren und Systeme beinhalten die Verwendung eines implantierbaren Gegenstands, umfassend die wiederhergestellte Typ II Kollagen, Knorpel-ähnliche Matrix der vorliegenden Erfindung zusammen mit Zellen wie etwa Chondrozytenzellen.
Für diese Zwecke ist die Stützmatrix des Implantats aus einem Material, spezifisch vernetztem Typ II Kollagen, mit einer ausreichenden physikalischen Integrität um eine stabile Form während eines Zeitraums beizubehalten, der ausreichend ist um das Wachstum von Zellen darauf sowohl vor der Transplantation als auch nach der Transplantation zu ermöglichen, und um ein der natürlichen Umgebung der Zellen ähnliches System bereitzustellen, um Wachstum und Differenzierung von Zellen zu optimieren. Es wird erwartet, dass die Matrix über den Zeitverlauf, vielleicht innerhalb von zwei bis drei Monaten, in einem Körper eines Patienten, der das Implantat empfängt, resorbiert wird, ohne irgendwelche signifikante Spuren zu hinterlassen und ohne toxische Abbauprodukte zu bilden. Unter dem Begriff "resorbiert" wird verstanden, dass davon Prozesse umfasst sind, durch welche die Stützmatrix durch natürliche biologische Prozesse zerlegt wird, und wobei die zerlegte Stützmatrix und Abbauprodukte davon entsorgt werden, beispielsweise durch die Lymphgefäße oder Blutgefäße.
Allgemeines Beispiel
In einer Ausführungsform beinhaltet das Verfahren zur Herstellung der Stützmatrix der vorliegenden Erfindung das Abkratzen von Gelenkknorpel von der Gelenkoberfläche eines großen Säugetiers oder anderen Tiers, wie etwa einem Pferd, Schwein, Rind (oder Kalb), einer Ziege, einem Huhn oder Känguru. Der abgekratzte Knorpel wird eingefroren und in einem gefrorenen Zustand, wie etwa in einer Atmosphäre von flüssigem Stickstoff oder flüssigem Argon, gemahlen. In einer derartigen Atmosphäre ist der Knorpel schockgefroren, so dass er ein pulverähnliches Material bildet. Die Masse des gemahlenen Knorpels beträgt typischerweise etwa 300 Gramm Nassgewicht.
Das pulverähnliche Material wird danach entfettet, durch einen oder mehrere Waschschritte mit einem geeigneten Lösungsmittel, wie etwa einem Alkohol, Ether, Benzol, p-Toluol, oder einem anderen Lösungsmittel mit einem hohen Löslichkeitsgrad für Fettmoleküle. Beispielsweise können 300 ml Ethanol (in einer 70% Lösung) verwendet werden. Die Entfettungslösung ermöglicht eine Extraktion der Fettmoleküle aus dem Knorpel. Die resultierende Lösung, welche die Fettmoleküle enthält, wird trocknen gelassen, beispielsweise durch Eindampfen bei Raumtemperatur, oder wird getrocknet durch Erwärmen auf eine Temperatur von etwa 50°C bis ein Feststoff erhalten wird.
Der entfettete feste Knorpel wird danach in einem geeigneten sauren (azidischen) Puffer, wie etwa 0,05 M Na-Acetat-Puffer mit einem pH-Wert von 1,5 erneut aufgelöst. Die resultierende Lösung wird danach mit einem proteolytischen Enzym wie etwa wässrigem Pepsin (0,1 mg/ml) behandelt, bevorzugt bei einer erniedrigten Temperatur wie etwa 4°C. Die Enzymbehandlung kann bis zu etwa 10 mal wiederholt werden um die Ausbeute an Produkt zu optimieren, aber es hat sich herausgestellt, dass fünf solche Wiederholungen ausreichend sind um eine günstige Ausbeute zu erreichen.
Das behandelte Material wird danach bei einer Temperatur zwischen 4°C und 10°C, und bei einer Geschwindigkeit von zwischen 10.000 und 20.000 Umdrehungen pro Minute (RPM), während etwa 30 Minuten bis etwa einer Stunde zentrifugiert. Dies kann mehrmals durchgeführt werden um eine klare Phasenauftrennung zu erreichen. Drei derartiger Wiederholungen haben eine günstige Auftrennung erreicht.
Sobald eine adäquate Phasenauftrennung erhalten worden ist, wird das Pellet verworfen und der aus der Zentrifugation (in mehreren Kolben) erhaltene Überstand wird gepoolt. Danach wird der Überstand präzipitiert unter Verwendung einer geeigneten Salzlösung und eines Puffers mit neutralem pH- Wert, wie etwa Kaliumchlorid (17,5% w/v) in Phosphatpuffer (0,02 M KH₂PO₄, pH 7,4), die das Präzipitat aussalzen. Unter "Aussalzen" wird verstanden, eine Lösung mit Salz aus einer Salzlösung zu sättigen, so dass ein Feststoff präzipitiert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung werden etwa 300 ml Überstand aus der Zentrifugation erhalten, die aus dem ersten Zentrifugationsschritt erzeugte Masse an Präzipitat beträgt etwa 280 Gramm, und das Kaliumchlorid wird in einem Gesamtvolumen von 2 Litern des Phosphatpuffers hergestellt.
Das Präzipitat wird danach bei einer Geschwindigkeit zwischen 30.000 und 100.000 RPM während etwa 30 Minuten bis etwa einer Stunde zentrifugiert, um weitere Phasenauftrennung zu erzeugen, wobei ein Pellet gebildet wird, und der resultierende Überstand wird verworfen, während das resultierende Pellet in einem geeigneten sauren Puffer, wie etwa 0,05% Essigsäure (200–500 ml) erneut suspendiert wird. Die Konzentration an knorpelartigem Material in der Lösung ist im Allgemeinen größer als 1 mg/ml.
Um eine Form der Matrix der vorliegenden Erfindung mit physikalischer Integrität für eine nachfolgende Handhabung und Manipulation bereitzustellen, ist eine Vernetzung erforderlich, wie nachstehend beispielhaft ausgeführt.
Ein biokompatibles Vernetzungsmittel wird danach zu der Knorpel/Kollagen-enthaltenden Lösung zugegeben. Wie vorstehend diskutiert kann das Vernetzungsmittel derart ausgewählt werden, so dass eine bestimmte Konsistenz und spezifische physikalische Eigenschaften für die Matrix erreicht werden, d.h. die vorstehend beschriebene Festigkeit und Elastizität. Das Vernetzungsmittel wird in einem geeigneten neutralen Puffer hergestellt, wie etwa 10–40 ml 0,2 M NaCl/0,05 M Tris-HCl pH 7,4, auf eine Konzentration von 20–100 mg/ml.
Die Lösung, welche vernetztes Kollagen/vernetzten Knorpel enthält, wird danach lyophilisiert um einen Feststoff zu erhalten. Das Lyophilisieren kann wiederholt werden nach erneutem Einweichen mit einer wässrigen Lösung, wie etwa mit 10–20 ml destilliertem Wasser (in Abhängigkeit von der Größe des lyophilisierten "Kollagenpellets"), bei einer Temperatur zwischen 20°C und 60°C, bevorzugt bei etwa 25°C, und bei einem Druck von etwa 0,05 mbar. Wenn die Temperatur innerhalb dieses Bereichs erhöht wird, steigen der Vernetzungsgrad und die entsprechende Stabilität des Materials. Wenn die Temperatur im Gegensatz dazu innerhalb dieses Bereichs erniedrigt wird, sinken der Vernetzungsgrad und die entsprechende Stabilität. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung beinhaltet mehrere Lyophilisierungsschritte und ergibt zwei glatte Oberflächen für die Enden der Matrix. Zusätzlich zu der Verwendung eines Vernetzungsmittels und einer Wärmebehandlung kann eine Behandlung mit Strahlung verwendet werden um die Vernetzung des Kollagens zu erhöhen.
Der Lyophilisationszeitraum variiert in Abhängigkeit vom Volumen der zu lyophilisierenden Lösung und der Größe des Pellets, das erhalten wird. Beispielsweise wird eine 100 ml Lösung während etwa 36 Stunden lyophilisiert um einen geeigneten Feststoff in Form eines Pellets zu ergeben. Der erhaltene Feststoff ist hygroskopisch und enthält nicht mehr als etwa 20% Wasser in seiner Polymerstruktur. Der Feststoff ist ein helles, weißes, Vlies-ähnliches Material.
Dieses Vlies-ähnliche Material kann mechanisch zu Lagen bzw. Blättern gepresst werden, für eine Verwendung mit Zellen als ein Implantationsgegenstand. Ein Beispiel einer für diesen Zweck geeigneten Pressvorrichtung ist in den 1 und 2 gezeigt. Die Vorrichtung umfasst zwei nicht texturierte zusammen passende Teile 6 und 8 aus rostfreiem Stahl mit flachen, zueinander passenden Oberflächen. Das Teil 6 passt in das Loch 4 von Teil 8. Die flache Bodenfläche von Teil 6 passt mit dem flachen Boden von Loch 4 zusammen, um für eine Presswirkung auf das dazwischen platzierte Vlies-ähnliche Material zu sorgen. Wenn das Vlies-ähnliche Material während etwa 24 Stunden zwischen diesen Oberflächen gepresst wird, wird die Vlies-ähnliche Lage einfacher zu handhaben und einfacher zu manipulieren. Zusätzlich ist die Lage reißfest.
Alternativ kann die Pressvorrichtung jede geeignete Vorrichtung mit zueinander passenden flachen Oberflächen sein, mit einem ausreichenden Gewicht um kontinuierlich eine Kraft auf das Matrixmaterial auszuüben. Die Pressvorrichtung ist bevorzugt aus rostfreiem Stahl, Metalle und andere Materialien mit ähnlichen Eigenschaften wie rostfreier Stahl, beispielsweise Kunststoff, Glas oder Keramik, können jedoch ebenfalls verwendet werden. Ein Gewicht von 650 bis 850 Gramm, bevorzugt von etwa 735 Gramm für das Teil 6 ist im Allgemeinen ausreichend um ein Vlies-ähnliches Ausgangswerkstück mit einer Schichtdicke von 5 bis 10 mm und einer Oberfläche von etwa 19 mm zu pressen. Nach dem Pressen beträgt die Schichtdicke der Vlies-ähnlichen Lage 0,5 bis 2,0 mm.
Das Matrixmaterial der vorliegenden Erfindung wird vor der Verwendung sterilisiert, wie etwa mittels Strahlung (UV oder Gammastrahlung) oder mittels anderer Sterilisationsverfahren wie etwa Epoxid- oder Ozonsterilisation. Sterilisation mittels Strahlung ist ein bevorzugtes Verfahren um einen Kontakt des Matrixmaterials mit Fremdchemikalien zu minimieren. Dieses letzte Verfahren (Sterilisation durch Strahlung) stabilisiert das kollagenartige Stützmatrixmaterial auch weiter.
Wenn die Stützmatrix der vorliegenden Erfindung mit Zellkulturmedium durchtränkt ist, ermöglicht sie das nachfolgende Kultivieren und Wachsen von Chondrozytenzellen auf der Matrix. Wie vorstehend ausgeführt ist dieses Wachstum möglich, da die Matrix großenteils Typ II Kollagen umfasst, welches das Hauptgerüstprotein für Chondrozytenzellen in vivo ist und eine natürliche Umgebung für optimales Wachstum und optimale Differenzierung von Chondrozytenzellen bereitstellt. Chondrozytenzellen können in einer ausreichenden Anzahl auf die Matrix geladen werden, ohne einen erheblichen Verlust an biophysikalischen und biomechanischen Eigenschaften des Typ II Kollagenmaterials. Darüber hinaus kann die Matrix der vorliegenden Erfindung vorübergehend deformiert werden, wie etwa für eine Ablieferung durch ein Gelenkendoskop, ohne einen Verlust der funktionellen Eigenschaften des Kollagens oder einen Verlust seiner Beladung mit Chondrozyten. Diese Deformation ist vollständig reversibel sobald die Matrix in das Gelenk eingeführt worden ist oder auf der zu behandelnde Oberfläche platziert worden ist.
Chondrozytenzellen sollten fest an der Matrix anhaften oder in sie integrieren, und sollten ihren Phänotyp beibehalten oder zumindest eine Tendenz haben, nach einer Transplantation zu redifferenzieren. Darüber hinaus sollte der resultierende Bioverbundstoff aus Zellen und Matrix ausreichend mechanisch stabil sein, so dass er in Operationsverfahren gehandhabt werden kann.
Bestimmte Aspekte der vorliegenden Erfindung werden mittels der nachstehenden Beispiele veranschaulicht. Beispiel 1 veranschaulicht ein Verfahren zur Herstellung der neuen Matrix der vorliegenden Erfindung, und das Wachstum und das Halten von Chondrozytenzellen auf der Matrix. Beispiel 2 veranschaulicht ein zusätzliches Verfahren zur Herstellung der neuen Matrix der vorliegenden Erfindung. Die Beispiele 3–5 zeigen das Wachstum und das Halten von Chondrozytenzellen auf der Matrix. Beispiel 6 zeigt die Ergebnisse einer Implantation der Chondrozytenzellen-enthaltenden Matrix in Schafe. Die Beispiele werden lediglich als Veranschaulichung und nicht einschränkend verstanden.
Beispiel 1
Für eine Extraktion von Typ II Kollagen werden 300 Gramm (Nassgewicht) Knorpel aus Schwein unter flüssigem Stickstoff zu einem Pulver gemahlen und dreimal mit 300 ml einer 70% Ethanollösung gewaschen um das Kollagen zu entfetten. Die entfettete Kollagenlösung wird danach bei Raumtemperatur getrocknet. Der resultierende Kollagenfeststoff wird in einer 0,05 M Natriumacetatlösung (pH 1,5) erneut aufgelöst und Pepsin wird in einer Endkonzentration von 0,1 mg/ml zugegeben. Die Lösung wird danach bei 4°C während zwischen 16 und 20 Stunden gewaschen und 30 Minuten bei 20.000 RPM zentrifugiert. Nach einem Zentrifugationszyklus wird der erhaltene Überstand (etwa 300 ml) gesammelt. Das restliche Pellet wird erneut in einer 0,05 M Natriumacetatlösung suspendiert und die Pepsinbehandlung, die Rühr- und Zentrifugationsschritte werden wiederholt bis sich der Großteil des Pellets aufgelöst hat.
Um einen Feststoff zu präzipitieren, der Typ II Kollagen enthält, werden Überstände gepoolt (Gesamtvolumen etwa 500 ml) und festes KCl wird zugegeben um eine Endkonzentration von 17,5% KCl zu erhalten. Danach wird festes KH₂PO₄ zugegeben um eine Endkonzentration von 0,02 M in einer wässrigen Lösung zu erhalten. Die Lösung wird danach 30 Minuten bei 95.000 RPM zentrifugiert und das Sediment (Pellet) wird in einer 0,05% Essigsäurelösung erneut aufgelöst und zweimal während 16 Stunden bei 4°C gegen 5.000 ml einer 0,05% Essigsäurelösung dialysiert.
Zu der dialysierten Probe wird ein biokompatibles Vernetzungsmittel auf Basis von Aldehyd zugegeben, in einer Konzentration von 20–100 mg/ml in 10–40 ml einer 0,2 M NaCl, 0,05 M Tris-HCl Lösung bei pH 7,4. Die resultierende Lösung wird danach gemäß dem im vorstehenden Allgemeinen Beispiel angegebenen Verfahren zweimal lyophilisiert um einen Feststoff zu erhalten. Die Vernetzung wird verstärkt durch Aussetzen des resultierenden Feststoffs an UV-Strahlung während 12 Stunden. Das Aussetzen an Strahlung erhöht die mechanische Stabilisierung der resultierenden Typ II Kollagenmatrix, welche danach mittels γ-Strahlung sterilisiert wird.
Chondrozytenzellen wurden enzymatisch aus dem Kniegelenkknorpel von erwachsenen Schafen freigesetzt, unter Verwendung von Kollagenase und Hyaluronidase (bezogen von Sigma, St. Louis, MO), und erneut suspendiert in Kulturmedium (Ham's F-12), enthaltend 12% fötales Kälberserum, 50 μl/ml Penicillin/Streptomycin, 50 μl/ml Glutamin (alles von Biochrom KG, Berlin, Deutschland), 50 μl/ml nicht essentielle Aminosäuren (Gibco BRL, Paisley, Schottland), und 2,3 mM MgCl₂. Die Zellen wurden in einem 80 cm2 Kulturkolben, beschichtet mit 0,1% Gelatine (Nalge Nunc, Rochester, N.Y.), kultiviert und während 4 bis 6 Wochen bei 37°C in einer befeuchteten 5% CO₂ Umgebung inkubiert. Sobald die Zellen Konfluenz erreicht hatten wurden sie trypsiniert und in einer Konzentration von etwa 4 × 10³ Zellen/ml auf der Typ II Kollagenmatrix angeimpft, die wie in diesem Beispiel beschrieben hergestellt worden war.
Kollagenmembranen (Matrices) wurden in dem vorstehend beschriebenen Medium während drei Tagen in Petrischalen inkubiert. Nicht angeimpfte Membranen und Chondrozytenzellen, die auf Thermanox Kunststoffgerüsten (Nunc, Rochester, N.Y.) gezüchtet worden waren, wurden im Experiment als Kontrollen verwendet.
Membranen wurden mit Bouin's Fixierlösung (375 ml 12% Pikrinsäure + 125 ml 40% Formaldehyd, um 500 ml Vorratslösung herzustellen. Für das Fixierungsverfahren werden 5 ml Eisessig zu 100 ml Vorratslösung zugegeben) fixiert, mittels einer abgestuften Ethanolreihe entwässert, geschnitten, mit Masson-Goldner und Mayer's Hämatoxylin-Eosin angefärbt, und unter dem Mikroskop analysiert. Schnitte der Membran mit mittlerer Dünne (0,5 μm) wurden mit Methylen-Blau-Azure II angefärbt, und sehr dünne Schnitte (60 nm) der Membran wurden mit Bleicitrat angefärbt.
Für Durchstrahlungselektronenmikroskopie (TEM) (in einem Philips 400 Gerät) wurden die Proben in einer 2,5% Glutaraldehydlösung in einem 0,06 M Natriumkakodylatpuffer (pH 7,35) während 48 bis 72 Stunden bei 4°C fixiert. Die fixierten Proben wurden nach Routineverfahren weiterverarbeitet und unter Verwendung eines Ultracut E Mikrotoms (Reichert, Deutschland) geschnitten.
Für Rasterelektronenmikroskopie wurden die Proben mit einer Phosphat-gepufferten Salzlösung (PBS) (150 mM) bei 37°C gespült, wie vorstehend für TEM beschrieben fixiert, in einer abgestuften Acetonreihe entwässert, am kritischen Punkt getrocknet, und mittels Sputtern mit Gold-Palladium beschichtet.
Die Grobmorphologie der trockenen Typ II Kollagenmatrices zeigte ein etwas sprödes, papierähnliches Erscheinungsbild. Es trat kein Schrumpfen oder eine Auflösung des Vlieses während des Kultivierungsverfahrens auf. Lichtmikroskopie von nicht angeimpften Typ II Kollagenmatrices zeigte eine dreidimensionale poröse Architektur mit einer variierenden Porengröße auf. Zelldetritus oder Lakunen konnten nicht nachgewiesen werden.
Chondrozyten, die auf Kunststoffoberflächen gezüchtet worden waren, zeigten eine dichte Monoschicht aus stachelzelligen, Fibroblasten-ähnlichen Zellen mit ovalen Kernen und zahlreichen interzellulären Kontakten. In der Durchstrahlungselektronenmikroskopie zeigten diese Zellen etwas rundliche Kerne, ein spärliches endoplasmatisches Reticulum und ein paar Mitochondrien. Wie in 5 gezeigt, zeigte Rasterelektronenmikroskopie große, abgeplattete Zellen auf.
Chondrozyten, die auf Typ II Kollagenmatrices angeimpft worden waren, bildeten eine Membran mit mehrlagigen Zellschichten, wobei zahlreiche Zellen sich in den membranbildenden Fortsätzen etablierten, um sich mit den vermaschten Typ II Kollagenfasern zu verheddern, wie mittels TEM in 6 gezeigt. Die Ultrastruktur dieser Zellen ähnelte einem mehr Chondrozyten-ähnlichen Aussehen als einem fibroblastischen Zelltyp. Die meisten Zellen waren kugelförmig mit unregelmäßigen Kernen, einem granulären endoplasmatischen Reticulum, und hervor stehenden Golgi-Feldern. Manche Zellen enthielten große Mengen an Glykogen, und manche zeigten kleine hervortretende Vesikel auf ihren Oberflächen.
Ein Vergleich der vorstehend genannten morphologischen Unterschiede zwischen den auf Kunststoffoberflächen und den auf der Kollagen Typ II Matrix gezüchteten Zellen legt in hohem Maße nahe, dass die auf der Kollagen Typ II Matrix gezüchteten Zellen redifferenzieren werden.
Die Untersuchungen in diesem Beispiel zeigen, dass eine in vitro Produktion von autologem knorpelähnlichem Gewebe unter Verwendung der Typ II Kollagenmatrix der vorliegenden Erfindung realisiert werden kann. Der resultierende implantierbare Gegenstand umfasst aktive Chondrozytenzellen mit dem Potenzial, in Knorpeldefekte einzuwachsen und diese zu reparieren. Die mechanische Stabilität des Gegenstands sorgt für einfache Handhabung, so dass er in Knorpeldefekte geklebt werden kann.
Beispiel 2
300 Gramm (Nassgewicht) Gelenkknorpel, abgekratzt von Kälbergelenken, wurden unter flüssigem Stickstoff zu einem pulverähnlichen Material gemahlen. Das Pulver wurde danach durch 3 Waschschritte, jeweils mit 300 ml 70% Ethanol, entfettet und bei Raumtemperatur getrocknet. Der Feststoff wurde in 0,05 M Natriumacetatpuffer, pH 1,5, erneut aufgelöst, und mehrfach in der Kälte mit Pepsin (0,1 mg/ml) behandelt. Die Behandlung wurde während 16–20 Stunden durchgeführt. Nach drei Runden Zentrifugation bei zwischen etwa 4°C und 10°C und 10.000–20.000 RPM während etwa 30 Minuten bis etwa einer Stunde wurde der Überstand gepoolt und durch Zugabe von Kaliumchlorid (17,5%) in Phosphatpuffer präzipitiert. Das Präzipitat wurde durch 45-minütige Zentrifugation bei 30.000–40.000 RPM gesammelt, und in 0,05% Essigsäure erneut suspendiert, auf eine annähernde Konzentration von mehr als 1 mg/ml.
Die resultierende Lösung wurde danach während 16 Stunden gegen 3 × 5 Liter verdünnte Essigsäure (0,05%) dialysiert um alles überschüssige Salz zu entfernen. 10–40 ml des Vernetzungsmittels Glutaraldehyd (hergestellt in 0,2 M NaCl/0,05 M Tris-HCl, pH 7,4, in einer Konzentration von 50 mg/ml) wurden zu der dialysierten Probe zugegeben. Dies bildete eine homogene Lösung, welche lyophilisiert, erneut mit destilliertem Wasser durchtränkt, und erneut lyophilisiert wurde.
Das resultierende Vlies-ähnliche Material wurde unter Verwendung der Vorrichtung wie in den 1 und 2 gezeigt mechanisch zu Lagen gepresst und mittels UV- und Gammastrahlung sterilisiert. Andere Standardverfahren zur Sterilisierung, welche die Matrix nicht beschädigen, könnten ebenfalls verwendet werden. Das Sterilisationsverfahren stabilisiert das kollagenartige Material weiter.
Beispiel 3
Chondrozyten wurden in minimalem essenziellen Kulturmedium, enthaltend HAM's F12 und 15 mM Hepes-Puffer und 5 bis 7,5% autologes Serum, in einem CO₂ Inkubator bei 37°C gezüchtet. und in einem Klasse 100 Labor bei Verigen Transplantation Service ApS, Kopenhagen, DK, oder an der Lübecker Universität, Lübeck, Deutschland, gehandhabt. Andere Zusammensetzungen von Kulturmedium, wie etwa Kälberserum, hätten ebenfalls für die Kultivierung der Chondrozytenzellen verwendet werden können. Die Zellen wurden unter Verwendung von Trypsin-EDTA (Trypsin: 2,5% Lösung ohne Ca²⁺ und Mg²⁺ in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS); EDTA: 1% Lösung ohne Ca²⁺ und Mg²⁺ in PBS; die endgültige Lösung enthält 0,05% Trypsin) während 5–10 Minuten trypsiniert und in einer Bürker-Türk-Kammer unter Verwendung einer Anfärbung mit Trypanblau auf Wachstumsfähigkeit ausgezählt. Die Zellzahl wurde auf 7,5 × 10⁵ Zellen pro ml eingestellt. Eine NUNCLON^TM Platte wurde in dem Klasse 100 Labor aufgedeckt.
Die Matrix der vorliegenden Erfindung wurde zu einer geeigneten Größe geschnitten, die in den Boden der Vertiefung in der NUNCLON^TM Zellkulturschale passte. In diesem besonderen Fall wurde eine runde Scheibe mit einer Größe von etwa 4 cm (aber dies hätte jede beliebige für das Experiment geeignete Größe sein können) unter aseptischen Bedingungen auf dem Boden der Vertiefung platziert. Etwa 5 × 10⁶ Zellen in 5 ml Kulturmedium wurden direkt auf das Trägermaterial gegeben und über die Oberfläche dispergiert. Die Platte wurde während 3 Tagen bei 37°C in einem CO₂ Inkubator inkubiert.
Am Ende des Inkubationszeitraums wurde das Medium dekantiert, und eine kalte, gekühlte 2,5% Glutaraldehydlösung, enthaltend 0,1 M des Natriumsalzes von Dimethylarsensäure, wurde als ein Fixiermittel zugegeben. Die Matrix wurde danach für eine histologische Bewertung mit Safranin O angefärbt.
Es wurde beobachtet, dass die Chondrozytenzellen sich in Clustern angeordnet hatten, begonnen hatten auf dem Träger zu wachsen, und nicht von dem Träger entfernt werden konnten, indem er mit Medium gespült wurde, oder sogar indem mechanisch leichter Druck auf die Matrix ausgeübt wurde. Es schien daher, dass die Zellen an der Matrix anhafteten.
Beispiel 4
Chondrozytenzellen wurden in minimalem essenziellen Kulturmedium, enthaltend HAM's F12 und 15 mM Hepes-Puffer und 5 bis 7,5% autologes Serum, in einem CO₂ Inkubator bei 37°C gezüchtet. und in einem Klasse 100 Labor bei Verigen Transplantation Service ApS, Kopenhagen, DK, oder an der Lübecker Universität gehandhabt. Andere Zusammensetzungen von Kulturmedium hätten für die Kultivierung der Chondrozyten verwendet werden können. Die Zellen wurden unter Verwendung von Trypsin-EDTA (mit den gleichen Konzentrationen wie vorstehend in Beispiel 3) während 5–10 Minuten trypsiniert und in einer Bürker-Türk-Kammer unter Verwendung einer Anfärbung mit Trypanblau auf Wachstumsfähigkeit ausgezählt. Die Zellzahl wurde auf 5 × 10⁵ Zellen pro ml eingestellt. Eine NUNCLON^TM Platte wurde in dem Klasse 100 Labor aufgedeckt.
Die neue Matrix der vorliegenden Erfindung wurde zu einer geeigneten Größe geschnitten, die in den Boden der Vertiefung in der NUNCLON^TM Zellkulturschale passte. In diesem besonderen Fall wurde eine runde Scheibe mit einer Größe von etwa 4 cm (aber dies hätte jede beliebige für das Experiment geeignete Größe sein können) unter aseptischen Bedingungen auf dem Boden der Vertiefung platziert. Etwa 5 × 10⁵ Zellen in 5 ml Kulturmedium wurden direkt auf das Trägermaterial gegeben und über die Oberfläche dispergiert. Die Platte wurde während 3 Wochen bei 37°C in einem CO₂ Inkubator inkubiert.
Am Ende des Inkubationszeitraums wurde das Medium dekantiert, und eine kalte, gekühlte 2,5% Glutaraldehydlösung, enthaltend 0,1 M des Natriumsalzes von Dimethylarsensäure, wurde als ein Fixiermittel zugegeben. Die Matrix wurde danach für eine histologische Bewertung mit Safranin O angefärbt. Für immunhistochemische Analyse wurden Kollagenmembranen in Methanol-Aceton fixiert und auf Aggrecan und Typ II Kollagen angefärbt, unter Verwendung von anti-human Typ II Kollagen aus Kaninchen und anti-human Aggrecan aus Maus. Primäre Antikörper wurden sichtbar gemacht unter Verwendung von fluoreszierenden sekundären Antikörpern.
Während der drei Wochen waren die Chondrozyten gewachsen und hatten sich auf der Matrix vervielfacht, wobei sie Cluster in den Zentren des Trägers gebildet hatten, die sich entlang der Oberfläche aufreihten.
Beispiel 5
Chondrozytenzellen wurden in minimalem essenziellen Kulturmedium, enthaltend HAM's F12 und 15 mM Hepes-Puffer und 5 bis 7,5% autologes Serum, in einem CO₂ Inkubator bei 37°C gezüchtet. und in einem Klasse 100 Labor bei Verigen Transplantation Service ApS, Kopenhagen, DK, oder an der Lübecker Universität gehandhabt. Andere Zusammensetzungen von Kulturmedium hätten für die Kultivierung der Chondrozytenzellen verwendet werden können. Die Zellen wurden unter Verwendung von Trypsin-EDTA (gleiche Konzentration wie vorstehend in Beispiel 3) während 5–10 Minuten trypsiniert und in einer Bürker-Türk-Kammer unter Verwendung einer Anfärbung mit Trypanblau auf Wachstumsfähigkeit ausgezählt. Die Zellzahl wurde auf 5 × 10⁵ Zellen pro ml eingestellt. Eine NUNCLON^TM Platte wurde in dem Klasse 100 Labor aufgedeckt.
Die Matrix der vorliegenden Erfindung wurde zu einer geeigneten Größe geschnitten, die in den Boden der Vertiefung in der NUNCLON^TM Zellkulturschale passte. In diesem besonderen Fall wurde eine runde Scheibe mit einer Größe von etwa 4 cm (aber dies hätte jede beliebige für das Experiment geeignete Größe sein können) unter aseptischen Bedingungen auf dem Boden der Vertiefung platziert. Etwa 5 × 10⁵ Zellen in 5 ml Kulturmedium wurden direkt auf das Trägermaterial gegeben und über die Oberfläche dispergiert. Die Platte wurde während 3 Wochen bei 37°C in einem CO₂ Inkubator inkubiert.
Die gesamte Matrix wurde 16 Stunden lang mit Kollagenase inkubiert. Das Material wurde in Medium aufgenommen und zentrifugiert. Zellen wurden auf einer NUNCLON^TM Platte angeimpft und ein Aliquot in einer Bürker-Türk-Kammer unter Verwendung einer Anfärbung mit Trypanblau auf Wachstumsfähigkeit ausgezählt. Die berechnete Gesamtzellzahl wurde als 6 × 10⁶ ermittelt und die Wachstumsfähigkeit war größer 95%.
Beispiel 6
Tierstudien wurden in den Einrichtungen der Lübecker Universität durchgeführt. Zwei Schafe hatten zuvor 4 definierte runde Läsionen mit einem Durchmesser von 7 mm des Knorpels des Kniegelenks empfangen. Alle Eingriffe wurden unter i.v. Ketanest/Rompun Totalanästhesie durchgeführt. Zwei Löcher waren im Knorpel der gewichttragenden Bereiche des medialen Oberschenkelknorrens platziert worden, und zwei zusätzliche Löcher wurden im Bereich der Oberschenkelknochen-Knie- und Schienbein-Oberschenkelknochen-Gelenke gebohrt. In jedem dieser zwei Bereiche wurde eines der zwei Löcher durch die Tidemark gebohrt, während bei dem anderen die Tidemark intakt belassen wurde.
Gleichzeitig war ein Stück Knorpel von einem nicht gewichttragenden Bereich entnommen worden. Die Chondrozyten aus diesem Knorpel wurden während eines Zeitraums von sechs Wochen auf einer Matrix gemäß Beispiel 3 gezüchtet. Die mit Chondrozyten beladene Matrix wurde danach reimplantiert. Die Schafe wurden isoliert gehalten und das Knie wurde während einer Woche in einem Stützverband gehalten. Danach durfte sich das Schaf frei bewegen. Die Bewertung des Gelenks zeigte eine Heilung des Defekts, das Anhaften des Transplantats, und die Erneuerung des Knorpels.
Obwohl diese Erfindung unter Bezugnahme auf spezifische Ausführungsformen davon beschrieben worden ist, ist sie nicht darauf beschränkt. In ihrem allgemeinsten Sinn umfasst diese Erfindung eine Typ II Kollagen-Stützmatrix, welche aus Gewebe oder jedem anderen geeigneten Material wiederhergestellt worden ist, nachdem sie solubilisiert wurde, und bevorzugt flexibel ist und in einem tierischen Körper resorbiert werden kann. Die Stützmatrix wirkt als ein Träger für lebende Zellen, die auf ihr gezüchtet werden und an ihr anhaften. Ein derartiges Anhaften kann mittels Zellwachstum, das die Oberfläche der Matrix durchdringt, erfolgen. Bevorzugt vermittelt die Stützmatrix dem implantierbaren Gegenstand auch eine ausreichende physikalische Integrität um dessen Manipulierung zu erleichtern, wie etwa die Manipulierung, welche erforderlich ist um ihn in einen lebenden Körper zu implantieren.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer wiederhergestellten auf Typ II Kollagen basierenden Matrix aus gelöstem Gelenkknorpelgewebe umfassend die Schritte: – Isolieren von Knorpelgewebe enthaltend Typ II Kollagen aus einem Tier ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pferd, Schwein, Rind, Kalb, Ziege, Huhn und Känguru, – mahlen des Knorpelgewebes zu Pulver, – entfetten des Pulvers durch Waschen mit einem Lösungsmittel und Trocknen um einen Feststoff auszubilden, wobei das Lösungsmittel geeignet ist Fettmoleküle zu lösen, – suspendieren des Feststoffes in einem azidischen Puffer um eine erste Lösung auszubilden, – behandeln der ersten Lösung mit einem proteolytischen Enzym, – zentrifugieren der ersten Lösung um einen Überstand und ein Pellet auszubilden, – zugeben einer Salzlösung zu dem Überstand in einer Menge ausreichend um ein Präzipitat auszubilden, – lösen des Präzipitats in einem azidischen Puffer um eine zweite Lösung auszubilden, – zugeben eines vernetzenden Agens zu der zweiten Lösung und – trocknen der zweiten Lösung um ein Vlies-ähnliches Material auszubilden und weiter umfassend die Schritte pressen des Vlies-ähnlichen Materials zu Blättern und sterilisieren der Materialblätter.
Verfahren nach Anspruch 1 umfassend die Schritte: – Isolieren von Knorpelgewebe enthaltend Typ II Kollagen aus Tieren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pferd, Schwein, Rind, Kalb, Ziege, Huhn und Känguru, – mahlen des Knorpelgewebes zu Pulver, – entfetten des Pulvers durch Waschen mit Äthanol und Trocknen um einen Feststoff auszubilden, – suspendieren des Feststoffs in einem Natriumacetatpuffer um eine erste Lösung auszubilden, – behandeln der ersten Lösung mit Pepsin, – zentrifugieren der ersten Lösung um einen Überstand und ein Pellet auszubilden, – zugeben einer Kaliumchlorid-Lösung zu dem Überstand um ein Präzipitat auszubilden, – lösen des Präzipitats in Essigsäure um eine zweite Lösung auszubilden, – dialysieren der zweiten Lösung gegen verdünnte Essigsäure, – zugeben des vernetzenden Agens, wobei das vernetzende Agens Reste ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aldehyden, Ketonen, Acetalen, Halbacetalen, Phenylgruppen, Chinonen, Carboxylgruppen enthält, und aktivierter Karbonsäuren zu der dialysierten zweiten Lösung, – lyophilisieren der zweiten Lösung um ein Vlies-ähnliches Material auszubilden, – pressen des Vlies-ähnlichen Materials in Blattform und – sterilisieren des Materials durch Strahlung um eine Matrix auszubilden.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das vernetzende Agens ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ethyl-dimethyl-aminopropylcarbodiimid, Cyanidanol und Glutaraldehyd.
Wiederhergestellte, auf Typ II Kollagen basierende Matrix aus gelöstem Gelenkknorpelgewebe herstellbar nach einem Verfahren nach Anspruch 1 bis 3.
Verfahren zur Herstellung eines implantierbaren Gegenstands umfassend Chondrozytenzellen in einer Trägermatrix, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: – Ernten von Knorpelchondrozytenzellen aus einer Wirtszelle, – kultivieren der Chondrozytenzellen in einem Medium, – bereitstellen einer auf Typ II Kollagen basierenden Matrix umfassend wiederhergestelltes Typ II Kollagen gebildet aus gelöstem Gelenkknorpelgewebe und einem vernetzenden Agens, wobei die Matrix Vlies-ähnlich ist, in einen tierischen Körper implantierbar und von dem tierischen Körper resorbierbar ist, und – zugeben der kultivierten Chrondrozytenzellen zu der Matrix um eine weitere Kultivierung der Chondrozytenzellen auf der Matrix und Festsetzen der Chondrozytenzellen auf der Matrix zu ermöglichen.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die Matrix für einen Zeitabschnitt zwischen harte Oberflächen gepresst wird, die ausreicht, um ihre Handhabbarkeit zu steigern.