KR102604205B1 - 생물학적 기능성 연조직 스캐폴드 및 임플란트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 다공성 구조를 갖는 생물학적 기능성 스캐폴드, 이의 제조 방법 및 사용 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 이를 이용하여 결함을 수복하는 방법, 세포를 배양하고 줄기 세포의 분화를 촉진하는 방법에 관한 것이다.

Description

생물학적 기능성 연조직 스캐폴드 및 임플란트
본 출원은 2015년 2월 10일 출원된 생물학적 기능성 연조직 스캐폴드 및 임플란트라는 제목으로 미국 가출원 번호 62/114,528의 이익과 관련되며 이를 청구하고, 그 내용은 참조로 본원에 통합된다.
본 발명은 다공성 구조를 갖는 생물학적 기능성 스캐폴드, 이의 제조 방법, 및 이의 사용 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이를 이용하여 결함을 수복하는 방법, 세포를 배양하고 줄기 세포의 분화를 촉진하는 방법에 관한 것이다.
(특허문헌 1) US 20110262515 A1
개요
본 발명은 하나 이상의 연조직(들)을 약 0-50℃의 온도에서 분산시켜 분산된 연조직을 생성하는 것을 포함하여, 다공성 구조를 갖는 생물학적 기능성 스캐폴드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 한 구체예에서, 분산된 연조직은 비천연 발생 크로스링커 또는 담체를 배제시킬 수 있다. 2개 이상의 유형의 분산된 연조직이 분산 후 혼합될 수 있다. 본 방법은 상기 분산된 연조직을 냉동시키거나, 건조시키거나, 냉동-건조시켜 생물학적 기능성 스캐폴드를 생성하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 방법에 의해 제조된 생물학적 기능성 스캐폴드에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 결함 부위에서 본원에 기술된 생물학적 기능성 스캐폴드를 이식하는 것을 포함하여 조직에서 다양한 결함을 수복하는 방법에 관한 것이다. 2개 이상의 유형의 분산된 연조직이 혼합되고 결함부에 적용될 수 있다. 또한, 본 발명은 본원에 기술된 생물학적 기능성 스캐폴드를 사용하여 세포를 시딩하고, 세포를 배양하고, 줄기 세포의 분화를 촉진하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 디스크 형상으로 냉동 건조시킨 후의 예시적인 다공성 연조직 구조를 묘사한다.
도 2는 실린더 형상으로 냉동 건조시킨 후의 예시적인 다공성 연조직 구조를 묘사한다.
도 3은 실시예 2에서 방법 1에 따라 제조된 다공성 연조직 구조의 SEM 사진 (30 x 및 60x 배율)을 묘사하며, 기공과 섬유를 갖는 웹 구조를 보여준다.
도 4는 실시예 2에서 방법 1에 따라 제조된 다공성 연조직 구조의 SEM 사진 (500 x 및 5000x 배율)을 묘사하며, 섬유를 보여준다.
도 5는 실시예 2에서 방법 2에 따라 제조된 스폰지형 연조직 구조의 SEM 사진 (30 x 및 60x 배율)을 묘사하며, 기공과 섬유를 갖는 구조를 보여준다.
도 6은 실시예 2에서 방법 2에 따라 제조된 스폰지형 연조직 구조의 SEM 사진 (500 x 및 5000x 배율)을 묘사하며, 섬유를 보여준다.
도 7은 일주일 동안 멸균 염수 내로 침지시킨 후의 예시적인 다공성 연조직 구조를 묘사하며, 형상 및 크기 유지 (A) 및 성형성 (B 및 C)을 보여준다.
도 8은 청색 염료를 함유하는 멸균 염수로 수화시킨 후의 예시적인 다공성 연조직 구조를 묘사하며, 디스크 구조 유지 (A) 및 성형성 (B)을 보여준다.
도 9는 9일의 배양에 걸친 다공성 연조직 구조에서 진피 섬유모세포 성장을 묘사한다.
도 10은 진피 섬유모세포가 시딩된 예시적인 다공성 연조직 스캐폴드의 H&E 염색을 묘사한다(40x).
도 11은 무흉선 마우스에서 4주 피하 이식 후 예시적인 얇은 다공성 연조직 임플란트 외식의 H&E 염색을 묘사한다. 세포 침윤이 구조의 전체 깊이에서 발견되었다. 외식편에서 현저한 염증이 발견되지 않았다.
도 12는 무흉선 마우스에서 4주 피하 이식 후 두꺼운 다공성 연조직 임플란트 외식의 H&E 염색을 묘사한다. 세포 침윤이 구조의 전체 깊이에서 발견되었다. 외식편에서 현저한 염증이 발견되지 않았다.
도 13은 무흉선 마우스에서 4주 피하 이식 후 외식된 다공성 연조직 임플란트의 H&E 염색을 묘사한다. 화살표는 구조 내부의 새로운 혈관을 보여주었다. 흰색 화살표는 구조 내로 침윤된 세포를 보여주었다. 외식편에서 현저한 염증이 발견되지 않았다.
도 14는 무흉선 마우스 개방 상처에서 4주 이식 후 외식된 다공성 연조직 임플란트의 H&E 염색을 묘사한다. 화살표는 마우스 각질세포에 의해 연조직 구조의 재-상피화를 보여주었다.
도 15 및 16은 분산된 진피를 묘사한다. 도 16은 청색 염료를 갖는 분산된 진피의 섬유 및 섬유 다발을 묘사한다.
도 17은 세정된/탈세포화된 진피, 진피 및 얼음으로 제조된 다공성 연조직 스캐폴드, 진피 및 냉수로 제조된 다공성 연조직 스캐폴드, 및 진피 및 실온수로 제조된 다공성 연조직 스캐폴드에 있어서 수은 다공도측정법으로 측정된 바와 같은 다양한 기공 크기 범위의 기공의 백분율을 묘사한다.
도 18은 7일의 배양에 걸쳐 진피로 제조된 다공성 연조직 스캐폴드에서 인간 지방세포 유래된 줄기 세포 성장을 묘사한다.
도 19는 지방생성 배지의 존재 또는 부재하의 3주 배양에 걸쳐 진피로 제조된 다공성 연조직 스캐폴드에서 분화된 지방세포로부터 배양 배지에서 분비된 아디포넥틴을 묘사한다.
도 20은 지방생성 배지로의 2주 배양 후 진피로 제조된 다공성 연조직 스캐폴드에서 분화된 지방세포에서의 페릴리핀 염색 (화살표로 지시된 갈색)을 묘사한다.
도 21은 청색 염료를 함유하는 멸균 염수로의 수화 후 진피로부터 제조된 예시적인 다공성 연조직 스캐폴드를 묘사하며, 왼쪽은 세 디스크의 구조 유지를 보여주며, 오른쪽은 압축되어 액체가 제거된 나머지 세 디스크를 보여준다 (a). 압축되었던 세 디스크 구조는 염수로의 재수화 후 이들의 원래 형상으로 되돌아갔다 (b).
도 22는 마우스 피하 모델에서 이식 24 주 후 매손 트리크롬(Masson's trichrome)으로 염색된 진피로부터 제조된 다공성 연조직 스캐폴드 (B) 및 세정된/탈세포화된 진피 (A)의 단면을 묘사한다. IM은 임플란트 샘플을 나타낸다.
도 23은 6주, 12주 및 24주의 이식 시간에 걸쳐 세정된/탈세포화된 진피, 진피로 제조된 다공성 연조직 스캐폴드, 및 헬리스탯(Helistat) 스폰지의 측정된 단면적을 묘사한다.
도 24는 6주, 12주 및 24주의 이식 시간에 걸쳐 세정된/탈세포화된 진피 및 진피로부터 제조된 다공성 연조직 스캐폴드로부터의 임플란트의 측정된 단면적에서 지방 조직의 백분율을 묘사한다.
도 25는 6주 및 12주의 이식 시간에 걸쳐 감마 방사선 조사 하의 및 감마 방사선 조사 없이 진피로부터 제조된 다공성 연조직 스패폴드 및 세정된/탈세포화된 진피의 측정된 단면적을 묘사한다.
도 26은 태반 (A) 및 태반막 (B)으로 제조된 다공성 연조직 임플란트의 매손 트리클롬 염색을 묘사한다: 세포 침윤 (검정색 화살표), 및 혈관형성 (흰색 화살표). 지방세포 및 지방 조직은 무흉선 마우스에서 4주 피하 이식 후 태반막으로 제조된 다공성 연조직 임플란트에서 페릴리핀의 면역조직화학 염색을 이용하여 적색 (도 26c에서 검정색 화살표)으로 염색되었다.
도 27은 4주 및 6주의 이식 시간에 걸쳐 태반 및 태반막으로 제조된 다공성 연조직 임플란트의 측정된 단면적을 묘사한다.
도 28은 냉동-건조된 인간 근막 (a), 냉동/해동된 인간 근막 (b), 및 DBM과 혼합된 냉동/해동된 인간 근막 (c)으로부터 제조된 예시적인 다공성 연조직 스캐폴드를 묘사한다.
도 29는 건조 상태 (a), 등장성 염수로의 수화 후 (b), 및 공 모양으로 성형된 (c) DBM과 혼합된 냉동/해동된 인간 근막으로부터 제조된 예시적인 다공성 연조직 스캐폴드를 묘사한다. 수화된 근막/DBM 스폰지를 한 쌍의 집게로 집어 들고 (d) 집게로 눌렀다 (e).
발명의 상세한 설명
한 양태에서, 본 발명은 다공성 구조를 갖는 임플란트 및/또는 생물학적 기능성 스캐폴드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본원에 기재된 스캐폴드는 임플란트를 포함할 수 있으며, 이는 생체내에서 이식되도록 구성된 스캐폴드이다. 다공성 구조는 다공성 스폰지형 구조를 포함할 수 있다. 용어 "다공성 스폰지형 구조"는 다공성, 탄성, 가요성, 섬유성 및 탄력성이 있는 3차원 구조를 나타낸다. 또한, 바람직한 "다공성 스폰지형 구조"는 실질적으로 온전하게 유지되거나 함께 고정된다는 점에서 실질적으로 응집성 (또는 밀착성)이 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "응집성" 또는 "밀착성"은 물질 구조의 요소가 (해체되거나 분리되기 보다는 함께 고정된다는 견지에서) 실질적으로 손상되지 않은채 유지되는 특성을 지칭한다. 건조 상태에서, 본 발명의 다공성 스폰지형 스캐폴드는 신속하에 유체를 흡수할 수 있다. 습윤 상태에서, 본 발명의 다공성 스폰지형 스캐폴드는 다공성, 응집성, 및/또는 온전성을 유지할 수 있다. 습윤 다공성 스폰지형 구조는 특정 인장 응력에 저항하고, 압축 해제 후 다시 튀어나와 유체를 재흡수할 수 있다. 다공성 스폰지형 스캐폴드 및/또는 생물학적 기능성 스캐폴드는 피부 병변, 국소 상처, 궤양, 종괴절제 또는 유방절제 후 유방, 깊은 또는 터널링 상처, 누공과 같은 결함부 상에 또는 내에 꼬이고/거나 접히고/거나 압연되고/거나 성형되고/거나 배치되고/거나 삽입되거나, 골, 연골 또는 연조직 결함부 주위를 감쌀 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 하나 이상의 연조직(들)을 약 0-50℃의 온도에서 분산시켜 분산된 연조직을 생성하는 것을 포함할 수 있다. 분산은 연조직에서 세포외 물질의 네트워크를 느슨하게 하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에 기술된 분산된 연조직은 도 15 및 16에 도시된 바와 같이 섬유의 네트워크를 포함할 수 있다. 천연 연조직과 비교하여, 분산된 연조직은 세포외 물질 중의 (및/또는 사이에) 더 많은 공간 및 증가된 공극 부피를 가질 수 있으며, 섬유 또는 섬유 다발은 분산 공정에 의해 무작위로 섞여 짜여지거나 역일 수 있다. 천연 연조직은 다른 몸체 구조를 연결하고/거나 지지하고/거나 둘러싸는 조직이다. 일부 구체예에서, 천연 연조직은 부분 또는 전체 장기, (예를 들어, 간, 신장, 췌장, 심장, 비장 및 폐), 근육, 지방, 혈관, 신경, 힘줄, 인대, 관절 막, 피부, 진피, 심장막, 심내막, 점막 조직, 근막, 동맥 또는 정맥, 경질막, 골막, 양막, 태반막, 융모막, 탯줄, 방광, 소장 또는 대장, 요도 및/또는 태반으로부터 선택될 수 있다.
추가의 구체예에서, 본원에 기재된 연조직은 자가이식편, 동종이식편 또는 이종이식편이다. 추가의 구체예에서, 연조직은 연골 및 골을 제외한 결합 조직일 수 있으며, 더욱 또는 덜 특수화될 수 있으며, 적어도 부분적으로 섬유로 이루어질 수 있는 외배엽, 중배엽 또는 내배엽 유래된 조직을 지칭한다. 본 발명에 고려되는 대부분의 결합 조직은 세포외 기질 (즉, 특히, 콜라겐, 프로테오글리칸, 엘라스틴, 히알루론산, 피브로넥틴, 라미닌)에서 풍부하고 다른 더욱 고도로 정돈된 조직 및 기관을 둘러싸는 덜 특수화된 조직이다. 본 발명에서 고려되는 비교적 더욱 특수화된 조직은 진피이다. 본 발명에 사용될 수 있는 다양한 결합 조직은 비제한적으로, 지방; 느슨한 결합 조직; 조밀한, 일정한, 불규칙한 또는 탄성의 결합 조직; 및 백색 섬유질 결합 조직을 포함한다. 그러나, 연골은 여기의 연조직에 포함되지 않는다. 결합 조직은 섬유의 농도에 따라 느슨한 (성근) 및 조밀한 것으로 분류될 수 있으며, 후자는 전자보다 더욱 풍부한 섬유를 갖는다. 본 발명의 일부 구체예에 사용될 수 있는 추가적인 유형의 근막의 예는 특히, 대퇴 근막, 부착판, 위팔 근막, 겨드랑 근막, 아래팔 근막, 복부 근막, 내부 근막, 장골 근막, 심근막, 빗장가슴 근막, 체모양 근막, 종아리 근막(crucial fascia), 삼각 근막, 배측 심 근막 (dorsal deep fascia), 골반 근막, 하퇴 근막, 요추 근막, 및 가슴 근막을 포함한다. 이용가능한 근막의 양 및 조달 동안 이용 가능성의 실제적인 이유로, 상부 다리 앞부분으로부터의 대퇴 근막이 특정 구체예에서 사용될 수 있다. 결합 조직은 척추동물로부터 얻을 수 있다. 결합 조직은 또한, 생물공학적 방법의 생성물 예를 들어, 세포 배양 방법을 이용하여 생성된 조직 공학처리된 결합 조직일 수 있으며, 생물공학적 방법의 이러한 생성물은 본원에 기재된 연조직으로서 포함될 수 있다. 일부 구체예에서, 본원의 연조직은 특히, 인간, 인간외 동물, 소, 말, 돼지, 양, 염소 또는 물고기 기원을 가질 수 있다.
본 발명의 특정 구체예에서 사용될 수 있는 결합 조직의 특정 예는 비제한적으로, 적어도 근막, 진피, 힘줄, 인대, 심장막, 요도, 소장, 근육, - 또는 피부를 포함한다. 본 발명의 특정 구체예에 사용될 수 있는 다양한 유형의 근막의 예는 특히, 대퇴 근막, 부착판, 위팔 근막, 겨드랑 근막, 아래팔 근막, 복부 근막, 내부 근막, 장골 근막, 심근막, 빗장가슴 근막, 체모양 근막, 종아리 근막, 삼각 근막, 배측 심 근막, 골반 근막, 하퇴 근막, 요추 근막, 및 가슴 근막을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 분산된 연조직은 슬라이싱하거나, 분쇄하거나, 깎거나, 쪼거나, 썰거나, 갈거나, 베거나, 나누거나, 찢거나, 떼어 내거나, 절개하거나, 자르거나, 깍둑썰기하거나, 밀거나, 빻거나, 단편으로 다듬어진 결합 조직을 나타내는, "대충 단편화된 결합 조직"을 임의로 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 그러한 단편화된 결합 조직은 약 50 마이크론 초과 및 약 0.5 cm 미만의 평균 직경을 가질 수 있고, 예를 들어, 약 0.5 x 0.5 cm의 절단 치수를 갖고, 대충 단편화된 조직에 적절한 두께를 갖는다. 일부 구체예에서, 미정제 단편은 크기가 일정하지 않을 수 있다. 한 양태에서, 본원에 기재된 분산된 연조직은 균일하게 작고 균등하게 분포된 입자로 감소된 결합 조직을 함유하는 "균질화된 결합 조직" 또는 "결합 조직 균질화물"을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 균질화된 결합 조직은 입자 외에, 물, 수용액, 또는 수혼화성 극성 유기 용매 중 적어도 하나를 임의로 포함할 수 있다. 본 발명의 방법에 이용된 균질화된 결합 조직은 약 50 마이크론 미만의 평균 직경을 갖는 입자를 포함한다. 일부 구체예에서, 균질화된 결합 조직은 결합 조직, 및 임의로, 물, 수용액 및 수혼화성 극성 유기 용매 중 적어도 하나를 포함하는 조성물의 전단-유도 파쇄(shredding)에 의해 제조될 수 있다.
또 다른 양태에서, 분산된 연조직 및/또는 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트는 본원에 기재된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개 이상의 연조직을 포함할 수 있다. 예를 들어, 분산된 연조직 및/또는 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트는 (i) 진피 또는 근막 및 (ii) 태반 조직, 지방 조직, 힘줄 인대 조직, 또는 신경 조직의 조합물을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, (i) 진피 또는 근막 대 (ii) 태반 조직, 지방 조직, 힘줄 인대 조직, 또는 신경 조직의 중량 비율은 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이다. 또 다른 예로서, 분산된 연조직 및/또는 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트는 (i) 양막 및 (ii) 융모막의 조합물을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, (i) 양막 대 (ii) 융모막의 중량 비율은 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이고, 바람직한 중량 비율은 0.1-10의 범위이거나, 더욱 바람직하게는 0.5-5의 범위이거나, 더욱 바람직하게는 0.7-3의 범위이다. 일부 구체예에서, 예를 들어, 융모막으로 제조된 분산된 연조직의 층 위에 양막으로 제조된 분산된 연조직의 층, 또는 양막으로 제조된 분산된 연조직의 두 층 사이에 샌드위치된 융모막으로 제조된 분산된 연조직의 층과 같이, 상이한 유형의 연조직이 적층될 수 있다. 다른 구체예에서, 분산된 연조직 및/또는 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트는, 특히, 인간, 비-인간 동물, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 또는 물고기 기원과 같은, 다양한 공급원으로부터의 연조직의 조합물을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 방법은 본원에 기재된 분산된 연조직 및/또는 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트에 하나 이상의 추가의 연조직을 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 그러한 첨가 단계(하나 이상의 추가의 연조직을 첨가하는)는 추가의 연조직의 분산 전이나 후에 수행될 수 있다.
또 다른 양태에서, 연조직은 약 -80, -70, -60, -50, -40, -30, -20, -10, -5, 0, 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37℃ 초과의 온도에서 분산될 수 있다. 일부 구체예에서, 연조직은 약 -70, -60, -50, -40, -30, -20, -10, -5, 0, 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 34, 35, 36, 37, 38 또는 39℃ 미만의 온도에서 분산될 수 있다. 추가 구체예에서, 연조직은 약 -80, -70, -60, -50, -40, -30, -20, -10, -5, 0, 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 또는 37℃의 온도에서 분산될 수 있다. 추가 구체예에서, 연조직은 약 -80 내지 약 50℃, -20 내지 약 50℃, -10 내지 약 50℃, 약 -5 내지 약 50℃, 약 0 내지 약 50℃, 약 0 내지 약 37℃, 약 5 내지 약 24℃, 약 10 내지 약 24℃, 약 15 내지 약 24℃, 약 -5 내지 약 10℃, 약 -5 내지 약 15℃, 또는 약 0 내지 약 15℃의 온도에서 분산될 수 있다. 또 다른 양태에서, 연조직은 연조직을 썰고/거나, 스카이빙하고/하거나(skiving), 제분하고/하거나, 분쇄하고/하거나, 슬라이싱하고/하거나, 두들김에 의해 기계적으로 분산될 수 있다(예컨대, 블렌더, 비터, 및 믹서에 의해). 일부 구체예에서, 연조직의 온도는 분산 과정으로 인해 주위 온도 이상으로 상승할 수 있으나, 연조직에는 추가 열이 가해지지 않는다. 바람직한 구체예에서, 연조직의 온도는 분산 과정 전이나 도중에, 예컨대, 차가운 용액(예컨대, 물 및 염수) 또는 얼음(예컨대, 물 또는 등장 용액으로 제조됨)을 연조직에 첨가함에 의해 조절될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 분산 전, 동안 및/또는 후에 연조직을 약 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 또는 200℃ 초과의 열로 처리하는 것을 배제할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 분산 전, 동안 및/또는 후에 연조직을 약 50, 70, 90, 또는 110℃ 미만의 열로 처리하는 것을 배제한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 분산 전, 동안 및/또는 후에 연조직을 약 26 내지 약 200℃, 약 30 내지 약 150℃, 약 40 내지 약 120℃, 약 50 내지 약 110℃, 및 약 50 내지 약 100℃의 열로 처리하는 것을 배제한다. 또 다른 양태에서, 상기 방법은 초음파분해, 마이크로파 조사, 또는 당 분야에 공지된 다른 방법 중에서, 가열 구성요소로부터의 통상적인 열 전달을 배제할 수 있다.
본원에서 사용된, 예를 들어, 조성물 내의 성분의 양, 농도, 부피, 공정 온도, 공정 시간, 수율, 유속, 압력, 및 유사 값, 및 이들의 범위를 수식하는 용어 "약"은, 예를 들어, 화합물, 조성물, 농축물 또는 사용 제형을 제조하는데 사용되는 전형적인 측정 및 취급 절차를 통해; 이러한 절차에서 우연한 실수 때문에; 상기 방법을 수행하기 위해 사용된 출발 물질 또는 성분의 제조업체, 공급원, 또는 순도의 차이; 및 유사한 고려사항을 통해 발생할 수 있는 수치적 양의 변동을 의미한다. 용어 "약"은 또한, 예를 들어, 특정 초기 농도 또는 혼합물을 갖는 조성물, 제형, 또는 세포 배양물의 에이징으로 인해 상이해진 양, 및 특정 초기 농도 또는 혼합물을 갖는 조성물 또는 제형의 혼합 또는 처리로 인해 상이해진 양을 포함한다. 용어 "약"에 의한 수식 여부와 상관없이, 여기에 첨부된 청구범위는 이러한 양에 대한 등가물을 포함한다. 용어 "약"은 명시된 참조 값과 유사한 범위의 값을 추가로 나타낼 수 있다. 특정 구체예에서, 용어 "약"은 명시된 참조 값의 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 퍼센트 이하에 있는 값의 범위를 나타낸다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 하나 이상의 연조직(들)은 약 5초, 10초, 15초, 20초, 25초, 30초, 40초, 50초, 60초, 2분, 3분, 4분, 5분, 10분, 15분, 30분, 60분, 2시간, 5시간, 10시간, 24시간, 48시간 또는 72시간 이상 동안 분산된다. 추가 구체예에서, 본원에 기재된 하나 이상의 연조직(들)은 약 20초, 30초, 60초, 2분, 3분, 4분, 5분, 10분, 15분, 30분, 60분, 2시간, 5시간, 10시간, 24시간, 48시간 또는 72시간 이하 동안 분산된다. 추가 구체예에서, 본원에 기재된 하나 이상의 연조직(들)은 약 20초 내지 72시간, 약 30초 내지 30분, 약 30초 내지 20분, 약 30초 내지 10분, 바람직하게는 약 1분 내지 20분, 약 1분 내지 10분, 또는 약 1분 내지 6분 동안 분산된다.
일부 구체예에서, 하나 이상의 연조직(들)은 용액 또는 용매(예컨대, 물 및 염수 용액)의 존재하에 분산된다. 용액 또는 용매는 액체 또는 고체의 형태일 수 있다. 추가 구체예에서, 하나 이상의 연조직(들)은 고체의 존재하에 분산된다(예컨대, 물로부터 형성된 얼음, 및 염수 용액으로부터 형성된 고체). 고체는 하나 이상의 염 과립 및/또는 하나 이상의 당 과립을 포함할 수 있다. 염 과립은, 예를 들어, NaCl2 및/또는 CaCl2를 포함할 수 있고, 당 과립은, 예를 들어, 글루코스, 수크로스, 및/또는 푸룩토스를 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 고체는 약 0.5 mm3, 1 mm3, 2 mm3, 4 mm3, 10 mm3, 2 cm3, 4 cm3, 6 cm3, 8 cm3, 10 cm3, 또는 그보다 큰 크기를 가질 수 있다. 추가 구체예에서, 고체의 크기는 약 0.5 mm3 내지 20 cm3, 약 1 mm3 내지 20 cm3, 약 5 mm3 내지 20 cm3, 약 1 cm3 내지 20 cm3, 또는 약 1 cm3 내지 10 cm3일 수 있다. 추가 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 연조직(들)을 분산시키는 동안 및/또는 후에 고체를 용해시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 또한 추가 구체예에서, 하나 이상의 촉촉한 연조직(들) 대 분산된 연조직 중 용액 또는 용매의 중량 비율(다시 말해, 조직의 습윤 중량 대 용액)은 약 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1.0 이상이다. 분산된 하나 이상의 연조직(들) 대 분산된 연조직 중 용액 또는 용매의 중량 비율은 또한 약 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1.0 이하일 수 있다. 추가로, 하나 이상의 연조직(들) 대 분산된 연조직 중 용액 또는 용매의 중량 비율은 약 0.010 내지 10.0, 바람직하게는 약 0.02 내지 2.0, 더욱 바람직하게는 약 0.04 내지 1.0, 약 0.05 내지 1.5, 약 0.05 내지 1.0, 또는 약 0.1 내지 1.0일 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 분산된 연조직 중 상기 하나 이상의 연조직(들)의 중량 백분율은 건조 상태에서 약 2, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 92, 94, 96, 98, 100% 이상이다. 추가 구체예에서, 상기 분산된 연조직 중 상기 하나 이상의 연조직(들)의 중량 백분율은 건조 상태에서 약 3, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 93, 95, 97, 99, 100% 이하이다. 추가 구체예에서, 상기 분산된 연조직 중 상기 하나 이상의 연조직(들)의 중량 백분율은 건조 상태에서 약 2% 내지 약 100%, 바람직하게는 약 50% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 80%, 60% 내지 100%, 80% 내지 약 100%, 또는 약 60% 내지 약 100%이다.
일부 구체예에서, 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트 중 상기 분산된 연조직의 중량 백분율은 건조 상태에서 약 50, 60, 70, 80, 또는 90% 이상이다. 추가 구체예에서, 상기 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트 중 상기 분산된 연조직의 중량 백분율은 건조 상태에서 약 50, 60, 70, 80, 또는 90%, 또는 100% 이하이다. 추가 구체예에서, 상기 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트 중 상기 분산된 연조직의 중량 백분율은 건조 상태에서 약 50% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 또는 약 90% 내지 약 100%이다. 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트 중 분산된 연조직의 양은 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트의 밀도, 다공성, 및/또는 점도 특성뿐만 아니라 다공성 구조의 재수화 특성을 조정하기 위해 달라질 수 있다. 더욱이, 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트에 추가적인 분산된 연조직을 혼입시키는 것은 3차원 프레임워크를 강화하고 다공성 구조의 무결성을 증가시킬 수 있다. 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트에 더 많은 분산된 연조직을 혼입시키는 것은 또한 세포의 부착, 이동, 및/또는 증식을 촉진시킴에 의해 다공성 구조의 프레임워크에 대한 세포 반응을 감소시키거나 증가시킬 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 분산된 연조직은 하나 이상의 연조직(들)으로부터의 천연(즉, 내인성) 크로스링커(들) 및 천연 담체(들) 외에 추가의 크로스링커 또는 담체를 요구하지 않으므로, 바람직한 구체예에서 이들을 포함하지 않는다. 따라서, 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법 및 결과로 초래된 생성물은 하나 이상의 연조직(들)으로부터의 천연 크로스링커(들) 및 천연 담체(들)를 필수적으로 포함하여 구성될 수 있다(및/또는 구성될 수 있다). 그러나, 또 다른 구체예에서, 방법 및 결과로 초래된 생성물은 연조직을 분산시킨 후에 하나 이상의 연조직(들)으로부터의 천연 크로스링커(들) 및 천연 담체(들) 외에 추가의 크로스링커(들) 또는 담체(들)의 첨가를 임의로 포함할 수 있어서, 이 구체예의 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트는 하기 기재된 대로 그러한 추가적 비천연 크로스링커(들) 또는 담체(들)를 임의로 포함할 수 있다.
천연 발생 크로스링커 및 담체와 관련하여, 본원에 기재된 연조직은 물리적 및/또는 화학적 결합인 천연 발생 크로스링커를 적어도 연조직의 두 부분 사이에 포함할 수 있다. 화학적 결합은 이온, 공유, 비공유, 및/또는 금속 결합을 포함할 수 있다. 더욱이, 전술한 바와 같이, 일부 바람직한 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 비천연 발생 크로스링커를 이용한 비천연 발생 결합에 의해 하나 이상의 연조직(들) 및/또는 분산된 연조직을 가교시키는 것을 포함하지 않는다
특히 비천연 발생 크로스링커 또는 담체와 관련하여, 일부 구체예에서, 전술한 바와 같이, 본원에 기재된 분산된 연조직 및/또는 생물학적 기능성 스캐폴드는 연조직을 분산시킨 후에 하나 이상의 연조직(들)으로부터의 천연 크로스링커(들) 및 천연 담체(들) 외에, 본원에서 가교제로도 불리는, 비천연 발생 크로스링커의 첨가를 임의로 포함할 수 있고, 임의로 첨가된 비천연 발생 크로스링커는 프로필렌 글리콜 알기네이트, 글리세롤, 수크로스 옥타설페이트, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리우레탄, 아크릴로일모르폴린, N,N-디메틸 아크릴아미드, N-비닐 피롤리돈 및 테트라하이드로푸르푸릴 메타크릴레이트, 하이드록시아파타이트, 폴리우레탄, 및 폴리락트산, 글루타르알데하이드, 글리세르알데하이드, 폴리(에틸렌 글리콜) 디에폭사이드 크로스링커, 폴리(에틸렌 글리콜) 디글리시딜 에테르, EDC 및 NHS, 트랜스글루타미나제, 에틸렌디아민, 리실 옥시다제 패밀리, 헥사메틸렌 디이소시아네이트(HMDIC), 디메틸 수베르이미데이트(DMS), 디메틸-3-3'-디티오비스프로피온이미데이트(DTBP), 및 아크릴 아지드, 및/또는 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 추가 구체예에서, 본원에 기재된 분산된 연조직 및/또는 생물학적 기능성 스캐폴드는 크산텐 염료, 나프탈이미드 화합물, 리보플라빈-5-포스페이트, N-하이드록시피리딘-2-(1H)-티온, N-(20-에틸아미노에틸)-4-아미노-1,8-나프탈이미드, 비스-디아조피루바미드-N,N9-비스(3-디아조피루보일)-2,29-(에틸렌디옥시)비스-(에틸아민)(DPD), 디아조피루보일(DAP), 메틸렌 블루, 에리트로신, 플록심(phloxime), 티오닌, 메틸렌 그린, 로즈 벵갈, 아크리딘 오렌지, 크산틴 염료, 티오크산틴 염료, 에틸 에오신, 및 에오신 Y, 및/또는 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 광활성제를 임의로 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 연조직은 또한 천연 담체를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 담체는 상처, 결함, 및/또는 수술 부위에 주사되거나 이식되는 3차원 프레임워크를 형성하도록 구성된다. 천연 담체는 연조직에서 천연 발생하는 담체이고, 예를 들어, 콜라겐 및 히알루론산(hyuronic acid) 또는 엘라스틴과 같은 세포외 기질을 포함한다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 분산된 연조직 및/또는 생물학적 기능성 스캐폴드는 젤라틴, 아가로스, 변형된 히알루론산, 프로필렌 글리콜 알기네이트, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세롤, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리우레탄, 아크릴로일모르폴린, N,N-디메틸 아크릴아미드, N-비닐 피롤리돈 및 테트라하이드로푸르푸릴 메타크릴레이트, 하이드록시아파타이트, 가교된 또는 작용기화된 히알루로난-기반 콜라겐 및 알기네이트, 폴리우레탄, 및 폴리락트산, 및/또는 상기 폴리머 중 적어도 하나를 포함하는 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 비천연 발생 담체를 임의로 포함할 수 있다. 추가의 잠재적인 구체예에서, 본원에 기재된 분산된 연조직 및/또는 생물학적 기능성 스캐폴드는 칼슘, 바륨, 알루미늄, 스트론튬, 구리, 아연, 마그네슘, 망간, 코발트, 또는 철의 염, 글루타르알데하이드, 글리세르알데하이드, 폴리(에틸렌 글리콜) 디에폭사이드 크로스링커, 폴리(에틸렌 글리콜) 디글리시딜 에테르, EDC 및 NHS, 트랜스글루타미나제, 에틸렌디아민, 리실 옥시다제 패밀리, 헥사메틸렌 디이소시아네이트(HMDIC); 디메틸 수베르이미데이트(DMS), 디메틸-3-3'-디티오비스프로피온이미데이트(DTBP), 아크릴 아지드, 및/또는 이들의 조합물을 임의로 포함할 수 있다.
전술한 대로, 한 구체예에서 본 발명의 분산된 연조직 및/또는 생물학적 기능성 스캐폴드는 연조직으로부터의 천연 크로스링커(들) 외에 추가의 크로스링커를 요구하지 않으므로, 바람직한 구체예에서 이를 포함하지 않는다. 그러나, 또 다른 구체예에서, 본원에 기재된 분산된 연조직은 연조직으로부터의 천연 담체(들) 외에 추가적 담체를 임의로 포함할 수 있다. 예를 들어, 대안적인 구체예에서 분산된 연조직은 알기네이트, 프로필렌 글리콜 알기네이트, 자연 또는 가교된 키토산, 전분, 폴리에틸렌 글리콜, 셀룰로스 및 이의 유도체(예컨대, 셀룰로스 아세테이트, 카르복시메틸 셀룰로스, 및 메틸 셀룰로스), 크산탄 검, 덱스트란, 히알루론산, 콘드로이틴 설페이트, 로커스트 빈 검, 트래거칸트 검, 아라비아 검, 커들란, 풀루란, 스클레로글루칸, 저급 메톡실펙틴, 또는 카라기난을 임의로 포함할 수 있다. 분산된 연조직은 임의로 담체 용액을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 포함되는 경우, 담체 용액은 칼슘, 바륨, 알루미늄, 스트론튬, 구리, 아연, 마그네슘, 망간, 코발트, 또는 철의 염, 글루타르알데하이드, 글리세르알데하이드, 게니핀, 글루코스 또는 리보스, 폴리(에틸렌 글리콜) 디에폭사이드 크로스링커, 폴리(에틸렌 글리콜) 디글리시딜 에테르, EDC 및 NHS, 트랜스글루타미나제, 에틸렌디아민, 리실 옥시다제 패밀리, 헥사메틸렌 디이소시아네이트(HMDIC); 디메틸 수베르이미데이트(DMS), 디메틸-3-3'-디티오비스프로피온이미데이트(DTBP), 또는 아크릴 아지드를 포함할 수 있다. 선택적 담체 용액은 또한 연조직으로부터의 천연 담체(들) 외에 천연 및/또는 합성 폴리머, 예컨대 자연 또는 변형된 콜라겐, 젤라틴, 아가로스, 변형된 히알루로산, 피브린, 키틴, 비오틴, 아비딘, MATRIGEL®, HUMAN EXTRACELLULAR MATRIX®, 프로테오글리칸, 라미닌, 피브로넥틴, 엘라스틴, 헤파린, 글리세롤, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리우레탄, 아크릴로일모르폴린, N,N-디메틸 아크릴아미드, N-비닐 피롤리돈 및 테트라하이드로푸르푸릴 메타크릴레이트, 하이드록시아파타이트, 히알루로난-기반 콜라겐 및 알기네이트의 가교결합 또는 작용기(cross-linkage or functionalization), 폴리우레탄, 폴리락트산, 또는 상기 폴리머 중 적어도 하나를 포함하는 조합물을 포함할 수 있다. 추가 구체예에서, 예를 들어, 본원에 기재된 분산된 연조직 및/또는 생물학적 기능성 스캐폴드는 연조직으로부터의 천연 담체(들) 외에 임의의 추가적 담체를 포함하거나 포함하지 않을 수 있고, 담체는 자연 콜라겐, 히알루론산, 피브린, 키틴, 비오틴, 아비딘, MATRIGEL®, HUMAN EXTRACELLULAR MATRIX®, 프로테오글리칸, 라미닌, 피브로넥틴, 엘라스틴, 헤파린, 알기네이트, 게니핀, 키토산, 전분, 글루코스 또는 리보스, 셀룰로스 및 이의 유도체(예컨대, 셀룰로스 아세테이트, 카르복시메틸 셀룰로스, 및 메틸 셀룰로스), 크산탄 검, 덱스트란, 히알루론산, 콘드로이틴 설페이트, 로커스트 빈 검, 트래거칸트 검, 아라비아 검, 커들란, 풀루란, 스클레로글루칸, 저급 메톡실 펙틴, 및 카라기난, 및/또는 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 또한, 추가 구체예에서, 본원에 기재된 분산된 연조직 및/또는 생물학적 기능성 스캐폴드는 연조직으로부터의 천연 크로스링커(들) 외에 임의의 추가적인 크로스링커를 포함하거나 포함하지 않을 수 있고, 임의의 추가적 크로스링커는 알기네이트, 전분, 셀룰로스 및 이의 유도체(예컨대, 셀룰로스 아세테이트, 카르복시메틸 셀룰로스, 및 메틸 셀룰로스), 크산탄 검, 덱스트란, 카라기난, 게니핀, 히알루론산, 콘드로이틴 설페이트, 로커스트 빈 검, 트래거칸트 검, 아라비아 검, 커들란, 풀루란, 스클레로글루칸, 및 저급 메톡실펙틴, 글루코스 또는 리보스, 자연 콜라겐, 히알루론산, 피브린, 키틴, 비오틴, 아비딘, MATRIGEL®, HUMAN EXTRACELLULAR MATRIX®, 프로테오글리칸, 라미닌, 피브로넥틴, 엘라스틴, 헤파린, 및 키토산, 및/또는 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된다.
본원에 기재된 방법은 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트를 생성시키기 위해 상기 분산된 연조직을 냉동시키거나, 건조시키거나, 냉동-건조시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 냉동 및 냉동-건조는 제어된 냉동 속도에서 실시될 수 있다. 제어된 냉동 속도는 분당 약 1℃ 내지 20℃, 분당 약 2℃ 내지 10℃, 분당 약 3℃ 내지 10℃, 분당 약 3℃ 내지 6℃일 수 있다. 일부 구체예에서, 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트는 냉동-건조된 단편이 약 10, 5, 4, 3, 2, 1, 0.5, 또는 0.1 wt% 미만의 평균 잔여 수분을 지니게 하는 지점까지 냉동-건조될 수 있다. 추가의 구체예에서, 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트는 건조되거나 냉동-건조된 단편이 약 0.01% 내지 10%, 약 0.01% 내지 5%, 약 0.01% 내지 3%, 약 0.1% 내지 3%, 0.5% 내지 3%, 또는 1% 내지 3%의 잔여 수분을 지니게 하는 지점까지 건조되고/거나 냉동-건조될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 분산된 연조직은 하나 이상의 연조직(들); 및 용액 또는 용매를 필수적으로 포함하여 구성되고/거나 이로 구성된다. 일부 구체예에서, 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트는 하나 이상의 연조직(들)으로부터의 성분을 필수적으로 포함하여 구성되고/거나 이로 구성된다. 용어 "~을 필수적으로 포함하여 구성되는"은 스캐폴드 및/또는 임플란트의 범위가 초기 요소들로 구성되는 스캐폴드 및/또는 임플란트의 다공도 또는 공극률에 실질적으로 영향을 미치지 않는 추가의 요소를 포함하는 것으로 정의된다. 예를 들어, 하나 이상의 연조직(들)을 필수적으로 포함하여 구성되는 분산된 연조직은 하나 이상의 연조직(들)으로 구성되는 분산된 연조직의 다공도 또는 공극률에 실질적으로 영향을 미치지 않는 하나 이상의 연조직(들) 이외의 요소를 포함할 수 있다. 본원에서 다공도 또는 공극률에 실질적으로 영향을 미치는 것은 다공도 또는 공극률을 적어도 약 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 또는 40% 만큼 변화시킨다는 것을 의미한다.
일부 구체예에서, 상기 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트의 밀도는 건조 상태에서 약 0.001 g/cm3, 0.01 g/cm3, 0.05 g/cm3, 0.1 g/cm3, 0.5 g/cm3, 0.7 g/cm3, 0.9 g/cm3 이상이다. 추가적인 구체예에서, 상기 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트의 밀도는 건조 상태에서 약 0.002 g/cm3, 0.02 g/cm3, 0.06 g/cm3, 0.3 g/cm3, 0.6 g/cm3, 0.8 g/cm3, 0.9 g/cm3, 1.0 g/cm3, 1.2 g/cm3, 1.5 g/cm3 이하이다. 추가의 구체예에서, 상기 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트의 밀도는 건조 상태에서 약 0.01 g/cm3 내지 약 1 g/cm3, 약 0.01 g/cm3 내지 약 1 g/cm3, 약 0.02 g/cm3 내지 약 0.5 g/cm3, 약 0.02 g/cm3 내지 약 0.2 g/cm3, 약 0.0.3 g/cm3 내지 약 0.2 g/cm3이다.
일부 구체예에서, 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트는 약 1, 5, 10, 100, 200, 300, 400, 500, 700, 1000, 1500, 2000, 3000, 또는 4000 μm 이상의 평균 직경을 지니는 기공을 포함한다. 추가의 구체예에서, 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트는 약 2, 6, 20, 100, 200, 300, 400, 500, 700, 900, 1000, 1300, 1500, 2000, 3000, 또는 4000 μm 이하의 평균 직경을 지니는 기공을 포함한다. 추가의 구체예에서, 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트는 평균적으로 약 1 μm 내지 4000 μm, 1 μm 내지 1000 μm, 약 10 μm 내지 1000 μm, 약 20 μm 내지 500 μm, 약 20 μm 내지 200 μm, 약 50 μm 내지 200 μm의 평균 직경을 지니는 기공을 포함한다. 일부 구체예에서, 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트는, 70% 이하가 50 μm 미만의 직경을 지니는 기공을 갖는다. 일부 구체예에서, 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트는, 30% 초과가 약 50 μm 내지 200 μm의 직경을 지니는 기공을 갖는다. 일부 구체예에서, 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트는, 50% 초과가 약 20 μm 내지 200 μm의 직경을 지니는 기공을 포함한다.
일부 구체예에서, 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트의 평균 공극 부피는 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99% 이상이다. 추가적인 구체예에서, 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트의 평균 공극 부피는 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99% 이하이다. 추가의 구체예에서, 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트의 평균 공극 부피는 약 10% 내지 약 99%, 약 30% 내지 99%, 약 50% 내지 약 99%, 약 70% 내지 99%, 약 80% 내지 약 99%, 또는 약 80% 내지 96%이다. 일부 구체예에서, 생물학적 기능성 스캐폴드의 평균 공극 부피는 약 1 cc/ 내지 30 cc/g, 약 2 cc/g 내지 20 cc/g, 약 3 cc/g 내지 20 cc/g, 약 5 cc/g 내지 20 cc/g이다. 일부 구체예에서, 생물학적 기능성 스캐폴드의 평균 공극 부피는 건조 또는 냉동 건조 전에 분산된 연조직에 첨가되는 액체의 부피를 조절함으로써 제어될 수 있다.
한 양태에서, 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트는 섬유 및/또는 시트를 포함한다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 방법에 의해 제조되는 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트는 종래 기술에서 일부 다른 가공 기술에 비해 이의 천연 상태와 더 유사한 치수 또는 직경의 콜라겐 섬유, 콜라겐 섬유 다발을 지닐 수 있다. 일부 구체예에서, 스캐폴드에서 섬유 또는 섬유 다발은 엮이거나 무작위로 섞여 짜여진다. 이전의 기술은 조직 섬유가 천연 섬유보다 작은 크기를 갖게 하여 생체 내에서 더 빠르게 분해될 수 있다. 더욱이, 본원에 기재된 방법에서 연조직은 바람직하게는 변성되거나, 미분화되거나, 저온파괴되지 않으면서, 그에 따라서 바람직하게는 세포외 기질 거대분자 성분(예를 들어, 특히, 콜라겐, 프로테오글리칸, 엘라스틴, 히알루론산, 라미닌, 피브로넥틴)이 변화되지 않거나 단지 최소한으로 변화되고, 분산된 연조직, 및/또는 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트에서 거대분자 성분의 상대 비율이 변화되지 않거나 단지 최소한으로 변화되면서 분산된다. 다시 말해서, 생성된 생물학적 기능성 스캐폴드의 세포외 기질 거대분자는 바람직하게는 본 발명의 바람직한 방법에 의해 변형되지 않는다(또는 적어도 실질적으로 변형되지 않는다). 본 발명의 바람직한 방법에 따른 연조직을 분산시키는 것은 스캐폴드 이식 후에 세포 침윤 및/또는 조직 성장(tissue-in-growth)을 용이하게 하기 위해 연조직의 구조를 개방할 수 있지만, 바람직하게는 다른 기술에 의해 제조되는 임플란트와는 달리 마이크로 규모 수준으로 세포-스캐폴드 및/또는 임플란트 상호작용을 변형시키지 않을 수 있다. 이와 동시에, 본 발명의 바람직한 스캐폴드 및/또는 임플란트의 섬유 및/또는 섬유 다발 치수(예를 들어, 직경, 또는 폭, 및 길이)는 추가의 (비-자연적인) 가교 필요 또는 담체 첨가 없이 비교적 강하고 안정한 뼈대를 제공할 수 있는 섬유, 섬유 다발 및/또는 시트의 네트워크 및 개방된 기공 구조를 지니는 뼈대를 지지할 수 있다. 일부 구체예에서, 섬유 또는 섬유 다발 치수는 스캐폴드 및/또는 임플란트의 온전성 및 밀착성을 변형 또는 약화시키지 않으면서 본 발명의 스캐폴드 및/또는 임플란트에 안정한 뼈대를 제공할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 스캐폴드 및/또는 임플란트의 구조는 액체에서 재수화 및 교반 후에 온전하게 유지될 수 있고, 본 발명의 스캐폴드 및/또는 임플란트는 동물에서 이식 후에 생체적합성 세포 및 조직 반응 및 우수한 부피 보유를 가능하게 할 수 있다. 동물에서 이식 후 부피 보유는 이식 후 상이한 시점에서 이식된 스캐폴드의 최대 단면적에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트는 이식한 지 1-4주 후에 수용체의 세포 침윤 및 혈관형성을 지니고, 스캐폴드 및/또는 임플란트 부피(예를 들어, 이식된 스캐폴드의 최대 단면적)를 이식한 지 4주 내지 24주에 약 30% 내지 100%, 이식한 지 4주 내지 24주에 약 40% 내지 100%, 또는 이식한 지 4주 내지 24주에 약 50% 내지 100%로 유지할 수 있다.
일부 구체예에서, 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트는 약 0.1, 0.5, 1, 3, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 μm 이상의 평균 직경을 지니는 섬유 또는 섬유 다발을 포함할 수 있다. 추가적인 구체예에서, 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트는 약 0.1, 0.5, 1, 3, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 μm 이하의 평균 직경을 지니는 섬유 또는 섬유 다발을 포함할 수 있다. 추가의 구체예에서, 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트는 약 0.1 μm 내지 약 500 μm, 약 0.1 μm 내지 약 200 μm, 약 1 μm 내지 약 500 μm, 약 10 μm 내지 약 500 μm, 약 100 μm 내지 약 1000 μm, 또는 약 100 μm 내지 약 500 μm의 평균 직경을 지니는 섬유 또는 섬유 다발을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트는 약 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 1000, 3000, 5000 μm 이상의 평균 직경을 지니는 시트를 포함할 수 있다. 추가적인 구체예에서, 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트는 약 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 μm 이하의 평균 직경을 지니는 시트를 포함할 수 있다. 추가의 구체예에서, 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트는 약 51 μm 내지 약 500 μm, 약 51 μm 내지 약 1000 μm, 약 100 μm 내지 약 800 μm, 약 60 μm 내지 약 500 μm, 약 100 μm 내지 약 1000 μm, 또는 약 100 μm 내지 약 500 μm의 평균 직경을 지니는 섬유 및/또는 시트를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트는 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 1000 μm, 5000 μm, 1 cm, 2 cm, 5 cm, 10 cm, 12 cm, 15 cm, 20 cm, 25 cm, 또는 50 cm 이상의 평균 길이를 지니는 섬유, 섬유 다발 및/또는 시트를 포함한다. 일부 구체예에서, 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트는 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 1000 μm, 5000 μm, 1 cm, 2 cm, 5 cm, 10 cm, 12 cm, 15 cm, 20 cm, 25 cm, 또는 50 cm 이하의 평균 길이를 지니는 섬유, 섬유 다발 및/또는 시트를 포함한다. 추가적인 구체예에서, 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트는 약 5 μm 내지 약 50 cm, 약 100 μm 내지 약 50 cm, 약 1000 μm 내지 약 50 cm, 약 1 cm 내지 약 50 cm, 약 1 cm 내지 약 30 cm, 약 1 cm 내지 약 20 cm, 또는 약 1 cm 내지 약 15 cm의 평균 길이를 지니는 섬유, 섬유 다발 및/또는 시트를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트는 무작위로 섞여 짜이거나 엮인 콜라겐 섬유 및 콜라겐 섬유 다발을 지니는 분산된 연조직 시트를 포함한다.
일부 구체예에서, 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트는 포켓, 빗, 중공형 실린더, 삼각 피라미드, 막대, 시트, 큐브, 튜브, 컵, 콘케이브(concave), 크레센트(crescent), 입자, 구체, 타원체, 쐐기, 또는 리본의 형태이다. 추가적인 구체예에서, 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트는 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 1000 μm, 5000 μm, 1 cm, 2 cm, 5 cm, 10 cm, 12 cm, 15 cm, 20 cm, 25 cm, 또는 50 cm 이상의 평균 길이를 지닐 수 있다. 일부 구체예에서, 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트는 5 μm, 10 μm, 50 μm, 100 μm, 1000 μm, 5000 μm, 1 cm, 2 cm, 5 cm, 10 cm, 12 cm, 15 cm, 20 cm, 25 cm, 또는 50 cm 이하의 평균 길이를 지닐 수 있다. 추가적인 구체예에서, 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트는 약 5 μm 내지 약 50 cm, 약 100 μm 내지 약 50 cm, 약 1000 μm 내지 약 50 cm, 약 1 cm 내지 약 50 cm, 약 3 cm 내지 약 40 cm, 약 3 cm 내지 약 30 cm, 약 3 cm 내지 약 20 cm, 또는 약 3 cm 내지 약 10 cm의 평균 길이를 지닐 수 있다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 본 발명의 방법은, 예를 들어, 약 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 13, 16, 17, 또는 20 mm 이하의 기공 크기를 지니는 체, 메쉬, 또는 그리드 상에서 분산된 연조직을 체질하는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 본원에 기재된 방법은 약 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 13, 16, 17, 또는 20 mm 이상의 기공 크기를 지니는 체, 메쉬, 또는 그리드 상에서 분산된 연조직을 체질하는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 본원에 기재된 방법은 약 0.5 내지 20 mm, 약 1 내지 10 mm, 약 2 내지 10 mm, 약 2 내지 8 mm, 또는 약 2 내지 6 mm의 기공 크기 직경을 지니는 체, 메쉬, 또는 그리드 상에서 분산된 연조직을 체질하는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 본원에 기재된 방법은 소정 형상을 지니는 주형에 분산된 연조직을 배치하는 것을 추가로 포함할 수 있고, 여기서 분산된 연조직은 주형에서 냉동되거나, 건조되거나, 냉동-건조된다. 또 다른 양태에서, 본원에 기재된 방법은 이식 전에 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트를 저장하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트는 건조 상태로, 냉동보존으로, 또는 습윤 상태로 저장된다. 추가적인 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트를 물 대체제로 처리하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 추가의 구체예에서, 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트는 습윤 상태로 저장될 수 있다. 또 다른 추가의 구체예에서, 물 대체제는 글리세롤(글리세린 USP), 아도니톨, 소르비톨, 리비톨, 갈락티톨, D-갈락토스, 1,3-디하이드록시프로판올, 에틸렌 글리콜, 트리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 글루코스, 수크로스, 만니톨, 자일리톨, 메소-에리트리톨, 아디프산, 프롤린, 하이드록시프롤린, 폴리에틸렌 글리콜, 알코올, 및 지질로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다. 또 다른 양태에서, 본원에 기재된 방법은 각각 전체가 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제6,293,970호, 제6,569,200호, 제6,544,289호, 제7,063,726호, 또는 미국 특허 출원 공개 제2010/0030340호, 제2014/0180437호, 제2011/0015757호, 및 제2013/0218294호에 기재된 바와 같은 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트를 가소화시킴을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 방법은 또한 냉동, 건조, 및/또는 냉동 건조 전 또는 그 후에(또는, 공기 건조 또는 사전-설정된 온도의 건조 오븐에서의 건조와 같은, 냉동 건조 이외의 스캐폴드를 건조시키기 위한 다른 방법 전 또는 그 후에) 상기 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트를 하나 이상의 처리 용액으로 처리하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 또한 상기 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트를 이식 전에 냉동, 건조, 및/또는 냉동 건조 후 하나 이상의 처리 용액으로 처리하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 처리 용액은 이온성, 효소적, 또는 화학적 가교제, 광활성제, 또는 폴리머를 포함한다. 이온성 가교제는 칼슘, 바륨, 알루미늄, 스트론튬, 구리, 아연, 마그네슘, 망간, 코발트, 및 철로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 효소적 가교제는 트랜스글루타미나제, 에틸렌디아민, 리실 옥시다아제 패밀리, 헥사메틸렌 디이소시아네이트(HMDIC), 디메틸 수베르이미데이트(DMS), 및 디메틸-3-3'-디티오비스프로피온이미데이트(DTBP)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 화학적 가교제는 글루타르알데하이드, 글리세르알데하이드, 게니핀, 글루코스 또는 리보스, 폴리(에틸렌 글리콜) 디에폭사이드 크로스링커, 폴리(에틸렌 글리콜) 디글리시딜 에테르, EDC 및 NHS, 및 아크릴 아지드로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다. 폴리머는 자연 또는 변형된 콜라겐, 젤라틴, 아가로스, 변형된 히알루론산, 피브린, 키틴, 비오틴, 아비딘, 탈광물화된 골 기질, MATRIGEL®, HUMAN EXTRACELLULAR MATRIX®, 프로테오글리칸, 라미닌, 피브로넥틴, 엘라스틴, 헤파린, 글리세롤, 수크로스 옥타설페이트, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리우레탄, 아크릴로일모르폴린, N,N-디메틸 아크릴아미드, N-비닐 피롤리돈 및 테트라하이드로푸르푸릴 메타크릴레이트, 하이드록시아파타이트, 폴리우레탄, 및 폴리락트산으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 게다가, 냉동 건조 외에, 공기 건조 또는 사전-설정된 온도의 건조 오븐에서의 건조와 같이 스캐폴드를 건조시키기 위한 다른 방법이 이용될 수 있음이 고려되어야 한다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 방법은 또한 하나 이상의 연조직(들), 분산된 연조직, 또는 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트에 하나 이상의 생활성 보충물(들)을 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 생활성 보충물(들)은 FGF 패밀리, TGF-패밀리, 아멜로게닌 패밀리, IGF-1, PDGF, EGF, VEGF, HGF, PTHrP, Ihh, 덱사메타손, 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄, ITS, 또는 아스코르베이트의 성장 또는 분화 인자로 구성된 군으로부터 선택된다. 생활성 보충물은 성장 인자, 분화 인자, 사이토킨, 항-미생물제, 에나멜 기질 유도체(enamel matrix derivative: EMD), 또는 항염증제일 수 있다. 성장 또는 분화 인자는, 예를 들어, FGF-패밀리 또는 TGF-패밀리, IGF-1, PDGF, EGF, VEGF, HGF, PTHrP, Ihh(Indian Hedgehog Homolog), 덱사메타손, 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄, ITS 보충물, 아스코르베이트의 성장 인자, 또는 이들의 조합물일 수 있다. 사이토킨은 GM-CSF, G-CSF, TNF-α, IL-1β, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, SLP1, MCP1, MIP-1α, MIP-2, IL-18, 안지오포이에틴, KGF, 엔도텔린, IFN-α, 또는 IFN-β를 포함할 수 있다. 항염증제의 예는 IL-1βR 항체, TNF-α 수용체 길항제, 사이클로옥시게나제-2 특이적 억제제, MAP 키나제 억제제, NO 신타아제 억제제, NF-κB 억제제, 또는 MMP의 억제제를 포함할 수 있다. 이들은 다양한 섬유모세포 성장 인자이다. 예로서, 인간 FGF-패밀리는 FGF-1 내지 FGF-23의 22개의 구성원을 포함한다(FGF-15는 인간 FGF-19의 마우스 오솔로그이기 때문에 인간 FGF-15는 없다). TGF-패밀리의 구성원의 예는 TGF-α 및 TGF-β 수퍼패밀리를 포함할 수 있다. TGF-β 수퍼패밀리는 TGF-β (예컨대, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3), 액티빈, 인히빈, 골 형태발생 인자(bone morphogenic factor: BMP), 변형된 BMP, 항-뮬러리안 호르몬(AMH), 마이오스타틴 등을 포함한다. BMP의 20개 아이소타입이 존재한다. 이들은, 예를 들어, (1) BMP2 및 BMP4; (2) BMP3 및 BMP3B (성장/분화 인자 10 (GDF10)으로도 알려짐); (3) BMP 5, 6, 7 및 8; 및 (4) GDF 5, 6, 및 7의 4개의 서브패밀리로 분류될 수 있다. 추가적인 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 또한 탈광물화된 골 기질, 기저막, 또는 점막하 기질을 포함하는 조직으로부터 추출된 하나 이상의 생활성 보충물(들)을 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 추가의 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 또한 산소-라디칼-유발 손상 항산화제로부터 생활성 성분을 보호하기 위해 예를 들어 소듐 니트로프루시드, 연골 기질 글리코단백질CMGP), 비타민 C, 비타민 E, 셀레늄, N-아세틸시스테인(NAC) 에스트라디올, 글루타티온, 멜라토닌, 레스베라트롤, 플라보노이드, 카로텐, 아미노글루아니딘, 또는 리코펜을 포함하는 하나 이상의 항산화제를 첨가함을 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 방법은 또한 하나 이상의 연조직(들), 분산된 연조직, 또는 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트에 생활성 보충물 결합 부위(들)를 지니는 하나 이상의 작용제(들)를 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 생활성 보충물 결합 부위(들)를 지니는 작용제는 히알루로난, 헤파린, 헤파린 설페이트, 케라틴 설페이트, 데르마탄 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 베타글리칸, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸, 신데칸, 바이글리칸, 또는 데코린을 포함할 수 있다. 추가적인 구체예에서, 생활성 보충물 결합 부위(들)를 지니는 작용제(들)는 상기 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트에 대한 성장 인자, 분화 인자, 사이토킨, 항-미생물제, 또는 항염증제의 친화성을 증가시킨다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 방법은 또한 연조직을 분산시키기 전에 하나 이상의 연조직(들)을 평균적으로 약 0.5, 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500 mm 이상의 길이 및/또는 직경의 치수를 지니도록 절단함을 포함할 수 있다. 추가적인 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 또한 하나 이상의 연조직(들)을 평균적으로 약 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 550 mm 이하의 치수를 지니도록 절단함을 포함할 수 있다. 추가의 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 또한 하나 이상의 연조직(들)을 평균적으로 약 1 mm 내지 약 60 cm, 약 1 mm 내지 약 50 cm, 약 1 cm 내지 약 30 cm, 약 1 cm 내지 약 20 cm, 또는 약 1 cm 내지 약 10 cm의 치수를 지니도록 절단함을 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본원에서 기술되는 방법은 하나 이상의 연조직(들)을 세정하고 소독하는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 본원에서 기술되는 방법은 또한 연조직을 세정하고 소독하고, 연조직과 관련된 외래 조직을 제거하는 것을 포함할 수 있다. 연조직은 작은 조각으로 절단되어 대충 단편화된 연조직을 생성하고, 임의로, 증류된/탈이온화된 내독소-비함유 물 및/또는 수용액, 예컨대, 특히 등장성 염수로 분쇄되고 세척될 수 있다. 처리시, 다수회의 "세척" 또는 "세정"은 일부 구체예에서, 처리되는 조직의 근사된 부피의 2, 5, 10, 또는 20배인 수용액 부피의 사용에 영향을 받을 수 있다. 이러한 세 처리 단계의 사용은 관련된 가용화 요소의 대략 1:100, 1:500 또는 1:1000 희석에 작용할 수 있어 조직에 그러한 가용화 요소가 본질적으로 존재하지 않게 한다. 분산된 연조직은 섬유, 다발, 시트 및 균일하게 작고 고르게 분포된 다른 성분들로 감소된 연조직을 포함할 수 있다. 분산된 연조직은 임의로 물, 수용액, 예를 들어 등장성 염수, 및 수혼화성 극성 유기 용매 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 분산된 연조직 및, 임의로 수혼화성 극성 유기 용매, 물 및 수용액 중 적어도 하나는 연조직의 전단-유도 파쇄에 의해 제조될 수 있다. 통상적인 블렌더가 특정 구체예에서 분산된 연조직을 제조하는데 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 분산 속도는 통상적인 블렌더에 대해 저속 내지 중속으로 설정된다. 또 다른 양태에서, 본원에서 기술되는 방법은 또한 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제6,734,018호, 제7,338,757호, 제8,574,826호, 제6,743,574호, 및 제8,563,232호, 및 미국 특허 출원 공개 번호 2014/0065238A1 및 2014/0154663A1에 기술된 방법에 따라 세포의 구성요소를 제거하기 위해 하나 이상의 연조직(들)을 탈활력화(devitalizeing) 또는 탈세포화(decellularizing)하는 것을 포함할 수 있다. 탈활력화 공정은 연조직의 기질 및/또는 조직 구조에 대한 손상 없이 수행될 수 있고, 세정제, 사르코시네이트, 엔도누클레아제, 및 소독제를 사용할 수 있다. 기질 구조는 다른 성분들 중에서 콜라겐, 히알루로닌, 엘라스틴, 피브로넥틴, 라미닌, 뮤코다당류 및 프로테오글리칸을 포함할 수 있다. 탈활력화되는 연조직은 특정 구체예에서 약 30, 20, 15, 10, 8, 5, 3, 2, 1, 0.5, 0.1, 0.05 mm 이하의 두께를 가질 수 있다. 탈활력화되는 연조직은 또한 약 30, 20, 10, 8, 5, 3, 2, 1, 0.5, 0.1, 0.05 mm 이상의 두께를 가질 수 있다. 또 다른 양태에서, 본원에서 기술되는 방법은 또한 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트를, 스캐폴드 및/또는 임플란트의 형상 및 치수에 적합하고, 이식할 때까지 형상 및 치수를 유지할 설계된 패키지에 배치하는 것을 포함할 수 있다(예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 WO2014130953 참조). 또 다른 양태에서, 본원에서 기술되는 방법은 또한 하나 이상의 연조직(들), 분산된 연조직, 또는 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트를 멸균시키는 것을 포함할 수 있다. 멸균은 일부 구체예에서 이온화 방사선의 사용을 포함할 수 있다. 그 밖의 구체예에서, 이온화 방사선의 흡수 선량은 약 8.0 KGy 내지 약 50 KGy, 약 8.0 KGy 내지 약 25 KGy, 또는 약 8.0 KGy 내지 약 18 KGy일 수 있다. 일부 구체예에서, 멸균 단계는 다공성 스폰지형 구조를 갖는 패키징된 조직 수복 임플란트를 드라이 아이스 상에 배치하고, 패킹징된 조성물을 조사하는 것을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 멸균은 약 -20℃ 내지 -50℃의 온도에서 수행될 수 있다. 본 발명의 임플란트는 감마 조사, 소독제, 초임계 이산화탄소, 에틸렌 옥사이드 또는 전자 빔을 사용하여 멸균될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본원에서 기술되는 방법은 하나 이상의 골 또는 연골 단편 물질(들)을 하나 이상의 연조직(들), 분산된 연조직, 또는 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트에 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 골 단편 물질(들)은 골, 피질골, 해면골, 피질 해면골, 세라믹, 하이드록시아파타이트, 칼슘 포스페이트, 칼슘 설페이트, 및 칼슘 카보네이트로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 골은 탈광물화된 골(demineralized bone) 또는 비탈광물화된 골(non-demineralized bone)일 수 있다. 본원에서 사용되는 "탈광물화된골 기질(demineralized bone matrix)(DBM)"은 약 8 wt% 미만의 잔류 칼슘을 갖는 골을 나타낸다. 탈광물화(demineralization)는 골 조직의 무기 미네랄 하이드록시아파타이트 물질을 제거하기 위해 골 조직을 처리하는 것을 포함한다. 골 조직의 탈광물화 수준은 탈광물화된 골에서 발견되는 잔류 칼슘의 양(wt%)에 의해 정의된다. 일부 구체예에서, 탈광물화된 골은 여전히 탈광물화 처리 후에도 초기 골로부터 잔류하는 생리학적 활성 수준의 성장 및 분화 인자(예를 들어, 골형성/골유도 성장 인자, 예컨대 골 형성 단백질(bone morphogenetic protein)(BMP))를 함유할 수 있다. 추가의 구체예에서, 탈광물화된 골은 콜라겐, 글리코사미노글리칸, 오스테오칼신(osteocalcin), 오스테오넥틴(osteonectin), 골 시알로단백질(bone sialoprotein), 오스테오폰틴(osteopontin) 및 이들의 혼합물을 함유할 수 있다. 본 출원에서 사용되는 "비탈광물화된 골"은 존재하는 미네랄, 예컨대, 이를 테면 하이드록시아파타이트를 제거하기 위해 처리되지 않은 골을 나타낸다. 본 발명의 특정 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트는 탈광물화된 골 입자 또는 섬유를 포함할 수 있다. 탈광물화된 골 기질은 동결 건조되거나 동결 건조되지 않고, 골 입자 또는 섬유로 분쇄/파쇄/밀링된 세정되고 소독된 골로부터 제조될 수 있다. 골 입자는 예를 들어, 요망하는 크기 범위 내의 입자를 얻기 위해 상업적으로 입수가능한 체질 디바이스(sieving device)(즉, 메쉬 체(mesh sieves))를 사용함으로써 선택될 수 있다. 이러한 탈광물화된 골 입자는 약 125 마이크론 내지 약 4 mm; 약 710 마이크론 내지 약 2 mm; 약 125 마이크론 내지 약 500 마이크론; 약 125 마이크론 내지 약 850 마이크론; 약 125 마이크론 내지 약 710 마이크론; 약 250 내지 1000 마이크론; 또는 약 250 마이크론 내지 약 710 마이크론의 평균 직경을 가질 수 있다. 본 발명의 특정 구체예는 상업적으로 입수가능한 탈광물화된 골 입자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 광범위하고 신뢰성있게 이용가능한 적합한 탈광물화된 골 입자는 LifeNet Health(Virginia Beach, Virginia)에 의해 생산된다. 본 발명의 일부 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트는 탈광물화된 골 섬유를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 탈광물화된 골 섬유는 약 0.1 mm 내지 약 0.3 mm의 평균 두께 및 약 0.3 mm 내지 약 1.0 mm의 평균 폭을 가질 수 있다. 섬유의 길이는 다양할 수 있다. 일부 구체예에서, 탈광물화 과정은 약 1 mm 내지 약 2 mm의 평균 직경 크기 범위를 갖는 골 입자 또는 0.1 mm 내지 0.5 mm 두께의 평균 치수 및 약 0.3 mm 내지 약 1 mm의 평균 폭을 갖는 골 섬유를 생성함으로써 시작된다. 단편은 세정 용액으로 처리될 수 있다. 단편으로 처리되어야 하는 골이 미리 세정되고/거나 소독되지 않은 경우, 이들은 골수 및 세포 요소와 같은 관련 조직의 제거에 영향을 미치는, 세정제, 과산화수소, 항생제, 산 및/또는 알코올을 사용함으로써 세정되고/거나 소독될 수 있다. 세정 및 소독 후, 이들 단편(즉, 입자 및 섬유)은, 골 단편(즉, 입자 및 섬유)의 미네랄 성분의 제거/감소에 영향을 미치는 묽은 염산에 노출시킴으로써 탈광물화될 수 있다. 이러한 추가 처리는 일부 예에서, 잠재적 바이러스 오염(즉, 특히, HIV 및 간염 바이러스)을 불활성화시킬 수 있다.
또 다른 양태에서, 본원에서 기술되는 방법은 다공성을 증가시키기 위해 냉동, 건조 또는 냉동-건조되기 전에 음정수압(negative hydrostatic pressure) 하에서 분산된 연조직을 처리하는 것을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 본 발명에서 3차원(3-D) 거대-다공성 구조는 세포들이 기능하는 조직으로 조직화될 때까지 세포에 대한 지지체를 제공하도록 설계된다. 이식 후, 거대-다공성 구조의 구성은 혈관형성 및 조직 내부성장에 대한 정도를 조절할 수 있다. 기공 크기 및 부피는 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트의 냉동-건조 전 또는 후 포로젠(porogen) 첨가, 불활성 가스 적용, 또는 음정수압 적용에 의해 조절될 수 있다.
한 양태에서, 본 발명은 본원에서 기술된 방법에 의해 제조된 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트에 관한 것이다. 예를 들어, 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트는 약 0-50℃의 온도에서 분산된 하나 이상의 연조직(들)을 포함할 수 있다.
한 양태에서, 본 발명은 또한 본원에서 기술된 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트를 결함 부위에 이식하는 것을 포함하는, 조직 내 결함(들)을 수복시키는 방법에 관한 것이다. 결함이 있는 조직은 골 조직, 연골, 또는 연조직일 수 있다. 결함이 있는 연조직의 예는 힘줄, 인대, 진피, 피부, 성대, 신경, 방광, 질, 요도, 심장, 피하 조직, 근막, 유방, 근육, 태반막, 태반, 및 회전근개를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 결함이 있는 조직은 근골격계, 소화계, 심혈관계, 호흡계, 비뇨기계, 생식계, 신경계, 및/또는 면역계에 있을 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 이식 전에 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트의 재수화를 배제하여 상기 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트가 원위치에서 혈액, 체액 및/또는 자가 세포를 흡수하도록 한다. 대안적으로, 조직 수복 임플란트의 인간 또는 동물로의 이식은 조직 수복 임플란트를 재수화 용액으로 재수화시키고; 임의로 생체 세포를 조직 수복 임플란트 상에 시딩하여 조직 수복 임플란트에 생기를 부여하고; 임의로 이식 전에 세포-시딩된 조직 수복 임플란트를 배양하고; 조직 수복 임플란트를 결함부에 이식함으로써 수행될 수 있다. 또 다른 양태에서, 상기 방법은 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트를 재수화 용액으로 재수화시키고; 임의로 상기 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트 상에 생체 세포를 시딩하여 상기 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트에 생기를 부여하고; 임의로 이식 전에 상기 세포-시딩된 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트를 배양하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 재수화 용액은 혈액 또는 골수 흡인액, 혈소판 풍부 혈장, 뇌척수액, 활액, 효소, 생활성 보충물, 천연 폴리머, 합성 폴리머, 광활성제, 항산화제, 가교제, 항미생물제, 생체 세포, 및 생활성 보충물 결합 부위(들)를 갖는 하나 이상의 작용제로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다. 추가의 구체예에서, 생체 세포는 자가이식 또는 동종이식 골수 흡인물; 골수로부터의 간질 세포 및/또는 줄기 세포; 지방, 지방흡입물, 윤활막, 골막, 연골막, 근육, 진피, 제대혈, 태반, 태반막, 및 바르톤 젤리(Wharton's jelly)로부터의 간질 세포 및/또는 줄기 세포; 및 혈관주위세포로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다.
한 양태에서, 본 발명은 또한 본원에서 기술된 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트 상에 세포를 배양하는 것을 포함하는 세포 배양 방법에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 세포 배양은 일반적으로 시험관내 환경으로 지칭되는 인공 환경에서 세포 유지를 나타낸다. 용어 세포 배양은 일반적인 용어이며, 개별 세포뿐만 아니라 조직, 기관, 기관계 또는 전체 유기체의 배양을 포함하도록 사용될 수 있다. 본원에 기술된 배양 방법에 사용되는 세포는 임의의 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 본원에서 기술되는 배양 방법에 사용되는 세포 유형은 세포 지지체 조성물이 유래하는 동일한 종으로부터 유래될 필요는 없다. 또한, 세포는 확립된 세포주로부터 유래 될 수 있거나, 일차 세포 또는 유전자 조작된 세포일 수 있다.
예를 들어, 본 발명은 본원에서 기술되는 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트 상의 세포 성장 및/또는 배양을 제공한다. "생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트 상의 세포 성장 및/또는 배양"은 천연 또는 합성 생체적합성 기질 또는 조직과 같은 임의 환경에서 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트의 표면 상에 배치하는 것뿐만 아니라 통상적인 배양 방법을 포함한다. 세포는 포유동물, 예컨대 사람, 소, 돼지, 쥐, 양, 말, 개, 고양이 및 기타일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 일부 구체예에서, 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트 상에 배양되는 세포는 줄기 세포이다. 본원에서 사용되는 용어 "줄기 세포"는 당업게에서 사용되는 바와 같이 사용되고, 자가-재생 능력을 갖고, 적어도 하나의 특수화된 세포 유형을 형성할 수 있는 세포를 나타낸다(예를 들어, [Donovan, P. J., Gearhart, J., Nature 414: 92-97 (2001)] 참조). 예를 들어, 줄기 세포는 분열하여 적어도 부분적으로 분화될 수 있는 하나의 딸 세포 및 모세포의 발달 가능성을 보유한 또 다른 딸 세포를 발생시킬 수 있다. 본원에서 사용되는 줄기 세포는 지방 유래 줄기 세포, 치과용 줄기 세포, 성체 줄기 세포(ASC), 배아 줄기 세포(ESC), 계통결정된 전구 세포(committed progenitor cell) 및/또는 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 일 수 있다. 추가의 구체예에서, 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트는 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트 상에서 배양된 줄기 세포의 골형성, 연골형성 또는 인대/힘줄 기원을 증가시키기 위해서뿐만 아니라 세포 성장 및 증식을 지지하기 위한 시험관내 방법에서 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 세포는 지방 유래 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 전구 세포, 분화된 세포, 비분화 세포 및/또는 유도-만능 줄기 세포와 같은 중간엽 줄기 세포일 수 있다. 적합한 세포는 또한 외배엽 계통의 세포, 중배엽 계통의 세포 및 내배엽 계통의 세포를 포함할 수 있지만, 이로 제한되는 것은 아니다. 외배엽 계통의 세포의 예는 각질형성세포, 뉴런을 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다. 중배엽 계통의 세포의 예는 근육 아세포, 지방 세포, 전지방 세포, 섬유모세포, 내피 세포, 골모세포, 연골 세포 또는 간질 세포를 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다. 내배엽 계통의 세포의 예는 청각관, 호흡기, 예컨대 기관(trachea), 기관지, 및 폐의 폐포, 위장관, 요로 방광의 상피 세포 및 모든 땀샘 내막의 상피 세포를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 또한, 세포는 조직 또는 기관으로부터 유래된 일차 세포일 수 있다. 본 발명에 사용되는 적합한 세포주는 간질 세포주, 전골모세포 세포주(preosteoblastic cell line), 조골 세포주(osteoblastic cell line) 및 연골 세포주를 포함하지만 이로 제한되는 것은 아니다.
일부 구체예에서, 세포는 자가 또는 동종 기원으로부터 유래될 수 있다. 세포는 연골 세포, 지방 세포, 골모세포, 파골 세포, 내피 세포, 상피 세포, 섬유모세포 및 골막 세포를 포함하는 분화된 세포일 수 있다. 추가로, 세포는 전능성, 만능, 다능성, 선구체 또는 성체 체세포 줄기 세포일 수 있다. 줄기 세포는 태아, 태반, 골수, 지방 조직, 혈관, 양수, 활액, 활막, 심장 막, 골막, 경질, 말초 혈액, 제대혈, 태반막, 월경혈, 아기 치아, 수핵(nucleus pulposus), 뇌, 신생아 포피, 피부, 모낭, 장내 담낭, 신경 조직, 근육으로부터 유래될 수 있다. 세포는 골격근, 평활근, 및 심근으로부터 유래될 수 있다. 줄기 세포는 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC)와 같은 성숙한 세포의 유전자 재프로그래밍(genetic reprogramming)으로부터 유도될 수 있다. 모든 세포는 추가로 살아 있거나 최근에 사망한 기증자로부터 추가로 유래될 수 있다.
본원에서 기술된 임의의 세포는 특정 구체예에서 약 15분 내지 약 4주, 약 2시간 내지 약 2주, 약 2시간 내지 약 1주, 약 2시간 내지 약 72시간, 약 24시간 내지 약 72시간, 또는 약 24시간 내지 약 96시간 동안, 약 20℃ 내지 약 40℃ 또는 약 30℃ 내지 약 37℃에서, 약 1% CO2 내지 약 10% CO2 또는 약 4% CO2 내지 약 6% CO2를 함유하는 분위기하에 본원에서 기술된 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트 상에서 배양될 수 있다. 본 발명의 일부 구체예에서, 세포는 본원에서 기술된 하나 이상의 성장 인자 및 (1) 조직 또는 기관, (2) 기질, 또는 (3) 이들의 조합의 존재하에 배양될 수 있다. 세포 배양 배지에서 본원에서 기술된 하나 이상의 성장 인자의 존재하에 배양된 세포는 이후 특정 구체예에서, 기질, 조직, 기관 또는 이들의 조합에 적용될 수 있다.
본 발명은 또한 골유도성(osteoinductivity)을 촉진시키는 방법으로서, 본원에 기술된 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트 상에 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 "골유도성"은 세포가 표현형에서 더욱 골모세포와 유사한 세포로 분화되도록 하는 것을 나타내거나, 이 용어는 골모세포의 증식을 증대시키는 것을 나타내거나, 둘 모두를 나타낼 수 있다. 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트 상에 배양하기 전에 세포는, 비분화되거나 부분적으로 분화된 세포일 수 있다. 세포는 배양물에 또는 조직, 기관 또는 이의 일부에, 또는 유기체에 존재할 수 있다. 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트의 골유도 활성은 변경되거나 변경되지 않을 수 있으며, 이러한 변경은 대조군에 비해 향상된 활성을 포함하나, 이로 제한되지 않는다.
본 발명은 또한 연골유도성(chondroinductivity)을 촉진하는 방법으로서, 본원에서 기술된 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트 상에 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 "연골유도성"은 세포가 표현형에서 더욱 연골 세포와 유사한 세포로 분화되도록 하는 것을 나타내거나, 이 용어는 연골 세포의 증식을 증대시키는 것을 나타내거나, 둘 모두를 나타낼 수 있다. 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트 상에 배양하기 전에 세포는, 비분화되거나 부분적으로 분화된 세포일 수 있다. 세포는 배양물에 또는 조직, 기관 또는 이의 일부에, 또는 유기체에 존재할 수 있다. 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트의 연골유도 활성은 변경되거나 변경되지 않을 수 있으며, 이러한 변경은 대조군에 비해 향상된 활성을 포함하나, 이로 제한되지 않는다.
본 발명은 또한 지방생성/지방유도성(adipogenesis/adipoinductivity)을 촉진시키는 방법으로서, 본원에서 기술된 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트 상에 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 "지방유도성"은 세포가 표현형에서 더욱 지방 세포와 유사한 세포로 분화되도록 하는 것을 나타내거나, 이 용어는 지방 세포의 증식을 증대시키는 것을 나타내거나, 둘 모두를 나타낼 수 있다. 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트 상에 배양하기 전에 세포는, 비분화되거나 부분적으로 분화된 세포일 수 있다. 세포는 배양물에 또는 조직, 기관 또는 이의 일부에, 또는 유기체에 존재할 수 있다. 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트의 지방유도 및 지방전도(adipoconductive) 활성은 변경되거나 변경되지 않을 수 있으며, 이러한 변경은 대조군에 비해 향상된 활성을 포함하나, 이로 제한되지 않는다.
본 발명은 또한 인대/힘줄 분화를 촉진시키는 방법으로서, 본원에서 기술된 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트 상에 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 "인대/힘줄 분화"는 세포가 표현형에서 더욱 인대 및/또는 힘줄과 유사한 세포로 분화되도록 하는 것을 나타내거나, 이 용어는 인대 및/또는 힘줄의 증식을 증대시키는 것을 나타내거나 둘 모두를 나타낼 수 있다. 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트 상에 배양하기 전에 세포는, 비분화되거나 부분적으로 분화된 세포일 수 있다. 세포는 배양물에 또는 조직, 기관 또는 이의 일부에, 또는 유기체에 존재할 수 있다. 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트의 인대/힘줄 분화 활성은 변경되거나 변경되지 않을 수 있으며, 이러한 변경은 대조군 표면에 비해 증가된 활성을 포함하나, 이로 제한되지 않는다.
골유도성, 연골유도성, 지방유도성, 또는 인대/힘줄 분화를 각각 평가하기 위해 측정될 수 있는 다양한 골모세포, 연골세포, 지방세포, 인대/힘줄 분화 마커가 존재한다. 예를 들어, 세포는 골모세포 계통 쪽으로의 분화의 초기 단계 동안 알칼리 포스파타제를 발현시킨다. 이에 따라, 시험관내 알칼리 포스파타제 검정은 본원에 기술된 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트 상에서 배양된 세포에서의 골유도성를 평가하는데 사용될 수 있다. 그 밖의 비-골 형성 세포, 예를 들어, 근아세포(C2C12 세포)에서 알칼리 포스파타제 발현을 자극시키거나 유도하는 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트의 능력은 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트가 골유도 활성을 가짐을 나타낼 것이다. 이러한 검정에서, 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트 상에서 그리고 대조군 표면 상에 배양된 세포는 비-골 형성 세포 상의 기준선 알칼리 포스파타제 발현을 보여주기 위한 음성 대조군으로서 사용된다. 음성 대조군에서 골모세포성 마커의 기준선은 0(zero)일 필요는 없는데, 이는 음성 대조군에서의 세포가 적어도 어느 수준의 표현형 마커(들)를 가질 수 있음을 의미한다. 따라서, 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트의 "골유도성" 표면은 간단하게, 실험 세포에서 골모세포 마커의 증가를 야기시킬 것이다. 유사하게, 몇 가지만 예를 들면, 타입 X 콜라겐, 타입 II 콜라겐, Sox 9, 아그레칸(Aggrecan), 마트릴린(Matrilin)-1 및 CEP-68을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 연골세포 마커는 연골유도 가능성을 평가하는데 사용될 수 있다. 지방형성 마커는 아디포넥틴, 페릴리핀, 렙틴, FATP(1, 2, 4, 5, 6), 및 퍼옥시좀 증식 인자-활성화된 수용체 감마(PPAR 감마)를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 또한, 스클레락시스(scleraxis)를 포함하지만 이로 제한되지 않는 인대/힘줄 마커는 인대/힘줄 분화 가능성을 평가하는데 사용될 수 있다.
또한, 골유도성, 연골유도성, 지방유도성/지방전도성, 및 인대/힘줄 분화는 일차 세포, 세포주, 또는 외식편과 같은 배양된 세포에서, 골모세포 표현형, 연골세포 표현형, 지방세포 표현형, 인대/힘줄 세포 표현형을 분화시키거나 유발시키는 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트의 능력을 조사함으로써 조직 배양물에서 결정될 수 있다. 예를 들어, 세포는 알칼리 포스파타제, 등과 같은, 골모세포에 대해 특징적인 마커의 증가된 생성을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트의 골유도, 연골유도, 지방유도, 인대/힘줄 분화 가능성은 대조군보다 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10배 넘게 더 클 수 있다. 또 다른 예에서, 본원에 기술된 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트의 골유도, 연골유도, 지방유도/지방전도성, 인대/힘줄 분화 가능성은 대조군 스캐폴드의 가능성보다 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 500 또는 심지어 1000배 넘게 더 클 수 있다.
근육과 같은 위치에서 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트에 의해 유도된 골, 연골, 지방 조직, 인대 또는 힘줄 형성 가능성을 평가하기 위한, 골유도성, 연골유도성, 지방유도성/지방전도성, 인대/힘줄 분화는 또한, 적합한 동물 모델을 이용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 설치류에 근육내 이식은 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트의 골유도 활성을 평가하기 위한 모델로서 사용되었다.
본 발명은 또한, 본원에 기술된 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트 상에서 세포를 배양시키는 것을 포함하는, 혈관형성, 지혈, 생체적합성, 감염 내성, 세포 부착, 증식을 촉진하거나, 분화된 상태를 유지시키거나 본원에 기술된 골모세포, 연골세포, 인대 세포, 힘줄 세포, 섬유모세포, 지방세포, 및/또는 임의 세포 타입의 탈-분화를 방지하는 방법에 관한 것이다. 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트의 증식 활성은 변경되거나 변경되지 않을 수 있으며, 이러한 변경은 대조군 표면에 비해 향상된 활성을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 본 발명은 추가로 지방세포, 섬유모세포, 상피세포 및/또는 혈관 내피세포의 지방 조직 형성을 촉진하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 혈관형성, 지혈 기능, 생체적합성 및/또는 감염 내성을 증가시키거나 촉진하는 방법에 관한 것이다.
미토겐성(mitogenicity)은 MTT [3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드] 검정, alamarBlue® 검정, 등과 같은 대사 활성을 측정하는 다양한 시험관내 검정을 이용하여 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트에 의해 유도된 세포 증식을 조사함으로써 평가될 수 있다. alamarBlue® 검정은 세포 대사 활성을 측정하기 위한 비-세포독성 환원-산화 지시제를 사용하며, 이는 본원에 기술된 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트의 미토겐 활성을 평가하기 위한 비파괴적 검정을 만든다. 증식은 또한, DNA 정량화를 측정함으로써, 예를 들어, PicoGreen™ DNA 검정, DNA 합성의 방사성 라벨링, 예를 들어, [3H]티미딘 라벨링 또는 BrdU 도입을 이용함으로써 평가될 수 있다. 증식은 또한, 수동 세포 계수를 통해, 예컨대, 트리판 블루로 세포를 염색하고, 혈구계로 계수함으로써 평가될 수 있다.
본 발명은 또한, 본원에 기술된 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트에서 세포의 골 형성, 연골 형성, 인대/힘줄 형성, 또는 지방형성을 증가시키거나 촉진시키는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 본원에 기술된 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트 상에서 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 "골 형성"은 막내 골 형성 및 연골내 골 형성을 포함하지만, 이로 제한되지 않는, 새로운 골 물질의 침적 또는 새로운 골의 형성이다. 본원에서 사용되는 "연골 형성"은 새로운 연골 물질의 침적 또는 새로운 연골의 형성이다. 본원에서 사용되는 "인대/힘줄 형성"은 새로운 인대 및/또는 힘줄 물질의 침적 또는 새로운 인대 및/또는 힘줄의 형성이다. 본원에서 사용되는 "지방형성"은 새로운 지방 조직의 침적 또는 새로운 지방 조직의 형성이다. 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트의 골형성, 연골형성, 지방형성, 인대, 또는 힘줄 유도 활성이 변경되거나 변경되지 않을 수 있으며, 이러한 변경은 대조군 표면에 비해 향상된 활성을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 세포는 골, 연골, 지방, 인대, 또는 힘줄 형성이 요망되는 임의 조직, 예를 들어, 비제한적으로, 골, 연골, 피하, 유방, 인대, 근육, 힘줄, 등에서의 세포를 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트는 연조직 결함, 골 결함, 또는 척수 손상을 치료하거나 수복하기 위해, 다른 스캐폴드 또는 디바이스, 예를 들어, 수술 봉합선, 탈세포화된 또는 비-탈세포화된 조직, 합성 폴리머 또는 금속 케이지와 함께 제공될 수 있다. 연조직 결함의 예는 종괴절제 또는 유방절제로 인한 유방 조직 손실, 회전 근개 파열 및 손상, 및 인대 파열 및 손상을 포함한다. 일 예로서, 본 발명의 임플란트는 종괴절제 또는 유방절제로 인한 유방 조직 손실을 수복하거나, 대체하거나, 치료하기 위해 탈세포화/탈활력화된 진피와 조합될 수 있다.
본 발명은 또한, 조직 또는 장기 결함(예를 들어, 골 결손, 연골, 인대, 힘줄, 추간판, 치조와, 유방, 진피, 및 골에 대한 힘줄 삽입 부위에서의 결함)에 본원에 기술된 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트 상에서 시딩되고/거나 배양된 세포를 투여하는 것을 포함하는, 동물 또는 인간에서, 조직 또는 장기 결함 또는 손상, 예를 들어, 근골격, 치아 또는 연조직 결함 또는 손상을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 본원에 기술된 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트를 결함에 적용함으로써, 동물에서, 조직 또는 장기 결함 또는 손상, 예를 들어, 근골격, 종괴절제 또는 유방절제 후 유방, 치아, 입술, 악안면, 또는 연조직 결함을 치료하는 방법에 관한 것이며, 결함에 대한 적용은 결함에 생물학적 기능성 스캐폴드를 주입하거나, 조직 또는 장기 사이에 생물학적 기능성 스캐폴드를 삽입하거나, 조직 또는 장기 둘레를 생물학적 기능성 스캐폴드로 감싸거나, 결함의 상부 상에 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트를 배치시킴으로써 달성될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 세포는 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트 상에 시딩될 수 있다. 생물학적 기능성 스캐폴드 상에 시딩된 세포는 본원에 기술되거나 당해 분야에서 달리 공지된, 임의 세포, 예를 들어, 비제한적으로, 골모세포, 연골세포, 인대 세포, 힘줄 세포, 전지방세포, 전구 세포, 및 줄기 세포일 수 있다. 시딩된 세포는 증식되어지고 가능하게는, 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트에 부착될 수 있다.
또 다른 추가의 구체예에서, 본 발명은 또한, 담체로서 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트를 사용하는 약물 전달에 관한 것이다. 예를 들어, 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트는 본원에 기술된 생활성 보충물을 캡슐화하고, 고려되는 부위에 이러한 생활성 보충물을 전달할 수 있다.
본 발명의 임의 방법은 실제 임의 셋팅, 예를 들어, 생체내, 생체외, 원위 또는 시험관내 환경으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 세포에서 골 형성, 연골 형성, 또는 힘줄/인대 유도 활성을 증진시키는 방법은 세포 배양에서 수행될 수 있거나, 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트 상에서의 시딩된 세포에서 수행될 수 있거나, 온전한 유기체에서 수행될 수 있다. 또한, 본원에 기술된 임의 구체예들 중 임의 둘 이상의 임의 조합이 고려된다.
본 발명이 다양한 특정 물질, 절차 및 실시예를 참조로 하여 본원에서 기술되고 예시되어 있지만, 본 발명이 그러한 목적을 위해 선택된 물질 및 절차의 특정 조합으로 제한되지 않는 것으로 이해된다. 이러한 세부사항들의 여러 변형들은 당업자에 의해 인식되는 것으로서 시사될 수 있다. 본 명세서 및 실시예가 단지 예시적인 것으로서 고려되는 것으로 의도되며, 본 발명의 진정한 범위 및 사상은 하기 청구범위에 의해 지시된다. 본 출원에서 언급되는 모든 참고문헌, 특허 및 특허출원은 이들의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
하기 실시예는 예시적인 것으로서, 본원에 기술된 본 발명의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1: 조직 수복 임플란트의 제조
인간 시체(human cadaver)로부터의 피부를 취득하고, 멸균 조건하에서 가공 설비로 되돌려 보내었다. 공여자의 인적 및 의학적 히스토리를 미국조직은행협회(American Association of Tissue Banks)의 허용된 표준에 따라 수득하였다. 미생물학적 시험을 제품의 멸균력을 시험하기 위한 FDA 가이드라인에 따라 수행하였다.
피부 조각의 모발, 원치않는 지방조직 및 상피층을 세척하였다. 얻어진 진피를 N-라우릴 사르스시네이트 및 DNAase를 함유한 세정제로 처리하고, 이후에, 염수로 헹구었다. 얻어진 깨끗하고 탈세포화/탈활력화된 진피를 하기 실험을 위해 사용하였다.
진피를 작은(약 1.0 cm × 1.0 cm) 조각(예를 들어, 미정제 단편)으로 절단하였다. 약 24 그램의 진피 및 3개의 얼음 큐브를 Sunbeam-Oster, Inc.로부터의 Osterizer를 이용하여 2분 동안 함께 기계적으로 분산시키고(예를 들어, 블렌딩하고), 얼음 큐브를 3조각 더 혼합물에 첨가하고, 또 다른 1분 동안 분산시켰다. (본 출원의 실시예 섹션에서 얼음 큐브(또는 얼음 조각)가 언급될 때, 달리 명시하지 않는 한, 각 얼음 큐브 또는 얼음 조각이 10 mL의 멸균 초순수로 제조된다는 것으로 이해되어야 한다). 이후에, 가공된 연조직을 멸균 체 상으로 옮겼다. 분산되지 않은 조직을 골라내어, 두 개의 얼음 큐브와 혼합하고, 또 다른 2분 동안 분산시켰다. 이후에, 분산된 연조직을 멸균 체로 다시 옮겼다. 분산된 연조직 층을 주형(예를 들어, 페트리 접시 또는 시험관)으로 옮기고, 칭량하였다. 분산된 연조직을 함유한 주형을 최소 4시간 동안 -20℃ 또는 -80℃ 냉동기에서 저장하고, 이후에, 48 내지 96시간 동안 냉동 건조시켰다. 이 후, 얻어진 다공성 연조직 구조를 멸균화를 위해 감마 방사선으로 조사하였다.
실시예 2: 얼음 또는 물을 이용한 조직 수복 임플란트의 제조
방법 1: 깨끗한 진피를 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조하고, 작은(약 1.0 cm × 1.0 cm) 조각들로 절단하였다. 약 12 그램의 진피 및 2개의 얼음 큐브를 2분 동안 함께 기계적으로 분산시키고(Sunbeam-Oster, Inc.로부터의 Osterizer), 얼음 큐브를 2개 더 혼합물에 첨가하고, 2분 동안 분산시켰다. 이후에, 분산된 연조직을 멸균 체 상으로 옮겼다. 분산되지 않은 조직을 골라내어, 2개의 얼음 큐브와 혼합하고, 또 다른 2분 동안 분산시켰다. 이후에, 분산된 연조직을 동일한 체 상으로 옮겼다. 분산된 연조직 층을 주형으로 옮기고, 칭량하였다.
방법 2: 또 다른 12 그램의 진피(약 1.0 cm × 1.0 cm) 조각 및 20 mL의 주변 온도 멸균 초순수를 2분 동안 함께 기계적으로 분산시키고(Sunbeam-Oster, Inc.로부터의 Osterizer), 20 mL의 주변 온도 멸균 초순수를 혼합물에 첨가하고, 2분 더 분산시켰다. 이후에, 분산된 연조직을 멸균 체 상으로 옮겼다. 분산되지 않은 조직을 골라내어, 20 mL의 주변 멸균 초순수와 혼합하고, 또 다른 2분 동안 분산시켰다. 이후에, 분산된 연조직을 멸균 체 상으로 옮겼다. 분산된 연조직 층을 주형으로 옮기고, 칭량하였다.
분산된 연조직(방법 1 또는 방법 2)을 함유하는 주형을 최소 4시간 동안 -20℃ 또는 -80℃ 냉동기에 저장하고, 이후에 48 내지 96시간 동안 냉동 건조시켰다.
실시예 3: 다공성 연조직 구조의 특징 분석
스폰지형 구조를 갖는 조직 수복 임플란트를 실시예 1, 및 실시예 2에 기술되고 도 1 및 도 2에 도시된 가공 단계에 따라 제조하였다.
다공성 스폰지형 구조의 다공성 및 섬유 분포: 스폰지형 연조직 구조를 갖는 다양한 프로토타입의 조직 수복 임플란트를 분석하였다. 다공성 스폰지형 연조직 구조의 대표적인 SEM 사진은 도 3 내지 도 6에 도시되어 있다. 도 3 및 도 4는 실시예 2의 방법 1을 이용하여 제조된 스폰지형 구조를 도시한 것이며, 도 5 및 도 6은 실시예 2의 방법 2를 이용하여 제조된 구조를 도시한 것이다. 직경이 10 μm 내지 500 μm 범위인 기공 크기를 갖는 다공성 스폰지형 임플란트 형태 웹 구조의 프레임워크가 발견되었다. 이러한 구조에서 섬유는 0.1 μm 내지 500 μm 범위의 직경을 갖는다.
수화 실험: 대표적인 샘플을 스폰지형 연조직 구조로부터 절단하였으며, 형상 및 크기 변화를 모니터하기 위해 일부 샘플을 수일 내지 수주 동안 멸균 초순수 또는 염수에 침지시키고, 침지 2주 후, 이러한 연조직 구조에 대해 어떠한 형상 변화도 발견되지 않았다(도 7, 항목 A). 일부 샘플을 용액 흡수 평가에 사용하였다. 각 샘플의 건조 중량 및 크기를 결정하였다. 이후에, 샘플을 칭량 보트 상에 배치시키고, 각 샘플에서 시각적으로 포화될 때까지 염료가 증분되어 첨가된 염수 용액을 첨가하였다(도 8, 항목 A). 수화된 샘플을 분석 저울 상의 칭량지(weighing paper) 상으로 옮기고, 각 샘플에 대한 습윤 중량을 결정하였다. 포화된 습윤 중량으로부터 구조 건조 중량을 감하여 총 용액 흡수 중량을 계산하였다. 용액 흡수는 구조 건조 중량의 약 3 내지 10배이었다. 6개의 샘플을 염료가 첨가된 염수 용액으로 수화시키고, 이후에, 3개의 샘플을 압착시켜 액체를 제거하였다(도 21A). 염료가 첨가된 새로운 염수 용액을 압착된 샘플에 다시 주입하였다. 3개의 스폰지형 연조직 구조는 재수화 후 이의 본래 형상으로 되돌아갈 수 있었다(도 21B).
조작 및 형상화: 수화된 스폰지형 연조직 구조를 손 또는 피펫 팁으로 다양한 형상으로 성형하였다(도 7, 항목 B 및 C, 및 도 8, 항목 B).
실시예 4: 시험관내 생체적합성
인간 진피 섬유모세포 Hs27 세포(ATCC CRL-1634)를 1 x 106 세포/cm2의 밀도로 스폰지형 연조직 구조의 표면 상에 직접적으로 시딩하고, 배양 플레이트로의 세포 부착을 방지하기 위해 1.2% 폴리(2-하이드록시에틸 메타크릴레이트로 사전-코팅된 24-웰 플레이트에서 배양하였다. 1.2% 폴리(2-하이드록시에틸 메타크릴레이트)로 사전-코팅된 조직 배양 플레이트 상에 시딩된 세포를 대조군으로 사용하였다. 스폰지형 연조직 구조 그룹 및 대조군에 대해 동일한 시딩 밀도를 유지시켰다. 알라마블루(AlamarBlue) 시약(10%)을 배양 배지에 배양 1일, 3일, 6일, 및 9일째에 첨가하고, 5시간 동안 인큐베이션하였다. AlamarBlue 시약을 갖는 배양 배지의 형광 세기를 측정하였다. 형광 세기는 세포의 생존력/대사와 상응하는 것으로서, 즉, 세기가 클수록, 세포의 생존/대사 활성이 더 높다. 도 9에 도시된 바와 같이, 스폰지형 연조직 구조 그룹에서의 세포 수가 9일의 배양에 걸쳐 꾸준히 증가하는 바, 스폰지형 연조직 구조는 세포 생존력을 유지시킬 뿐만 아니라, 세포 성장을 지지한다. 대조군 세포는 1일째에 약 65% 생존력 감소, 및 3일째에 90% 생존력 감소를 나타내었는데, 이는 이러한 세포 타입이 흡착-의존(anchorage-dependent)적이고, 세포 부착 및 확장을 위해 특별히 처리되는 적합한 기판 상에서 배양되어야 함을 시사하는 것이다. 또한, 스폰지형 연조직 구조는 배양 동안 이의 온전성을 유지시켰다. 9일의 배양 후에 대표적인 스폰지형 연조직 구조 중 하나의 H&E 염색은 도 10에 도시되어 있다. 스폰지형 연조직 구조는 세포 부착, 확장, 및 증식을 위한 적합한 기판을 제공하였다.
실시예 5: 스폰지형 연조직 구조의 피하 이식
스폰지형 연조직 구조를 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조하였다. 두 개의 상이한 두께(2 mm 및 4 mm)의 연조직 구조를 제조하였다. 냉동 건조된 구조로부터 8 mm 생검 펀치를 취득함으로써 임플란트 샘플을 생성시켰다. 각 펀치를 캘리퍼스로 측정하고 칭량하여 밀도 및 두께를 확인하였다. 모든 연조직 구조 샘플을 드라이 아이스 상의 12.8 내지 19.8 kGy 흡수 선량의 감마 방사선 조사에 의해 최종적으로 멸균하였다.
약 6주령의 수컷 무흉선 마우스(Nu/Nu Foxn1nu)를 본 연구를 위해 사용하였다. 동물을 가장 가까운 0.1 g까지 칭량하고, 이소플루란(달성하기 위해 O2 중 1 내지 5%)에 의해 마취를 유도하고, 수술을 위해 O2 중 2 내지 3%에서 유지시켰다. 각 동물에 피하 주사를 통해 0.5 내지 1.0 mg/kg으로 수술전후 진통제 Buprenorphine SR®을 투여하고, 안연고제를 안구 위에 두었다. 등 부위를 베타딘 및 알코올로 2회 닦아내었다. 등 중간선의 각각 측면 상에 하나씩 약 1 cm 절개를 생성시켰다. 무딘 박리(blunt dissection)를 이용하여 이러한 절개부로부터 약 0.15 cc의 두 개의 피하 포켓을 형성시켰다. 연조직 구조의 임플란트 샘플을 이식 전 최소 5분 동안 등장성 염수(50 μL)로 재수화시켰다. 임플란트를 피하 포켓에 삽입하였다. 각 동물은 총 2개의 임플란트를 수용하였다. 절개부를 비연속성 4-0 프롤렌 봉합선으로 봉합하고, 스테플로 고정시켰다. 각 동물을 깨끗한 우리에 개별적으로 넣고 동물이 경계하며 움직일 때까지 모니터하였다.
이식 4주 후, 동물을 CO2 흡입에 의해 안락사시키고, 이의 체중을 기록하였다. 임플란트로부터 약 5 mm 떨어진 피부와 피하 조직을 절단함으로써 임플란트 부위를 조심스럽게 노출시켰다. 이식된 샘플 및 3 내지 5 mm의 주변 조직을 잘라내고, 최소 4일 동안 10% 중성 완충된 포르말린(NBF) 중에서 고정시켜 완전한 고정화를 달성하였다.
각 외식편 샘플을 이의 가장 긴 중간선을 따라 절단하여 두 개의 반쪽을 생성시켰다. 얻어진 시편을 동일한 파라핀 블록 내에 함께 (절단부가 아래를 향함) 포매시키고, 조직학적 절편을 준비하였다. 각 그룹으로부터 두 개의 절편을 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하였다. 임플란트 물질의 가장 큰 단면을 갖는 절편을 등급화(grading)에 사용하였다. 조직 절편을 임플란트의 섬유모세포 침윤, 혈관신생의 정도, 염증 세포 반응(대식 세포/거대 세포, 호중구), 및 섬유 조직/캡슐화에 대해 반정량적으로 평가하였다.
얇은 연조직(2 mm) 및 두꺼운 연조직(4 mm) 구조 둘 모두는 충분한 깊이의 숙주 세포 침윤을 나타내었다(도 11 내지 도 13). 모든 이식된 연조직 구조에서 새로운 혈관이 발견되었다. 연조직 구조에서 염증이 나타나지 않거나 단지 약한 호중구 침윤이 나타났다. 모든 연조직 구조 임플란트에서 캡슐화가 나타나지 않았다.
실시예 6: 마우스 개방 상처에서 스폰지형 연조직 구조의 이식
임플란트 샘플 및 수컷 무흉선 마우스를 실시예 5와 같이 제조하였다.
등 중간선의 각각의 측면 상에 하나씩 약 1 cm 절개를 생성시켰다. 무딘 박리를 이용하여 상기 절개로부터 약 0.15 cc의 두 개의 피하 포켓을 형성시켰다. 연조직 구조의 임플란트 샘플을 이식 전에 최소 5분 동안 등장성 염수(50 μL)로 재수화시켰다. 임플란트를 피하 포켓에 삽입하였고, 임플란트 샘플의 일부를 공기에 노출시켰다. 각각의 동물을 깨끗한 우리에 개별적으로 넣고, 동물이 경계하고 움직일 때까지 모니터하였다.
이식 4주 후, 동물을 안락사시키고, 조직학 슬라이드를 실시예 5와 같이 제조하였다. 조직 절편을 임플란트의 섬유모세포 침윤, 혈관신생의 정도, 노출된 스폰지 상의 재상피화의 정도, 염증 세포 반응(대식세포/거대 세포, 호중구), 및 섬유 조직/캡슐화에 대해 반정량적으로 평가하였다.
얇은 연조직(2 mm) 및 두꺼운 연조직(4 mm) 구조 둘 모두는 충분한 깊이의 숙주 세포 침윤을 나타내었다. 새로운 혈관이 모든 이식된 연조직 구조에서 발견되었다. 노출된 연조직 구조는 마우스 피부 각질세포로 재상피화되었다(도 14). 드레싱이 없는 개방 상처로 인해 경증에서 중등증의 호중구 침윤이 연조직 구조에서 발견되었다. 모든 연조직 구조 임플란트에서 캡슐화가 나타나지 않았다.
실시예 7: 태반막을 이용한 조직 수복 임플란트의 제조
인간 태반을 공여자의 동의를 얻고 제왕절개술로부터 획득하고, 젖은 얼음 위에 두었다. 태반막을 세정하고, 작은(약 20 cm × 2.0 cm) 조각(예를 들어, 미정제 단편)으로 절단하였다. 약 12그램의 태반막 및 3개의 얼음 큐브 조각을 2분 동안 함께 기계적으로 분산(예를 들어, 블렌딩)(Sunbeam-Oster, Inc.로부터의 Osterizer)시키고, 얼음 큐브를 3조각 더 혼합물에 첨가하고, 또 다른 1분 동안 분산시켰다. 이후, 분산된 연조직을 멸균 체 상으로 옮겼다. 섬유성 연조직의 층을 주형(예를 들어, 페트리 접시 또는 시험관)으로 옮기고, 칭량하였다. 분산되지 않은 조직을 2개의 얼음 큐브와 혼합하고, 또 다른 2분 동안 분산시켰다. 이후, 분산된 연조직을 멸균 체 상으로 옮겼다. 분산된 연조직의 층을 주형으로 옮기고, 칭량하였다. 대부분의 연조직이 분산될 때까지 상기 과정을 반복하였다. 분산된 섬유성 조직을 함유하는 주형을 최소 4시간 동안 -20℃ 또는 -80℃의 냉동고에 보관한 후, 48-96시간 동안 냉동 건조시켰다.
실시예 8: 인간 진피 및 DBM을 이용한 조직 수복 임플란트의 제조
세정된 진피를 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하고, 작은(약 1.0 cm × 1.0 cm) 조각으로 절단하였다. 약 12그램의 진피 및 2조각의 얼음 큐브를 2분 동안 함께 기계적으로 분산(Sunbeam-Oster, Inc.로부터의 Osterizer)시키고, 얼음 큐브를 2조각 더 혼합물에 첨가하고, 2분 동안 분산시켰다. 이후, 분산된 연조직을 주형(예를 들어, 페트리 접시 또는 시험관)으로 옮기고, 칭량하였다. 탈광물화된 골 기질 입자를 분산된 연조직에 첨가하고, 잘 혼합하였다. 연조직 대 DBM 중량의 3개의 상이한 비를 이용하였다.
분산된 섬유성 조직 및 DBM 혼합물을 함유하는 주형을 최소 4시간 동안 -20℃ 또는 -80℃의 냉동고에 보관한 후, 48-96시간 동안 냉동 건조시켰다.
실시예 9: 다양한 종류의 연조직을 이용한 조직 수복 임플란트의 제조
분산된 연조직을 실시예 1과 같이 제조하고, 분산된 연조직의 또 다른 배치(batch)를 실시예 7과 같이 제조하였다. 둘 모두의 유형의 분산된 연조직을 다양한 비(4:1, 2:1, 1:1, 1:2, 및 1:4)로 주형(예를 들어, 페트리 접시 또는 시험관)으로 옮겼다. 배치된 연조직 혼합물을 함유하는 주형을 최소 4시간 동안 -20℃ 또는 -80℃의 냉동고에 보관한 후, 48-96시간 동안 냉동 건조시켰다. 이후, 생성된 다공성 연조직 구조를 멸균을 위해 감마 방사선 조사하였다.
실시예 10: 얼음, 실온수, 또는 냉수를 이용한 스폰지형 연조직 구조 수복 임플란트의 제조
방법 1: 세정되고, 탈세포화/탈활력화된 진피를 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하고, 작은(약 1.0 cm × 1.0 cm) 조각으로 절단하였다. 약 24그램의 진피 및 얼음 조각(3조각, 각각 10mL의 멸균 초순수로 제조됨)을 2분 동안 함께 기계적으로 분산(Sunbeam-Oster, Inc.로부터의 Osterizer)시켰다. 이후, 가공된 연조직을 멸균 체 상으로 옮겼다. 분산되지 않은 조직 조각을 골라내어, 3개의 얼음 큐브와 혼합하고, 또 다른 2분 동안 분산시켰다. 가공된 연조직을 다시 동일한 멸균 체 상으로 옮겼다. 분산되지 않은 조직 조각을 골라내어, 2개의 얼음 조각과 혼합하고, 또 다른 2분 동안 분산시켰다. 가공된 연조직을 동일한 체 상으로 옮겼다. 분산된 연조직의 층을 주형으로 옮기고, 칭량하였다. 이를 피부 스폰지(얼음)로 명명하였다.
방법 2: 또 다른 24그램의 진피(약 1.0 cm x 1.0 cm) 조각 및 30 mL의 실온 멸균 초순수를 2분 동안 함께 기계적으로 분산(Sunbeam-Oster, Inc.로부터의 Osterizer)시켰다. 이후, 분산된 연조직을 멸균 체 상으로 옮겼다. 분산되지 않은 조직을 골라내어, 30 mL의 실온 멸균 초순수와 혼합하고, 또 다른 2분 동안 분산시켰다. 가공된 연조직을 다시 동일한 멸균 체 상으로 옮겼다. 분산되지 않은 조직 조각을 골라내어, 20 mL의 실온 멸균 초순수와 혼합하고, 또 다른 2분 동안 분산시켰다. 이후, 분산된 연조직을 멸균 체 상으로 옮겼다. 분산된 연조직의 층을 주형으로 옮기고, 칭량하였다. 이를 피부 스폰지(RT H2O)로 명명하였다.
방법 3: 또 다른 24그램의 진피(약 1.0 cm x 1.0 cm) 조각 및 30 mL의 저온 멸균 초순수(4℃ 냉장고로부터의 저온 멸균 초순수)를 2분 동안 함께 기계적으로 분산(Sunbeam-Oster, Inc.로부터의 Osterizer)시켰다. 이후, 가공된 연조직을 멸균 체 상으로 옮겼다. 분산되지 않은 조직을 골라내어, 30 mL의 저온 멸균 초순수(4℃ 냉장고로부터의 저온 멸균 초순수)와 혼합하고, 또 다른 2분 동안 분산시켰다. 가공된 연조직을 다시 동일한 멸균 체 상으로 옮겼다. 분산되지 않은 조직 조각을 골라내어, 20 mL의 저온 멸균 초순수와 혼합하고, 또 다른 2분 동안 분산시켰다. 이후, 분산된 연조직을 멸균 체 상으로 옮겼다. 분산된 연조직의 층을 주형으로 옮기고, 칭량하였다. 이를 피부 스폰지(저온 H2O)로 명명하였다.
분산된 연조직(방법 1, 방법 2, 또는 방법 3)을 함유하는 주형을 분당 약 3-5℃의 제어된 냉동 속도로 48-96시간 동안 냉동 건조시켰다. 제조된 연조직 스폰지의 절반을 최종 멸균을 위해 드라이아이스 상에서 16-18 kGy의 감마 방사선 조사하였다.
실시예 11: 3개의 상이한 방법으로 제조된 피부 스폰지형 연조직 구조에 대한 수은 다공도측정법
실시예 1에 기재된 바와 같은 세정되고, 탈세포화/탈활력화된 진피, 실시예 10에 기재된 바와 같은 3개의 방법으로 제조된 피부 스폰지인 피부 스폰지(얼음), 피부 스폰지(저온 H2O), 및 피부 스폰지(RT H2O)로부터의 8 mm의 생검 펀치의 샘플을 수은 다공도측정법 분석을 이용한 다공도 측정에 사용하였다.
결과는 세정되고, 탈세포화/탈활력화된 진피의 기공의 80% 초과가 50 마이크론보다 작으며, 기공의 6% 미만이 50-200 마이크론인 것을 나타내었다(도 17). 피부 스폰지(얼음)의 기공의 70% 초과가 50-200 마이크론이고, 기공의 약 20%가 50 마이크론보다 작았다. 피부 스폰지(저온 H2O 및 RT H2O)의 기공의 약 30-40%가 50-200 마이크론이고, 기공의 약 48-60%가 50 마이크론보다 작았다.
실시예 12: 스폰지형 연조직 구조에서의 시험관내 인간 지방 유래 줄기 세포(hASC) 부착, 증식, 및 분화
6 mm 생검 펀치를 이용하여 실시예 11의 방법 1과 같이 제조된 피부 스폰지로부터 디스크를 제조하였다. 이들 피부 스폰지 디스크의 높이는 약 4 mm였다. 이들을 시딩 전에 2시간 동안 37℃에서 MSC 배지(LifeLine Cell Technology)에 미리 적셨다. 3번째 계대배양의 인간 지방 유래 줄기 세포를 제조된 피부 스폰지 디스크에 시딩(200,000 세포/디스크)하고, 배양 플레이트에 대한 세포 부착을 방지하기 위해 1.2% 폴리 (2-하이드록시에틸 메타크릴레이트)로 미리 코팅한 12-웰 플레이트 내의 MSC 배지 중에서 7일 동안 배양하였다. 배양 배지를 1일, 3일, 5일, 및 7일에 MSC 배지 중 AlamarBlue 시약(10%)으로 변경하고, 2시간 동안 인큐베이션하였다. AlamarBlue 시약을 갖는 배양 배지의 형광 세기를 측정하였다. 형광의 세기는 세포의 생존력/대사와 상응하고, 즉, 세기가 높을수록, 세포의 생존/대사 활성이 더 높다. 도 18에 제시된 바와 같이, 피부 스폰지는 세포 생존력을 유지시킬 뿐만 아니라, 피부 스폰지의 세포수가 7일의 배양에 걸쳐 꾸준히 증가함에 따라 세포 성장을 뒷받침한다.
MSC 배지에서 7일의 배양 후, 샘플의 절반(6 웰)의 배지를 AdipoLife DfKt-1 지방세포형성 배지(LifeLine Cell Technology)로 변경하고, 2-3일마다의 배지 변경과 함께 3주 동안 배양하였다. 각각의 배지 변경에 대해, 소모된 배지를 수거하고, Acrp30 Quantikine ELISA Kit(R&D Systems, Inc.)를 이용한 지방세포형성 마커인 아디포넥틴의 ELISA 분석을 위해 -80℃ 냉동기에 보관하였다. 아디포넥틴 ELISA는 피부 스폰지가 지방세포형성 배지가 없는 샘플에 비해 지방세포형성 배지 배양 조건하에서 지방세포로의 hASC 분화를 뒷받침하는 것을 나타내었다(도 19).
지방세포형성 배지에서의 2주 및 3주 배양 후, 항-파릴리핀 A(anti-parilipin A)(Abcam ab3526)를 이용한 지질 비말의 표면에 국한되는 고도로 인산화된 지방세포 단백질인 페릴리핀에 대한 조직학적 제조 및 면역조직학적 염색을 위해 hASC 시딩된 피부 스폰지 샘플을 또한 채취하였다. 이차 항체는 비오티닐화된 염소 항-토끼 IgG였으며, 스트렙타비딘 퍼옥시다제-컨쥬게이트 처리 및 AEC 기질 발달을 후속시켰다. 페릴리핀 양성 염색된 세포(흰색 화살표)가 2주의 지방세포형성 배지 배양 후 hASC 시딩된 스폰지로부터 제조된 절편에서 발견되었다(도 20).
실시예 13: 마우스 모델을 이용한 스폰지형 연조직 구조의 장기간 피하 이식
실시예 10과 같이 제조된 냉동 건조된 피부 스폰지로부터 8 mm 생검 펀치를 취함으로써 임플란트 샘플을 생성시켰다. 실시예 1과 같이 제조된 세정되고, 탈세포화/탈활력화된 진피로부터의 생검 펀치(8 mm)를 이식 대조군으로 사용하였다. 세정된/탈세포화된 진피 및 피부 스폰지 펀치의 절반을 드라이아이스 상에서 16-18kGy의 감마-방사선조사로 최종 멸균시켰다. 흡수성 콜라겐 지혈 스폰지인 HELISTAT®로부터의 생검 펀치(8 mm)를 또 다른 이식 대조군으로 사용하였다.
약 6주령의 수컷 무흉선 마우스(Nu/Nu Foxn1nu)를 Charles Rivers Laboratories에서 입수하고, 수술 전에 최소 72시간의 순응 기간을 보냈다. 동물을 멸균 깔짚과 음식물이 있는 멸균 우리의 울트라 배리어(ultra barrier) 시설 내에 두었다. 동물을 가장 가까운 0.1 g까지 칭량하고, 이소플루란(달성하기 위해 O2 중 1 내지 5%)에 의해 마취를 유도하고, 수술을 위해 O2 중 2 내지 3%에서 유지시켰다. 각각의 동물에 피하 주사를 통해 0.1 내지 1.0 mg/kg의 수술전후 진통제 Buprenorphine을 투여하고, 안과용 연고를 눈 위에 두었다. 어깨 부위 근처의 등 위쪽을 베타딘 및 알코올로 2회 닦았다. 동물의 어깨 부위 근처의 등의 각각의 측면(내측방(para-medial)) 상에 하나씩 약 1 cm 절개를 생성시켰다. 무딘 박리를 이용하여 상기 절개로부터 2개의 피하 포켓을 형성시켰다.
세정되고, 탈세포화/탈활력화된 진피 대조군을 이식 전에 최소 5분 동안 등장성 염수에 적셨다. 피부 스폰지 및 헬리스탯 대조군 샘플을 이식 전에 최소 5분 동안 등장성 염수(100μL)로 재수화시켰다. 임플란트를 피하 포켓에 삽입하였다. 각각의 동물에 전체 2개의 임플란트를 주입하였다. 절개부를 단속봉합(interrupted suture)으로 닫았다.
동물을 처음 48시간 동안 매일 2회 모니터한 후, 연구 종료 때까지 1주일에 1회 모니터하였다. 봉합사를 수술 후 10-14일에 제거하였다. 임플란트 부위의 사진을 이식 직후 및 외식(explantation) 때까지 2-3주마다 찍었다. 지정된 시점(6주, 12주, 및 24주)에서, 동물을 CO2 흡입에 의해 안락사시키고, 이들의 체중을 기록하였다.
안락사 후, 임플란트에서 약 5 mm 떨어진 피부와 피하 조직을 절단하여 임플란트 부위를 조심스럽게 노출시켰다. 염증, 감염, 섬유증, 혈종 또는 장액종의 임의의 심각한 증거를 기록하고, 사진을 찍었다. 이식된 샘플 및 3-5 mm의 주위 조직을 절개하고, 최소 4일 동안 주위 온도에서 10% 중성 완충 포르말린(NBF)에 고정시켜 완전한 고정을 달성하였다.
각각의 외식편 샘플을 이의 가장 긴 중간선을 따라 절단하여 2개의 반쪽을 생성시켰다. 얻어진 시편을 동일 파라핀 블록 내에 함께 포매(절단부가 아래를 향함)시켰다. 5 마이크론 두께의 절편을 만들고, 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 또는 매손 트리크롬 염색으로 염색하였다. 임플란트 물질의 가장 큰 단면을 갖는 절편을 평가에 사용하였다. 임플란트 물질 및 지방 조직의 단면적을 Image-J 소프트웨어를 이용하여 별도로 측정하였다.
매손 트리크롬 염색을 갖는 세정된/탈세포화된 진피(도 22A) 및 피부 스폰지(도 22B)의 단면의 이미지는 임플란트 물질 내부의 세포 침윤, 혈관형성, 및 지방 조직을 나타내었다. 감마 방사선 조사된 임플란트 샘플의 측정된 단면적을 6주, 12주, 및 24주의 3개의 시점에 대해 세정된/탈세포화된 진피, 피부 스폰지, 및 헬리스탯 대조군 사이에서 비교하였다(도 23). 6주에서부터 24주까지, 피부 스폰지의 임플란트 단면적은 약 30% 감소한 반면, 세정된/탈세포화된 진피의 임플란트 단면적은 약 10% 감소하였다. 그러나, 헬리스탯의 임플란트는 이식 6주 후에 가장 많이 흡수되었다. 24주에서, 피부 스폰지의 지방 조직 단면적은 6주의 외식편의 2배 초과만큼인 반면, 세정된/탈세포화된 진피의 지방 조직 단면적은 6주로부터 24주까지의 외식편에서 대략 동일하게 유지되었다(도 24).
세정된/탈세포화된 진피 및 피부 스폰지로부터의 임플란트 샘플의 측정된 단면적을 감마 방사선 조사된 것과 감마 방사선 조사되지 않은 것 사이에서 비교하였다(도 25). 6주에서부터 12주까지, 방사선 조사된 피부 스폰지의 임플란트 단면적은 약 22% 감소한 반면, 방사선 조사되지 않은 피부 스폰지의 임플란트 단면적은 대략 동일하게 유지되었다.
실시예 14: 태반 및 태반막을 이용한 스폰지형 연조직 구조의 제조
한 공인 연구 공여자의 제왕절개술로부터 회수된 태반막을 포함하는 인간 용어 태반을 태반 스폰지를 제조하는데 사용하였다. 태반 회수 4시간 내에, 태반막을 태반의 가장자리 주위를 절단하고, 태반으로부터 분리시켰다. 남은 태반을 작은 단편(1-2cm x 1-2 cm x 1-2 cm)으로 절단하고, 등장액(DPBS)으로 5회 헹구었다. 적혈구(RBC) 용해 완충액을 사용하여 태반 조직 및 태반막으로부터 RBC를 분리시킨 후, 염수로 헹구었다.
약 24그램의 세정된 태반 조직 및 얼음 큐브(2조각, 각각 10mL의 멸균 초순수로 제조됨)을 2분 동안 함께 기계적으로 분산(Sunbeam-Oster, Inc.로부터의 Osterizer)시켰다. 분산된 연조직을 주형으로 옮기고, 칭량하였다. 이를 태반 스폰지로 명명하였다. 약 24그램의 세정된 태반막 및 얼음 큐브(2조각, 각각 10mL의 멸균 초순수로 제조됨)을 0.5분 동안 함께 기계적으로 분산(Sunbeam-Oster, Inc.로부터의 Osterizer)시켰다. 분산된 연조직의 층을 주형으로 옮기고, 칭량하였다. 이를 태반막 스폰지로 명명하였다. 모든 샘플을 제조한 후, 분산된 조직을 갖는 주형을 분당 3.5℃의 제어 냉동 속도로 냉동 건조시켰다.
실시예 15: 태반 및 태반막을 이용하여 제조된 스폰지형 연조직 구조의 피하 이식
실시예 14와 같이 제조된 냉동 건조된 태반 스폰지 및 태반막 스폰지로부터 8 mm 생검 펀치를 취함으로써 임플란트 샘플을 생성시켰다. 수컷 무흉선 마우스(Nu/Nu Foxn1nu)를 실시예 13에 기재된 바와 같이 제조하였다. 태반 스폰지 및 태반막 스폰지를 이식 전에 최소 5분 동안 등장성 염수(100μL)로 재수화시켰다. 임플란트를 피하 포켓에 삽입하였다. 각각의 동물에 전체 2개의 임플란트를 주입하였다. 절개부를 단속봉합으로 닫았다.
동물을 처음 48시간 동안 매일 2회 모니터한 후, 연구 종료 때까지 1주일에 1회 모니터하였다. 봉합사를 수술 후 10-14일에 제거하였다. 임플란트 부위의 사진을 이식 직후 및 외식 때까지 2-3주마다 찍었다. 지정된 시점(4주 및 6주)에서, 동물을 CO2 흡입에 의해 안락사시키고, 이들의 체중을 기록하였다.
안락사 후, 임플란트에서 약 5 mm 떨어진 피부와 피하 조직을 절단하여 임플란트 부위를 조심스럽게 노출시켰다. 염증, 감염, 섬유증, 혈종 또는 장액종의 임의의 심각한 증거를 기록하고, 사진을 찍었다. 이식된 샘플 및 3-5 mm의 주위 조직을 절개하고, 최소 4일 동안 주위 온도에서 10% 중성 완충 포르말린(NBF)에 고정시켜 완전한 고정을 달성하였다.
각각의 외식편 샘플을 가장 긴 중간선을 따라 절단하여 2개의 반쪽을 생성시켰다. 생성된 시편을 동일 파라핀 블록 내에 함께 포매(절단부가 아래를 향함)시켰다. 5 마이크론 두께의 절편을 만들고, 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 또는 매손 트리크롬 염색으로 염색하였다. 일부 절편을 또한 항-파릴리핀 A(Abcam ab3526)를 이용하여 지방세포에서 페릴리핀에 대해 염색하였다. 이차 항체는 비오티닐화된 염소 항-토끼 IgG였으며, 스트렙타비딘 퍼옥시다제-컨쥬게이트 처리 및 AEC 기질 발달을 후속시켰다. 임플란트 물질의 가장 큰 단면을 갖는 절편을 평가에 사용하였다. 임플란트 물질 및 지방 조직의 단면적을 Image-J 소프트웨어를 이용하여 별도로 측정하였다.
매손 트리크롬 염색을 갖는 태반 스폰지(도 26a) 및 태반막 스폰지(도 26b)의 단면의 이미지는 임플란트 물질 내부의 세포 침윤(검정색 화살표), 혈관형성(흰색 화살표), 및 지방 조직을 나타내었다. 지방세포 및 지방 조직을 페릴리핀의 면역조직화학 염색을 이용하여 적색으로 염색하였다(도 26c의 검정색 화살표). 태반 스폰지 및 태반막 스폰지 둘 모두에 대해 4주와 6주 사이에서 임플란트 단면적에서 유의한 차이가 없었다(도 27).
실시예 16: 인간 근막을 이용한 스폰지형 연조직 구조의 제조
공인 연구 공여자로부터 회수된 인간 근막을 스폰지형 연조직 구조를 제조하는데 사용하였다. 근막 조각을 세정제를 함유한 용액으로 임의의 여분의 조직 및 혈액을 세정하고, 냉동 건조시키거나 사용 때까지 냉동 상태로 유지시켰다. 냉동 건조된 근막 조각을 사용 전에 실온에서 2일 동안 초순수에서 수화시켰다. 모든 근막을 1-2cm x 1-2cm 조각으로 절단하고, 칭량하였다. 약 12그램의 냉동 건조되거나 냉동/해동된 근막 및 얼음 큐브(2조각, 각각 10mL의 멸균 초순수로 제조됨)을 2분 동안 함께 기계적으로 분산(Sunbeam-Oster, Inc.로부터의 Osterizer)시켰다. 이후, 가공된 연조직을 멸균 체 상으로 옮겼다. 분산되지 않은 조직 조각을 골라내어, 2개의 얼음 큐브와 혼합하고, 또 다른 2분 동안 분산시켰다. 가공된 연조직을 다시 동일한 멸균 체로 옮겼다. 분산된 연조직의 층을 주형으로 옮기고, 칭량하였다. 이를 근막 스폰지(냉동/해동) 그룹으로 명명하였다. 또한, 약 14 그램의 분산된 연조직을 1.44 그램의 탈광물화된 골 기질과 혼합하였다. 이를 근막/DBM 그룹으로 명명하였다. 냉동 건조된 근막에 대해, 더 많은 분산되지 않은 조직 조각을 2회 실시 후에 골라내어, 얼음 조각을 하나 더 혼합하고, 또 다른 1분 동안 분산시켰다. 가공된 연조직을 동일한 체 상으로 옮겼다. 분산된 연조직의 층을 주형으로 옮기고, 칭량하였다. 이를 근막 스폰지(냉동-건조) 그룹으로 명명하였다.
모든 샘플을 제조한 후, 분산된 조직을 함유하는 주형을 냉동 건조시켰다. 근막 스폰지(냉동-건조) 그룹(도 28a), 근막 스폰지(냉동/해동) 그룹(도 28b), 및 근막/DBM 그룹(도 28c)에 대해 대표 사진을 찍었다. 근막/DBM 스폰지의 일부를 절단하고(도 29a), 등장성 염수로 수화시키고(도 29b), 공 모양으로 성형시켰다(도 29c). 수화된 근막/DBM 스폰지를 또한 한 쌍의 집게로 집어들고(도 29d), 집게로 눌렀다(도 29e).

Claims (122)

  1. 다공성 연조직을 제조하는 방법으로서,
    a. 37℃ 미만의 온도에서 고체의 존재하에 하나 이상의 천연 연조직을 분산시켜 분산된 연조직을 생성하는 단계;
    b. 단계 a 동안 및/또는 후에 고체를 용해시키는 단계; 및
    c. 단계 b 후에 분산된 연조직을 냉동 및 건조시키고, 이에 의해 건조 다공성 연조직이 제조되는 단계로서, 건조 다공성 연조직은 무작위로 섞여 짜인 콜라겐 섬유 또는 콜라겐 섬유 다발을 포함하며, 하나 이상의 천연 연조직과 비교하여 세포외 물질 중에 더 많은 공간 및 증가된 공극 부피를 가지며, 비-천연 발생 크로스링커를 포함하지 않는, 단계를 포함하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 다공성 연조직이 비-천연 발생 담체를 포함하지 않는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 방법이 비-천연 발생 결합에 의해 하나 이상의 연조직 또는 다공성 연조직을 가교시키는 것을 포함하지 않는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 다공성 연조직을 멸균시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 하나 이상의 연조직이 24℃ 미만의 온도에서 분산되는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 고체가 얼음 과립, 염 과립, 당 과립, 또는 이의 조합물인 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 분산된 연조직에서 하나 이상의 연조직의 중량 백분율이 건조 상태에서 2% 내지 80%인 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 하나 이상의 연조직이 1 mm 내지 50 cm의 평균 직경을 갖는 방법.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중의 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 다공성 연조직.
  10. 제 9항의 다공성 연조직을 포함하는 생물학적 기능성 스캐폴드.
  11. 제 10항에 있어서, 생물학적 기능성 스캐폴드가 건조 상태에서 0.01 g/cm3 내지 1 g/cm3의 밀도를 갖는 생물학적 기능성 스캐폴드.
  12. 제 10항에 있어서, 생물학적 기능성 스캐폴드가 1 μm 내지 4000 μm의 평균 직경을 갖는 기공을 포함하는 생물학적 기능성 스캐폴드.
  13. 제 10항에 있어서, 생물학적 기능성 스캐폴드가 10% 내지 99%의 평균 공극 부피를 갖는 생물학적 기능성 스캐폴드.
  14. 제 10항에 있어서, 생물학적 기능성 스캐폴드가 0.1 μm 내지 500 μm의 평균 직경을 갖는 섬유 또는 섬유 다발을 포함하는 생물학적 기능성 스캐폴드.
  15. 환자의 조직에서 결함을 수복시키는 방법에 사용하기 위한 조성물로서, 제 10항의 생물학적 기능성 스캐폴드를 포함하며, 생물학적 기능성 스캐폴드가 환자의 결함 부위에 이식되는 조성물.
  16. 제 15항에 있어서, 생물학적 기능성 스캐폴드가 재수화되지 않은 조성물.
  17. 제 15항에 있어서, 생물학적 기능성 스캐폴드가 재수화 용액으로 재수화된 조성물.
  18. 제 15항에 있어서, 생물학적 기능성 스캐폴드에 생체 세포(vital cell)가 시딩된 조성물.
  19. 제 18항에 있어서, 세포-시딩된 생물학적 기능성 스캐폴드가 배양된 조성물.
  20. 생물학적 기능성 스캐폴드를 제조하는 방법으로서,
    a. 고체의 존재하에 하나 이상의 천연 연조직을 분산시켜 분산된 연조직을 생성하는 단계;
    b. 단계 a 동안 또는 후에 고체를 용해시키는 단계;
    c. 단계 b 후에 분산된 연조직을 스캐폴드로 형상화시켜 형상화된 분산된 연조직을 생성하는 단계; 및
    d. 형상화된 분산된 연조직을 탈수화시키고, 이에 의해 건조 다공성 연조직을 포함하는 생물학적 기능성 스캐폴드가 제조되며, 건조 다공성 연조직은 무작위로 섞여 짜인 콜라겐 섬유 또는 콜라겐 섬유 다발을 포함하며, 하나 이상의 천연 연조직과 비교하여 세포외 물질 중에 더 많은 공간 및 증가된 공극 부피를 가지며, 비-천연 발생 크로스링커를 포함하지 않는, 단계를 포함하는 방법.
  21. 제 20항에 있어서, 고체가 얼음 과립, 염 과립, 당 과립 또는 이의 조합물을 포함하는 방법.
  22. 제 20항에 있어서, 생물학적 기능성 스캐폴드에서 분산된 연조직의 중량 백분율이 건조 상태에서 50% 내지 100%인 방법.
  23. 제 20항에 있어서, 생물학적 기능성 스캐폴드의 밀도가 건조 상태에서 0.001 g/cm3 내지 1.0 g/cm3인 방법.
  24. 제 20항에 있어서, 생물학적 기능성 스캐폴드가 기공을 포함하며, 30%가 넘는 기공이 50 μm보다 큰 직경을 갖는 방법.
  25. 제 20항에 있어서, 생물학적 기능성 스캐폴드가 10% 내지 95%의 평균 공극 부피를 갖는 방법.
  26. 제 20항 내지 제 25항 중의 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 생물학적 기능성 스캐폴드.
  27. 하나 이상의 천연 연조직으로부터 제조된 건조 다공성 연조직을 포함하는 생물학적 기능성 스캐폴드로서, 건조 다공성 연조직이 무작위로 섞여 짜여진 콜라겐 섬유 또는 콜라겐 섬유 다발을 포함하며, 하나 이상의 천연 연조직과 비교하여 세포외 물질 중에 더 많은 공간 및 증가된 공극 부피를 가지고, 비-천연 발생 크로스링커를 포함하지 않으며, 생물학적 기능성 스캐폴드는 건조 상태에서 0.001 g/cm3 내지 1.0 g/cm3의 밀도를 가지며, 생물학적 기능성 스캐폴드는 기공을 포함하는데, 30%가 넘는 기공이 50 μm보다 큰 직경을 갖는, 생물학적 기능성 스캐폴드.
  28. 제 27항에 있어서, 생물학적 기능성 스캐폴드가 액체에서 재수화 후 응집성을 유지하며, 생물학적 기능성 스캐폴드의 가장 큰 단면적이 동물에서 임플란트 부위에서의 이식 후 4주 내지 24주에 70% 미만으로 감소된 생물학적 기능성 스캐폴드.
  29. 조직 또는 장기 결함 또는 손상을 갖는 환자를 치료하기 위한 조성물로서, 제 1항 내지 제 8항 중의 어느 한 항의 방법 또는 제 20항 내지 제 25항 중의 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 다공성 연조직을 포함하는 생물학적 기능성 스캐폴드를 포함하며, 이는 조직 또는 장기 결함부 또는 손상부에 투여되는 조성물.

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