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Diese Erfindung betrifft kollagenöse Gewebe
Zusammensetzungen.
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In den letzten Jahren wurde der Entwicklung von
Zusammensetzungen und Zubereitungen für Wundbehandlung und zur
Verwendung in der Allgemeinchirurgie und der plastischen
Chirurgie, besonders zur verbesserten Wiederherstellung
chirurgisch induzierter Wunden oder zur Korrektur
physiologischer Störungen, wie beispielsweise des
Harnröhrensphinkters in Fällen einer Harninkontinenz, viel
Aufmerksamkeit gewidmet.
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Viel Aufmerksamkeit erhielt die Bereitstellung von
Materialien auf Kollagenbasis, entweder menschlichen oder
tierischen Ursprungs. Insbesondere richtete sich erhebliche
Aufmerksamkeit auf das Entwickeln von Zubereitungen und
Materialien auf der Basis von Tiergeweben, die behandelt
sind, um Kompatibilität zu gewährleisten, d. h., um die
Abstoßung der Gewebe zu vermeiden, wenn sie am Menschen
verwendet werden.
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Frühere Arbeit von den Erfindern der vorliegenden Erfindung
ist widergespiegelt in der US-amerikanischen Patentschrift 5397353
und EP-A-182842, die Verfahren zum Zubereiten von
Kollagenmaterialien, vorzugsweise in Blattform und welche
zur Transplantation geeignet sind, offenbart. Die
Behandlung ist konzipiert, um ein Kollagenmaterial herzustellen,
das nicht antigen ist, so dass es nicht abgestoßen wird,
und das nicht absorbierbar ist, so dass es ein permanentes
Transplantat bildet. Insbesondere behält das in diesen
Patentschriften beschriebene Material die natürliche
Struktur und den ursprünglichen Aufbau des natürlichen Gewebes
bei; die molekulare Ultrastruktur des Kollagens wird
beibehalten. Diese Materialien erwiesen sich in der Praxis als
äußerst zufrieden stellend, und erwiesen sich insbesondere
als in der Lage, nach der Implantation revaskularisiert zu
werden, während sie gleichzeitig resistent gegenüber einer
Kalzifizierung sind. Sie sind insbesondere nützlich in Ohr,
Nase und Kehle, bei orthopädischen, gynäkologischen und
urologischen Verfahren und zur Korrektur einer Reihe von
Hernien, einschließlich parastomalem Narbenbruch und
Leistenbruch.
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Die in der US-Patentschrift 5397353 beschriebenen
Zusammensetzungen sind jedoch als Strukturen im großen Maßstab
offenbart, beispielsweise mit einer Stärke von 0,75 mm und
in der Regel präsentiert als Blätter mit einer Größe im
Bereich von. 25 cm³ bis 50 cm³. Dies ist nützlich für
spezielle Implantatverwendung, z. B. bei der restaurativen
Chirurgie, ist aber nicht immer geeignet für die
Verwendung zum allgemeinen Aufbau von Weichgeweben.
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In der kosmetischen und rekonstruktiven Chirurgie, z. B. bei
der Korrektur kleiner Aknenarben und zum Anheben und
Glätten von Fältchen, ist es häufig wünschenswert, zur
Gewebeimplantation und für die so genannte Vergrößerung
(Augmentation) Material in einer anderen Form zu verwenden,
welches injiziert oder auf andere Weise in die gewünschte
Stelle eingeführt werden kann.
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Für solche Zwecke wurden verschiedene, so genannte
injizierbare Implantatmaterialien entwickelt. Die
US-Patentschritten 5523291, 5673398 und 5705488 offenbaren
injizierbare Implantatzusammensetzungen für die
Weichgewebevergrößerung, umfassend Elastin und Kollagen und einen
biokompatiblen Träger, oder flexible Beutel, die ein solches
Material enthalten. Das Problem mit diesen Materialien, wie
in diesen US-Patentschriften offenbart, ist, dass eine
Tendenz zur Resorption vorliegt und dies kann bedeuten,
dass das Implantat nur für eine beschränkte Zeit wirksam
ist. Außerdem fördern solche Materialien die
Vaskularisierung nicht, d. h. sie integrieren sich nach der
Implantation nicht gut in das umliegende, gesunde Gewebe.
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Des Weiteren besteht in der Traumachirurgie, z. B. der
Wiederherstellung von Schusswunden oder von durch Maschinen
oder Verkehrsunfälle verursachten Wunden und tatsächlich
auch bei Wunden aufgrund invasiver Eingriffe, häufig das
Problem, dass Gewebe aus dem Wundbereich verloren geht.
Dies führt zur Entwicklung von Narben, die hyperplastisch
und entstellend sein und zu einer eingeschränkten
Körperfunktion führen können.
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Narben ergeben sich aus der biologischen Antwort von
erwachsenem Bindegewebe auf Verletzung. Im Gegensatz zu
fötalen Geweben, die auf Einschnitte oder Verletzung durch
Regeneration neuer Haut reagieren, um das
verlorene/verletzte Gewebe zu ersetzen (d. h. Überbrücken des
Defektes mit Hautkollagenfasern mit normalem Aufbau von
Hautkollagen), werden nach der Geburt äquivalente Wunden
vielmehr repariert als regeneriert und die Wunde füllt sich
mit Narbengewebe. Das Überbrückungsgewebe nach der Geburt
repliziert daher nicht den ursprünglichen, normalen
Hautaufbau. Während des Reparaturvorgangs wandern
Fibroblasten (die Zellen, die jedes Bindegewebe
durchdringen und die extrazelluläre Matrix einschließlich
strukturellen Kollagens synthetisieren) und kleine Blutgefäße in
den Wundraum ein, um hoch zelluläres Granulationsgewebe zu
bilden, das sich in die dichte, unregelmäßig organisierte
Kollagenmasse, d. h. Narbengewebe, verwandelt.
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Eine Lösung für dieses spezielle Problem des
Gewebeverlustes war es, dreidimensionale Kollagengele in den
Wundbereich, wo Gewebe verloren gegangen war, aufzutragen,
welches dann als Matrixnetzwerk für das Wachstum der so
genannten histiotypischen Haut wirkt. Das zum Bilden dieses
speziellen Gels verwendete Kollagen ist vollständig
wasserlöslich und wenn es aufgetragen ist, wird es von
Fibroblasten und kleinen Blutgefäßen besiedelt, Wasser wird
extrudiert und es bildet sich ein zartes Gel, in dem das
Kollagenmolekül polymerisiert ist, um Kollagenfasern zu
bilden. Die ursprüngliche, von dem Kollagengel geformte,
dreidimensionale Matrix repliziert nicht den normalen
Matrixaufbau des natürlichen Körpergewebes, obwohl sie beim
Wiederaufbauen des verlorenen Gewebes in dem Bereich um die
ursprüngliche Wunde einigermaßen erfolgreich ist, und das
Gel hat an sich keine eigene Stabilität. Diese inhärente
Instabilität führt dazu, dass das Gel schnell vom Körper
resorbiert und durch narbenähnliches Gewebe ersetzt wird.
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Andere neue Vorschläge zum Überwinden des Problems der
Bildung von Narbengewebe involvierten die extrem schwierige
(und sehr teure) Verwendung von monoklonalen Antikörpern,
um die Wirkung von Wachstumsfaktoren, wie z. B. dem
Transforming Growth Factor (TGF-β), zu unterdrücken.
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Wir haben nun überraschenderweise gefunden, dass die
günstigen Eigenschaften, einschließlich des Widerstandes
gegenüber eine Resorption, Widerstand gegenüber Kalzifizierung,
Granulation und die Fähigkeit, rezellularisiert und
revaskularisiert zu werden, was die Strukturen in großem
Maßstab, die in der Patenschrift 5397353 offenbart sind,
kennzeichnet, beibehalten werden können, wenn das
Kollagenmaterial in formbarer Form der Organisationsstufe von
Faserfragmenten präsentiert ist, wo es als Wundfüller
verwendet werden kann, oder in injizierbarer Form zur
Verwendung in der kosmetischen und rekonstruktiven
Chirurgie.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine implantierbare
Zusammensetzung bereit gestellt, die ein biokompatibles
Trägermedium mit darin verteilten Partikel von
Kollagenmaterial umfasst, wobei die Partikel Fragmente von
Kollagenfasern umfassen und deshalb ausreichend lang sind, um
den ursprünglichen Aufbau und molekulare Struktur des
natürlichen Gewebematerials, von dem sie abstammen, zu
erhalten, und wobei das Kollagenmaterial im Wesentlichen
frei ist von nicht-faserigen Gewebeproteinen,
Glyko
proteinen, zellulären Elementen und Lipiden oder
Lipidresten und welches nicht toxisch ist. Vorzugsweise ist das
Material frei oder im Wesentlichen frei von antigenen
Polysacchariden und Mukopolysacchariden. Das biokompatible
Medium kann beispielsweise eine Salzlösung oder Dextran
oder Hyaluronsäurelösung sein.
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Solche Zusammensetzungen können sich in ihrer Konsistenz
sehr unterscheiden. Wenn beispielsweise die Größe und
Konzentration der Partikel in dem biokompatiblen Medium so
ist, dass eine eher flüssige Suspension hergestellt wird,
kann diese injiziert werden, vorausgesetzt, dass die
Partikel nicht zu groß sind. Konzentriertere Zusammensetzungen
dickerer Konsistenz können als pastenförmige
Zusammensetzungen zur Wundfüllung verwendet werden.
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Solche Materialien können durch Verfahren, wie offenbart in
der Patentschrift 5397353, oder durch dazu analoge
Verfahren, aus Kollagenmaterialien menschlicher oder
tierischer Herkunft hergestellt sein, wobei das bevorzugte
Ausgangsmaterial Schweinehaut ist. Je nach Ausgangsmaterial
kann die Zusammensetzung einen Anteil von Elastin
enthalten. Vorausgesetzt, man ist vorsichtig, ist es dann
möglich, das Material von großen Stücken auf kleine
Partikel zu reduzieren, die dann zu einer sterilen,
injizierbaren Zusammensetzung oder einer sterilen Wundfüllungspaste
formuliert werden können.
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Um eine Kollagenpaste mit geeigneter Dichte und
rheologischen Eigenschaften (Flussrate und eine Fähigkeit, nach
dem Formen die Form beizubehalten) herzustellen, kann eine
Suspension kollagenöser Partikel in einem geeigneten Träger
hergestellt werden, um eine kontrollierbare Konzentration
der Zusammensetzung zu bilden.
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Es muss jedoch sorgfältig sichergestellt werden, dass die
Größenverringerung des Ausgangsmaterials nicht von einem
Abbau der molekularen Struktur des ursprünglichen Materials
begleitet ist. Das bevorzugte Verfahren des Bereitstellens
von Partikel einer geeigneten Größe ist durch Reiben oder
Mahlen, und dies wird vorzugsweise ausgeführt in einer
Kugel- oder Hammermühle, die auf eine geeignete Temperatur
gekühlt sein kann. Das Mahlen kann in trockener Form
(Feuchtigkeitsgehalt von unter 10%) oder in gefrorener,
hydratisierter Form (20-80% Feuchtigkeitsgehalt)
erfolgen.
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Kollagen, das in einem gefrorenen, hydratisierten Stadium
gemahlen wurde, kann durch Acetonextraktion,
Gefriertrocknen oder in einem Strom von Luft dehydriert werden.
Das trockene Kollagenpulver kann vor der Injektion in einem
im Wesentlichen nicht wässrigen, nicht toxischen,
biokompatiblen Medium suspendiert werden, wie z. B. Glycerol.
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Es kann ein Anästhetikum, wie zum Beispiel Lignocain, in
die Zusammensetzung integriert werden.
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Das Kollagenmaterial kann, falls gewünscht, quervernetzt
werden, z. B., indem ein Diisocyanat verwendet wird, um es
gegenüber kollagenolytischen Enzymen resistent und es daher
im Wesentlichen nicht resorbierbar zu machen.
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Das bevorzugte Verfahren zum Sterilmachen der
Zusammensetzungen ist durch Gammabestrahlung.
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Die bevorzugte Partikelgröße der Partikel des
Kollagenmaterials in den injizierbaren Zusammensetzungen gemäß der
vorliegenden Erfindung liegt zwischen 50 und 500 Mikron,
Die Größenverteilung der Partikel kann variieren, aber
vorzugsweise mindestens 50% der Partikel liegen innerhalb
von 35% der durchschnittlichen Partikelgröße. Die
Konzentration der Feststoffe in der injizierbaren
Zusammensetzung liegt vorzugsweise im Bereich zwischen 10 und 70%
(Gewicht/Volumen). Dagegen beträgt die Konzentration der
Feststoffe in den pastenförmigen
Wundfüllungszusammensetzungen im Allgemeinen bis zu 80%.
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Die Effizienz der Zusammensetzungen der Erfindung ist in
vitro ersichtlich. Es wurde beobachtet, dass, wenn
dispergierte Kollagenfaserfragmente (gemahlenes Kollagen)
zusammen mit menschlichen Fibroblasten oder
Nagerfibroblasten in Gewebekultur ausgesät werden, sich die
Fibroblasten an die Kollagenfragmente anheften und diese
zusammenlagern, um dichte, gewebeähnliche Scheiben
zubilden, die dann leicht manipulierbar sind.
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Außerdem wird gemahlenes Kollagen nach in vivo-Injektion
schnell von Fibroblasten und kleinen Blutgefäßen
durchdrungen (viel schneller als Kollagenblätter), um neues
Gewebe zu formen, in dem die Kollagenfaserfragmente,
ähnlich wie bei dem normalen Aufbau von Kollagen in der Haut,
in quervernetzten Kollagenfasern organisiert sind, d. h.,
nicht resorbiert werden und kein Narbengewebe bilden.
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Die injizierbaren Zusammensetzungen können bei
verschiedenen klinischen Problemstellungen verwendet werden.
Beispielsweise durch periurethrale Injektion zur
Verringerung der Lumenöffnung, um Harninkontinenz zu
kontrollieren und, spezifischer, bei intrinsischer
Sphinkterdysfunktion. Kosmetische Anwendungen beinhalten die
Verwendung der Injektion kollagenöser Suspensionen nach dem
Anheben von Augenbrauen, zur Lippenvergrößerung und zur
Korrektur von fazialen Defekten, Stirnfalten und.
Aknenarben. Als ein weiteres Beispiel liegt bei arthritischen
Gelenken häufig ein ausgeprägter Verlust und eine
ausgeprägte Beschädigung der glatten Knorpelschicht vor, die aus
Chondrozyten besteht, welche von einer faserigen
Kollagenmatrix gestützt werden. Es liegen Beweise dafür vor, dass
unter den entzündlichen Bedingungen arthritischer Gelenke
Kollagenase hergestellt wird, welche die Kollagenmatrix der
Knorpelschicht zerstört. Wird eine erfindungsgemäße
Kolla
gensuspension in das Gelenk injiziert, kann sie dazu
beitragen, eine kollagenase-resistente Matrix zu bilden, um
Chondrozyten zu stützten und so den Schaden zu korrigieren.
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Ein alternatives klinisches Szenario sind Situationen, bei
denen ein großer Hautbereich zu behandeln ist,
beispielsweise der Handrücken oder der Nacken bei älteren Patienten,
bei denen, die Haut inzwischen sehr dünn ist. Für einen
solchen Zweck kann ein Mehrpunkt-Injektionssystem angewandt
werden. In einem solchen System kann eine Anzahl von
Kanülen kombiniert sein, welche in einem hohlen Block aus
Metall- oder Kunststoffmaterial befestigt sind, dessen
Einlass mittels einer Spritze, einer Messpumpe, einer
peristaltischen Kolbenpumpe oder einer beliebigen anderen
geeigneten Vorrichtung mit Kollagenmaterial gespeist wird.
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Die Kollagenzusammensetzungen der Erfindung können auch zum
Zweck des Unterdrückens der Narbenbildung in
Operationswunden verwendet werden, wobei das gemahlene
Kollagenmaterial wiederum dazu dient, unmittelbar während oder nach
dem Verschluss der Wunde durch Nähte oder Verband Fragmente
mit Faserstruktur in den Wundraum einzubringen. Obwohl eine
solche Vorgehensweise vollkommen ungewöhnlich ist, erwies
sie sich als äußerst nützlich. Die Einführung der
Kollagenmaterialfragmente in neu gebildete Wunden, z. B.
Einschnitte, stellt eine anatomisch "dünne" Matrix
kollagenreicher Stellen für die Fibroblasten und kleine Blutgefäße
dar, damit diese von den Wundrändern aus einwandern können.
Dies hat grundlegenden Einfluss auf das Verhalten der
Fibroblasten, da sie in einer solchen kollagenreichen
Umgebung innerhalb des Wundraums keine Signale zur Bildung
von Granulationsgewebe zur Synthese von überschüssigem
neuen Kollagen erhalten. Mit anderen Worten wird die
Narbenbildung weit gehend unterdrückt. Dieser einfache,
"mechanische" Ansatz unterscheidet sich vom Stand der
Technik, insbesondere von der Verwendung von monoklonalen
Antikörpern, da er viel einfacher anzuwenden und viel
billiger ist.
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Verwendung von gemahlenem Kollagen durch Injektion durch
feine Kanülen ist aufgrund der Art der Einführung von
Kollagenmaterial in die Stelle, an der es benötigt wird, in
gewissem Sinn eingeschränkt. Die Zusammensetzungen dickerer
Konsistenz jedoch, die die Verwendungen eines größeren
Spektrums von Fragmentgrößen des Kollagenmaterials
ermöglichen, können bei einer Vielzahl von Problemstellungen
verwendet werden, für die ein injizierbares Material nicht
geeignet wäre. Um verlorenes Gewebe zu ersetzen und die
Bildung von Narbengewebe weit gehend zu verringern, können
daher bei der Behandlung größerer oder schwerer Wunden
Kollagenfaserfragmente als pastenförmige Zusammensetzung in
den Wundraum eingeführt werden, bevor ein geeigneter
Verband oder ein Verschluss durch Nähte oder Klebeband
angebracht wird. Die Zusammensetzung kann beispielsweise zur
unmittelbaren Rekonstruktion nach Entfernung eines Knotens
aus der Brust verwendet werden. Bei Defekten mit
Hautverlust, einschließlich denen nach traumatischen
Chemikalien- oder Brandverletzungen oder den durch Beingeschwüre
Hervorgerufenen, kann die pastenförmige Zusammensetzung
verwendet werden, um verlorene Haut durch geeignete
Abdeckung und Verband zu ersetzen.
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Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der
Erfindung:
Beispiel 1
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Proben von Hautkollagen vom Schwein wurden unter sterilen
Bedingungen in kleine Stücke geschnitten (1 bis 3 mm³) und
durch mehrmaligen Wechsel von 100% Ethanol und
wasserfreiem Aceton dehydriert. Mithilfe einer Kugelmühle wurden
die getrockneten Kollagenstücke zermahlen und gesiebt, um
ein feines, weißes Pulver zu erhalten. Das gesiebte,
pulverförmige Kollagen wurde in steriler,
phosphatgepufferter Salzlösung rehydriert, um eine
Kollagensuspensionskonzentration von 60 bis 70% (Gewicht/Volumen) zu
ergeben.
Beispiel 2
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Kleine Stückchen von geblottetem Schweinekollagen wurden in
flüssigem Stickstoff eingefroren und in einer Gefriermühle
zermahlen. Die zermahlenen Kollagenfragmente wurden in
steriler, phosphatgepufferter Salzlösung suspendiert, um
eine Kollagensuspensionskonzentration von 60 bis 70%
(Gewicht/Volumen) zu ergeben.
Beispiel 3
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Um die Zell/Kollagen-Biointeraktion direkt zu untersuchen,
wurde das gesiebte, pulverförmige Schweinhautkollagen in
vollständigem Säugetierzellkulturmedium rehydriert, um eine
Kollagensuspensionskonzentration von 70% (Gewicht/Volumen)
zu ergeben und entweder mit primären menschlichen
Vorhautfibroblasten oder primären Rattenhautfibroblasten ausgesät.
Kollagen/Fibroblastenproben wurden in Costar (eingetragene
Handelsmarke)-Vertiefungen aliquotiert und bei 37ºC, 5 bis
7% (Gewicht/Volumen) feuchtigkeitsgesättigtem CO&sub2;,
inkubiert. Wie im Laufe des 21-tägigen Inkubationszeitraums
untersucht wurde, proliferierten sowohl menschliche
Fibroblasten als auch Rattenfibroblasten und wanderten in
die Schweinekollagenfragmente ein bzw. hafteten sich an die
Schweinekollagenfragmente an, die sie i dicht gepackte
Klumpen oder Scheiben zusammenlagerten.
Beispiel 4
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Um die in vivo-Leistung zu untersuchen, wurden
Kollagensuspensionen durch eine 21-Gauge-Kanüle intrakutan seitlich
dorsal in isogene PVG/Ola-Ratten injiziert
(0,2 ml/Injektion). Sequenzielle Biopsien bis zu 12 Monate
nach der Injektion zeigten das anhaltende, makroskopische
Vorhandensein von injiziertem Kollagen als subdermal
lokalisierte, weiße Scheiben ohne offensichtliche Zeichen eines
Verlustes der injizierten Kollagenmasse oder von
Gegenreaktionen des Empfängers. Frühe Biopsien zeigten, dass das
injizierte Kollagen in situ bleibt und innerhalb von 9
Tagen vollständig mit Fibroblasten und kleinen Blutgefäßen
durchdrungen ist. Darauf folgende Histologie zeigte, dass
die Kollagenfaserfragmente in quer vernetzten
Kollagenfasern organisiert sind, um ein Gewebe hervorzubringen,
dessen Aufbau dem von normalem Hautkollagen gleicht.
Beispiel 5
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Unter sterilen Bedingungen wurden
Schweinehautkollagenproben, hervorgebracht gemäß dem Vorgang, der in US-A-5397353
beschrieben ist, in kleine Stücke geschnitten (1
bis 3 mm³), in flüssigem Stickstoff eingefroren und in
einer Gefriermühle zermahlen. Die zermahlenen
Kollagenfragmente wurden in steriler, phosphatgepufferter
Salzlösung suspendiert, um eine pastenförmige Zusammensetzung
mit einem Feststoffgehalt von 80% Gewicht/Volumen
hervorzubringen.
Beispiel 6
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In den Ohrmuscheln von PVG/Ola-Ratten wurden Taschen
angelegt, die Kollagenpastenzusammensetzungen mit einem Spatel
eingeführt und die Wunden mit einem Sprühverband sicher
verschlossen. An den Stellen der Kollageninsertion wurden
in monatlichen Abständen Biopsien zur histologischen
Untersuchung entnommen. Über einen Zeitraum von 6 Monaten wurden
die Kollagenimplantate, die als Hauterhebungen
persistierten, in das umliegende Empfängergewebe eingebaut und
es wurden keine gegenteiligen Auswirkungen festgestellt.
Beispiel 7
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1 ml der Kollagenpaste wurde durch ein "Trokar" oder eine
Kanüle mit großem Durchmesser in das Dorsum von PVG/Ola-
Ratten injiziert. Dieser "Weichgewebe-Füller" persistierte
ohne gegenteilige Reaktionen des Empfängers über einen
Zeitraum von sechs Monaten.
Beispiel 8
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Im Rücken von PVG/Ola-Ratten wurden Hautinzisionswunden,
die durch alle Hautschichten hindurch reichten,
vorgenommen. Die Wunden wurden mithilfe einer unterbrochenen
Naht geschlossen und eine
Kollagenzusammensetzungssuspension wurde in die. Wunden injiziert, bis sie über der
Wundfläche heraustrat. Am Tag 6, 8, 10 und 14 wurden
Biopsien der Wunden für die histologische Untersuchung
entnommen, die die Heilung des Einschnitts ohne sichtbares
Narbengewebe bewiesen.
Beispiel 9
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Die Kollagenpastenzusammensetzung, mit oder ohne
vorhergehendes Aussäen mit isogenen Fibroblasten in Kultur, wurde
verwendet, um Hautexzisionswunden der Größe 1 · 1 cm, die
durch alle Hautschichten hindurch reichten, in PVG/Ola-
Ratten zu füllen, und mit einer halbdurchlässigen Membran
(Opsite - EINGETRAGENE HANDELSMARKE) als Primärverband
abgedeckt. Nachfolgende Beobachtung und Histologie zeigten,
dass die implantierte Kollagenzusammensetzung innerhalb von
28 Tagen von Epithel bedeckt wurde, welches von den
Wundrändern aus einwanderte und als effektiver und
persistierender Hautersatz wirkte.