DE69202332T2

DE69202332T2 - Wachstumsfaktor enthaltende matrix zur behandlung von knorpelschäden.

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Publication number: DE69202332T2
Application number: DE69202332T
Authority: DE
Inventors: Ernst B. M.E.Mueller-Inst. Fuer Biomemec. Ch-3010 Bern Hunziker
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1991-01-31
Filing date: 1992-01-30
Publication date: 1996-01-04
Anticipated expiration: 2012-01-31
Also published as: IL100799A; NO932748D0; AU667032B2; IE920309A1; AU1412892A; HK1006416A1; ZA92726B; DK0569541T3; ES2072144T3; JP2004230184A; US5206023A; EP0569541B1; WO1992013565A1; US5368858A; KR100235391B1; ATE121943T1; NZ260125A; DE69202332D1; CA2101556C; CN1064813A

Description

Technisches Fachgebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft die Behandlung und Wiederherstellung von Defekten oder Schäden im Knorpel. Insbesondere betrifft die Erfindung Verfahren zur Behandlung von Defekten oder Schäden (im folgenden als Synonyme verwendet) im Knorpel und Mittel, umfassend eine biologisch abbaubare Matrix, die ein oder mehrere Proliferationsmittel zur Förderung der Proliferation von Reparaturzellen enthält, welche sodann neues stabiles Knorpelgewebe erzeugen. Die erfindungsgemäßen Mittel sind insbesondere für die Behandlung von Osteoarthritis und anderen, zu Knorpelschäden führenden Krankheiten und Verletzungen nützlich.

Stand der Technik

Die Knochen im Skelett sind normalerweise durch Gelenke miteinander verbunden. Die Enden von normalen, durch Gelenke verbundenen Knochen sind mit Gelenkknorpelgewebe überzogen, das eine praktisch reibungsfreie Bewegung der Knochen gegeneinander ermöglicht [L. Weiss, Hrsg., Cell and Tissue Biology (Urban und Schwarzenberg, München, 1988), S. 247].
Gelenkknorpel ist durch eine besondere strukturelle Organisation gekennzeichnet. Er besteht aus spezialisierten Zellen (Chondrocyten), die in intrazellulärem Material eingebettet sind (in der Literatur häufig als "Knorpelmatrix" bezeichnet), das reich ist an Proteoglykanen, Kollagenfibrillen, hauptsächlich vom Typ II, anderen Proteinen und Wasser [Buckwalter et al., "Articular Cartilage: Injury and Repair", in Injury and Repair of the Musculoskeletal Soft Tissues (American Academy of Orthopaedic Surgeons Symposium, Park Ridge, 111., 1987), S. 465]. Knorpelgewebe ist weder mit Nerven versorgt noch ist es von Gefäß- oder Lymphsystemen durchzogen. Im ausgewachsenen Gelenk von Erwachsenen ist jedoch das darunterliegende subchondrale Knochengewebe, das eine dünne durchgehende Platte zwischen dem Knochengewebe und dem Knorpel bildet, mit Nerven und Gefäßen versorgt. Unter dieser Knochenplatte bildet das Knochengewebe Trabeculae, welche das Mark enthalten. In nicht ausgewachsenen Gelenken liegen unter dem Gelenkknorpel lediglich primäre Knochentrabeculae. Auch ein Teil des Meniskusgewebes in Gelenken besteht aus Knorpel, dessen Zusammensetzung ähnlich ist wie die des Gelenkknorpels [Beaupre, A., et al., Clin. Orthop. Rel. Res., (1986), S. 72-76].
Man kennt zwei Typen von Defekten oder Schäden im Knorpelgewebe, d.h. Defekte innerhalb der ganzen Schicht und oberflächliche Defekte. Diese Defekte unterscheiden sich nicht nur im Ausmaß der physischen Schädigung des Knorpels, sondern auch in der Art der Reparaturantwort, die durch den jeweiligen Typ des Defektes ausgelöst wird.
Defekte innerhalb der ganzen Schicht reichen bis zum subchondralen Knochen und können zu schweren Schmerzen führen, da die Knochenplatte sensorische Nervenendigungen enthält. Solche Defekte entstehen im allgemeinen in Folge schwerer Verletzungen oder in späten Stadien einer degenerativen Gelenkerkrankung, wie z.B. Osteoarthritis. Defekte innerhalb der ganzen Schicht können gelegentlich zu Blutungen und zur Induktion einer Reparaturreaktion im subchondralen Knochen führen [Buckwalter et al., "Articular Cartilage: Composition, Structure, Response to Injury, and Methods of Facilitating Repair", in Articular Cartilage and Knee Joint Function: Basic Science and Arthroscopy (Raven Press, New York, 1980), S. 19-56]. Das gebildete Reparaturgewebe ist ein Knorpel vom Gefäß-durchzogenen Faser-Typ mit unzulänglichen biomechanischen Eigenschaften, der einer langfristigen Beanspruchung nicht gewachsen ist [Buckwalter et al. (1990), a.a.O.]
Oberflächliche Defekte im Gelenkknorpelgewebe sind auf das Knorpelgewebe selbst beschränkt. Solche Defekte sind gefürchtet, da sie nicht verheilen und keine Reparaturreaktionen induzieren.
Diese Defekte können sich als Fissuren, Risse oder Furchen in der Oberfläche des Knorpels zeigen oder sie können im befallenen Gewebe wie "Krabbenfleisch" erscheinen. Hier sind keine blutenden Gefäße (Blutflecken) enthalten, wie man sie bei den innerhalb der ganzen Schicht ausgedehnten Defekten sieht. Oberflächliche Defekte können ohne bekannte Ursache auftreten, häufig jedoch sind sie das Ergebnis von mechanischen Störungen, die zu einer Abnützung des Knorpelgewebes führen. Die Ursache der mechanischen Störungen können eine Verletzung des Gelenkes, z.B. eine Verlagerung von eingerissenem Meniskusgewebe in das Gelenk, eine Meniskektomie, eine Lockerung des Gelenkes durch ein gerissenes Band, eine Frakturfehlstellung des Gelenkes oder ein Knochenbruch, oder auch Erbkrankheiten sein. Außerdem sind oberflächliche Defekte in den frühen Stadien von degenerativen Gelenkerkrankungen, wie z.B. Osteoarthritis, charakteristisch. Da das Knorpelgewebe nicht mit Nerven [Ham's Histology (9. Auflage), (J. B. Lippincott Co., Philadelphia, 1987), S. 266-272] oder Blutgefäßen versorgt ist, sind oberflächliche Defekte nicht schmerzhaft. Oberflächliche Defekte können jedoch trotz der Schmerzfreiheit nicht verheilen und degenerieren häufig zu Defekten, die sich dann auf die ganze Schicht ausdehnen.
Allgemein besteht die Meinung, daß das geschädigte Knorpelgewebe aufgrund des Fehlens eines Gefäßsystems im Gelenkknorpel keine ausreichenden oder nicht die richtigen Stimuli erhält, um eine Reparaturantwort auszulösen [Webber et al., "Intrinsic Repair Capabilities of Rabbit Meniscal Fibrocartilage: A Cell Culture Model", (30. Jahr. Orthop. Res. Soc., Atlanta, Feb. 1984); Webber et al., J. Orthop. Res. 3 (1985), 36-42]. Eine Theorie sagt, daß die Chondrocyten im Knorpelgewebe normalerweise nicht mit ausreichenden Mengen der Stoffe in Kontakt kommen, die eine Reparatur stimulieren, wie z.B. Wachstumsfaktoren und Fibringerinnsel, die typischerweise in beschädigtem, von Gefäßen durchzogenem Gewebe vorliegen. Ein Verfahren, das eingesetzt wurde, um beschädigtes Knorpelgewebe mit Reparaturstimuli in Kontakt zu bringen, bestand darin, durch den Knorpel bis in den subchondralen Knochen zu bohren oder zu kratzen, um auf diese Weise eine Blutung auszulösen [Buckwalter et al., (1990), a.a.O.]. Unglücklicherweise ist die Reparaturantwort auf eine solche operative Verletzung normalerweise mit derjenigen vergleichbar, die bei den Defekten beobachtet wird, die innerhalb der ganzen Schicht ausgedehnt sind und die eine Blutung auslösen, d.h. Erzeugung eines Knorpels vom Faser-Typ, der einer langfristigen Beanspruchung nicht gewachsen ist [Buckwalter et al., (1990), a.a.O.]
Verschiedene Wachstumsfaktoren wurden isoliert und sind nun für die Forschung und für biomedizinische Anwendungen verfügbar [vgl. z.B. Rizzino, A., Dev. Biol. 130, (1988), 411- 422]. Es wurde beschrieben, daß einige dieser Wachstumsfaktoren, wie z.B. der transformierende Wachstumsfaktor-beta (TGF- ß), in embryonalen Ratten-Mesenchymzellen in vitro die Erzeugung von Knorpel-spezifischen Molekülen, wie z.B. Typ II-Kollagen und Knorpel-spezifischen Proteoglykanen, fördern [z.B. Seyedin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 2267- 2271; Seyedin et al., J. Biol. Chem. 261 (1986), 5693-5695; Seyedin et al., J. Biol. Chem. 262 (1987), 1946-1949]
Bei Millionen von Patienten wurde eine Osteoarthritis diagnostiziert, d.h. diese Patienten leiden an degenerativen
Defekten oder Schäden der Gelenkknorpel. Es gibt auch bereits Patentansprüche auf verschiedene Verfahren zur Anregung einer Reparaturantwort in beschädigtem Knorpel, jedoch hat sich keine dieser Behandlungen wirklich bewährt [Buckwalter et al., (1990), a.a.O.; Knutson et al., J. Bone and Joint Surg. 68-B (1986), 795; Knutson et al., J. Bone and Joint Surg. 67-B (1985), 47; Knutson et al., Clin. Orthop. 191 (1984), 202; Marquet, Clin. Orthop. 146 (1980), 102]. Außerdem haben solche Behandlungen lediglich eine vorübergehende Besserung gebracht. Auch die systemische Anwendung von "knorpelschützenden Mitteln" wurde versucht, um die Progression von Osteoarthritis aufzuhalten und die Schmerzen zu lindern. Jedoch konnte nicht nachgewiesen werden, daß solche Mittel die Wiederherstellung von Schäden und Defekten im Knorpelgewebe fördern.
Bisher bestand die Behandlung von Patienten, die an Osteoarthritis leiden, hauptsächlich darin, die Symptome zu lindern, indem man Schmerzmittel und entzündungshemmende Mittel verabreichte. Ohne eine Behandlung, die eine Wiederherstellung von oberflächlichen Defekten im Gelenkknorpel bewirkt, wird der Knorpel häufig bis zur subchondralen Knochenplatte abgenützt. In dieser Phase der Krankheit, d.h. einer schweren Osteoarthritis, lassen die unaufhörlichen Schmerzen und die signifikante Funktionseinschränkung häufig keine andere Wahl, als das ganze Gelenk zu entfernen und es durch ein künstliches Gelenk aus Metall und/oder Kunststoff zu ersetzen. Zur Zeit werden jährlich etwa eine halbe Million Operationen an Knie und Hüfte durchgeführt, welche die Resektion des Gelenkes und den Ersatz durch ein künstliches Gelenk umfassen [vgl. z.B., Graves, E. J., "1988 Summary; National Hospital Discharge Survey", Advanced Data From Vital and Health Statistics 185 (19. Juni 1990), 1-12]
Aus diesem Grund besteht ein Bedarf an einer zuverlässigen Behandlung von Knorpeldefekten, mit deren Hilfe eine Wiederherstellung und Regeneration von stabilem Knorpel induziert und die Progression von oberflächlichen Knorpeldefekten oder -schäden zu einer schweren Osteoarthritis verhindert werden kann.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung löst die vorstehend angesprochenen Probleme, indem wirksame Arzneimittel bereitgestellt werden, welche die Wiederherstellung von Knorpelschäden bei Menschen und anderen Tieren induzieren. Die Verwendung der erfindungsgemäßen Mittel verhindert auch die Progression von traumatischen Schäden und frühen Formen von Osteoarthritis, die ansonsten zu einer schweren Osteoarthritis mit dauernden Schmerzen und dem Verlust der Gelenkfunktion und möglicherweise sogar zu Resektion und Ersatz des Gelenkes führen würden.
Im allgemeinen Überblick umfassen die Verfahren zur Wiederherstellung von Knorpeldefekten die Füllung oder eine andere Versorgung eines Defektes im Knorpel mit einem erfindungsgemäßen Mittel, umfassend (1) eine biologisch abbaubare Matrix oder ein Matrix-bildendes Material, (2) ein Proliferationsmittel zur Förderung der Proliferation von Reparaturzellen in der Matrix und dem defekten Bereich, und in bestimmten Ausführungsformen (3) ein chemotaktisches Mittel zur Anlockung von Reparaturzellen an die Matrix und den defekten Bereich, und (4) einen transformierenden Faktor in einem geeigneten Freisetzungssystem, welches den transformierenden Faktor zum geeigneten Zeitpunkt freigibt, wodurch die Differenzierung (d.h. Transformation) der Reparaturzellen in der Matrix oder im defekten Bereich in Chondrocyten gefördert wird, welche neues stabiles Knorpelgewebe erzeugen. In einer anderen Ausführungsform kann der transformierende Faktor zu der defekten Stelle zum geeigneten Zeitpunkt getrennt zugesetzt werden.
Die Behandlung von Knorpeldefekten unter Verwendung der erfindungsgemäßen Mittel kann während einer einzigen Arthroskopie oder Operation durchgeführt werden. Nach der Identifizierung des Defektes wird dieser gemäß bestimmten Verfahren in den folgenden Schritten behandelt: 1) Füllung des defekten Bereiches mit einem Enzym, welches die auf der Oberfläche des Defektes vorliegenden Proteoglykane spaltet, (2) Entfernung des Enzyms und (3) Versorgung des Defektes mit einem Mittel, das eine Matrix, ein Proliferationsmittel und einen transformierenden Faktor in einem geeigenten Freisetzungssystem enthält.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die folgende ausführliche Beschreibung dient dem besseren Verständnis der Erfindung. Die nachstehenden Begriffe werden in der Beschreibung verwendet.

Arthroskopie

- bezieht sich hier auf die Verwendung eines Arthroskops zur Untersuchung eines Gelenkes oder zur Durchführung einer Gelenkoperation.

Knorpel

- bezieht sich hier auf eine Art von Bindegewebe, das Chondrocyten enthält, eingebettet in intrazelluläres Material (häufig als "Knorpelmatrix" bezeichnet), das Kollagenfibrillen (hauptsächlich Typ II-Kollagen zusammen mit anderen weniger verbreiteten Typen, wie die Typen IX und XI), verschiedene Proteoglykane (z.B. Chondroitinsulfat-, Keratansulfat- und Dermatansulfatproteoglykane), andere Proteine und Wasser umfaßt. Der hier verwendete Begriff Knorpel umfaßt Gelenk- und Meniskusknorpel. Gelenkknorpel bedeckt die Oberflächen der Knochenabschnitte in den Gelenken und ermöglicht die Bewegung in den Gelenken ohne einen direkten Kontakt von Knochen auf Knochen, hierdurch verhindert er die Abnutzung und Beschädigung der aufeinanderliegenden Knochenoberflächen. Der normale gesunde Gelenkknorpel wird auch größtenteils als "hyalin" beschrieben, d.h. er zeigt das charakteristische Aussehen von mattiertem Glas. Meniskusknorpel findet sich üblicherweise in Gelenken, die sowohl Erschütterung als auch Bewegung ausgesetzt sind. Meniskusknorpel liegt z.B. in Kiefer-, Sternoklavikular-, Akromioklavikular-, Hand- und Kniegelenken vor [Gray's Anatomy (Bounty Books, New York, 1977)].

Faktor, der die Haftwirkung von Zellen fördert

- bezieht sich hier auf eine Verbindung oder ein Mittel, umfassend Fibronectin und andere kleine Peptide, wie z.B. Tetrapeptide, die das Tripeptid Arg-Gly-Asp umfassen, welches die Haftwirkung von Zellen an extrazelluläres Material vermittelt [Ruoslathi et al., Cell 44 (1986), 517-518].

Chemotaktisches Mittel

- bezieht sich hier auf eine beliebige Verbindung oder ein beliebiges Mittel, umfassend Peptide, Proteine, Glykoproteine und Glykosaminoglykanketten, das befähigt ist, in Standard-in vitro-Chemotaxistests Zellen anzulocken [z.B., Wahl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 5788-5792; Postlewaite et al., J. Exp. Med. 165 (1987), 251-256; Moore et al., Int. J. Tiss. Reac. XI (1989), 301-307].

Chondrocyten

- bezieht sich hier auf Zellen, die befähigt sind, Komponenten von Knorpelgewebe zu produzieren, wie z.B. Typ II-Knorpelfibrillen und -fasern sowie Proteoglykane.

Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF)

- ein beliebiges Mitglied der Familie von FGF-Polypeptiden [Gimenez-Gallego et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 135 (1986), 541-548; Thomas et al., Trends Biochem. Sci. 11 (1986), 81-84] oder Derivate davon, erhalten aus natürlichen, synthetischen oder rekombinanten Quellen, das die Fähigkeit aufweist, in vitro die DNA-Synthese und die Zellteilung [für den Test vgl. z.B., Gimenez-Gallego et al. (1986), a.a.O.; Canalis et al., J. Clin. Invest. 81 (1988), 1572-1577] verschiedener Zellen zu stimulieren, einschließlich primärer Fibroblasten, Chondrocyten, Gefäß- und Kornea-Endothelzellen, Osteoblasten, Myoblasten, glatter Muskel- und Gliazellen [Thomas et al. (1986), a.a.O.]. Die FGFs können, abhängig von ihren isoelektrischen Punkten (pI), als saurer (aFGF) oder basischer FGF (bFGF) klassifiziert werden.

Matrix

- bezieht sich hier auf eine poröse, zusammengesetzte, feste oder halbfeste biologisch abbaubare Substanz, die Poren oder Zwischenräume besitzt, die groß genug sind, daß Zellen die Matrix besiedeln können. Der Begriff Matrix umfaßt Matrix-erzeugende Stoffe, d.h. Stoffe, die im defekten Bereich des Knorpels Matrizes erzeugen können. Bei den Matrix-erzeugenden Stoffen kann zur Erzeugung einer Matrix der Zusatz eines Polymerisationsmittels erforderlich sein, z.B. der Zusatz von Thrombin zu einer Lösung, die Fibrinogen enthält, wodurch eine Fibrinmatrix erzeugt wird.

Proliferationsmittel (mitogen)

- bezieht sich hier auf eine beliebige Verbindung oder ein beliebiges Mittel, umfassend Peptide, Proteine und Glykoproteine, die/das befähigt ist, die Proliferation von Zellen in vitro zu stimulieren. In vitro-Tests zur Bestimmung der Proliferationsaktivität (mitogen) von Peptiden, Polypeptiden und anderen Verbindungen sind dem Fachmann wohlbekannt [vgl. z.B. Canalis et al., J. Clin. Invest. (1988), 1572-1577; Gimenez-Gallego et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 135 (1986), 541-548; Rizzino, "soft Agar Growth Assays for Transforming Growth Factors and Mitogenic Peptides", in Methods Enzymol. 146A (Academic Press, New York, 1987), S. 341-352; Dickson et al., "Assay of Mitogen-Induced Effects on Cellular Incorporation of Precursors for Scavengers, de Novo and Net DNA Synthesis", in Methods Enzvmol. 146A (Academic Press, New York, 1987), 5. 329-340]. Ein Standardverfahren zur Bestimmung der Proliferationsaktivität (mitogen) einer Verbindung oder eines Mittels besteht darin, sie (es) in vitro auf ihre (seine) Fähigkeit zur Induktion von Wachstum, das von Verankerung unabhängig ist, von nichttransformierten Zellen in Weichagar zu testen [z.B., Rizzino (1987), a.a.O.]. Auch andere Testsysteme zur Bestimmung der mitogenen Aktivität sind bekannt [z.B., Gimenez-Gallego et al., (1986), a.a.O., Canalis et al., (1988), a.a.O.; Dickson et al., (1987), a.a.O.].

Reparaturzelle

- bezieht sich hier auf eine Zelle, die sich bei Kontakt mit geeigneten Stimuli differenziert und in einen Chondrocyten transformiert wird. Reparaturzellen umfassen Mesenchymzellen, Fibroblasten, Fibroblasten-ähnliche Zellen, Makrophagen und entdifferenzierte Chondrocyten.

Transformierender Faktor

- bezieht sich hier auf ein beliebiges Peptid, Polypeptid, Protein oder eine beliebige andere Verbindung oder ein beliebiges Mittel, die/das die Differenzierung einer Reparaturzelle in einen Chondrocyten induziert. Die Fähigkeit der Verbindung oder des Mittels, die Erzeugung von Knorpel-spezifischen Proteoglykanen und Typ II- Kollagen durch Zellen zu induzieren oder zu stimulieren, kann durch Tests bestimmt werden, die dem Fachmann bekannt sind [Seyedin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 2267- 2271; Seyedin et al., Path. Immunol. Res. 7 (1987) , 38-42]

Transformierender Wachstumsfaktor-beta (TGF-ß)

- ein beliebiges Mitglied der Familie von TGF-ß-Polypeptiden [Derynck, R., et al., Nature 316 (1985), 701-705; Roberts et al., "The transforming growth factor-ß's", in Peptide Growth Factors and their Receptors I (Springer Verlag, Berlin, 1990), S. 419] oder Derivate davon, erhalten aus natürlichen, synthetischen oder rekombinanten Quellen, das die charakteristische TGF-ß- Fähigkeit zeigt, normale Rattennieren(NRK)-Zellen in einem Weichagartest [Roberts et al., (1984), a.a.O.] zum Wachstum und zur Erzeugung von Kolonien zu stimulieren, und das befähigt ist, die Transformation von Reparaturzellen in Chondrocyten zu induzieren, dies zeigt sich anhand der Fähigkeit, die Erzeugung von Knorpel-spezifischen Proteoglykanen und Typ II- Kollagen durch Zellen in vitro zu induzieren oder zu stimulieren [Seyedin et al., (1985), a.a.O.]
Diese Erfindung betrifft Mittel zur Behandlung von Defekten oder Schäden im Knorpel. Die erfindungsgemäßen Mittel umfassen eine biologisch abbaubare Matrix mit Poren, die ausreichend groß sind, um die Besiedlung der Matrix mit Reparaturzellen zuzulassen. Außerdem enthält die Matrix ein Proliferationsmittel, um die Proliferation von Reparaturzellen in der Matrix zu stimulieren. Vorzugsweise dient das Proliferationsmittel auch als chemotaktisches Mittel, um Reparaturzellen an die Matrix anzulocken. In einer anderen Ausführungsform kann die Matrix zusätzlich zum Proliferationsmittel ein chemotaktisches Mittel enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung enthält die Matrix außerdem eine geeignete Konzentration eines transformierenden Faktors, wobei der transformierende Faktor in einem Freisetzungssystem enthalten ist oder in Verbindung mit einem Freisetzungssystem vorliegt, welches den transformierenden Faktor zum geeigneten Zeitpunkt freigibt, wodurch die proliferierten Reparaturzellen in der Matrix in Chondrocyten transformiert werden, welche stabiles Knorpelgewebe erzeugen. Die Matrix kann auch einen Faktor zur Förderung der Haftwirkung von Zellen enthalten.
Matrixstoffe, die in den erfindungsgemäßen Mitteln zur Füllung oder anderweitigen Versorgung des Defektes im Knorpel nützlich sind, umfassen Fibrinogen (aktiviert mit Thrombin, wodurch im Defekt oder Schaden Fibrin gebildet wird), Kollagen, Sepharose, Gelatine und jedes beliebige andere biologisch abbaubare Material, das eine Matrix mit Poren erzeugt, die ausreichend groß sind, um die Besiedlung der Matrix mit Reparaturzellen und deren Proliferation innerhalb der Matrix zuzulassen, und das während des Reparaturprozesses abgebaut und durch Knorpel ersetzt werden kann.
Die in den erfindungsgemäßen Mitteln nützlichen Matrizes können vorher hergestellt oder in situ erzeugt werden, z.B. durch Polymerisation von Verbindungen und Mitteln, wie z.B. Fibrinogen zur Erzeugung einer Fibrinmatrix. Matrizes, die vorher erzeugt werden können, umfassen Kollagen (z.B. Kollagenschwämme und Kollagenvlies), chemisch modifiziertes Kollagen, Gelatineperlen oder -schwämme, eine Gel-erzeugende Subso stanz, wie z.B. Sepharose, eine beliebige andere Gel-erzeugende oder zusammengesetzte Substanz, die aus biologisch abbaubarem Material besteht, das den Defekt füllt und die Besiedlung der Matrix mit Reperaturzellen zuläßt, oder Gemische der vorstehenden Stoffe.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wird die Matrix unter Verwendung eines Matrix-erzeugenden Stoffes erzeugt, vorzugsweise einer Fibrinogenlösung, die kurz vor Verwendung mit Thrombin versetzt wird, um die Polymerisation in Gang zu setzen. Eine Fibrinogenkonzentration von 0,5 bis 5 mg/ml in wäßriger Pufferlösung kann verwendet werden. Vorzugsweise wird eine Fibrinogenlösung von 1 mg/ml in wäßriger Pufferlösung eingesetzt. Durch die Polyrnerisation dieser Fibrinogenlösung im defekten Bereich entsteht eine Matrix mit Poren, die ausreichend groß sind (z.B. etwa 50 bis 200 um), um die Besiedlung der Matrix mit den Reparaturzellen und deren Proliferation zuzulassen, wodurch das von der Matrix eingenommene Defektvolumen aufgefüllt wird. Vorzugsweise wird die Fibrinogenlösung erst kurz vor der Verabreichung mit einer ausreichenden Menge Thrombin versetzt, damit dem Operateur genügend Zeit bleibt, das Material in den Defektbereich einzubringen, bevor die Polymerisation vollständig abläuft. Typischerweise sollte eine Thrombinkonzentration verwendet werden, bei der die Polymerisation innerhalb weniger bis mehrerer (2 bis 4) Minuten stattfindet, denn es wurde gezeigt, daß ein längerer Kontakt des Knorpels mit Luft zu einer Schädigung führt [Mitchell et al., J. Bone Joint Surg. 71A, (1989), 89- 95]. Thrombin sollte nicht in großen Mengen eingesetzt werden, da es Wachstumsfaktormoleküle spalten und inaktivieren kann. Für die Zugabe zur Fibrinogenlösung können Thrombinlösungen von 10 bis 500 Einheiten pro ml, vorzugsweise 100 Einheiten pro ml, in wäßriger Pufferlösung zubereitet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung werden etwa 200 Sekunden vor Auffüllen des Defektes pro ml Fibrinogenlösung (1 mg/ml) etwa 20 ul Thrombinlösung (100 E/ml) zugemischt. Die Polymerisation geht langsamer vor sich, wenn eine niedrigere Thrombinkonzentration zugesetzt wird. Selbstverständlich kann die Menge der Thrombinlösung, die zum Erreichen der Fibrinpolymerisation innerhalb von 2 bis 4 Minuten nötig ist, nur ungefähr angegeben werden, da sie von der Umgebungstemperatur, der Temperatur der Thrombinlösung, der Temperatur der Fibrinogenlösung usw. abhängt. Die Polymerisation der Thrombin-aktivierten Matrixlösung, die den Defekt füllt, kann einfach überwacht werden, indem man die Thrombin-induzierte Polymerisation einer externen Probe der Fibrinogenlösung beobachtet. Vorzugsweise werden in den erfindungsgemäßen Mitteln die Fibrinmatrizes aus autologen Fibrinogenmolekülen erzeugt, d.h. Fibrinogenmolekülen, die aus dem Blut der gleichen Säugerart stammen, die auch behandelt werden soll. Auch kann nichtimmunogenes Fibrinogen von anderen Arten verwendet werden.
Wenn Kollagen als Matrixmaterial eingesetzt wird, können ausreichend viskose Lösungen hergestellt werden, indem z.B. collagen-VliessR ("Fleece") oder Gelatine-Blut-Gemische verwendet werden, wobei kein Polymerisationsmittel nötig ist. Außerdem können Kollagenmatrizes zusammen mit einer Fibrinogenlösung eingesetzt werden, die mit einem Polymerisationsmittel aktiviert wird, so daß eine kombinierte Matrix erhalten wird.
Polymerisationsmittel können auch entbehrlich sein, wenn zur Erzeugung der Matrix andere biologisch abbaubare Verbindungen verwendet werden. Z.B. können Sepharose-Lösungen ausgewählt werden, die bei 39 bis 42ºC flüssige Matrixlösungen darstellen und bei 35 bis 38ºC fest (d.h. Gel-ähnlich) werden. Die Sepharose sollte auch in solchen Konzentrationen vorliegen, daß das Gel, das den Knorpeldefekt ausfüllt, ausreichend große Maschen aufweist, um die Besiedlung der Matrix und des Defektbereiches mit Reparaturzellen zuzulassen.
In den erfindungsgemäßen Mitteln können zur Matrixlösung ein oder mehrere Proliferationsmittel (mitogen) zugesetzt werden. Das oder die Proliferationsmittel sollte(n) in einem geeigneten Konzentrationsbereich vorliegen, damit es (sie) die Proliferation der Reparaturzellen in der den Defekt füllenden Matrix bewirkt (bewirken) (vgl. Abschnitt Beispiele). Vorzugsweise sollte dasselbe Mittel auf die Zellen auch chemotaktisch wirken (wie im Fall von TGF-ß); jedoch kann auch ein Faktor eingesetzt werden, der ausschließlich proliferativ wirkt. In einer anderen Ausführungsform können zwei verschiedene Mittel verwendet werden, um eine chemotaktische Einwanderung der Zellen zu bewirken und anschließend die Zellproliferation zu induzieren, wobei jedes Mittel nur eine dieser spezifischen Wirkungen besitzt (entweder die chemotaktische oder die proliferative Wirkung).
Proliferationsmittel (mitogen), die in den erf indungsgemäßen Mitteln nützlich sind, um die Proliferation von Reparaturzellen zu stimulieren, umfassen transformierende Wachstumsfaktoren ("TGFs"), wie z.B. TGF-αs und TGF-ßs, den Insulinähnlichen Wachstumsfaktor ("IGF I"), saure oder basische Fibroblasten-Wachstumsfaktoren ("FGFs"), den aus Thrombocyten stammenden Wachstumsfaktor ("PDGF"), den epidermalen Wachstumsfaktor ("EGF") und hämatopoetische Wachstumsfaktoren, wie z.B. Interleukin 3 ("IL-3") [Rizzino, (1987), a.a.O.; Canalis et al., (1988), a.a.O.; Growth factors in biology and medicine, Ciba Foundation Symposium, 116 (John Wiley & Sons, New York, 1985); Baserga, R., Hrsg., Cell qrowth and division (IRL-Press, Oxford, 1985); Sporn, M. A., und Roberts, A. B., Hrsg., Peptide growth factors and their receptors, Bd. I und II (Springer-Verlag, Berlin, 1990)]. Diese besonderen Beispiele sollen jedoch in keiner Weise den Umfang der Patentansprüche einschränken. In dieser Erfindung ist jede beliebige Verbindung als Proliferationsmittel nützlich, die zur Stimulierung der Proliferation von Zellen befähigt ist, dies wird durch einen in vitro-Zellproliferationstest gezeigt. Solche Tests sind dem Fachmann bekannt [z.B. Canalis et al., (1988) a.a.O.; Gimenez-Gallego et al., (1986), a.a.O.; Dickson et al., (1987), a.a.O.; Rizzino, (1987), a.a.O.]
Chemotaktische Agentien, die in den erf indungsgemäßen Mitteln zur Anlockung von Reparaturzellen nützlich sind, umfassen z.B. TGF-ßs, FGFs (saure oder basische FGFs), PDGF, Tumornekrosefaktoren (z.B. TNF-α, TNF-ß) und Proteoglykan- Spaltprodukte, wie z.B. Glykosaminoglykanketten [Roberts et al., (1990), a.a.O.; Growth factors in biology and medicine, Ciba Foundation Symposium, 116 (John Wiley & Sons, New York, 1985); R. Baserga, Hrsg., Cell growth and division (IRL Press, Oxford, 1985)]. Tests zur Bestimmung der chemotaktischen Fähigkeit von Polypeptiden und anderen Verbindungen sind dem Fachmann bekannt [z.B. Postlewaite et al., (1987), a.a.O.; Wahl et al., (1987), a.a.O.; Moore et al., (1989), a.a.O.]
In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung enthält die Matrix TGF-ß als Proliferationsmittel und als chemotaktisches Mittel. Insbesondere können TGF-ßIII oder TGF- ßII als Proliferations- und chemotaktisches Mittel eingesetzt werden. Auch andere TGF-ß-Formen (z.B. TGF-ßIII, TGF-ßIV, TGF- ßV usw.) oder Polypeptide mit TGF-ß-Aktivität [vgl. Roberts, (1990), a.a.O.] können für diesen Zweck nützlich sein, außerdem weitere Formen dieser Substanz, die vielleicht in Zukunft gefunden werden, sowie andere Wachstumsfaktoren. Bei Verwendung als Proliferationsmittel und chemotaktisches Mittel werden die TGF-ß-Moleküle in der Matrix in einer Konzentration von vorzugsweise 2 bis 50 ng/ml Matrixlösung, am stärksten bevorzugt 2 bis 10 ng/ml Matrixlösung, gelöst oder suspendiert. Selbstverständlich kann die bevorzugte Konzentration von TGF- ß, welche die Proliferation von Reparaturzellen stimuliert, entsprechend dem jeweils zu behandelnden Tier verändert werden.
In der Matrixlösung können außerdem ein transformierender Faktor oder transformierende Faktoren vorliegen, wobei der transformierende Faktor nach Besiedlung der Matrix mit den Reparaturzellen in den Defektbereich in einer Konzentration freigesetzt wird, die ausreichend ist, um die Differenzierung (d.h. Transformation) der Reparaturzellen in die neues stabiles Knorpelgewebe erzeugenden Chondrocyten zu fördern. Der richtige Zeitpunkt zur Freisetzung des transformierenden Faktors ist besonders dann wichtig, wenn der transformierende
Faktor die Wirksamkeit des Proliferationsmittels hemmen oder beeinträchtigen kann [vgl. Roberts et al., (1990), a.a.0.].
Transformierende Faktoren, die in den erfindungsgemäßen Mitteln nützlich sind, umfassen ein beliebiges Peptid, Polypeptid, Protein oder eine beliebige andere Verbindung oder ein beliebiges anderes Mittel, welche(s) die Differenzierung von Reparaturzellen in Chondrocyten induzieren, die Knorpel-spezifische Proteoglykane und Typ II-Kollagen erzeugen. Die Fähigkeit einer Verbindung oder eines Mittels, die Erzeugung von Knorpel-spezifischen Proteoglykanen und Typ II-Kollagen in Zellen zu induzieren oder zu stimulieren, kann mit Hilfe von Tests bestimmt werden, die dem Fachmann bekannt sind [z.B. Seyedin et al., (1985), a.a.O.; Seyedin et al., (1987), a.a.O.] . Die transformierenden Faktoren, die in den erfindungsgemäßen Mitteln nützlich sind, umfassen z.B. TGF-ßs, TGF- αS und FGFS (saure oder basische FGFS). Diese transformierenden Faktoren können alleine oder in Kombination eingesetzt werden. Außerdem kann TGF-ß in Kombination mit EGF verwendet werden.
Die Freisetzung des transformierenden Faktors zum richtigen Zeitpunkt kann erreicht werden, indem der transformierende Faktor in oder mit einem geeigneten Freisetzungssystem verpackt wird. Freisetzungssysteme, die in den erfindungsgemäßen Mitteln nützlich sind, umfassen Liposomen, biologisch zersetzbare Polymere, auf Kohlenhydraten basierende Partikel, Fasern, wie z.B. Kollagen, die chemisch verknüpft sind mit Heparinsulfatproteoglykanen oder anderen solchen Molekülen, an die transformierende Faktoren spontan binden, sowie osmotische Pumpen. Freisetzungssysteme, wie z.B. Liposomen, biologisch zersetzbare Polymere, Fasern mit gebundenen transformierenden Faktoren und auf Kohlenhydraten basierende Partikel, die das transformierende Mittel enthalten, können mit der zur Füllung des Defektes verwendeten Matrixlösung gemischt werden. Diese Systeme sind dem Fachmann bekannt und allgemein verfügbar [vgl. P. Johnson und J. G. Lloyd-Jones, Hrsg., Drum Delivery Systems (Ellis Horwood Ltd., Chichester, England, 1987)]. Liposomen können gemäß dem Verfahren von Kim et al., Biochem. Biophys. Acta 728 (1983), 339-348, hergestellt werden. Zur Herstellung von Liposomen können aber auch andere Verfahren verwendet werden. Außerdem können zu dem Freisetzungssystem zusammen mit dem transformierenden Faktor weitere Faktoren zugesetzt werden, welche die Synthese von Knorpelgewebe durch die Chondrocyten stimulieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung enthält die Matrix TGF-ß als Proliferations- und chemotaktisches Mittel, außerdem enthält sie als transformierenden Faktor TGF-ß, der in einem Freisetzungssystem verpackt ist. Insbesondere können TGF-ßI oder TGF-ßII als Proliferations- und chemotaktisches Mittel und als transformierender Faktor verwendet werden. Auch andere TGF-ß-Formen (z.B. TGF-ßIII, TGF- ßIV, TGF-ßV usw.) oder Polypeptide mit TGF-ß-Aktivität [vgl. Roberts, (1990), a.a.O.] können für diesen Zweck nützlich sein, außerdem andere Formen dieser Substanz, die vielleicht in Zukunft gefunden werden, sowie andere Wachstumsfaktoren.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine TGF-ß-Konzentration von vorzugsweise 2 bis 50 ng/ml Matrixlösung, am stärksten bevorzugt 2 bis 10 ng/ml Matrixlösung, als Proliferationsmittel und als chemotaktisches Mittel verwendet. In der Matrixzusammensetzung liegt außerdem eine wesentlich höhere Konzentration von TGF-ß als transformierender Faktor in einer Form vor, daß er später freigesetzt wird. Die spätere Konzentration von TGF-ß liegt vorzugsweise über 200 ng/ml Matrix und am stärksten bevorzugt über 500 ng/ml Matrix. Selbstverständlich kann die bevorzugte Konzentration von TGF-ß, welche die Differenzierung von Reparaturzellen induziert, entsprechend dem jeweils zu behandelnden Tier verändert werden.
Die Reparaturzellen müssen nacheinander mit den zwei Konzentrationsbereichen von TGF-ß in Kontakt kommen, da TGF-ß bei relativ hohen Konzentrationen (z.B. über 200 ng/ml Matrixlösung) nicht nur die Transformation von Reparaturzellen in Chondrocyten bewirkt, sondern auch die chemotaktische Anlockung von Reparaturzellen hemmt; wohingegen TGF-ß bei relativ niedrigen Konzentrationen (z.B. 2 bis 10 ng/ml) zwar die Reparaturzellen anlockt und ihre Proliferation stimuliert, nicht jedoch die Transformation von Reparaturzellen in die Knorpelgewebe-erzeugenden Chondrocyten induziert.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt TGF-ß sowohl in freier nichtverkapselter Form als auch in verkapselter oder anderweitig sequestrierten Form in der Matrix vor, auf diese Weise kann die gewünschte Reihenfolge von Chemotaxis und Proliferation und darauf folgender Transformation eingehalten werden. Die TGF-ß-Moleküle werden in der Matrix zwecks Anlockung und Induktion der Proliferation von Reparaturzellen in Matrix und Defektbereich vorzugsweise in einer Konzentration von 2 bis 10 ng/ml Matrixlösung gelöst oder suspendiert. Zur Förderung der Transformation von Reparaturzellen in Chondrocyten in der Matrix können die TGF-ß-Moleküle in der Matrix außerdem verkapselt in multivesikulären Liposomen vorliegen, wobei das Verfahren von Kim et al., 1983, a.a.O., verwendet und eine Konzentration von über 200 ng/ml Matrixlösung, vorzugsweise eine Konzentration von über 500 ng/ml, eingesetzt wird. Die mit TGF-ß beladenen Liposomen werden aufgeschlossen, sobald die angelockten Reparaturzellen die Matrix besiedelt und mit dem Abbau der Matrix begonnen haben. Während des Abbaus der Matrix nehmen die Reparaturzellen die Liposomen auf und/oder spalten sie, wodurch TGF-ß in ausreichend hohen Konzentrationen freigesetzt wird, wodurch die Transformation von Reparaturzellen in Chondrocyten bewirkt wird.
Die erforderliche zweistufige Freisetzung von TGF-ß einerseits in chemotaktischen und proliferierenden Konzentrationen und andererseits in transformierenden Konzentrationen kann auch erreicht werden, indem man transformierende Konzentrationen von TGF-ß mit einem biologisch zersetzbaren Polymer kombiniert. In einer anderen Ausführungsform kann eine Pumpe, vorzugsweise eine implantierte osmotische Pumpe verwendet werden, um die Konzentration von TGF-ß in dem Defekt und der Matrix zu kontrollieren. In dieser Ausführungsform der Erfindung kontrolliert die Pumpe die Konzentration von TGF-ß in der Matrix, d.h. die Pumpe kann TGF-ß anfangs in einer Konzentration, die chemotaktisch und stimulierend auf die Proliferation wirkt, und anschließend in einer transformierenden Konzentration freisetzen. Die transformierende Konzentration von TGF-ß wird vorzugsweise etwa ein bis zwei Wochen nach der Operation durch die Pumpe freigesetzt. Die Freisetzung des transformierenden Faktors in das Defektvolumen findet vorzugsweise in der Matrix im Defektbereich statt.
Die Proliferationsmittel und, sofern eingesetzt, die transformierenden Faktoren in den erfindungsgemäßen Mitteln werden in die biologisch abbaubare Matrix im Defektbereich eingebracht. Sie liegen somit nur in einem sehr begrenzten Bereich vor. Dies wird so gehandhabt, um die freie Injektion oder Infusion dieser Substanzen ins Innere des Gelenkes zu vermeiden. Eine solche freie Infusion kann zu der nachteiligen Wirkung führen, daß die Zellen der Synovialmembran stimuliert werden, einen Gelenkerguß zu erzeugen.
Fibronectin oder eine beliebige andere Verbindung, einschließlich kleiner Peptide, wie Tetrapeptide, welche die Aminosäuresequenz Arg-Gly-Asp enthalten, können als Faktoren zur Förderung des Haftwirkung von Zellen eingesetzt werden [Ruoslathi et al., (1986), a.a.O.], um die anfängliche Haftwirkung der Reparaturzellen an die in die Defektstelle eingebrachte Matrix zu steigern. Fibrin- und bestimmte Kollagenmatrizes enthalten diese Sequenz bereits [Ruoslathi et al., (1986), a.a.O.]. Wenn andere biologisch abbaubare Matrizes eingesetzt werden, können solche die Haftwirkung der Zellen fördernden Faktoren mit dem Matrixmaterial gemischt werden, bevor die Matrix in den Defekt eingebracht wird. Außerdem können Peptide, die Arg-Gly-Asp enthalten, an das Matrixmaterial (z.B. an dessen Fasern oder Maschen) oder an eine zur Matrix zugegebenen Verbindung, wie z.B. Albumin, chemisch gekoppelt werden.
Die vorstehend beschriebenen Mittel sind in Verfahren nützlich, in denen sie die Erzeugung von Knorpel an einer ausgewählten Stelle eines Defektes oder eines Schadens im Knorpelgewebe eines Tieres induzieren.
Die erfindungsgemäßen Mittel stellen eine Behandlung von Knorpeldefekten in Tieren, einschließlich Menschen, bereit, deren Verabreichung einfach ist und die auf den befallenen Gelenkbereich beschränkt bleibt. Die gesamte Behandlung kann in einer einzigen Arthroskopie oder offenen Operation durchgeführt werden.
Zur Durchführung der Verfahren zur Behandlung von Defekten oder Schäden im Knorpel wird ein Defekt oder Schaden identifiziert, präpariert und mit einer biologisch abbaubaren Matrixzusammensetzung gemäß dieser Erfindung aufgefüllt. Ein Proliferationsmittel (mitogen) liegt in der Matrixzusammensetzung in geeigneter Konzentration vor, um die Proliferation von Reparaturzellen in der Matrix und im Defekt oder Schaden zu stimulieren. Das gleiche Mittel kann in dieser Konzentration auch als chemotaktisches Mittel zur Anlockung von Reparaturzellen dienen, vorausgesetzt der eingesetzte Faktor weist eine kombinierte Wirkung bezüglich Zellproliferation und Chemotaxis auf (wie das bei TFG-ß bei 2 bis 10 ng/ml Matrix der Fall ist) . In einer anderen Ausführungsform können zwei verschiedene Mittel vorliegen, eines mit spezifischer proliferativer Wirkung und das andere mit spezifischer chemotaktischer Wirkung. In einer anderen Ausführungsform kann (können) das proliferative Mittel und, falls gewünscht, ein chemotaktisches Mittel nach Auffüllen des Defektbereichs mit der biologisch abbaubaren Matrix direkt in den mit Matrix gefüllten Defektbereich injiziert werden.
In einem darauffolgenden Schritt werden die Reparaturzellen in der Matrix zum geeigneten Zeitpunkt mit einem transformierenden Faktor bei einer Konzentration in Kontakt gebracht, die ausreichend groß ist, um die Transformation der Reparaturzellen in die stabiles Knorpelgewebe erzeugenden Chondrocyten zu bewirken. Dies kann erreicht werden, indem ein geeignetes Freisetzungssystem, das den transformierenden Faktor enthält, in die Matrixzusammensetzung eingebracht wird, wie vorstehend beschrieben. In einer anderen Ausführungsform kann das transformierende Mittel zum geeigneten Zeitpunkt direkt in den mit Matrix gefüllten Defektbereich injiziert werden. Ein bis zwei Wochen nach der anfangs durchgeführten Implantation der biologisch abbaubaren Matrix in den Defektbereich sollte die transformierende Konzentration bei den Zellen vorliegen. Außerdem können noch weitere Faktoren in das Freisetzungssystem zugegeben oder zu diesem Zeitpunkt direkt injiziert werden, wodurch die Synthese der Knorpelmatrixkomponenten noch besser gefördert wird.
Knorpeldefekte oder -schäden bei Tieren können während einer arthroskopischen Untersuchung des Gelenkes oder während einer einfachen Untersuchung des Schadens oder Defektes bei einer offenen Operation leicht identifiziert werden. Außerdem können Knorpedefekte unter Verwendung von Computertomographie (CAT-Scanning), Röntgenuntersuchung, Kernspintomographie (MRI), Analyse von Synovialflüssigkeit oder Serummarkern oder durch ein beliebiges anderes bekanntes Verfahren identifiziert werden.
Sobald ein Defekt identifiziert wurde, kann der Operateur den Defekt operativ modifizieren, um die physischen Voraussetzungen zu schaffen, daß die Lösungen und das Matrixmaterial, die in den hier beschriebenen Behandlungsverfahren zugegeben werden, innerhalb des Defektes verbleiben. Der Defekt weist anstelle einer flachen oder schwach konkaven Geometrie vorzugsweise senkrechte Kanten auf oder wird entsprechend geformt, oder er wird unterhöhlt, damit die in den hier beschriebenen Behandlungsverfahren zugegebenen Lösungen und Matrixstoffe besser darin verbleiben.
Die Haftwirkung der Matrix kann einerseits durch die vorstehende mechanische Anpassung zur Verbesserung der Haftwirkung der Matrix an den Defektbereich und andererseits auch durch ein chemisches Vorgehen verbessert werden. Ein solches Vorgehen umfaßt den Abbau der oberflächlichen Schichten der Knorpel-Proteoglykane an der Defektoberfläche, wobei die Kollagenfibrillen des Knorpels freigelegt werden und mit den Kollagenfibrillen der Matrix (wenn eine Kollagenmatrix verwendet wird) oder mit den Fibrinfibrillen der Matrix (wenn eine Fibrinmatrix verwendet wird) in Wechselwirkung treten können. Die Proteoglykane auf der Knorpeloberfläche neigen nicht nur dazu, die Haftwirkung einer Fibrinmatrix oder einer anderen biologisch abbaubaren Matrix an den Knorpel zu stören, sondern sie hemmen auch örtlich die Thrombinaktivität. Außerdem können Proteoglykan-Abbauprodukte vorteilhafterweise eine chemotaktische Wirkung auf Reparaturzellen aufweisen [Moore, A. R., et al., Int. J. Tiss. Reac. XI (6) (1989), 301-307].
Ferner kann die Haftwirkung der Matrix an den Knorpeldefekt auch durch Verwendung eines Fibrinklebers gesteigert werden (d.h. Blutfaktor XIII oder Fibrin-stabilisierender Faktor), wodurch die chemische Bindung (Vernetzung) der Matrixfibrillen an die Knorpelkollagenfibrillen auf der Oberfläche des Defektes unterstützt wird [vgl. Gibble et al., Transfusion 30(8) (1990) , 741-747] . Die gleiche Wirkung kann auch erzielt werden, indem das Enzym Transglutaminase verwendet wird [vgl., z.B., Ichinose et al., J. Biol. Chem. 265(23) (1990), 13411- 13414; "Transglutaminase", Hrsg.: V. A. Najjar und L. Lorand, Martinus Nijhoff Publishers, Boston, (1984)]. Außerdem können auch andere Komponenten verwendet werden, die die Haftwirkung von extrazellulären Stoffen fördern.
In einem Verfahren wird die Oberfläche des Defektes durch Abtupfen des Bereiches mit einem sterilen absorbierenden Material getrocknet und der Defektbereich für 2 bis 10 Minuten mit einer sterilen Enzymlösung gefüllt, wodurch die Proteoglykane abgebaut werden, die auf der Oberfläche des Knorpels und lokal innerhalb von 1 bis 2 um Tiefe unterhalb der Defektoberfläche vorliegen. Zum Abbau der Proteoglykane können verschiedene Enzyme, einzeln oder in Kombination, in sterilen gepufferten wäßrigen Lösungen verwendet werden. Der pH-Wert der Lösung sollte zur Optimierung der Enzymaktivität eingestellt werden.
Enzyme, die zur Spaltung der Proteoglykane in den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind&sub7; umfassen Chondroitinase ABC, Chondroitinase AC, Hyaluronidase, Pepsin, Trypsin, Chymotrypsin, Papain, Pronase, Stromelysin und Staph V8-Protease. Die geeignete Konzentration eines bestimmten Enzyms oder einer Enzymkombination hängt von der Aktivität der Enzymlösung ab.
In einem bevorzugten Verfahren füllt man den Defekt mit einer sterilen Lösung von Chondroitinase ABC in einer Konzentration von 1 E/ml und läßt die Spaltung vier Minuten ablaufen. Die bevorzugte Konzentration von Chondroitinase ABC wurde bestimmt, indem man mit einem Elektronenmikroskop Knorpelgewebe aus einem Kaninchengelenk untersuchte, das mit verschiedenen Enzymkonzentrationen verschiedene Zeit spannen lang behandelt worden war, wie in Beispiel 1 beschrieben. Jedes andere Enzym, das verwendet wird, sollte in einer solchen Konzentration und eine solche Zeitspanne eingesetzt werden, so daß lediglich oberflächliche Proteoglykane bis zu einer Tiefe von etwa 1 bis 2 um gespalten werden.
Die Zeitspanne zur Anwendung der Enzymlösung sollte möglichst klein gehalten werden, damit die Spaltung der Proteoglykane hauptsächlich im Reparaturbereich stattfindet. Bei der Chondroitinase ABC in einer Konzentration von 1 E/ml kann eine Spaltungszeit von länger als 10 Minuten zu einem unnötigen und möglicherweise schädlichen Abbau der Proteoglykane außerhalb des Defektbereichs führen. Außerdem verlängern Spaltungszeiten von über zehn Minuten die Gesamtzeit des Verfahrens zu sehr. Die Gesamtzeit des Verfahrens sollte möglichst kurz gehalten werden, insbesondere während einer offenen Arthrotomie, denn Knorpelgewebe kann durch Luftexposition geschädigt werden [Mitchell et al., (1989), a.a.O.]. Aus diesen Gründen sind in den Ausführungsformen der Verfahren, die einen Schritt zur Spaltung von Proteoglykanen durch enzymatischen Abbau umfassen, Spaltungszeiten von weniger als zehn Minuten bevorzugt und Spaltungszeiten von weniger als fünf Minuten am stärksten bevorzugt.
Nachdem die Proteoglykane auf der Oberfläche des Defektes durch das Enzym gespalten wurden, sollte die Enzymlösung aus dem Defektbereich entfernt werden. Die Enzymlösung kann entfernt werden, indem ein mit einer feinen Spitze ausgestattetes Absauggerät eingesetzt und der Bereich anschließend mit Watte abgetupft wird. In einer anderen Ausführungsform kann die Enzymlösung nur durch Abtupfen mit Watte entfernt werden.
Nach Entfernung der Enzymlösung sollte der Defekt gründlich, vorzugsweise dreimal, mit steriler physiologischer Kochsalzlösung (z.B. 0,15 M NaCl) gespült werden. Anschließend sollte die gespülte Defektstelle getrocknet werden. Zur Trocknung der Defektstelle kann steriler Mull oder Watte verwendet werden.
In einer anderen Ausführungsform oder zusätzlich zum Enzymbehandlungsschritt kann die Defektstelle mit einer Verbindung versehen werden, wie z.B. einem Fibrinkleber oder Transglutaminase, um die Haftwirkung der Matrix an die Defektstelle zu steigern. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Fibrinkleber oder die Transglutaminase auf die Defektstelle aufgetragen, nachdem die Defektstelle anschließend an die Enzymbehandlung gespült und getrocknet worden ist.
Sodann wird die Defektstelle mit einem hier beschriebenen erfindungsgemäßen Mittel versehen, wodurch der Defekt vorzugsweise bis zu seinen Ecken mit der Matrixzusammensetzung so aufgefüllt wird, daß eine glatte Fläche erhalten wird. Die Zusammensetzung umfaßt ein Matrixmaterial und ein Proliferationsmittel und, sofern gewünscht, ein chemotaktisches Mittel. Die in diesem Schritt verwendete Zusammensetzung kann außerdem einen transformierenden Faktor enthalten, der in einem geeigneten Freisetzungssystem verpackt ist. Im am stärksten bevorzugten Verfahren enthält die Matrix ein Proliferationsmittel, ein chemotaktisches Mittel (das mit dem Proliferationsmittel identisch sein kann) und einen transformierenden Faktor, der in einem Freisetzungssystem verpackt ist oder damit assoziiert ist, welches den transformierenden Faktor zu einem Zeitpunkt, wenn die die Matrix besiedelnden Reparaturzellen mit dem Umbau der interzellulären Substanz begonnen haben, in einer Konzentration freisetzt, die die Transformation von Reparaturzellen in Chondrocyten bewirkt. Bevorzugte Mittel werden vorstehend beschrieben.
Sofern die Matrix selbst kein Proliferations- und kein chemotaktisches Mittel enthält, kann (können) das (die) Mittel direkt in den mit Matrix gefüllten Defektbereich injiziert werden, wodurch die bevorzugten Konzentrationen zur Förderung von Chemotaxis und Proliferation der Reparaturzellen bereitgestellt werden. Vorzugsweise wird TGF-ß nach Auffüllen des Defektes mit der Matrix lokal in die Matrix injiziert, so daß eine Konzentration von 2 bis 10 ng/ml Matrix erhalten wird. Die Injektion sollte auf den mit Matrix gefüllten Defektbereich beschränkt bleiben, damit der Kontakt von Zellen der Synovialmembran mit Wachstumfaktoren vermieden wird, dies könnte ansonsten zu Zellproliferation und zu einem Gelenkerguß führen.
Nachdem die Defektstelle mit der Matrixzusammensetzung gefüllt (und, im Fall von Fibrinmatrizes, sobald die Matrix fest geworden ist) und, sofern erforderlich, das Proliferationsmittel in die mit Matrix gefüllte Defektstelle injiziert wurde, können Gelenkkapsel- und Hautschnitte wieder geschlossen und die Arthroskopie oder offene Operation beendet werden.
Sofern der transformierende Faktor nicht in der Matrix in einem geeigneten Freisetzungssystem vorliegt, kann er etwa ein bis zwei Wochen nach der Operation direkt in die Matrix, z.B. durch Injektion oder durch eine osmotische Pumpe, in einer ausreichenden Konzentration zugegeben werden, um die Transformation von Reparaturzellen in Chondrocyten zu bewirken. In dieser Ausführungsform der Erfindung wird TGF-ß vorzugsweise etwa eine Woche nach der Operation direkt in die Matrix zugesetzt, so daß eine Konzentration von mehr als 200 ng/ml, stärker bevorzugt mehr als 500 ng/ml Matrix erhalten wird.
Die hier beschriebenen Verfahren zur Wiederherstellung von Defekten in Gelenkknorpel sind am wirkungsvollsten, wenn sich der Defekt nicht bis auf den unter dem Knorpel liegenden Knochen erstreckt. Die hier beschriebenen Verfahren können auch zur Wiederherstellung von Defekten in Meniskusknorpelgewebe eingesetzt werden.
Die folgenden Beispiele dienen dem besseren Verständnis der hier beschriebenen Erfindung. Diese Beispiele dienen lediglich der Erläuterung und sollen in keiner Weise den Umfang der Patentansprüche einschränken.

Beispiel 1

Test des Enzyms zur Entfernung von Proteoglykanen

Die Haftwirkung der Matrix an Defektoberflächen des Gelenkknorpelgewebes kann gefördert und verbessert werden, indem innerhalb der oberflächlichen Knorpelmatrix die Proteoglykanmoleküle enzymatisch entfernt werden, wodurch das Kollagenfibrillen-Netzwerk freigelegt und mit den verabreichten Matrizes und den wandernden Reparaturzellen in Kontakt kommen kann. Für diesen Zweck ist die Verwendung verschiedener Proteasen und Glykosaminoglykan-abbauender Enzyme geeignet, jedoch sollten die pH-Bedingungen kontrolliert werden, damit die maximale Aktivität jedes Enzyms erhalten wird.
In diesem Beispiel wurden Chondroitinase ABC (0,5 bis 5 E/ml) und Trypsin (0,5 bis 4%) auf ihre Fähigkeit getestet, Proteoglykane zu entfernen. Hierfür wurden Kniegelenke von frisch geschlachteten Kaninchen verwendet, die von einem Metzger am Ort erhalten wurden. Mechanisch verursachte oberflächliche Knorpeldefekte wurden eine Zeitspanne von vier Minuten mit den Enzymlösungen in Kontakt gebracht. Anschließend wurden die Enzymlösungen mit einem saugfähigem Papiertuch entfernt und die Defektbereiche gründlich mit physiologischer Kochsalzlösung gespült. Unmittelbar nach diesem Vorgehen wurde das Knorpelgewebe in 2% (Vol./Vol.) Glutaraldehydlösung (gepuffert mit 0,05 M Natriumcacodylat, pH 7,4), die 0,7% (Gew./Vol.) Rutheniumhexamintrichlorid (RHT) enthielt, für die histologische Untersuchung fixiert. Das Nachf ixierungsmedium bestand aus einer 1%igen RHT-Osmiumtetroxidlösung (gepuffert mit 0,1 M Natriumcacodylat). Das Gewebe wurde mit Ethanol in abgestuften Konzentrationen entwässert und sodann in Epon 812 eingebettet. Dünnschnitte wurden angefertigt, mit Uranylacetat und Bleicitrat gefärbt und im Elektronenmikroskop untersucht. In diesen Schnitten erschienen die RHT-fixierten (d.h. gefällten) Proteoglykane als dunkelgefärbte Granula. Diejenigen Enzymkonzentrationen, die eine oberflächliche Proteoglykanschicht von nicht mehr von 1 bis 2 um Dicke entfernten, wurden als optimal definiert (ein tieferes Eindringen der Enzyme könnte die darunterliegenden Chondrocyten beeinträchtigen) . Es wurde gefunden, daß Chondroitinase ABC bei einer Konzentration von etwa 1 E/ml die optimale Aktivität aufweist. Trypsin zeigte bei einer Konzentration von etwa 2,5% die optimale Aktivität. In ähnlicher Weise kann der optimale Aktivitätsbereich für andere Glykosaminoglykanasen oder Proteasen bestimmt werden. Ein beliebiger Puffer kann zusammen mit dem Enzym verwendet werden, vorausgesetzt, er ist nicht toxisch und seine maximale Pufferkapazität liegt bei einem pH-Wert nahe demjenigen Wert, der für die maximale Enzymaktivität erforderlich ist.

Beispiel 2

Haftwirkung der Matrix an oberflächliche Defekten

Die Möglichkeit wurde untersucht, inwieweit sich die Haftwirkung der Matrix an Defektoberflächen durch den kontrollierten enzymatischen Abbau von oberflächlichen Knorpelproteoglykanen steigern läßt. Drei ausgewachsenen Kaninchen wurden an den Kniegelenken durch Einschnitte mit einem Hobelmesser Defekte zugefügt. Diese Defekte wurden nicht mit Enzym behandelt. Die Defekte wurden mit einer Fibrinmatrix gefüllt, die hergestellt wurde, indem etwa 200 Sekunden vor Auffüllen des Defektes pro ml Fibrinogenlösung (1 mg/ml wäßriger Puffer) 20 ul Thrombinlösung (100 E/ml wäßriger Puffer) zugemischt wurden. Die Kaninchen wurden nach einem Monat getötet und die Kniegelenke untersucht, um festzustellen, wie stark die Fibrinmatrix am Defektbereich haftete. Die Ergebnisse wurden mit denjenigen verglichen, die mit Kaninchen erhalten wurden, deren Defekte mit Chondroitinase ABC (1 E/ml, 4 Minuten) behandelt worden waren, bevor sie mit Fibrinmatrix aufgefüllt wurden (vgl. Beispiele 3, 4 und 5).
Die Fibrinmatrizes, welche in die nicht mit Enzym behandelten Defektbereiche gefüllt wurden, zeigten eine geringe Neigung, an der Defektoberfläche zu haften. Nach einer Enzymbehandlung war die Klebefähigkeit der Fibrinmatizes signifikant erhöht (indirekt bestimmt durch Messung der mechanischen Haftfestigkeit, d.h. durch Test, wie leicht sich die Matrix manuell mit der Spitze einer Pinzette abziehen ließ, und außerdem indirekt bestimmt, indem man die Zahl von Defekten notierte, in denen die Matrix während des ganzen Experiments erfolgreich kleben blieb). Die geringe Affinität der Matrizes für die Defektoberflächen ohne eine Enzymbehandlung beruht möglicherweise darauf, daß die Haftwirkung der Matrix durch Proteoglykanmoleküle lokal gehemmt und die Fibrinpolymerisation inhibiert wird. Diese beiden Wirkungen werden verhindert, indem die oberflächlichen Proteoglykane im Bereich der Defektoberfläche enzymatisch entfernt werden.

Beispiel 3

Anwendung von Wachstumsfaktoren auf Defektstellen, um die Einwanderung von Reparaturzellen in die Defektbereiche chemotaktisch zu stimulieren und die Proliferation von Reparaturzellen zu induzieren

Verschiedene Faktoren wurden getestet, inwieweit sie nützlich sind, um die chemotaktische Wanderung von Reparaturzellen in den Defektbereich zu stimulieren, damit diese die Heilung des Defektes bewirken.
Die verwendeten Wachstumfaktoren umfassten a) epidermalen Wachstumfaktor (EGF), b) basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), c) Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor I (IGF I), d) menschliches Wachstumshormon (hGH) und e) transformierenden Wachstumsfaktor ß (TGF-ß) in Konzentrationen zwischen 5 und 10 ng/ml.
Jeder dieser Faktoren wurde lokal auf die im Knie erzeugten Defekte aufgetragen, nachdem die Behandlung mit Chondroitinase ABC und die Spülung wie in Beispiel 2 durchgeführt worden war. Insgesamt wurden zehn Tiere (zwei pro Wachstumsfaktor) eingesetzt. Jeder Wachstumfaktor war befähigt, Reparaturzellen chemotaktisch zu den Defektoberflächen anzulocken oder deren Proliferation lokal zu stimulieren, daß die Defektoberflächen vollständig bedeckt waren. Die Zellen lagen jedoch nur auf den Oberfächen der Defekte vor, in keinem Fall reichte die Proliferation der Reparaturzellen aus, um das Defektvolumen zu füllen.
(Man nimmt an, daß die Proteoglykan-Abbauprodukte selbst, d.h. ohne Zusatz eines anderen Mittels, eine ausreichende chemotaktische Wirkung ausüben, um Reparaturzellen zum Defekt anzulocken. Moore, A. R., et al. [Int. J. Tiss. Reac. XI (b) (1989), 301-307] haben gezeigt, daß Proteoglykan-Abbauprodukte selbst chemotaktische Wirkungen zeigen.)

Beispiel 4

Anwendung von Wachstumsfaktoren auf Defektstellen wobei die Wachstumsfaktoren in biologisch abbaubaren Matrizes vepackt sind, um die Wanderung von Reparaturzellen in die Defektbereiche chemotaktisch zu stimulieren und die Proliferation von Reparaturzellen zu induzieren

Da die lokale Anwendung eines Wachstumsfaktors unter den Bedingungen von Beispiel 3 in keinem Fall eine zur Füllung des Defektvolumens ausreichende Proliferation von Reparaturzellen induzierte, wurde das Experiment unter Verwendung der gleichen Wachstumsfaktoren wiederholt, wobei die Wachstumsfaktoren dieses Mal jedoch in biologisch abbaubare Matrizes verpackt wurden. Die verwendeten biologisch abbaubaren Matrizes waren Fibrin, Kollagen und Sepharose. Ausreichende Mengen der Matrizes, die den Wachstumsfaktor enthielten, wurden angewendet, um die Defektvolumina vollständig aufzufüllen.
Fibrinmatrizes wurden hergestellt, indem etwa 200 Sekunden vor Auffüllen des Defektes pro ml Fibrinogenlösung (1 mg pro ml einer wäßrigen Pufferlösung: 0,05 M Tris, pH 7,4, 0,1 M NaCl) 20 ul Thrombinlösung (100 E pro ml einer wäßrigen Pufferlösung: Veronal-Acetat-Puffer, pH 7,0) zugemischt wurden. Bei Herstellung von Kollagenmatrizes wurden ausreichend viskose Lösungen zubereitet, indem Colagen-Vliess R oder Gelatine- Blut-Gemische verwendet wurden. Bei Herstellung von Sepharosematrizes wurden die Defekte mit flüssigen Sepharoselösungen bei 39 bis 42ºC gefüllt. Bei Abkühlung (35 bis 38ºC) wurde eine Sepharosematrix im Defekt erhalten.
In diesem Experiment wurden 30 Kaninchen (jeweils zwei für jeden Matrixtyp und Wachstumsfaktor) eingesetzt. In allen Fällen, in denen die aufgelegte Matrix am Defekt haften blieb, wurde sie vollständig mit Fibroblasten-ähnlichen Reparaturzellen besiedelt. Diese Situation zeigte sich bereits acht bis zehn Tage nach der Operation. Bis zu vier Wochen nach der Operation trat keine Anderung in der strukturellen Organisation der Reparaturzellen ein, mit der Ausnahme, daß die biologisch abbaubaren Matrizes durch die Reparaturzellen umgebaut und durch einen lockeren Bindegewebetyp einer extrazellulären Matrix ersetzt wurden.
Eine Transformation dieses Gewebes in Knorpelgewebe fand nicht statt.

Beispiel 5

Anwendung von Wachstumsfaktoren auf Defektstellen, wobei die Wachstumsfaktoren in biologisch abbaubaren Matrizes verpackt sind, um die Wanderung von Reparaturzellen in die Defektbereiche chemotaktisch zu stimulieren und die Proliferation von Reparaturzellen zu induzieren, in einem sekundären Stadium gefolgt von einer zeitlich festgelegten lokalen Freisetzung eines transformierenden Faktors. um die Defektstelle in hyalinen Knorpel zu transformieren

Die Beobachtung, daß die Matrizes im Defektvolumen nach Anwendung eines Wachstumsfaktors vollständig mit Reparaturzellen gefüllt waren und daß diese Zellen befähigt waren, die aufgelegte Matrix umzubauen (vgl. Beispiel 4), veranlasste uns zu der Untersuchung, welche Wirkung die Einführung eines transformierenden Faktors (wie z.B. TGF-ß) in einer verkapselten Form (z.B. Liposomen) haben würde, aus welcher der transformierende Faktor freigesetzt werden könnte, wenn die Matrix vollständig mit Reparaturzellen besiedelt ist, die mit dem Umbau der interzellulären Struktur begonnen haben.
TGF-ß wurde in niedriger Konzentration (z.B. 2 bis 10 ng/ml) in die Fibrinogenlösung (1 mg/ml) eingemischt, um die anfänglichen chemotaktischen und proliferativen Wirkungen zu fördern. Außerdem wurde TGF-ß gemäß dem Verfahren von Kirn et al., (1983), a.a.O., in Liposomen verkapselt. Diese TGF-ß-enthaltenden Liposomen wurden zu derselben Fibrinogenlösung in einer ausreichenden Konzentration zugesetzt, um bei Aufschließen der Liposomen und Freisetzung von TGF-ß die höhere Konzentration von 100 bis 1000 ng TGF-ß pro ml Fibrinogenlösung bereitzustellen, wodurch während eines sekundären Stadiums, wenn die die Fibrinmatrix besiedelnden Reparaturzellen mit dem Umbau der interzellulären Substanz begonnen haben, die Transformation der Reparaturzellen in Chondrocyten und die Transformation des mit Matrix gefüllten Defektes in Knorpel gefördert wird.
Zehn ausgewachsene Kaninchen, denen jeweils am Kniegelenk oberflächliche Gelenkknorpeldefekte wie in Beispiel 2 zugefügt wurden, wurden behandelt, wobei dieses Fibrinogengemisch, das freien und Liposomen-verkapselten TGF-ß enthielt, auf die Defektstelle aufgetragen wurde. In den verschiedenen Experimenten dieser Experimentenreihe wurde die Konzentrationen des freien TGF-ß im Bereich von 2 bis 10 ng/ml Fibrinogenlösung gehalten, während die Konzentration des verkapselten TGF-ß in jeweils 100 ng-Schritten verändert wurde, wodurch eine Konzentration zwischen 100 und 1000 ng TGF-ß pro ml Fibrinogenlösung bereitgestellt wurde. In allen Fällen wurde an den behandelten Stellen hyalines Knorpelgewebe erzeugt. Die reproduzierbarsten Ergebnisse wurden bei Konzentrationen von über 200 ng verkapseltem TGF-ß pro ml Fibrinogenlösung, vorzugsweise bei über 500 ng TGF-ß pro ml Fibrinogenlösung, erhalten.

Beispiel 6

Bestimmung des Zeitpunktes der Gewebetransformation

In diesem Experiment wurden einer Gruppe von sechs ausgewachsenen Kaninchen bei Knieoperationen, wie in Beispiel 2, oberflächliche Defekte zugefügt. Ein vollständiges Behandlungsschema für die Wiederherstellung von oberflächlichen Defekten wurde angewendet, d.h. Behandlung mit Chondroitinase ABC (1 E/ml, 4 Minuten), anschließend Auffüllen der Defektstelle mit Fibrinmatrix (1 mg/ml Fibrinogenlösung, 20 ul 100 E/ml Thrombinlösung pro ml Fibrinogenlösung), enthaltend freien TGF-ß (etwa 2 bis 10 ng/ml) und in Liposomen verkapselten TGF-ß (etwa 800 ng/ml). Drei Kaninchen wurden 8, 10 und 12 Tage nach der Operation getötet, die restlichen drei wurden 20, 24 und 28 Tage nach der Operation getötet. Die Transformation des primitiven Fibroblasten-ähnlichen Reparaturzellengewebes in hyalines Knorpelgewebe fand in diesem Tiermodell zwischen den Tagen 12 und 20 statt. Dies wurde mittels histologischer Untersuchungen festgestellt. An den Tagen 8 bis 12 lag noch lockeres fibröses Reparatugewebe vor (wobei die aufgetragene Fibrinmatrix teilweise oder vollständig umgebaut war), wohingegen am Tag 20 und danach der Defektraum teilweise oder vollständig mit hyalinem Knorpelgewebe gefüllt war.

Beispiel 7

Anwendung von Verfahren zur Wiederherstellung von Knorpel in einem Minischwein-Modell

Die experimentellen Verfahren, die im Kaninchenmodell angewendet wurden, a.a.O., wurden in einem Tiermodell mit einem größeren Tier, dem Minischwein, eingesetzt. Bei vier ausgewachsenen Minischweinen (2 bis 4 Jahre alt, 80 bis 110 engl. Pfund) wurden oberflächliche Defekte (0,6 mm Breite, 0,6 mm Tiefe und etwa 10 bis 15 mm Länge) erzeugt, indem mit einem Hobelmesser in die Patellafurche und den mittleren Gelenkkopf eingeschnitten wurde. Anschließend wurden die Defekte mit Chondroitinase ABC behandelt (1 E/ml, 4 Minuten, wie bei den Kaninchen, a.a.O.). Die Enzymlösung wurde entfernt, der Defekt getrocknet, mit physiologischer Kochsalzlösung gespült und sodann wieder getrocknet. Danach wurden die Defektstellen mit einer Fibrinogenmatrix gefüllt. Die in diesem Experiment verwendete Fibrinogenmatrixlösung enthielt 2 bis 6 ng freien TGF- ß pro ml und 1500 bis 2000 ng in Liposomen verkapselten TGF-ß pro ml Fibrinogenlösung. Vor Auffüllen der Defekte wurde Thrombin zur Matrixlösung zugesetzt, wie vorstehend im Kaninchenexperiment beschrieben.
Die Minischweine wurden sechs Wochen nach der Operation getötet und die Stellen der mit Matrix gefüllten Defekte histologisch untersucht. Alle Stellen zeigten eine Heilung, d.h. die Bildung von hyalinem Knorpelgewebe an der behandelten Stelle.

Claims

1. Mittel zur Behandlung oder Wiederherstellung von Defekten oder Schäden im Knorpel, umfassend eine biologisch abbaubare Matrix oder ein Matrix-erzeugendes Material, die/das verwendet wird, um den Defekt- oder Schadenbereich im Knorpel aufzufüllen, wobei die Matrix oder das Matrix-erzeugende Material

ein Proliferationsmittel in geeigneter Konzentration, wodurch die Proliferation von Reparaturzellen in der Matrix und im Defekt- oder Schadenbereich stimuliert wird, und

einen transformierenden Faktor enthält, der mit einem Freisetzungssystem assoziiert ist und in einer geeigneten Konzentration vorliegt, wodurch bei anschließender Freisetzung des transformierenden Faktors zu den proliferierten Reparaturzellen in der Matrix und dem Defekt die Reparaturzellen in Knorpelgewebe erzeugende Chondrocyten transformiert werden.

2. Mittel nach Anspruch 1, das ferner ein chemotaktisches Mittel in geeigneter Konzentration enthält, wodurch Reparaturzellen an die Matrix und den Defektbereich angelockt werden.

3. Mittel nach Anspruch 2, wobei das chemotaktische Mittel ausgewählt ist aus TGF-ßs, FGFs, PDGF, TNF-α, TNF-ß und Proteoglykan-Abbauprodukten.

4. Mittel nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Proliferationsmittel ausgewählt ist aus TGF-ßs, FGFs, IGF I, PDGF, EGF,

TGF-αs, menschlichem Wachstumshormon und hämatopoetischen Wachstumsfaktoren.

5. Mittel nach Anspruch 1 oder 2, wobei der transformierende Faktor ausgewählt ist aus TGF-ßs, TGF-αs, FGFs und Kombinationen davon sowie TGF-ß in Kombination mit EGF.

6. Mittel nach Anspruch 1 oder 2, wobei die biologisch abbaubare Matrix, die zum Auffüllen des Defektbereiches verwendet wird, ausgewählt ist aus Fibrin, Kollagen, Gelatine, Sepharose oder Kombinationen davon.

7. Mittel nach Anspruch 2, wobei das Proliferationsmittel, das chemotaktische Mittel und der transformierende Faktor ausgewählt sind aus TGF-ßs.

8. Mittel nach Anspruch 1 oder 2, wobei der transformierende Faktor ein Gemisch aus einem oder mehreren transformierenden Faktoren ist.

9. Mittel nach Anspruch 7, wobei das Proliferations- und chemotaktische Mittel in der Matrix TGF-ß in einer Konzentration von 2 bis 50 ng/ml ist und der transformierende Faktor TGF-ß ist, assoziiert mit einem geeigneten Freisetzungssystem, welches in der Matrix eine TGF-ß-Konzentration von über 200 ng/ml bereitstellt.

10. Mittel nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Freisetzungssystem ausgewählt ist aus Liposomen, biologisch zersetzbaren Polymeren, Kollagenfasern, die mit Heparinsulfatproteoglykanen chemisch verknüpft sind, und auf Kohlenhydraten basierenden Partikeln.

11. Mittel zur Behandlung oder Wiederherstellung von Defekten oder Schäden im Knorpel, umfassend:

Fibrinmatrix, die durch Zusatz von Thrombin zu einer Fibrinogenlösung hergestellt wird,

TGF-ß, der als proliferationsmittel und cheniotaktisches Mittel in einer Konzentration von 2 bis 10 ng pro ml Fibrinogenlösung vorliegt, wodurch die Proliferation von Reparaturzellen und deren Anlockung in die Matrix und den Defekt stimuliert wird, und

TGF-ß, der in Liposomen verkapselt ist und in einer Konzentration von über 200 ng pro ml Fibrinogenlösung als transformierender Faktor vorliegt, der anschließend zu den proliferierten Reparaturzellen freigesetzt wird, wodurch die Reparaturzellen in Knorpelgewebe erzeugende Chondrocyten transformiert werden.

12. Mittel nach Anspruch 1 oder 2, das ferner einen Faktor zur Förderung der Haftwirkung der Zellen enthält, umfassend das Tripeptid Arg-Gly-Asp.

13. Verwendung von einem oder mehreren Mitteln der Ansprüche 1 bis 12 zur Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von oberflächlichen Knorpeldefekten.