JPH04503951A - 創傷治癒に活性のあるポリペプチド―ポリマー複合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｓ　汗　に゛　のあるポリペプチド−ポリマー　Ａ本発明は生分解性ポリマーに 結合したペプチドと、ヒトを含む哺乳類における創傷の治癒を促進する複合体を 用いる方法に関する。

及豆旦互盈 皮膚の創傷、例えば、褥癒性潰瘍、重度の熱傷、および糖尿病性の潰瘍および眼 の障害、例えば乾性眼及び角膜潰瘍などの治癒が遅かったり、治癒できないこと は、数百刃の人々に影響を与え、多くの患者に激しい苦痛あるいは死をもたらす 。外科的創傷の治癒でさえも、特に高齢のおよび糖尿病の患者には問題である。

創傷は、原因、形態および影響を受けた組織の点からは非常に異なるものである が、共通の治癒機構を有している。各々の修復過程においては、最終的には、正 しい種類の細胞が効果を有する十分な数だけ、創傷に移動することが必要である ：創傷を創縁切除するマクロファージ、細胞外基質が損傷を受けた創傷に新しい コラーゲンと他の細胞外基質成分を形成する繊維芽細胞、血液を供給する毛細管 内皮細胞および最終的に創傷を覆う上皮細胞などがある。

創傷を受けていない真皮はその構造と強さの大部分を細胞の細胞外基質との相互 作用に依存している。この基質は、多種類の細胞の付着を助けることが知られて いるいくつかのタンパクを含んでいる。これらのタンパクはフィブロネクチン、 ビトロネクチン、トロンポスポンジン、コラーゲンおよびラミニンを含有する。

フィブロネクチンは創傷を受けていない皮膚中に比較的低濃度で存在するが、創 傷を受けた後、血しょうフィブロネクチンの沈着は速やかに起こる。組織が損傷 を受けた時、細胞外基質は、細胞の付着と移動を助ける足場を与えるため置き換 わらなければならない。

足場を与えるのに加えて、細胞外基質は細胞の増殖と分化を導くこともできる。

それ故に、細胞外基質は正しい組織の形状が回復されるような方法で組織の治癒 を導くことができる。創傷に用いると、外因性のフィブロネクチンは創傷の治癒 を増強し、上皮の移動を起こし、さらにコラーゲンの沈着を起こす。しかし、コ スト、有用性および不安定性を含む多くの点を考慮すると、フィブロネクチンま たは他の細胞外基質タンパクは、このような治療にとって理想的ではない。さら に、血液製剤の場合、細胞外基質タンパクは伝染病に対する媒介体となり得る。

フィブロネクチンを用いた治療に加えて、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）あるい は表皮細胞成長因子（ＥＧＦ）などの細胞成長因子を与えることによって、治癒 を促進する試みもなされた。この様な因子は、確実に創傷を治療するのに有用と なるが、新しい組織の正しい形状に影響を与えることができないので、著しく血 管化した組織となり異常な治癒をもたらす。

フィブロネクチンと他の接着タンパクの結合領域が、アミノ酸配列Ａ　ｒ　ｇ− Ｇ　ｌ　ｙ　−Ａ　ｓ　ｐ−Ｘ　（アミノ酸の標準的−文字記号ではＲＧＤ−Ｘ ともよばれる）に局在していることは認識されており、ここで、Ｘはペプチドが 細胞接着促進活性を有するような、様々なアミノ酸または置換基であり得る。

Ａ　ｒ　ｇ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ａ　ｓ　ｐを含むペプチド、およびそれらの用途は、 例えば、下記の発行された米国特許および係属中の特許出願に開示されている： すなわち、米国特許出願第４，５７８．０７９号および第４，６１４，５１７号 ；米国特許出願第７４４，９８１号および第７３８，０７８号である。これらの 発見から、特定の細胞表面受容体に対して様々な特異性を有する Ａ　ｒ　ｇ−Ｇ　１　’！−Ａ　ｓ　ｐを含む種々のペプチドの生成に関する研 究が進められている。

従って、創傷の位置への細胞の移動と付着を促進する効果的な薬剤が必要となる 。好ましくは、そのような薬剤は安価であり、無菌であり、安定性と効果が持続 するものであるのがよい。本発明はこのような必要性を満足し、関連する利点を も提供する。

及朋ヱ目」丘 本発明は創傷の迅速な治癒を促進するのに有用なＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを含む ペプチドおよびペプチド−ポリマー複合体と、創傷を治療するためのペプチド− ポリマー複合体を用いる方法を提供する。一つの実施態様において、この複合体 はアミノ酸配列Ｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを含むペプチドを含有し、ここで、Ｙは生分 解性ポリマーに結合したＡｒｇまたはＤ−Ａｒｇである。このようなポリマーの 例は、ヒアルロネート、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ポリラ クテート、ポリグリコール酸、デンプンまたはゼラチンを含有する。

他の局面において、ペプチドを生分解性ポリマーに結合する方法が、提供されて いる。さらに別な局面において、本発明は、ペプチド複合体を含むＹ−Ｇｌｙ− Ａｓｐを用いることによって、創傷を治療する方法を含有している。

図面の簡単な説明 第１図は、ヒアルロネートとＲｅＧＤＳＰＫとの複合体を用いてなされた、コン トロールと比較した創傷の強さの増加についての１０日にわたるテストを示して いる。

第２図は、コントロールに対する割合（％）として第１図の結果を示している。

箪３図は、ヒアルロネー）−〇　（ｄＲ）ｓＧｓ　（ｄＲ）ＧＤＳＰＡＳＳＫ複 合体を用いた、第２の創傷の強さの実験結果を示す。

第４図は、コントロールの創傷に対する割合（％）とじて第３図のデータを示す 。

ｌ豆Δ毘綴星五皿 哺乳類の真皮の細胞外基質は、付着を助け、フィブロネクチン、ビトロネクチン 、コラーゲンおよびラミニンを含有する多種類の細胞の移動と分化を促進するこ とが知られているいくつかのタンパクを含有する。真皮が切除され、焼かれある いはすりむかれると、細胞外基質は分離されるか、あるいは喪失され得る。この 基質は、創傷が細胞の移動および再生により修復され得る前に、置き換わらなけ ればならない。なぜならば、細胞は、細胞の移動と治癒が起こる前に元の位置に ある基質を必要とするからである。

創傷が自然に治癒する際には、細胞の移動と、細胞による細胞外基質の合成とに よって、組織が置き換わる。この過程には時間がかかり、しばしば完結するまで に１年以上かかる。

そして、搬痕が形成され、周囲の創傷を受けていない組織よりも弱い組織となる 。

本発明は、細胞に細胞移動のための付着基盤を提供することにより、多くの異な った創傷の治癒を助けるために使用され得る安定な”合成基質”を提供する。

”合成基質”は、生分解性ポリマーと、皮膚細胞が移動の際に結合部位として使 用し得るペプチド配列との複合体を含有する。好ましくは、このペプチドは配列 Ａｒｇ−Ｇｌｙ−ＡｓｐあるいはＤ−Ａ　ｒ　ｇ−Ｇ　ｌ　ｙ　−Ａ　ｓ　ｐを 含む。皮膚の創傷の場合には、これら２つの成分は、好ましくは水和した基質に 結合したペプチドを含有する粘着性のセミ−ゲル（Ｓｅｍｉ−ｇｅｌ）を形成す る。セミ−ゲルは基質が破壊された単数あるいは複数の部位における創傷に直接 配置される。

さもなければ、創傷は通常の方法で治療される。セミ−ゲルであるので、複合体 は、患者が動くというような物理的効果によるか、あるいは、患者自身のシステ ムによる吸収によって、創傷部位から離れる傾向はない。複合体は細胞の創傷へ の移動を促進し、治癒を早める一時的な補充基質として作用する。創傷が治癒す るにしたがって、実施例４で証明するように、複合体は移動する細胞によってゆ っくりと壊れ、自然の補充基質によって置き換わる。他の適用として、乾性眼の 条件あるいは他の状態によって起こる角膜剥離に関するものでは、コンドロイチ ン硫酸に結合したＹ−Ｇｌｙ−Ａｓｐペプチドからなる複合体が好ましい。この 複合体は結合して真皮のコラーゲン基質を曝し、角膜上皮細胞に対する付着部位 を明らかにする。このような物質は、涙のような液体の形で与えられ得る。

（以下余白ン 次の標準的な略語記号は、アミノ酸残基と一致してここで使用される。

アミノ助１　３文字（令）黴　１文ダ書已号ｐ−ア１しｉ−ン　Ｄ−ＡｒｇｄＲ ア人パラｆ“ン　入ａｎ　Ｎ アズ１５う千゛ンＱ　ＡＳｐ　Ｄ ブ゛Ｉレクミンα史　Ｇｌｕ　ｇ ７シシルアラシン　Ｐｈｅ　Ｆ ｎＭｅ−謬　ルーフかし器上≦ε（。

本発明の好ましいアミノ酸配列の一部はフィブロネクチンに由来する。フィブロ ネクチンは損傷を受けていない真皮には低レベルで存在し、損傷を受けた真皮に は高レベルで存在する天然に見いだされるタンパクである。フィブロネクチンは 治癒において重要な要因として示されてきた。なぜならば、フィブロネクチンは 、傷害によって失われた細胞と置き換わるために現れる移動細胞に、結合部位を 与えるからである。

細胞の結合に必要なフィブロネクチンにおけるアミノ酸配列は、Ａ　ｒ　ｇ−Ｇ 　１　ｙ−Ａ　ｓ　ｐ−Ｘであり、ここでＸはセリンである。しかし、Ｘは、ペ プチドが細胞付着促進活性を有する他のアミノ酸または置換基である。（Ｐｉｅ ｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ　ａｎｄＲｕｏｓｌａｈｔｉ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、 　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８１：５９８５−５９８８（１９８４））。

Ａ　ｒ　ｇ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ａ　ｓ　ｐはまた、ビトロネグチン、フラーゲン、フ ィブリンおよびテナシンを含有する多くの他の接着タンパクにおける細胞付着促 進配列である。その配列を−含む合成ペプチドは、不溶性の基質として与えられ たときには、細胞の付着を促進することができ、また、溶液のときには、フィブ ロネクチンまたは他の接着タンパクに細胞が付着するのを阻害できる。このペプ チド配列に対するいくつかのレセプターが様々な細胞種において同定されている （Ｐｙｔｅｌａら、、Ｃｅ１１４０：１９１−１９８　（１９８５）；Ｒｏｕｓ ｌａｈｔｉおよびＰｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３８：４ ９１−４９７　（１９８７））。付着されるべき細胞のタイプにより、Ａ　ｒ　 ｇ−Ｇ　１　ｙ−Ａ　ｓ　ｐ−Ｘ配列は、個々のレセプターに優先的に結合する ように修飾され得、そして、それゆえに、個々の種類の細胞を引き付けることが できる（ＰｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ’、Ｊ、Ｂｆｏ ｌ、Ｃｈｅｔ　２６２：１４０８０−１４０８５　（１９８７））。さらに、大 部分の細胞外基質タンパクはすべての接着を増大すると考えられる、塩基性の” ヘパリン結合”領域を含んでいる。この性質は、ポリアルギニン、ポリリシンま たはポリオルニチンにより、あるいは他の塩基性残基により模倣され得る。さら に、ペプチドは直鎖状または環状であり得る。請求項は、これまでのすべてのこ のような付加物および置換基を含有するように意図されている。

従って、本発明の好ましい実施態様において、創傷の治癒を促進する生分解性ポ リマーとの結合に有用なポリペプチドは次の配列を含有する： ＲＲＲＲＲＲＧ　Ｄ　Ｓ　Ｐ　Ｋ； Ｇ（ｄＲ）Ｇ　ＤＳ　Ｐ　Ａ　Ｓ　Ｓ　Ｋ；ｎＭｅ　Ｇ　（ｄＲ）（ｄＲ）（ｄ Ｒ）（ｄＲ）（ｄＲ）ＧＧＧ（ｄＲ）ＧＤＳＰＡＳＳＫ薯 Ｇ　（ｄＲ）（ｄＲ）（ｄＲ）（ｄＲ）（ｄＲ）Ｇ　Ｇ　Ｇ（ｄＲ）　Ｇ　Ｄ　 Ｓ　Ｐ　Ａ　Ｓ　Ｓ　Ｋ；およびＧ　（ｄＲ）　（ｄＲ）　（ｄＲ）　ＣｄＲ＞ 　（ｄＲ）Ｇ　Ｇ　Ｇ（ｄＲ）　Ｇ　Ｄ　Ｓ　Ｐ　Ａ　Ｓ　Ｓ　Ｋｉおよびここ で、Ｒはアミノ酸のアルギニン（Ａｒｇ）；　ｄＲは７ミ／酸のＤ−アルギニン （Ｄ−Ａｒｇ）；Ｇはアミノ酸のグリシン（Ｇｌｙ）：Ｄはアミノ酸のアスパラ ギン酸（Ａｓｐ）；Ｓはアミノ酸のセリン（Ｓｅｒ）；Ｐはアミノ酸のプロリン （Ｐｒｏ）；にはアミノ酸のりシン（Ｌｙｓ）；　Ａはアミノ酸のアラニン（Ａ ｌ　ａ）；そしてｎＭｅはｎ−メチル基である。

これらのペプチドは合成物であり、比較的容易に製造でき（例えば、フィブロネ クチンと比べて）、血液から抽出する必要はない。さらに、ペプチドのサイズが 小さいので（例えば、フィブロネクチンと比べて）、所定容量の生分解性ポリマ ーに付着する結合部位が多くなる。これらのペプチドは溶液状態のフィブロネク チンよりもさらに安定でもある。特に、Ｄ−Ａｒｇはプロテアーゼ耐性を与える 。さらに、これらのペプチドは種特異的な免疫学的決定因子を有しないので、そ れゆえに、獣医学的およびヒトへの用途の両方に使用され得る。好ましくは、そ のようなペプチドは、ＤあるいはＬ型のＡｒｇＳ　Ｌｙｓ、またはオルニチンか ら選択される少なくとも３つのアミノ酸の少な（ともひとつのグループを、Ａｒ ｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列のＮ末端側に含んでいる。

本発明の好ましい生分解性ポリマーはヒアルロン酸である。

ヒアルロン酸はＤ−グルクロン酸およびＮ−７セチルーＤ　−グルコサミンの変 換された残基から成る。このポリマーは真皮の基質に見いだされ、純粋な形態で 多くの原材料から商業的に入手可能である。ヒアルロン酸は水溶性のポリマーで あるので、ゲルまたは粘着性の溶液を形成する。有用に使用され得る他のゲル形 成生分解性ポリマーは、コラーゲン、アガロースおよびデンプンを含有するが、 これらに限定されるものではない。このポリマーはその物理的性質を安定化させ るために架橋され得る。

他の好ましい生分解性ポリマーは、コンドロイチン硫酸であり、露出したコラー ゲン／基質に特異的に結合する能力により特に目への用途に有用である。このよ うな複合体は、点眼薬のような、液体状で与えられ得る安定な溶液を形成する。

有用に使用され得る他のポリマーには、ヘパリン、ヘノくリン硫酸、デキストラ ン、ポリラクテートおよびポリグリコール酸が含有される。さらに、これらの物 質は、ゲルを形成するために架橋することにより、あるいはメ・ツシュ様の構造 を形成することによって、皮膚への用途に使用され得る。

創傷治癒複合体の二つの成分は多くの方法によって結合され得る。好ましくは、 これらの成分は、架橋／力・ノブリング剤である、１−エチル−３−（３−ジメ チルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を用いて結合される。他の架橋 ／カップリング剤としてジシクロへキシルカルボミド（Ｄ　Ｄ　Ｃ”）、グルタ ルアルデヒド、シアノゲンブロマイド、あるいはＮ−ヒドロキシスクシンイミド なども使用される。当該分野でよく知られた他の方法もまた使用され得る。

ペプチド−ヒアルロン酸複合体は、その粘性が非複合体のヒアルロン酸トの添加 またはペプチド複合体の程度を変えることによって変化し得るセミ−ゲルを形成 する。好ましくは、ペプチドのポリマーに対する割合は０．２〜０．３：１であ るが、他の割合の範囲でも使用可能である。セミ−ゲルは、人工的な生分解性基 質を与えることによって、治癒を促進するために創傷部に直接据えられえる。形 質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）あるいは血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）のよ うな成長因子を複合体とともに用いると、治癒をさらに促進する。他の実施態様 においては、複合体は、生分解性のメツシュまたは移植材料で被覆するか、それ 自体をシート状または他の構造に成形するか、あるいは安定な溶液として提供し 得る。このような複合体は、切られ、擦りむかれ、あるいは“他の損傷を受けた 体細胞を含むあらゆる創傷に使用され得る。

組織（たとえば、軟骨、骨、または神経組織）の再生は、複合体の付与によって も増大され得る。

次の実施例は本発明の様相をさらに明かに例示することを意図したものであり、 その範囲を限定することを意図したものではない。

実施例！ 二ヱ二二皇底 ペプチドＧ　（ｄＲ）（ｄＲ）（ｄＲ）（ｄＲ）（ｄＲ）ＧＧＧ（ｄＲ）ＧＤＳ ＰＡＳＳＫ　を製造業者の手引にしたがって自動ペプチド合成装置（Ｍｏｄｅｌ 　４３０Ａ；　ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔ ｙ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）を用いて合成した。

樹脂をフッ化水素で開裂後、ペプチドを冷エチルエーテルで洗浄し、水冷したエ ーテルを用いてトリフルオロアセテートの溶液から沈澱させた。ペプチドを蒸留 水に再溶解し、凍結乾燥した。得られたペプチドをさらに、Ｗａｔｅｒｓ　Ｂｏ ｎｄａｐａｋ”Ｃｐｓ　（３Ｘ３０ｃｍ；１０μｍ　ｐａｃｋｉｎｇ、　Ｗａｔ ｅｒｓ　Ａｓ５ｏｃ、、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を用いたＨＰＬＣにより精製し た。他のペプチドも同様の方法で調製され得る。

他の方法として、より大、きな体積のものに対しては、ペプチドは次の方法によ って調製され得る。およそ３０グラムのｔ−ｂｏＣリシンポリスチレン樹脂（お よそ１９．５ｍＭのｔ−ｂｏａリシンを含む）を計量し、ペプチド合成反応容器 に入れた。樹脂の重量は所望の生成物の所望の量に依存して増加あるいは減少し 得る。以下に示したような保護基を有する次のアミノ酸はペプチドの製造に使用 される：１−セリン（ベンジル；ｂｚｌ） １−アスパラギンＭ（０−シクロヘキシル；０ｃＨｘ）グリシン 各々のアミノ酸はｔ−ｂｏｃのモル量を基準に４倍量を計量し、個々に、５００ ｍＬのガラスエルレンマイヤーフラスコに詰めた。” 各々のアミノ酸（ｔ−ｂｏａリシンポリスチレン樹脂を除く）をＮ−メチルピロ リドン中に溶解し、ＩＭのヒドロキシベンゾトリアゾールを加えて活性化した。

ヒドロキシベンゾトリアゾールはアミノ酸の濃度と当モル濃度になる体積で加え た。各々のアミノ酸（ｔ−ｂｏｃリシンポリスチレン樹脂を除（）の活性化は、 溶解したアミノ酸の濃度と当モル濃度のジシクロへキシルカルボジイミドを与え るように、ＩＭのジシクロへキシルカルボジイミドのＮ−メチルピロリドン溶液 を添加して完結した。これらの物質を活性化が完結するまですくなくとも３０分 間インキコベートした。各々のアミノ酸をＨｏｔ）を活性エステルに変換した。

活性化したアミノ酸をＷｈａｔｍａｎ＃１濾紙で濾過し、不溶物を取り除いた。

Ｎ末端アミノ酸のアミノ末端からｔ−ｂｏａの保護基を取り除くために、ｔ−ｂ ｏｃアミノ酸ポリスチレン樹脂を膨張させ、ジクロロメタン（樹脂１グラムにつ きおよそ１２ｍＬ）で５分間で３回洗浄した。各々の洗浄後に、液体を反応容器 から除去した。膨張および洗浄後、樹脂を５０％トリフルオロ酢酸のジクロロメ タン溶液（樹脂１グラムにつきおよそ６ｍＬ）で２分間洗浄することにより酸性 化した。ｔ−ｂｏｃアミノ酸−ポリスチレン樹脂の脱保護はさらに５０％トリフ ルオロ酢酸のジクロロメタン溶液（樹脂１グラムにつきおよそ１２ｍＬ）を加え 、およそ３０分間以上インキュベートすることにより完結した。

脱保護のあと、トリフルオロ酢酸のジクロロメタン溶液を反応容器から取り除き 、脱保護したアミノ酸−ポリスチレン樹脂を２回ジクロロメタン−イソプロパツ ール洗浄液（５０％Ｖ／Ｖ、樹脂１グラムにつきおよそ１２ｍＬ）で２回洗浄し 、洗浄液は捨てた。次に、樹脂をジクロロメタン（樹脂１グラムにつきおよそ１ ２ｍＬ）で２回洗浄した。

酸性化して、脱保護したアミノ酸−ポリスチレン樹脂を１０ｍＬのジイソプロピ ルエチルアミンのジクロロメタン溶液（樹脂１グラムにつきおよそ１２ｍＬ）で ３回洗浄して中性化した。中性化の洗浄液は反復の後に捨てた。中性化したアミ ノ酸ポリスチレン樹脂をジクロロメタン（樹脂１グラムにつきおよそ１２ｍＬ） で３回洗浄し、モしてＮ−メチルピロリドン（樹脂１グラムにつきおよそ１２ｍ Ｌ）で３回洗浄した。洗浄液は反復のあとに捨てた。

適当な、活性化したアミノ酸をアミノ酸−ポリスチレン樹脂を含む反応容器に、 モル比で４対１（樹脂に結合した脱保護アミノ酸に対する活性化アミノ酸）の量 で加えた。適当なアミノ酸は所望するペプチド配列に従って選択された。この物 質を３０分間以上混合し、カップリング反応を完結させた。

反応はニンヒドリン反応を用いてモニターした。連結したアミノ酸を含む樹脂を Ｎ−メチルピロリドン（樹脂１グラムにつきおよそ１２ｍＬ）で２回洗浄し、そ してジクロロメタン（ａｔ脂１グラムにつきおよそ１２ｍＬ）で２回洗浄した。

各々の洗浄液は反復の終了後に捨てた。

この工程を通して、ｔ−ｂｏａアミノ酸ポリスチレンｍ脂の酸性化および脱保護 で始まるプロセスは、ペプチド鎖に加えるために、各々の引き続くアミノ酸につ いて繰り返された。

ペプチドの製造のために続くアミノ酸配列は、以下に表で示す０ ゴＵ瓦　ｆｉ　１１プ刀二 Ｑｔ−ｂｏａ　７７７１口ａｈ 弧紺マη懺 １　１−９ソン　（ｂｚｌ）　Ｓ＠ｒ−Ｌｙｓ−Ｒｅｓｉｎ２　ｘ−＜ソン　（ ｂｚｌ）　５ａｒ−５＠ｒ−Ｌｙｓ−Ｒａｓｉｎコ　１−アラニン　入１ａ−５ ＠ｒ−５ａｒ−Ｌｙｓ−Ｒａｓｉｎ４　１−　７’ｌ；７リン　Ｐｒｏ−人１ａ −５ａｒ−５ａｒ−Ｌｙｓ−Ｒｅｓｉｎ５　１−−（；り７　（ｂｚｌ）　５ａ ｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−５ａｒ−５ａｒ−Ｌｙｓ−Ｒａｓｉｎ８　ｄ−アｐ−”＋ ’：、−”／　（ｔｏｓ）　（ｄ）入ｒｇ−Ｇａｙ−人５ｐ−５ａｒ−Ｐｒｏ− 人１ａ−５ｅｒ−５＠ｒ−Ｌｙｓ−Ｒａｓｚｎ ペプチドのためのすべてのカップリング工程が終了したあとに、樹脂をジクロロ メタン（各々の洗浄において、樹脂１グラムにつきおよそ１２ｍＬ）で２回洗浄 した。樹脂回収して、アルゴンガスを吹き込んで乾燥した。乾燥した樹脂を干か らびさせ、次のプロセスまで室温で貯蔵した。

乾燥し計量した樹脂を攪拌子を含む適当な大きさのガラスの反応容器に入れた。

アニソールを攪拌しながらペプチド樹脂１グラムにつき１ｍＬの体積で樹脂に加 えた。°ペンタメチルベンゼンを、ペプチド樹脂１グラムにつき５０ｍｇのペン タメチルベンゼンと等しい量のペプチド樹脂および、アニソールを入れた反応容 器に加えた。容器の内容物をおよそ一７０℃まで冷却した。次にフッ化水素ガス をペプチド樹脂１グラムにつき１０ｍ１の体積で反応容器に液化して加えた。攪 拌を続けると、反応容器の温度はゆっ（つとおよそ−１５℃まで上昇し、６０分 間以上ずっと温度をＯ′Ｃより低く保った。

開裂の工程および保護基の除去が完結した時点で、窒素ガスをおよそ１時間吹き 込むことによってすべてのフッ化水素を蒸発させ、その間容器の内容物を０℃以 下にして攪拌条件に保った。

チル（無水）に、水とエーテルの比がおよそ１：１．５にして溶解し、ガラスフ リットロートを通して濾過し、フリーのペプチドから不溶物の樹脂を取り除いた 。濾過後、開裂したペプチドを含む水相を回収し、エチルエーテル（無水）でさ らに２回再抽出した。溶解した水性のペプチド溶液のｐＨを、２Ｍの炭酸水素ア ンモニウムで６．５から７．５に調整した。

中性化した溶液をシェル（ｓｈｅｌｌ）冷凍し、凍結乾燥し、粗ペプチドを回収 した。

逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰＨＰＬＣ）を合成ペプチドの精製に利用 した。この方法はペプチド配列の疎水性を利用している。ペプチドを、カラムの 結合を確実にするために、水性の極性溶媒を用いてカラムに詰めた。ペプチドを 、線形のグラジェントアプローチを利用して、極性の水性溶媒を非極性の有機溶 媒のペプチドと交換することによって効果的に精製した。

およそ６グラムの凍結乾燥した粗ペプチドを０．０５％ＴＦＡ（緩＃Ｉ液Ａ）を 含むおよそ１００ｍＬのＨＰＬＣ水に溶解し、Ｗｈａｔｍａｎ＃ｌ濾紙を通して ガラスフラスコに濾過した。粗ペプチドの水溶液を、およそ１分間に３０ｍＬの 流速で緩衝液Ａでプレ平衡化した３０ｃｍの耐圧Ｃ−１８カラムに詰めた。粗ペ プチドを詰めたあと、ペプチドのカラムへの結合を確実にするために、１分間に つきおよそ３０ｍＬの流速でおよそ５０ｍＬの緩衝液Ａを流した。５０分間で０ から２０％の勾配で、水に対するアセトニトリルを増加させることにより、ペプ チドを溶離した。精製に続き、２１０ｎｍでの吸収をモニターした。ペプチドの ピークを示す１２から１５分の画分および３４から３８分の画分を手動で集めた 。

この物質はピーク積分による決定でおよそ８０％の純度であった。半精製したペ プチドをシェル冷凍し、凍結乾燥しそして室温でデシケータ−中に保存した。

半精製したペプチドを、ペプチド９００ｍｇにつきおよそｌＯＯｍＬの体積で緩 衝液Ａに溶解し、Ｗｈａｔｍａｎ＃１濾紙を通して適当な大きさのシリコンで容 器内を被覆処理されたガラス容器に濾過した。半精製したペプチドの水溶液を、 直径２インチ長さ３０ｃｍの耐圧プレ平衡カラムに、１分間につきおよそ３０ｍ Ｌの流速で、３５０グラムのＣ−１８樹脂につき１グラムの部分的に精製したペ プチドに等しい量を°詰めた。カラムは３５０ｇの１５μ　Ｃ−１８樹脂を含ん だ。

カラムの大きさは詰めるべきペプチドの量を基にしている。

より大きなスケールの精製は、直径４インチ長さ６０ｃｍのカラムが使用される 。半精製したペプチドをカラムに詰めた後で、ペプチドのカラムに対する結合を 確実にするために、１分間につきおよそ３０ｍＬの流速で、およそ５０からｌＯ ＯｍＬの緩衝液Ａでカラムを流した。１分間につきおよそ３０ｍＬの流速を用い て、２０分間で０から７％の勾配で、水に対してアセトニトリルを増加させるこ とにより、ペプチドを溶離した。７％アセトニトリル濃度での定組成溶離をおよ そ６０分間続け、この時間でペプチドを溶離した。ＴＵ分ヲ０゜３分の間隔をお いて集めた。純粋な画分をプールし、ＨＰＬＣ分析後に凍結乾燥した。各々のプ ールをバッチと見なした。

精製したペプチドの各々のバッチの１％をサンプルとして抜取り、−緒にプール し、逆相Ｃ−１８ＨＰＬＣにより分析した。プールしたサンプルは９５％よりも 高い純度でなければならず、不純物が１％よりも多くあってはならない。純粋な ペプチドは系内のスタンダードとともに、工程におけるコントロールとして同時 溶離される。プールしたペプチドのバッチをＨＰＬＣグレードの水に溶解し、Ｗ ｈａｔｍａｎ＃１濾紙を通して濾過した。合成からの収率を計量した。プールし たペプチドの多量の混合物を冷凍し、凍結乾燥し、計量しそして最終生成物の製 造の使用まで室温でデシケータ−中に保存した。

精製したペプチドは、定量アミノ酸分析（表■）、アミン末端配列分析（表■） 、および高速原子衝撃マススペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）を用いて分析した。結果 はすべて予期したペプチドの構造と一致した。４つの（ＦＡＢ−ＭＳ）分析から の分子イオンは１９１３．２±０．５であり、理論値の１９１３．５と非常に近 似していた。

ム　捗 γ詣ζ’ＪＬｑベア９ナトのアミノ１嬶１ノコ伽・７乍１８　Ｋ　Ｏ，２ 寅４乞別り乃　ベア°デＦ°う７ミノ籐資ゲ）り入ｓｐ　Ｌ、ＯＬ　±　０．０ ３ Ｓ＠ｒ　２．６１　ｔ　Ｏ，０６ Ｐｒｏ　Ｄａｔ＊ｃｔａｂｌｓ ＧＩＹ　４．８２±０．０５ 人１ａ　１．０９　±　０．０６ Ｌｙ＠１．０２　±０．０２ Ａｒｇ　６．１４±０．０８ 実施例■ ペプチド−ヒアルロン　ム　の ヒアルロン酸（細菌由来；Ｇｅｎｚｙｍｅ、Ｂｏｓｔｏｎ。

ＭＡ）の溶液を、リン酸緩衝化生理食塩水中で緩衝化して、カップリング剤１− エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドと０．０７Ｍの濃 度で３０分間混合することによって、複合体を調製した。この後、実施例Ｉのペ プチドをヒアルロネートの重量と等しい重量だけ加えた。この混合物を一夜振盪 し、その後生成物を、３倍容量のアセトンまたはエタノールを用いて透析および 沈澱により精製した。

典型的な調製物は、重量で２０から３０％の間のペプチドを含む複合体から成っ ていた。無菌のリン酸緩衝化生理食塩水の添加により透明な溶液となり、その粘 度は連結していないヒアルロネートの添加により調整し得る。

複合体からフリーのペプチドを分離するために、名目上の分子量８から１４，０ ００を分離するａ準的透析膜を用いて、透析を行った。ｌｏｏｍｌのサンプル（ ＨＡおよびペプチドの初期濃度が４ｍｇ／ｍｌである）を２リツターのリン酸緩 衝化生理食塩水に対して透析し、ｐＨは７．４で、緩衝液を１日に３度換え、合 計５０時間行った。ペプチドを標準タンパクアッセイ（ＢＣＡアッセイ、Ｐｌｅ ｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、、ＩＬ）によって分析し、そし て１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）ウレア（ＥＤＵ）をアミノ 酸分析を用いてアッセイした。

表■に示すように、カップリング工程での低分子・量の副生成物（ＥＤＵ）は、 複合体から透析され、一方、ペプチドは複合体と共に留まった。示された条件は 正常なカップリング”　法を模倣していることに注目すべきである。残っている ペプチドの量は出発物質の２０から３０％である。等量から始めたので、ペプチ ドは最終生成物においてヒアルロネートの量の２０から３０％であった〇 （ＰＬ壬ネｂ） ゑ　Ｊ 洗行斬 遣１　シＬ−ム証　３コ三ム鰺ユ ０　１１．０００　４．ＱＱ ｌｏ　０．６６０　２．１６ ２０　０．１１０　１．２５ コＯＯ，０１６０，９５ ４００，００５０，６２ ５００，００２０，５２ 実施例■ コンドロイチン硫　ム　の 水中で１００ｍｇ／ｍｌにしたコンドロイチン硫酸（Ｈｅｐａｒ　Ｉｎｄｕｓｔ ｒｉｅｓ、Ｉｎｃｏ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ。

ＯＨ）を、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ ＥＤＣ）７０ｍＭと３０分間混合し、１０ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌの実施例Ｉのペプ チドを加え、室温で一夜振盪することにより、実施例Ｉのペプチドをコンドロイ チン硫酸に複合化した。複合体を１％となるようにＮａＣ１を加えてそして３倍 容量のアセトンを加えて沈澱し、５分間２０００ｘＧで遠心分離した。複合体を 真空上乾燥し、リン酸緩衝化生理食塩水に再懸濁し、１００　ｍ　ｇ　／　ｍ　 １とした。典型的なペプチドの取り込みは７４ｍｇペプチド／ｇ複合体である。

フンドロイチン硫酸複合体は、７００から１０００細胞／ｍｇ複合体のレベルで 、これは実施例■で記述するように決定された。

実施例■ 々な　とのペプチド　ム　の　。

次のようなシアノゲンブロマイド活性化法を用いて実施例Ｉで調製したペプチド をジャガイモのデンプンと複合化させた：２５ｍｇのＣＮＢｒを２０ｍ１の水に 溶解した。ＩＮのＮａＯＨでｐＨをすぐにｐＨ１１まで上昇させ、この時５００ ｍｇのジャガイモのデンプン（３ｉｇｍａ　Ｃｈｅｍ　Ｃｏ。

、Ｓｔ、Ｌｏｕｔｓ、ＭＯ）を加えた。３分間、６分間または１２分間ｐＨを１ １に維持しく追加のＮａＯＨを加え、継続して攪拌する）、そしてデンプンを濾 紙（ＷｈａｔｍａｎＮｏ、２）で集め、冷水とアセトンで洗浄した。これらの活 性化サンプル２００ｍｇを２０ｍｇのペプチドＹＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＳＫＰ ＩＳＮＹ装置ＬＤＫＰＳＱＭを含む１０ｍ１のカップリング緩衝液に加え、冷却 下−夜攪拌した。

午前中に、Ｗｈａｔｍａｎ＃２濾紙で複合体を集め、カップリング緩衝液、Ｏ， ０ＩＮＨＣＩ、ＩＭＮａＣｌ、および濃度勾配のある水／アセトン（８０％、６ ０％、４０％、２０％）、さらにアセトンで洗浄した。ペプチドの取り込みはニ ンヒドリンによりアッセイした。収量はおよそ１０ｍｇペプチド取り込み７ｇデ ンプンであった。

その他の方法として、ジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＤＣ）の活性化を用 いて、ペプチドをジャガイモのテンフンに複合化させた。０．２ｇのジャガイモ のデンプンを６ｍｇのジオキサンに懸濁させ、１００μｇのＤＤＣを加え、そし て３０分間振盪した。デンプンをフリットガラスフィルターで集め、ジオキサン で洗浄した。空気乾燥したあと、デンプンを８ｍｇのＩＭ　Ｎａ２ＣＯｓ（ｐＨ １０）に加えた。１゜２ｍｇのペプチド加え、混合物を４℃で一夜振とうした。

午前中に複合体を濾過によって集め、水、ＬＭ　ＮａＣ１，水および前記のよう な濃度勾配のあるアセトン／水で洗浄した。

ペプチドの組み込みはニンヒドリンによってアッセイした。

典型的な収量は３から４ｍｇペプチド組み込み７ｇジャガイモのデンプンであっ た。

ペプチドはまた１００μｇのＤＤＣの代わりに４０μｇのＤＤＣを用いて上記の ジシクロへキシルカルボジイミド活性化法によるように、アガロース（Ｂｅｔｈ ｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂ ｕｒｇＳ　ＭＤ）に複合化される。

実施例Ｉの方法によって調製したペプチドをＰｊｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒおよび Ｒｕｏｓｌａｈｔｉの方法（Ｎａｔｕｒｅ　３０９二３Ｏ−３３（１９８４）、 これは、ここで参考文献として取り上げられている。）を改変した方法に従って セファロースに複合化した。７．５ｍｇのＩＭＮａｚＣＯｚ中の５０ｍｇのセフ ァ０−スを２０ｍｇのＣＮＢｒで１０分間活性化した。サンプルを集め、洗浄後 、５ｍｇの１ＭＮａ２ＣＯｓに再懸濁し、１ｍｇのペプチドＧＲＧＤＳＰＫと共 に冷却下、−夜振盪した。

複合体を集め、前記のように洗浄し、そしてスタンダードとしてペプチドを用い てＢＣＡタンパクアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）により ペプチドの組み込みをアッセイした。組み込みは５　ｍ　ｇ　／　ｍ　１ビーズ のレベルであった。

これらの複合体を１００μｇ　／　ｍ　ｌのウサギ免疫グロブリンＧで被覆した 細胞培養プラスチックに固定化することにより細胞の付着についてテストした。

これを複合体のウェルへの添加によって行い、続いて濃縮したｌ−エチル−３− （３−ジメチルアミノブロビル）カルボジイミド（ＥＤＣ）をくわえ、複合体を タンパクコーティングに連結した。４時間後に細胞を洗浄し、そして細胞（正常 なラットの腎臓の細胞で２ｘｌＯ’／ｍｌ）を加え、３７℃で１時間インキュベ ートした。固定し、染色した後、細胞の付着をアッセイした。

すべての複合体はペプチド依存性細胞付着を示した。生体高分子のみへの細胞付 着はほとんどなく、シかしペプチド−生体高分子複合体への重要な細胞付着が見 られた。ジャガイモのデンプン複合体は、およそ１５０細胞／ｍｇ複合化デンプ ンゲルの結合となった。

実施例Ｖ ペプチドーヒアルロネート　ム　での　理″の自　の　さお去ブ１■１贋肚定 Ｗｉｓｔｅｒ４齢期の雄ラット（１７５から２５０　ｇ）をベンドパルビタール （ｅｏｍｇ／ｋｇ体重）の腹膜内注射により麻酔をかけた。ラットの背側の部位 をきっちりと毛を剃り、各々を手術のためにしっかりと固定した。無菌法を用い て５つの十分な厚さの皮膚の切込みを、１．５ｃｍの長さで、背側の部位につけ た。各々の切込みを、０．０５から０．１０ｍ１のヒアルロネートに複合化した ペプチドＲＲＲＲＲＲＧＤＳＰＫの盲検または０．０５から０．１０ｍ１のヒト フィブロネクチン（ＰＢＳ中３ｍｇ／ｍｌ　Ｃｏｌ　１　ａｂｏｒａｔｉｖｅ　 Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）またはラットのフィブロネクチン（ ＰＳＢ中２ｍｇ／ｍｌ、Ｔｅ１ｉｏｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎ ｃ、、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で処理し、またはコントロールとして無処理 のものを残した。処理後、標準４−０のナイロン縫合糸を用いて５針から７針の 断続縫合をして、切込みを閉じた。

ラットを回復と観察のためにカゴに戻した。手術から２日目から７日目および１ ０日後に、６匹のラットを上記のように麻酔をかけ、０．５ｃｃのＴ−６１を心 臓内注射することのより安楽死させた。

安楽死に続き、ラットから裸皮を取り除き、幅５ｍｍ長さ２ｃｍの切込みを三等 分する皮膚断片を調製した。張力のある断片に隣接した皮膚由来の組織学的試料 も張力の測定のために取り出し、断片の一端を１ｍｍのＭｉｃｈｅｌ　Ｃ１１ｐ ｐｅｒ　（Ｍｉｌｉｔｅｘ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｃｏ、）を用いて切取り 、それをグラス（Ｇｒａｓｓ）モデルＦＴ０３Ｃ力移動変換器にくくりつけた。

断片のもう一端を、綿糸を滑車にかけて用いるＨａｒｖａｒｄ　Ｍｏｄｅｌ　９ ０１プッシュプル式注入ポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍ ｉ　１１　ｉｓ、Ｍａｓｓ、）に取り付けた軽量の止血鉗子を用いて、切り取っ た。変換器を、結果を記録するために、グラスポリグラフ（Ｍｏｄｅ１７Ｄ）に 取り付けた。

較正値を読んだ後、ポンプを６４ｍｍ／ｍｉｎの速度で引くためにスイッチをい れた。切込みにおいて、皮膚を引き離すのに必要な力の量をポリグラフに記録し た。結果を図１および図２に示す。これらの図が示すように、創傷の力は切込み 後３日から７日の間に複合体を使用することによって増加し、最大の効果は５日 目に見られ、この時複合体処理創傷は未処理の創傷の力の２１１％に達した。

実施例■ ポリビニルアルコールスポンジ　モデルにおけるベブチドーヒアルロネート　Ａ 　のテスト ベブチドーヒアルロネート複合体は、ここに参考文献として採用するＤａｖｉｄ ｓｏｎらの方法（Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　１００＋１２１９−１２２７　（ １９８５））を用いてテストした。このモデルはラットの皮膚の下にこの複合体 またはコントロール物質を含んだ不活性なＰＶＡの移植を包含する。スポンジを 移植後４日から１００日目動物から取り除き、細胞の進界成長数およびタイプお よびコラーゲンの容量として、血管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）および炎 症の応答、さらに創傷における複合体の持続について分析した。これらの研究の 結果を次に示すＡ、実施例Ｈの方法によってペプチドＲ６ＧＤＳＰＫと複合化し たヒアルロネートを含むスポンジは、初期においては、血管形成を増加、コラー ゲンの分泌および繊維芽細胞の移動を引き起こし、後期にはこの効果は減少し、 コラーゲンがさらに持続的に、ヒアルロネートーペプチド複合体を含んだスポン ジに堆積することを除いて、実験の終わりまでにコントロールのスポンジと類似 のスポンジが現れた。

Ｂ、ヒアルロネート複合体はゆっ（りとスポンジから消失し、移植後１４日まで に明かに複合体の存在は減少した。

実施例■ ラットの　”みにおけるペプチドーヒアルロネート　ム風二二五上 ペプチドＧ　（ｄＲ）ｓＧ３（ｄＲ）ＧＤＳＰＡＳＳＫ　（これはＰｉｅｒｓｃ ｈｂａｅｈｅｒら、、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、８０：　１２２４−１ ２２７（１９８３）の文献に記述されているタイプのインビトロのアッセイにお いて実施例ＶでテストされたＲＧＤＳＰＫペプチド複合体よりもより活性がある ことが分かった）を使った複合体も、インビボにおいてより優れた活性があるか どうかテストするために実施例Ｖの方法を使用した。図３および図４に見られる ように、このペプチドの複合体はより早く活性を示しく２日でコントロールの１ ６０％に達する）、そして持続した活性を示した（１０日間を通してコントロー ルよりも高い活性を維持した）。

ヒアルロネートおよびペプチドの混合物（ヒアルロン酸およびペプチドを等量混 合して形成した）を、前述の報告を用いて、創傷の強さのモデルについてテスト した。複合体が最大活性値を示す４日目で、混合物の活性はコントロールの１０ ０．８％であった。一方、複合体の活性はコントロールの実施例■ コンドロイチン硫　−ペプチド　ム　による　眼の几乾性眼の状態を、６匹の猫 について０日目に、眼から護管および瞬膜を切除することによって引き起こした 。猫を４つのグループに分け、以下のように処理したニゲループ１は、１７日か ら３４日までは１日に２度３ｍｇ／ｍｌのヒトフィブロネクチンを２滴で、３４ 日から４３日までは１日に３度２滴で処理した。グループ２は、１７日から３４ 日までは、１日に２度１００ｍｇ／ｍｌのフンドロイチン硫酸ペプチド複合体Ｇ 　（ｄＲ）ｓＧ３（ｄＲ）ＧＤＳＰＡＳＳＫを、３４日から４３日までは１日に ３度２滴で処理した。グループ３は、リン酸緩衝化生理食塩水で１日に２度２滴 で処理し、グループ４は処理した。

眼は印象細胞学によって検査する。この印象細胞学において眼の表面の印象は、 顕微鏡的に検査した表面に接着された細胞上の眼の表面にポリマーを張り付ける ことにより、そして、露出した基質および下部に位置する基底部の上皮細胞を選 択的に染色し、損傷を受けていない角膜上皮を染色しない赤い色素である、ロー ズベンガル（ｒｏｓｅ　ｂｅｎｇａｌ）で眼を染色することによって得られる。

　グループ１および２における猫は、フィブロネクチンまたはペプチド複合体で 処理したものであるが、乾性眼状態の著しい軽減を示した。

リン酸緩衝化生理食塩水のみで処理した猫および未処理の猫は、与えられた時間 では、眼の状態に変化を示さなかった。

実施例■ 表え二紅ｉ立旦ユ ２０から２５ｋｇの、特定の病原体に感染していない（ＳＰＦ）３匹の若いブタ を、実験に先だって２週間条件を整えた。動物に水と抗生物質（Ｐｕｔｉｎｓコ ントロール因子）を含まない基礎的な食事を随意に与え、そして各々を動物用施 設（ラボラトリ−用動物のケアーの有資格校認定のためのントロールされた温度 （１９°Ｃから２１℃）および明るさと暗さく１２ｈ／１２ｈ）のもとで飼育し た。

実験動物を標準的なはさみで切取った。背中の皮膚および動物の両側を、非抗生 物質石鹸（ＮｅｕｔｒｏｇｅｎａＲ）で洗うことによって、創傷が起こるように 調製した。

創傷ができた日（０日）に、ブタをケタミン（１，Ｍ、）およびハロタン、酸素 そして亜酸化窒素の組み合せで麻酔をかけた。３５８ｇの５個の特別にデザイン した円、筒形の真鍮の棒を沸騰した水浴中で１００℃まで加熱した。棒を水浴か ら取り出し、水の小滴が皮膚に蒸気による焼は焦げを作るのを防ぐために、棒を 皮膚の表面に当てる前にぬぐって乾燥した。真鍮の棒を６秒間皮膚に垂直に置き 、重力による全圧力がかかるようにし、直径ｇ、５ｍｍＸ深さ０．６ｍｍのやけ どの創傷を作った。やけどを作った後すぐに、やけどによる水庖の上蓋を滅菌し たスパチユラで取り除いた。やけどによる創傷をおよそ２ｃｍ間隔に作った。ヒ アルロン酸のみをコントロールとして用いた。ペプチドとヒアルロン酸の複合体 は実施例Ｈの方法によって作った（細菌由来：Ｇｅｎｚｙｍｅ）。創傷を、空気 の循環を防ぎ閉塞して手当するＴｅｇａｄｅｒｍＲ（３Ｍ：　Ｓｔ、Ｐａｕｌ、 ＭＮ）を用いて、あるいは用いないで手当した。

３匹の動物の傷を３つの処理グループに分け、以下のように処理した： およそ１１０から１２０のやけどによる創傷を前の２／３の動物に作った。後の １／３は構造上の差により使用せず、結果として後のやけどがより早く治癒した 。

やけどによる創傷を、創傷を受けた後すぐに、創傷を覆うのに十分な物質（およ そＯ，１ｍ１）で１度処理した。ペプチド７３１体およびヒアルロネート（賦形 剤）をＴｅｇａｄｅｒｍ包帯剤で閉塞した。動物をＣｏｂａｎＲ接着性包帯（Ｊ 。

ｈｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｎｅｗ　Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ）で くるみ、包帯剤を固定した。包帯剤を全実験を通して固定した。

７日目から１５５日目かけて、各々の処理グループからの５つのやけどによる創 傷をエレクトロケラドーム（ｅｌｅｃｔｒｏｋｅｒａｔｏｍｅ）を用いて手術に より切除した（０゜６ｍｍの深さ）。切除したやけどによる創傷および周囲の正 常な皮膚を０．５ＭＮａＢｒ中で２４時間３７　℃でインキュベートした（図４ ）。インキュベーシヨン後に、試料を表皮および皮膚のシートに分離した。表皮 をやけどによる創傷の部位における欠失について肉眼で検査した。もし欠失がな ければ（治癒していれば）上皮化を完全と見なした：やけどの部位におけるどの 欠失も、治癒が不完全であることを示している。上皮のシートを常に記録するた めにボール紙の上に置いた。　表Ｉに示すように、治癒（上皮化）した創傷の数 を１日につきサンプリングした創傷の全数で割り、そして１００を掛けた。

”　創傷をうけた後の９日目には、ペプチドーヒアルロネート複合体処理した創 傷は、空気中にさらし、ヒアルロネートおよびコントロール処理した創傷がそれ ぞれ、０％、１０％、７０％であったのに比べて、９０％上皮化しており、これ はペプチドーヒアルロネート複合体は創傷の治癒を促進するこ２Δｊ枯ｆ暮Ｉ； δ１する丁εムＬＯ−ｒ）ジυヂｍり効ｒ””　Ｊ”Ｊ／％　）’ｔ’＋７７− 、ｔｊｎ　５ｉｘ７　８　９　１０　ユ１　１２ 本発明は、現在のところ好ましい実施態様を参考として記述されているが、様々 な修飾が本発明から離れることな（当業者になされ得ることは理解されるべきで ある。従って、本発明は次の請求項において詳細に述べられる。

う・・ｌトリグＩＰｆ：　＃Ｉ％１％フタスリ定日数 ラ・・１１−のシ閉：　フシドロー１しｉ−ン１ｈ害＋＋Ａン（％ｌとしてつダ 東ζ日枚 う・リドめｐｑ、第λ。９〔拘釘　：　少１イ蔦ウ　ダ依３　ｑ　＞＋Ｉ　定Ｂ 叡 う１．μめｔρ閏１１：　フレトＱ−１し１；灼７１枦１．登（−）ＬＬｊｑ畑 Ｓ日秋 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）１、特許出願の表示 ＰＣＴ／［ｌ５８９１０５７７１ 、発明の名称 創傷治癒に活性のあるポリペプチド−ポリマー複合体３、特許出願人 住所　アメリカ合衆国　カリフォルニア　９２０３７．　ラ　ホヤ。

ノース　トレイ　パインズ　ロード　１０９０１名称　ラ　ホヤ　キャンサー　 リサーチ　ファウンデーション４；代理人 住所　〒５４０大阪府大阪市中央区域見−Ｔ目２番２７号５、補正書の提出年月 日 １９９０年１１月１５日　゛ ６、添付書類の目録 （１）補正書の写しく翻訳文）　１通 正された君　の ａ、アミノ酸配列Ｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを含む越ペプチドであり、ＹはＲまたはｄ Ｒであり、該ペプチドは細胞付着促進活性を有する；および す、細胞結合に対する該親和性を実質的に減少させることなく該ペプチドに結合 した生分解性ポリマー。

２、前記合成ポリペプチドが、Ｋ、ｄＫ％　Ｒｓ　ｄ　Ｒ，オルニチンまたはＤ −オルニチンから選択される、少なくとも３つの同定されたアミノ酸からなる、 少なくとも１つのグループを配列中にさらに含有する、請求項１に記載の複合体 。

３、前記ポリペプチドがそのＣ末端にアミノ酸リシン（Ｋ）を有する、請求項１ に記載の複合体。

４、前記ペプチドが以下のアミノ酸配列からなる群から選択される、請求項１に 記載の複合体： Ｇ　ＲＧ　Ｄ　Ｓ　Ｐ　Ｋ； ＲＲＲＲＲＲＧ　Ｄ　Ｓ　Ｐ　Ｋ： Ｇ（ｄＲ）ＧＤＳＰＡＳＳＫ； ｎＭＥ　Ｇ　（ｄＲ）（ｄＲ）（ｄＲ）（ｄＲ）（ｄＲ）ＧＧＧ（ｄＲ）ＧＤＳ ＰＡＳＳＫ； Ｇ　（ｄＲ）（ｄＲ）（ｄＲ）（ｄＲ）（ｄＲ）Ｇ　Ｇ　Ｇ（ｄＲ）　Ｇ　Ｄ　 Ｓ　Ｐ　Ａ　Ｓ　Ｓ　Ｋ；および上記配列のいずれかを含むポリペプチド。

５　、前記生分解性ポリマーが、ヒアルロネート、コンドロイチン硫酸、ヘパリ ン、ヘパリン硫酸、ポリラクテート、ポリグリコール酸、デンプンまたはコラー ゲンからなる群から選択される、請求項１に記載の複合体。

６、前記生分解性ポリマーがヒアルロン酸を特徴する請求項１に記載の複合体。

７、前記生分解性ポリマーがコンドロイチン硫酸を特徴する請求項１に記載の複 合体。

８、Ａ　ｒ　ｇ−Ｇ　１　ｙ−Ａ　ｓ　ｐを含む鯨ポリペプチドと、少なくとも １つのカルボキシル基、アミン基またはスルフヒドリル基を含む生分解性ポリマ ーとを含有する、ｍとして１　の汁　に　な複合体を調製する方法であって、架 橋／カップリング試薬によって該生分解性ポリマー上の該カルボキシル基に該ポ リペプチドのアミノ酸鎖または末”端を結合させる工程を包含する、調製方法。

９、請求項８の方法によって調製される複合体。

１０、前記架橋／カップリング試薬が、ｌ−エチル−３−（３−ジメチルアミノ プロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、ジシクロへ手ジルカルボジイミド、グル タルアルデヒド、シアノゲンブロマイドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドか らなる群から選択される、請求項８に記載の方法。

１１、前記ポリペプチドが以下からなる群から選択される、請求項８に記載の方 法： Ｇ　（ｄＲ）　（ｄＲ）　（ｄＲ）　（ｄＲ）　（ｄＲ）Ｇ　Ｇ　Ｇ（ｄＲ）Ｇ ＤＳＰＡＳＳＫ： Ｇ　ＲＧ　Ｄ　Ｓ　Ｐ　Ｋ； ＲＲＲＲＲＲＧ　Ｄ　Ｓ　Ｐ　Ｋ； Ｇ（ｄＲ）ＧＤＳＰＡＳＳＫ： ｎＭｅ　Ｇ　（ｄＲ）　（ｄＲ）　（ｄＲ）　（ｄＲ）　（ｄＲ）ＧＧＧ（ｄＲ ）ＧＤＳＰＡＳＳＫ： Ｇ　（ｄＲ）　（ｄＲ）　（ｄＲ）　（ｄＲ）　（ｄＲ）Ｇ　Ｇ　Ｇ（ｄＲ）　 Ｇ　Ｄ　Ｓ　Ｐ　Ａ　Ｓ　Ｓ　Ｋ；および上記配列のいずれかを含むポリペプチ ド。

１２、前記生分解性ポリマーが、ヒアルロネート、コンドロイチン硫酸、ヘパリ ン、ヘパリン硫酸、ポリラクテート、ポリグリコール酸、デンプンまたはコラー ゲンからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。

１３、前記生分解性ポリマーがヒアルロン酸である、請求項８に記載のム［複合 体］。

１４、前記生分解性ポリマーがコンドロイチン硫酸である、請求項８に記載の方 法［ｙ１合体コ。

１５、前記架橋／カップリング試薬が１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ ロピル 項８に記載の方法。

１６、創傷を処置する方法であって、該創傷に請求項１の複合体を投与ことを包 含する、処置方法。

１７、以下からなる［なる］群から選択される観ペプチド： ｎＭｅ　Ｇ　（ｄＲ）　（ｄＲ）　（ｄＲ）　（ｄＲ）　（ｄＲ）ＧＧＧ（ｄＲ ）ＧＤＳＰＡＳＳＫ；およびＧ　（ｄＲ）　（ｄＲ）　（ｄＲ）　（ｄＲ）　（ ｄＲ）Ｇ　Ｇ　Ｇ（ｄＲ）ＧＤＳＰＡＳＳＫｏ １８、創傷を処置する方法であって、該創傷に請求項９の複合体を投与ごとを包 含する、処置方法。

１９、前記創傷が、重度の熱傷、皮膚移植供与部位、褥瘉性潰瘍、糖尿病性潰瘍 、手術の切開創、またはケロイド形成創傷である、請求項１８に記載の方法。

２０、組織再生を誘発する方法であって、該組織再生が所望される部位に請求項 １の複合体を投与することを包含する、方法。

２１、傷跡の形成を低減する方法であって、該傷跡の形成が低減されるべき組織 に請求項１の複合体を投与することを包含する、方法。

国際調査報告 ｋｔｗ−−←−＋ｔａｌＡ６Ｍｔ＊＋１１＋１１１１．ＰＣＴ／υ５８９１０５ ７７１国際調査報告

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．以下のａおよびｂを含有する複合体：ａ．アミノ酸配列Ｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ を含むペプチドであり、ＹはＲまたはｄＲであり、該ポリペプチドは細胞付着促 進活性を有する；および ｂ．細胞結合に対する該親和性を実質的に減少させることなく該ペプチドに結合 した生分解性ポリマー。
2. ２．前記合成ポリペプチドが、Ｋ，ｄＫ、Ｒ、ｄＲ、オルニチンまたはＤ−オル ニチンから選択される、少なくとも３つの同定されたアミノ酸からなる、少なく とも１つのグループを配列中にさらに含有する、請求項１に記載の複合体。
3. ３．前記ポリペプチドがそのＣ末端にアミノ酸リシン（Ｋ）を有する、請求項１ に記載の複合体。
4. ４．前記ペプチドが以下のアミノ酸配列からなる群から選択される、請求項１に 記載の複合体： 【配列があります】； 【配列があります】； 【配列があります】； 【配列があります】； 【配列があります】；および 上記配列のいずれかを含むポリペプチド。
5. ５．前記生分解性ポリマーが、ヒアルロネート、コンドロイチン硫酸、へパリン 、へパリン硫酸、ポリラクテート、ポリグリコール酸、デンプンまたはコラーゲ ンからなる群から選択される、請求項１に記載の複合体。
6. ６．前記生分解性ポリマーがヒアルロン酸を含有する、請求項１に記載の複合体 。
7. ７．前記生分解性ポリマーがコンドロイチン硫酸を含有する、請求項１に記載の 複合体。
8. ８．Ａｒｇ−ＧＬＹ−Ａｓｐを含むポリペプチドと、少なくとも１つのカルボキ シル基、アミノ基またはスルフヒドリル基を含む生分解性ポリマーとを含有する 複合体を調製する方法であって、架橋／カップリング試薬によって該生分解性ポ リマー上の該カルボキシル基に該ポリペプチドのアミノ酸鎖または末端を結合さ せる工程を包含する、調製方法。
9. ９．請求項８の方法によって調製される複合体。
10. １０．前記架橋／カップリング試薬が、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ プロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド、グル タルアルデヒド、シアノデンブロマイドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドか らなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
11. １１．前記ポリペプチドが以下からなる群から選択される、請求項８に記載の方 法： 【配列があります】； 【配列があります】； 【配列があります】； 【配列があります】： 【配列があります】； 【配列があります】；および 上記配列のいずれかを含むポリペプチド。
12. １２．前記生分解性ポリマーが、ヒアルロネート、コンドロイチン硫酸、ヘパリ ン、ヘパリン硫酸、ポリラクテート、ポリグリコール酸、デンプンまたはコラー ゲンからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
13. １３．前記生分解性ポリマーがヒアルロン酸である、請求項８に記載の複合体。
14. １４．前記生分解性ポリマーがコンドロイチン硫酸である、請求項８に記載の複 合体。
15. １５．前記架橋／カップリング試薬が１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ ロピル）カルボジイミドである、請求項８に記載の方法。
16. １６．創傷を処置する方法であって、該創傷に請求項１の複合体を投与ことを包 含する、処置方法。
17. １７．以下のからなる群から選択されるペプチド：【配列があります】；および 【配列があります】
18. １８．創傷を処置する方法であって、該創傷に請求項９の複合体を投与ことを包 含する、処置方法。
19. １９．前記創傷が、重度の熱傷、皮膚移植供与部位、褥瘡性潰瘍、糖尿病性潰瘍 、手術の切開創、またはケロイド形成創傷である、請求項１８に記載の方法。
20. ２０．組織再生を誘発する方法であって、該組織再生が所望される部位に請求項 １の複合体を投与することを包含する、方法。
21. ２１．傷跡の形成を低減する方法であって、該傷跡の形成が低減されるべき組織 に請求項１の複合体を投与することを包含する、方法。