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Daten der weitergeführten Anmeldung
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Diese
Anmeldung basiert auf vorausgehenden Anmeldungen, U.S.S.N. 60/037,327
(Atty. Dock. Nr. CRP-111PR), eingereicht am 7. Februar 1997, und
U.S.S.N. 60/047,909 (Atty. Dock. Nr. CRP-147PR), eingereicht am
29. Mai 1997.
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Gebiet der Erfindung
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Das
Ziel der Erfindung ist in den Ansprüchen definiert.
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Die
hier offenbarte Erfindung betrifft Stoffe und ihre Verwendung für die Herstellung
eines Medikaments für
die Reparatur von Knochendefekten unter Verwendung von knochenbildenden
Proteinen.
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Hintergrund der Erfindung
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Eine
Klasse von Proteinen wurde jetzt identifiziert, die kompetent sind,
als echte chondrogene Gewebemorphogene zu wirken und allein in der
Lage sind, die Proliferation und Differenzierung von Vorläuferzellen in
funktionelles Knochen-, Knorpel-, Sehnen- und/oder ligamentales
Gewebe zu induzieren. Diese Proteine, die hier als "knochenbildende Proteine" oder "morphogene Proteine" oder "Morphogene" bezeichnet werden, umfassen
Mitglieder der Familie von morphogenen Proteinen des Knochens (BMPs),
die ursprünglich
durch ihre Fähigkeit
identifiziert wurden, die ectopische, endochondrale Knochenmorphogenese
zu induzieren. Die knochenbildenden Proteine werden im Stand der
Technik im Allgemeinen als Untergruppe der TGF-β-Superfamilie von Wachstumsfaktoren
(Hogan (1996) Genes & Development
10: 1580–1594)
klassifiziert. Mitglieder der Familie der Proteine der Morphogene
umfassen das knochenbildende Protein-1 der Säuger (OP-1, auch bekannt als
BMP-7, und das Drosophila-Homologe 60A), das knochenbildende Protein-2
(OP-2, auch bekannt als BMP-8), das knochenbildende Protein-3 (OP-3),
BMP-2 (auch bekannt als BMP-2A oder CBMP-2A, und das Drosophila-Homologe DPP),
BMP-3, BMP-4 (auch bekannt als BMP-2B oder CBMP-2B), BMP-5, BMP-6 und
sein murines Homologes Vgr-1, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, GDF3
(auch bekannt als Vgr2), GDF8, GDF9, GDF10, GDF11, GDF12, BMP-13,
BMP-14, BMP-15,
GDF-5 (auch bekannt als CDMP-1 oder MP52), GDF-6 (auch bekannt als
CDMP-2), GDF-7 (auch
bekannt als CDMP-3), das Xenopus-Homologe Vg1 und NODAL, UNIVIN,
SCREW, ADMP und NEURAL. Mitglieder dieser Familie codieren sezernierte
Polypeptidketten, die gemeinsame strukturelle Eigenschaften haben,
einschließlich
der Prozessierung von einer Vorläufer-"pro-Form", um eine reife Polypeptidkette
zu ergeben, die zur Dimerisierung in der Lage ist und die am Carboxy-Terminus
eine aktive Domäne
von etwa 97–106
Aminosäuren
hat. Alle Mitglieder haben ein konserviertes Muster von Cysteinen
in dieser Domäne
und die aktive Form dieser Proteine kann entweder ein Disulfid-verknüpftes Homodimeres
eines einzigen Mitglieds der Familie sein oder ein Heterodimeres
von zwei verschiedenen Mitgliedern (vgl. z. B. Massague (1990) Annu.
Rev. Cell. Biol. 6: 597; Sampath et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:
13198). Vgl. auch
U.S. 5,011,691 ;
U.S. 5,266,683 , Ozkaynak
et al., (1990) EMBO J. 9: 2085–2093, Wharton
et al., (1991) PNAS 88: 9214–9218),
(Ozkaynak (1992) J. Biol. Chem. 267: 25220–25227 und
U.S. 5,266,683 ); Celeste et al., (1991)
PNAS 87: 9843–9847);
(Lyons et al., (1989) PNAS 86: 4554–4558). Die Offenbarungen beschreiben
die Aminosäure-
und DNA-Sequenzen
ebenso wie die chemischen und physikalischen Charakteristika dieser
knochenbildenden Proteine. Vgl. auch Wozney et al. (1988) Science
242: 1528–1534;
BMP 9 (
WO93/00432 ,
veröffentlicht
am 7. Januar 1993); DPP (Padgett et al. (1987) Nature 325: 81–84; und
Vg-1 (Weeks (1987) Cell 51: 861–867).
WO95/33502 ,
FR-A-2564732 und
EP-A-0321277 offenbaren knochenbildende
Zusammensetzungen, die eine Matrix umfassen.
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Somit
wurden echte knochenbildende Proteine nunmehr identifiziert, isoliert
und cloniert, die in der Lage sind, die vorstehend beschriebene
Kaskade von morphogenen Ereignissen zu induzieren, die in endochondraler
Knochenbildung resultieren. Ob natürlicherweise vorkommend oder
synthetisch hergestellt, von diesen knochenbildenden Faktoren ist
gezeigt worden, dass sie, wenn sie in Verbindung mit einer herkömmlichen
Matrix oder einem herkömmlichen
Substrat, das die Anheftung, Proliferation und Differenzierung von
migratorischen Vorläuferzellen
erlaubt, in einen Säuger
implantiert werden, die Rekrutierung von zugänglichen Vorläuferzellen
induzieren und ihre Proliferation stimulieren und damit die Differenzierung
in Chondrocyten und Osteoblasten induzieren und weiterhin die Differenzierung
von intermediärem
Knorpel induzieren, die Vaskularisierung, die Knochenbildung, die
Remodellierung und letztlich die Markdifferenzierung. Darüber hinaus
haben zahlreiche Anwender die Fähigkeit
von diesen knochenbildenden Proteinen gezeigt, wenn sie entweder Matrixmaterial
von natürlichen
Quellen wie Kollagen oder synthetisch hergestellten polymerem Matrixmaterial zugemischt
werden, dass sie die Knochenbildung induzieren, einschließlich der
endochondralen Knochenbildung unter Bedingungen, wo sonst kein echter
Knochenersatz stattfinden würde.
Wenn diese knochenbildenden Proteine zum Beispiel mit einem Matrixmaterial
kombiniert werden, induzieren sie die Bildung von neuem Knochen
bei: großen
segmentalen Knochendefekten, spinalen Fusionen und Brüchen. Ohne
Ausnahme beschreibt jede der vorstehend beschriebenen Offenbarungen
Implantieren oder Verabreichung der knochenbildenden Proteine an
der defekten Stelle durch Verpacken, Füllen und/oder Einwickeln der
defekten Stelle mit einem Gemisch aus knochenbildendem Protein und
Matrix, wobei das relative Volumen und die Oberfläche der
Matrix von Bedeutung sind. Im Falle von nicht einheitlichen Defekten,
die nicht spontan heilen, war es bisher herkömmliche Praxis, Volumen von
Gemischen aus Matrix-knochenbildendem Protein an der defekten Stelle
zu implantieren, mit ausreichenden Volumen zur Füllung des Defekts, um eine
3-dimensionales Gerüst für die anschließende Bildung
von neuem Knochen bereitzustellen. Während Standardknochenbrüche spontan
und ohne Behandlung heilen können,
war es in dem Maße,
in dem im Stand der Technik die Behandlung von Brüchen mit
knochenbildenden Proteinen in Betracht gezogen wurde, Praxis im
Stand der Technik, knochenbildende Proteine zusammen mit einer Matrix
lokal an einer defekten Stelle bereitzustellen, um die Heilung zu
fördern.
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Während das
Implantieren eines Volumens an Matrix im herkömmlichen Sinn, vor allem im
Fall von nicht heilenden, nicht einheitlichen Defekten, klug sein
kann, können
sich bei gewissen Patienten als Resultat dieser Praxis klinische
Konsequenzen entwickeln. Zum Beispiel können Patienten, denen wiederholte
Konstruktionen oder Defektreparaturen widerfahren, oder bei denen
das Matrixvolumen groß ist,
schädliche
immunologische Reaktionen gegen Matrizes entwickeln, die von Kollagen
abgeleitet sind. Kollagenmatrizes können gereinigt werden, aber
Reste von Verunreinigungen können
verbleiben, die für
gewisse Patienten stark allergen sind. In einer anderen Ausführungsform
kann entmineralisierte autogene, allogene oder xenogene Knochenmatrix
anstelle von Kollagen verwendet werden. Eine solche Matrix ist Kollagen
mechanisch überlegen und
kann in einigen Fällen
schädliche
Immunreaktionen verhindern, aber die richtige Herstellung ist teuer,
zeitaufwendig und die Verfügbarkeit
von zuverlässigen
Quellen für
Knochen kann beschränkt
sein. Solche Matrizes aus natürlichen
Quellen können
durch inerte Materialien wie Plastik ersetzt werden, aber Plastik
ist kein geeigneter Ersatz, da es nicht resorbiert und auf Anwendungen
beschränkt
ist, die einfache geometrische Konfigurationen erfordern. Bis jetzt
wurden auch biologisch abbaubare Polymere und Copolymere als Matrizes
zur Reparatur nicht einheitlicher Defekte verwendet, denen knochenbildende
Proteine beigemischt waren. Während
solche Matrizes einige der vorstehenden Unzulänglichkeiten überwinden
können,
erfordert die Verwendung solcher Matrizes immer noch die Bestimmung
und Kontrolle von Eigenschaften wie der Polymerchemie, der Teilchengröße, der
biologischen Verträglichkeit
und anderer Besonderheiten, die für die Anwendbarkeit kritisch
sind.
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Zusätzlich würden Individuen,
die wegen eines erworbenen oder angeborenen Zustands eine verminderte
Fähigkeit
haben, Knochenbrüche
oder andere Defekte zu heilen, die normalerweise eine spontane Reparatur
erfahren, aus Verfahren und injizierbaren Zusammensetzungen ihren
Nutzen ziehen, die die Reparatur von Knochen und/oder Sehnen verbessern,
ohne ein chirurgisches Verfahren zu erfordern. Letztlich stellt
eine injizierbare Formulierung auch Mittel zur Reparatur von osteochondralen
oder chondralen Defekten bereit, ohne ein chirurgisches Verfahren
zu erfordern.
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Es
verbleibt Bedarf an Mitteln, Implantaten und Verfahren zur Reparatur
von Knochendefekten, die nicht auf einer Matrixkomponente beruhen.
Es verbleibt ein besonderer Bedarf an Mitteln, Implantaten und Verfahren,
die die Verabreichung von Knochen-induzierenden Mengen an knochenbildenden
Proteinen ohne gleichzeitige Verabreichung von raumfüllenden
Matrixmaterialien erlaubt, die für
den Empfänger
von Nachteil sein können
oder biomechanisch und drehstabil nicht ideal sind. Es verbleibt
Bedarf an der Bereitstellung von Verfahren und Mitteln, insbesondere
injizierbaren Mitteln, die die Rate der Bildung von neuem Knochen
beschleunigen und die Qualität
verbessern.
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Demgemäß ist es
ein Ziel der vorliegenden Erfindung, die Verwendung von Zusammensetzungen
für die
Herstellung eines Medikaments für
die Reparatur von Knochendefekten, bereitzustellen, die den Bedarf
einer Zumischung von knochenbildenden Proteinen zu einer Matrix
umgehen. Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung von matrixfreien
knochenbildenden Zusammensetzungen für die Herstellung von Medikamenten
für die
Reparatur von nicht heilenden, nicht einheitlichen Defekten bereit,
ebenso wie für
die Förderung einer
verbesserten Knochenbildung bei Knochenbrüchen. Diese und andere Ziele,
zusammen mit Vorteilen und Eigenschaften der hier offenbarten Erfindung,
werden durch die folgende Beschreibung, die folgenden Figuren und
die folgenden Ansprüchen
anschaulich.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass ein knochenbildendes
oder für
den Knochen morphogenes Protein wie OP-1, in Zumischung zu einer
wässrigen
Lösung
als Träger
und nicht einem herkömmlichen
Matrixmaterial, die endochondrale Knochenbildung induzieren kann,
die ausreichend ist, um segmentale Knochendefekte kritischer Größe zu reparieren.
Somit überwindet
diese Entdeckung die vorstehend beschriebenen Probleme, die mit
herkömmlichen
Materialien und Verfahren zur Reparatur von Knochendefekten einhergehen,
weil sie die Eliminierung von Matrixmaterial erlaubt. Weiterhin
ist diese Entdeckung angesichts der bestehenden orthopädischen
und rekonstruktiven Praxis unerwartet und widerspricht dem gegenwärtigen Verständnis des
Fachgebiets für
die Prozesse der Knochenreparatur/-bildung.
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Wie
hier offenbart, wird nun anerkannt, dass ein knochenbildendes Protein
einer wässrigen
Lösung zugemischt
wird, wie hierin definiert, um ein matrixfreies Mittel zu bilden,
das, wenn es einem Säuger
verabreicht wird, bei der Verbesserung der Reparatur von nicht einheitlichen
Knochendefekten und Brüchen
wirksam ist. Wie hier offenbart, werden Verfahren und Mittel zur
Induzierung der Bildung von neuem Knochen an einer lokalen Defektstelle
bereitgestellt, ohne den Bedarf der Bereitstellung einer dreidimensionalen
Strukturkomponente an der defekten Stelle. Wie hier beabsichtigt,
ist eine "matrixfreie" knochenbildende
Vorrichtung eine Vorrichtung, die zur Zeit der Verabreichung an
den Empfänger
ohne Matrix ist. Es ist zu verstehen, dass der Ausdruck "Matrix" eine Strukturkomponente
oder ein Substrat meint, die eine dreidimensionale Form hat und
an der gewisse zelluläre
Ereignisse, die in die Morphogenese des endochondalen Knochens involviert sind,
ablaufen; eine Matrix wirkt als eine zeitweise Gerüststruktur
für die
Infiltration von Zellen, die Zwischenräume für die Anheftung, die Proliferation
und Differenzierung solcher Zellen hat.
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Die
Erfindung stellt in einem Aspekt die Verwendung einer matrixfreien
Zusammensetzung ohne Gerüststruktur
für die
Herstellung eines Medikaments für
die Induktion von Knochenbildung in einem Säuger bereit, die ausreicht,
um einen Defekt zu reparieren. Eine Ausführungsform umfasst den Schritt
der Bereitstellung einer matrixfreien knochenbildenden Vorrichtung
für einen
defekten Ort, der einen Hohlraum definiert. Die matrixfreie Zusammensetzung
kann aus knochenbildendem Protein in Zumischung zu einer wässrigen
Lösung zusammengesetzt
sein. Diese Zusammensetzung induziert die Bildung von neuem Knochen,
welcher den defekten Ort auffüllt
und dabei den Defekt repariert. Wie hier beabsichtigt, wird eine
matrixfreie knochenbildende Zusammensetzung an einem defekten Ort
in einem Volumen bereitgestellt, das nicht ausreichend ist, um den Hohlraum
an dem defekten Ort zu füllen.
In gewissen Ausführungsformen
umfasst der Hohlraum ein Volumen, das zu einer endogenen oder spontanen
Reparatur nicht in der Lage ist. Beispiele für Defekte, die für eine Reparatur
mit dem vorliegenden Verfahren geeignet sind, umfassen segmentale
Defekte mit kritischer Größe und nicht
einheitliche Brüche.
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In
einer anderen Ausführungsform
stellt die Erfindung Zusammensetzungen und ihre Verwendung für die Herstellung
eines Medikaments für
die Verbesserung der Reparatur eines Bruchs bereit durch die Bereitstellung
der hier beschriebenen matrixfreien knochenbildenden Zusammensetzung
für eine
Bruchdefektstelle. Die Fähigkeit
der hier beschriebenen Zusammensetzungen, die Bruchreparatur substantiell
zu verbessern, einschließlich
der Beschleunigung der Wachstumsrate und der Verbesserung der Qualität von neu
gebildetem Knochen, hat Implikationen auf die Verbesserung der Knochenheilung
bei betroffenen Individuen wie Diabetikern, Rauchern, fettleibigen
Individuen und anderen, die, wegen eines erworbenen oder angeborenen
Zustands, eine verminderte Fähigkeit
haben, Knochenbrüche
zu heilen, einschließlich
Individuen mit beeinträchtigtem
Blutfluß zu
ihren Extremitäten.
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In
noch einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine
matrixfreie knochenbildende Vorrichtung zur Induzierung der Knochenbildung
in einem Säuger
bereit. Wie hier beabsichtigt, umfasst eine bevorzugte knochenbildende
Zusammensetzung ein bei der Knochenbildung aktives Protein bereit,
das in einer wässrigen
Lösung
dispergiert ist. Bevorzugte knochenbildende Proteine umfassen, sind
aber nicht beschränkt auf,
OP-1, OP-2, BMP-2, BMP-4, BMP-5 und BMP-6 (siehe nachstehend). Somit
fehlt den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung eine Gerüststruktur
und sie sind im Wesentlichen frei von Matrix, wenn sie einem Säuger verabreicht
werden.
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Insbesondere
für die
Verbesserung der Reparatur eines Knochenbruchs ist in Betracht zu
ziehen, dass eine geeignete Formulierung an der Bruchstelle zu dem
Zeitpunkt injiziert werden kann, wenn der Bruch gerichtet wird,
um die Wachstumsrate von neu gebildetem Knochen zu beschleunigen
und die Qualität
von neu gebildetem Knochen zu verbessern.
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Die
Formulierung ist eine Lösung,
wie durch Kombination des Proteins mit einer sauren gepufferten Lösung, z.
B. pH 4,0–4,5,
zum Beispiel einem Acetat- oder Citratpuffer.
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Im
Allgemeinen sind die Proteine der Erfindung dimere Proteine, die
die endochondrale Morphogenese von Knochen induzieren. Knochenbildende
Proteine umfassen ein Paar von Polypeptiden, die, wenn sie gefaltet
sind, eine Konfiguration annehmen, die ausreichend ist, damit das
resultierende dimere Protein eine morphogenetische Wirkung ausübt. Das
heißt,
dass knochenbildende Proteine im Allgemeinen alle der folgenden biologischen
Funktionen in einer morphogenetisch sensitiven Umgebung induzieren:
die Stimulierung der Proliferation von Vorläuferzellen; die Stimulierung
der Differenzierung von Vorläuferzellen;
die Stimulierung der Proliferation von differenzierten Zellen; und
die Unterstützung
des Wachstums und der Erhaltung von differenzierten Zellen. Vorläuferzellen
sind nicht bestimmte Zellen, die in der Lage sind, in einen oder
mehr spezifische Typen von differenzierten Zellen zu differenzieren,
in Abhängigkeit
von ihrem genetischen Repertoire und der Gewebespezifität der sensitiven
Umgebung, in der die Morphogenese induziert wird. In der vorliegenden
Erfindung können
knochenbildende Proteine die morphogenetische Kaskade induzieren,
die die endochondrale Knochenbildung typisiert.
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Wie
hier verwendet umfasst der Ausdruck "Morphogen", "Knochenmorphogen", "morphogenes Knochenprotein", "BMP", "knochenbildendes
Protein" und "knochenbildender
Faktor" die Klasse
an Proteinen, die durch das menschliche knochenbildende Protein
1 (hOP-1) typisiert werden. Die Nucleotid- und Aminosäuresequenzen
für hOP-1
werden in den SEQ ID Nrs 1 und 2 bereitgestellt. Zur Erleichterung
der Beschreibung wird hOP-1 hier des Weiteren als ein repräsentatives
knochenbildendes Protein bezeichnet. Es wird jedoch vom Durchschnittsfachmann
auf dem Fachgebiet erkannt, dass hOP-1 lediglich ein Repräsentant
der TGF-β-Unterklasse
der echten Gewebemorphogene ist und in der Lage ist, als knochenbildendes
Protein zu wirken, und es ist nicht beabsichtigt, die Erfindung
zu beschränken.
Andere bekannte und nützliche
Proteine umfassen BMP-2,
BMP-3, BMP-3b, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12,
BMP-15, GDF-1, GDF-3, GDF-5, GDF-6, GDF-7, GDF-8, GDF-9, GDF-10,
GDF-11.
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Wie
hier beabsichtigt, umfasst diese Familie an knochenbildenden Proteinen
längere
Formen eines vorgegebenen Proteins ebenso wie phylogenetische, d.
h. Arten- und allelische Varianten. Zusätzlich können die knochenbildenden Proteine, die
bei dieser Erfindung von Nutzen sind, Formen umfassen, die verschiedene Glycosylierungsmuster
und verschiedene N-Termini haben, natürlicherweise vorkommen können oder
biosynthetisch abgeleitet sein können,
und die durch Expression von rekombinanter DNA in prokaryontischen
oder eukaryontischen Wirtszellen produziert werden können. Die
Proteine sind als einzelne Art aktiv (d. h. Homodimer) oder kombiniert
als gemischte Arten, einschließlich
Heterodimeren.
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Wenn
bei der Ausführung
der Erfindung das Protein in Verbindung mit einem Träger bereitgestellt
wird, muß der
Träger
ohne Gerüststruktur
sein, wie vorstehend festgestellt. Wenn ein bevorzugter Träger einem knochenbildenden
Protein zugemischt wird, wird eine Vorrichtung gebildet, die im
Wesentlichen frei von Matrix ist, wie hier definiert. "Im wesentlichen frei
von Matrix" ist
so zu verstehen, dass die trägerlose
Vorrichtung, wie sie vor der Verabreichung formuliert wird, keine
Substratkomponente enthält,
die per se als Gerüst
dient. Das heißt,
dass die Vorrichtung kein Substrat enthält, das von einer exogenen
Quelle eingeführt
wurde und in der Lage ist, als Gerüst zu dienen. Anders ausgedrückt, ist
der Träger
anerkanntermaßen
vor der Verabreichung wegen seiner chemischen Natur nicht in der
Lage, zu der Vorrichtung eine Gerüststruktur beizutragen. Per
Definition sind bevorzugte Träger
biologisch verträglich,
nicht starr und amorph und haben keine definierten Oberflächen. Wie
hier verwendet, bedeutet "nicht
starr" eine Trägerformulierung,
die lose oder locker ist oder anders im Wesentlichen nicht in der
Lage, eine dreidimensionale Struktur bereitzustellen oder zu bilden,
die eine oder mehr definierte Oberflächen hat. Wie hier verwendet,
bedeutet "amorph" das Fehlen einer
definierten dreidimensionale Form, oder einer spezifischen Gestalt,
das heißt
ohne besondere Gestalt oder Form oder mit einer undefinierten Gestalt
oder Form. Zusätzlich
tragen bevorzugte Träger
kein signifikantes Volumen zu der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung
bei. Das heißt,
bevorzugte Träger
erlauben die Dispersion eines knochenbildenden Proteins so, dass
das Endvolumen der resultierenden Vorrichtung weniger ist als das
Volumen des Hohlraums an der defekten Stelle. Der Träger ist
eine wässrige
Lösung.
Zum Beispiel können
besonders bevorzugte Träger
ohne Einschränkung
Acetatpuffer, physiologische Salzlösungen umfassen. In einer anderen Ausführungsform
könne knochenbildende
Proteine allein an einer defekten Stelle bereitgestellt werden.
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Zusammenfassend
kann die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung verwendet werden,
um die endochondrale Knochenbildung zu induzieren, die ausreicht,
Knochendefekte zu reparieren, die nicht spontan heilen, ebenso wie
die Wachstumsrate und/oder Qualität der Knochenneubildung zu
erhöhen
und zu verbessern, insbesondere bei der Reparatur von Brüchen. Die
vorliegende Erfindung ist insbesondere geeignet für die Verwendung
bei Empfängern,
die allergisch gegen Kollagen oder Matrix sind. Sie ist auch besonders geeignet
für die
Verwendung bei Patienten, die wiederholte rekonstruktive Chirurgie
benötigen
ebenso wie für Krebspatienten
als eine Alternative für
Rekonstruktionsverfahren unter Verwendung von Metallgelenken. Die vorliegende
Erfindung ist auch für
Individuen von Nutzen, deren Fähigkeit
zur spontanen Knochenreparatur beeinträchtigt ist, wie Diabetiker,
Raucher, fettleibige Individuen, immundefiziente Individuen und
alle Individuen mit reduziertem Blutfluß zu ihren Extremitäten. Andere
Anwendungen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, prosthetische Reparatur
und massive Allograftreparatur.
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Ausführliche Beschreibung von bevorzugten
Ausführungsformen
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Um
den Inhalt der beanspruchten Erfindung klarer und genauer zu beschreiben,
ist es beabsichtigt, dass die folgenden Definitionen eine Anleitung
bei der Bedeutung von spezifischen Ausdrücken sind, die in der folgenden
geschriebenen Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen verwendet werden.
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"Knochenbildung" bedeutet die Bildung
von endochondralem Knochen. Bei Menschen beginnt die Knochenbildung
während
der ersten 6–8
Wochen der Entwicklung des Fötus.
Vorläuferstammzellen
von mesenchymalem Ursprung wandern zu vorbestimmten Stellen, wo
sie entweder: (a) kondensieren, proliferieren und in knochenbildende
Zellen (Osteoblasten) differenzieren, ein Prozess, der im Schädel beobachtet
wird und als "intramembrane
Knochenbildung" bezeichnet
wird; oder (b) kondensieren, proliferieren und in knorpelbildende
Zellen (Chondroblasten) als Zwischenprodukt differenzieren, die
anschließend
von knochenbildenden Zellen ersetzt werden. Spezifischer differenzieren
mesenchymale Stammzellen in Chondrocyten. Die Chondrocyten werden
dann kalzifiziert, hypertrophieren und werden durch neugebildeten
Knochen ersetzt, der von differenzierten Osteoblasten gemacht wird,
die nun an der Stelle anwesend sind. Anschließend wird der mineralisierte
Knochen extensiv umgeformt und danach von einem Knöchelchen
verdrängt,
das mit funktionellen Knochenmarkselementen gefüllt ist. Dieser Prozess wird
bei langen Knochen beobachtet und als "endochondrale Knochenbildung" bezeichnet. Im Leben
nach dem fötalen
Zustand hat der Knochen die Fähigkeit
zur Selbstreparatur bei Verletzung, indem er den zellulären Prozess
der embryonalen endochondralen Knochenentwicklung nachahmt. Das
heißt,
dass mesenchymale Vorläuferstammzellen
aus dem Knochenmark, Peristeum und Muskel induziert werden können, zu
der defekten Stelle zu wandern und die vorstehend beschriebene Kaskade
an Ereignissen zu beginnen. Dort akkumulieren sie, proliferieren
und differenzieren in Knorpel, der dann von neugebildetem Knochen
ersetzt wird.
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"Defekt" oder "defekte Stelle", wie hier beabsichtigt,
definiert einen Hohlraum, der eine Störung einer Knochenstruktur
ist, die eine Reparatur erfordert. "Hohlraum" ist so verstanden, dass er einen segmentalen Defekt
bedeutet. Ein Defekt kann das Resultat eines Unfalls sein, einer
Krankheit, eines chirurgischen Eingriffs und/oder von prosthetischem
Versagen. In gewissen Ausführungsformen
ist die defekte Stelle ein Hohlraum, der ein Volumen hat, das einer
endogenen oder spontanen Reparatur nicht zugänglich ist. Solche Defekte
werden auch als segmentale Defekte von kritischer Größe bezeichnet.
Im Stand der Technik ist anerkannt, dass solche Defekte eine Lücke von
etwa 3–4
cm sind, mindestens aber größer als
2,5 cm, der spontanen Reparatur unzugänglich. In anderen Ausführungsformen
ist die defekte Stelle ein nicht kritischer segmentaler Defekt von etwa
mindestens 0,5 cm, aber nicht mehr als etwa 2,5 cm. Im Allgemeinen
sind diese zu einer gewissen spontanen Reparatur fähig, obgleich
biomechanisch unterlegen derjenigen, die durch Anwendung der vorliegenden Erfindung
möglich
gemacht wird. Andere Defekte, die unter Verwendung der vorliegenden
Erfindung einer Reparatur zugänglich
sind, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, nicht einheitliche
Brüche;
Tumorresektionen; frische Brüche;
ebenso wie diejenigen, die von Krankheiten wie Krebs und anderen
degenerativen Knochenstörungen
herrühren. "Reparatur" ist so gemeint,
dass sie die Induktion einer Knochenneubildung bedeutet, die ausreichend
ist, den Hohlraum an der defekten Stelle zu füllen, "Reparatur" bedeutet aber nicht oder legt zwingend
ein Verfahren der vollständigen
Heilung nahe, oder eine Behandlung, die zu 100% wirksam bei der
Wiederherstellung eines Defekts zum physiologischen/strukturellen
Zustand vor dem Defekt ist.
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"Matrix" wird im Stand der
Technik so verstanden, dass sie ein den Knochen leitendes Substrat
bedeutet, das eine gerüstbildende
Struktur hat, an die infiltrierende Zellen anheften können, proliferieren
und an dem morphogenen Prozess teilhaben, der in Knochenbildung
kulminiert. In gewissen Ausführungsformen
kann die Matrix partikulär
und porös
sein, wobei die Porosität
eine kritische Eigenschaft bei ihrer Wirksamkeit bei der Induktion
der Knochenbildung ist, insbesondere bei der endochondralen Knochenbildung.
Wie früher
beschrieben, ist eine Matrix so zu verstehen, dass sie der herkömmlichen
knochenbildenden Vorrichtung gewisse strukturelle Komponenten bereitstellt
(d. h. bis jetzt eine poröse
partikuläre
Matrixkomponente wie Kollagen, demineralisierten Knochen oder synthetische
Polymere umfassend), um dabei wie eine vorübergehende und resorbierbare Gerüststruktur
für infiltrierende
Zellen zu wirken, die Zwischenräume
für Anheftung,
Proliferation und Differenzierung von solchen Zellen hat. Dementsprechend
bedeutet der Ausdruck "matrixfreie
knochenbildende Vorrichtung" oder
eine knochenbildende Vorrichtung, die "im Wesentlichen frei von Matrix" ist, eine Vorrichtung,
der zum Zeitpunkt der Verabreichung an den Empfänger eine im Fachgebiet anerkannte
Matrix fehlt. Darüber hinaus ist im Wesentlichen frei von Matrix
so zu verstehen, dass, wenn eine Vorrichtung an der defekten Stelle
bereitgestellt wird, kein Substrat von einer exogenen Quelle eingeführt wird,
die per se als Gerüst
dienen kann. Matrixfrei oder im Wesentlichen frei von Matrix ist
nicht so gemeint, dass es eine endogenen Matrix ausschließt, die
nach der Verabreichung der hier offenbarten Vorrichtungen an der
defekten Stelle induziert oder gebildet wird. Somit betrifft die
Erfindung weiterhin ein Verfahren zur Induzierung der Bildung einer
endogenen Matrix durch Bereitstellung der hier offenbarten matrixfreien
Vorrichtungen an der defekten Stelle.
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"Knochenbildende Vorrichtung" ist so zu verstehen,
dass sie eine Zusammensetzung bedeutet, die ein knochenbildendes
Protein umfasst, das in einem Träger
dispergiert ist, der eine wässrige
Lösung
ist. Knochenbildende Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung sind
in der Lage, eine Knochenbildung zu induzieren, die ausreichend
ist, eine defekte Stelle zu füllen,
die einen Hohlraum definiert. Knochenbildende Vorrichtungen sind
matrixfrei, wenn sie an der defekten Stelle bereitgestellt werden,
und werden der defekten Stelle in einem Volumen verabreicht, das
nicht ausreicht, den Hohlraum zu füllen, der durch die defekte
Stelle definiert wird. Eine Vorrichtung kann in einer flüssigen Konfiguration
vorliegen.
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"Knochenbildendes
Protein" oder morphogenes
Protein für
den Knochen wird im Allgemeinen so verstanden, dass es ein Protein
bedeutet, das die volle Kaskade an morphogenen Ereignissen induzieren
kann, die in der endochondralen Knochenbildung kulminieren. Wie
an anderer Stelle hierin beschrieben, wird die Klasse an Proteinen
durch das menschliche knochenbildende Protein (hOP1) typisiert.
Knochenbildende Proteine, die bei der Ausführung der Erfindung von Nutzen
sind, umfassen die bei der Knochenbildung aktiven Formen von OP1,
OP2, OP3, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP9, DPP, Vg1, Vgr, 60A
Protein, GDF-1, GDF-3, GDF-5, 6, 7, BMP10, BMP11, BMP15. In einer
gegenwärtig
bevorzugten Ausführungsform
umfasst das knochenbildende Protein eines von: OP1, OP2, OP3, BMP2,
BMP4, BMP5, BMP6, BMP9. Gewisse bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden
Erfindung umfassen das knochenbildende Protein OP-1. Gewisse andere
bevorzugte Ausführungsformen
umfassen reifes OP-1 das in einer physiologischen Salzlösung solubilisiert
ist. Wie woanders hier weiter beschreiben, können die knochenbildenden Proteine,
die zur Verwendung bei der Erfindung der Anmelder geeignet sind,
mittels Routineexperimenten unter Verwendung des auf dem Fachgebiet
anerkannten und von Reddi und Sampath beschriebenen Biotests identifiziert
werden.
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Bei
der Erfindung nützliche
Proteine umfassen eukaryontische Proteine, die als knochenbildende
Proteine identifiziert wurden (vgl.
U.S.
Patent 5,011,691 , das durch Bezugnahme eingeschlossen ist),
wie die OP-1-, OP-2-, OP-3- und CBMP-2-Proteine, so wie in der Aminosäuresequenz
verwandte Proteine wie DPP (aus Drosophila), Vg1 (aus Xenopus),
Vgr-1 (aus Maus), GDF-1 (aus Mensch, vgl. Lee (1991), PNAS 88: 4250–4254),
60A (aus Drosophila, vgl. Wharton et al. (1991), PNAS 88: 9214–9218),
Dorsalin-1 (aus Huhn, vgl. Basler et al. (1993) Cell 73: 687–702 und
GenBank-Zugangsnummer L12032) und GDF-5 (aus Maus, vgl. Storm et
al. (1994) Nature 368: 639–643).
BMP-3 wird auch bevorzugt. Noch andere Proteine umfassen osteogen
aktive Formen von BMP-3b (vgl. Takao et al. (1996) Biochem. Biophys.
Res. Comm. 219: 656–662), BMP-9
(vgl.
WO95/33830 ),
BMP-15 (vgl.
WO96/35710 ),
BMP-12 (vgl.
WO95/16035 ),
CDMP-1 (vgl.
WO94/12814 ),
CDMP-2 (vgl.
WO94/12814 ),
BMP-10 (vgl.
WO94/26893 ),
GDF-1 (vgl.
WO92/00382 ,
GDF-10 (vgl.
WO95/10539 ),
GDF-3 (vgl.
WO94/15965 )
und GDF-7 (vgl.
WO95/01802 ).
-
Bevorzugte
Träger
umfassen Acetatpuffer, (20 mM, pH 4,5), physiologische Salzlösung (PBS)
und Citratpuffer. Im Falle von Vorrichtungen, die Träger wie
Acetat und PBS umfassen, kann die Verabreichung durch Injektion
in der Präzipitation
gewisser knochenbildender Proteine an der Verabreichungstelle resultieren.
-
Die
Mittel zur Herstellung und Verwendung der Zusammensetzungen der
Erfindung, ebenso wie andre materielle Aspekte bezüglich ihrer
Natur und ihres Nutzens, einschließlich, wie der beanspruchte
Gegenstand der Erfindung herzustellen und zu verwenden ist, wird
aus dem folgenden weiter verstanden, welches die gegenwärtig als
beste erachtete Ausführungsform
der Erfindung darstellt.
-
I. BETRACHTUNGEN ZUM PROTEIN
-
A. Biochemische, strukturelle und funktionelle
Eigenschaften von morphogenen Proteinen des Knochens
-
Natürlicherweise
vorkommende Proteine, die hier als knochenbildende oder für Knochen
morphogene Proteine identifiziert und/oder anerkannt werden, bilden
eine getrennte Subgruppe innerhalb der losen evolutionären Gruppierung
von Sequenzverwandten Proteinen, die als TGF-β-Superfamilie oder -Supergenfamilie bekannt
sind. Die natürlicherweise
vorkommenden Morphogene des Knochens haben eine substantielle Aminosäuresequenzhomologie
in ihren C-terminalen Regionen (Domänen). Typischerweise werden
die vorstehend erwähnten
natürlicherweise
vorkommenden knochenbildenden Proteine als Vorläufer translatiert, die eine
N-terminale Signalpeptidsequenz
haben, typischerweise weniger als etwa 30 Reste, gefolgt von einer "pro"-Domäne, die
abgespalten wird, um die reife C-terminale Domäne zu ergeben. Das Signalpeptid
wird bei der Translation rasch abgespalten, an einer Spaltstelle,
die bei einer vorgegebenen Sequenz unter Verwendung des Verfahrens
von Von Heijne (1986) Nucleic Acids Research 14: 4683–4691 vorausgesagt
werden kann. Die pro-Domäne
ist typischerweise etwa dreimal größer als die voll prozessierte
reife C-terminale Domäne.
Hier betrifft die "pro"-Form eines Morphogens
ein Morphogen, das ein gefaltetes Paar an Polypeptiden umfasst,
von denen jedes die pro- und reife Form eines morphogenen Polypeptids
umfasst. Typischerweise ist unter physiologischen Bedingungen die
pro-Form eines Morphogens löslicher
als die reife Form. Die pro-Form scheint die primäre Form
zu sein, die von einer kultivierten Säugerzelle sezerniert wird.
-
Knochenbildendes
Protein aus natürlicher
Quelle in seiner reifen, nativen Form ist ein glycosyliertes Dimer,
das typischerweise ein offenbares Molekulargewicht von etwa 30–36 kDa
hat, wie mittels SDS-PAGE bestimmt. Wenn reduziert, ergibt das Protein
von 30 kDa zwei glycosylierte Peptiduntereinheiten, die ein apparentes
Molekulargewicht von etwa 16 kDa und 18 kDa haben. Im reduzierten
Zustand hat das Protein keine nachweisbare knochenbildende Aktivität. Das nicht
glycosylierte Protein, das auch knochenbildende Aktivität hat, hat
ein apparentes Molekulargewicht von etwa 27 kDa. Wenn reduziert,
ergibt das Protein von 27 kDa zwei nicht glycosylierte Polypeptide,
die ein apparentes Molekulargewicht von etwa 14 kDa bis 16 kDa haben
und in der Lage sind, in einem Säuger
die endochondrale Knochenbildung zu induzieren. Wie vorstehend beschrieben,
umfassen besonders nützliche
Sequenzen diejenigen, die die C-terminalen 102 Aminosäuresequenzen von
DPP (aus Drosophila) umfassen, Vg1 (aus Xenopus), Vgr-1 (aus Maus),
die OP1- und OP2-Proteine,
(vgl.
U.S.-Pat. Nr. 5,011,691 und
Oppermann et al., ebenso wie die Proteine, die als BMP2, BMP3, BMP4
(vgl.
WO88/00205 ,
U.S.-Patent Nr. 5,013,649 und
WO91/18098 ), BMP5 und BMP6
(vgl.
WO90/11366 ,
PCT/US90/01630 ) und BMP9
bezeichnet werden.
-
Wie
vorstehend festgehalten sind bei der vorliegenden Erfindung nützliche
Proteine im Allgemeinen dimere Proteine, die ein gefaltetes Paar
der vorstehenden Polypeptide umfassen. Solche morphogenen Proteine
sind inaktiv, wenn sie reduziert sind, sind aber aktiv als oxidierte
Homodimere und wenn sie in Kombination mit anderen der Erfindung
oxidiert werden, um Heterodimere zu ergeben. Somit können die
Mitglieder eines gefalteten Paares von morphogenen Polypeptiden
in einem morphogen aktiven Protein unabhängig von jedem der vorstehend
erwähnten
spezifischen Polypeptide ausgewählt
werden.
-
Die
morphogenen Proteine des Knochens, die bei den Materialien dieser
Erfindung von Nutzen sind, umfassen Proteine, die jede der vorstehend
beschriebenen Polypeptidketten umfassen, entweder isoliert aus natürlicherweise
vorkommenden Quellen oder hergestellt mittels rekombinanter DNA-
oder anderer synthetischer Verfahren. Die Proteine können Formen
umfassen, die verschiedene Glycosylierungsmuster haben, verschiedene
N-Termini, hergestellt durch Expression von rekombinanter DNA in
Wirtszellen.
-
Die
hier betrachteten morphogenen Proteine des Knochens können von
intakter oder verkürzter
cDNA oder von synthetischen DNAs in prokaryontischen oder eukaryontischen
Wirtszellen exprimiert werden, und gereinigt, gespalten, wiedergefaltet
und dimerisiert werden, um morphogen aktive Zusammensetzungen zu
bilden. Gegenwärtig
bevorzugte Wirtszellen umfassen E. coli oder Säugerzellen, wie CHO-, COS-
oder BSC-Zellen. Ausführliche
Beschreibungen der bei der Ausführung
dieser Erfindung nützlichen
morphogenen Proteine des Knochens, einschließlich ihrer Herstellung, Verwendung
und Testung auf knochenbildende Aktivität sind in zahlreichen Veröffentlichungen
offenbart, einschließlich
US-Patent Nr. 5,266,683 und
5,011,691 , deren Offenbarung
hier durch Bezugnahme eingeschlossen wird.
-
Somit
können
angesichts dieser Offenbarung geübte
Gentechniker Gene von cDNA oder genomischen Bibliotheken zahlreicher
verschiedener biologischer Arten isolieren, die geeignete Aminosäuresequenzen
codieren, oder DNAs aus Oligonucleotiden konstruieren, und sie dann
in verschiedenen Arten von Wirtszellen exprimieren, einschließlich Prokaryonten
und Eukaryonten, um große
Mengen an aktiven Proteinen zu produzieren, die in der Lage sind,
die Morphogenese von endochondialem Knochen in einem Säuger zu
stimulieren.
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B. Die Gewinnung von morphogenem Protein
des Knochens, OP-1
-
1. Lyphilisiertes Protein
-
OP-1
kann aus 20 mM Acetatpuffer, pH 4,5, mit 5% Mannitol, Lactose, Glycin
oder anderen Zusatz- oder Volumenmitteln unter Verwendung von Standardlyophilisierungsprotokollen
lyophilisiert werden. Von auf diese Weise wiederhergestelltem OP-1
ist beobachtet worden, dass es bei Aufbewahrung bei 4°C oder 30°C mindestens
sechs Monate biologisch aktiv ist.
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OP-1
kann auch aus einem Succinat- oder Citratpuffer (oder einem anderen
nicht flüchtigen
Puffer) für die
Wiederherstellung in Wasser lyophilisiert werden, oder von Wasser
für die
Wiederherstellung in 20 mM Acetatpuffer, pH 4,5.
-
Zum
Beispiel sind flüssige
Formulierungen von OP-1 in 10 und 20 mM Acetatpuffer (pH 4, 4,5
und 5) ohne Mannitol für
mindestens sechs Monate stabil und osteogen aktiv.
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II. BETRACHTUNGEN ZUM TRÄGER
-
Wie
bereits erklärt,
bedeutet "Träger", wie hier verwendet,
ein biologisch verträgliches,
nicht starres amorphes Material, das keine definierten Oberflächen hat
und für
die Verwendung bei den Vorrichtungen, Implantaten und Verfahren
der vorliegenden Erfindung geeignet ist. Geeignete Träger sind
nicht partikulär
und nicht porös,
das heißt
porenlos. Trägern,
die für
die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet sind, fehlt
eine Gerüststruktur
und sind im Wesentlichen matrixfrei. Somit ist "im wesentlichen frei von Matrix auch so
zu verstehen, dass es bedeutet, dass, wenn eine einen Träger enthaltende
Vorrichtung an einer defekten Stelle bereitgestellt wird, kein Substrat
von einer exogenen Quelle einschließlich des Trägers eingeführt wird, das
per se als Gerüst
wirken kann. Vor der Verabreichung an und der Implantation in den
Empfänger
wird von dem Träger
wegen seiner chemischen Natur anerkannt, dass er im Wesentlichen
nicht in der Lage ist, zu der Vorrichtung eine dreidimensionale
Gerüststruktur
beizutragen. Bevorzugte Träger
sind zumindest vorübergehend
adhärent
zu Geweben wie Knochen, Knorpel und/oder Muskel. Bevorzugte Träger umfassen
ohne Einschränkung
Acetatpuffer, (20 mM, pH 4,5), physiologische Salzlösung und
Citratpuffer. Im Falle von Vorrichtungen, die Träger wie Acetat und PBS enthalten,
kann die Verabreichung mittels Injektion in einer Ausfällung gewisser
knochenbildender Proteine an der Verabreichungsstelle resultieren.
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III. ÜBERLEGUNGEN
ZUR FORMULIERUNG UND ZUR VERABREICHUNG
-
Die
Vorrichtungen der Erfindung können
unter Verwendung von Routineverfahren formuliert werden. Alles,
was erforderlich ist, ist die Bestimmung der gewünschten Endkonzentration des
knochenbildenden Proteins pro Volumeneinheit an Träger, wobei
man im Gedächtnis
behalten muß,
dass das verabreichte Volumen an Vorrichtung weniger sein wird als
das Volumen des Hohlraums an der defekten Stelle. Die gewünschte Endkonzentration
an Protein wird von der spezifischen Aktivität des Proteins abhängen ebenso
wie von der Art, dem Volumen und/oder der anatomischen Lage des
Defekts. Zusätzlich
kann die gewünschte
Endkonzentration an Protein vom Alter, dem Geschlecht und/oder dem
Gesundheitszustand des Empfängers
abhängen.
Es wurde beobachtet, dass für
segmentale Defekte kritischer Größe von etwa
mindestens 2,5 cm Länge
typischerweise 0,05 ml (oder mg) einer Vorrichtung, die 0,5 bis
1,5 mg knochenbildendes Protein enthält, eine Knochenbildung induziert,
die ausreicht, um die Lücke
zu füllen.
Im Falle von frischen Brüchen
mit Defekten nicht kritischer Größe, wurde
beobachtet, dass etwa 0,1–0,5
mg Protein die Lücke
oder den Defekt reparieren. Die Optimierung der Dosen erfordert
nur Routineversuche und gehört
zum Können
eines Durchschnittsfachmanns auf dem Fachgebiet.
-
Wie
nachstehend beispielhaft dargestellt, können die Vorrichtungen der
vorliegenden Erfindung eine Vielzahl an Konfigurationen annehmen.
Zum Beispiel kann eine matrixfreie knochenbildende Vorrichtung in
Lösung
durch Solubilisierung gewisser Formen von OP-1 in Lösungen von
Acetat- (20 mM, pH 4,5) oder Citratpuffern oder phosphatgepufferter
Salzlösung
(PBS), pH 7,5, formuliert werden. In einigen Fällen kann das knochenbildende
Protein nicht vollständig
solubilisiert werden und/oder kann bei Verabreichung an der defekten Stelle
ausfallen. Suspensionen, Aggregatbildung und/oder in vivo-Präzipitation
beeinträchtigen
nicht die Wirksamkeit der matrixfreien knochenbildenden Vorrichtung,
wenn sie gemäß der hier
offenbarten Erfindung durchgeführt
wird. Matrixfreie Vorrichtungen in Lösung sind besonders geeignet
für die
Verabreichung durch Injektion, wie die Bereitstellung einer Vorrichtung
an einer Bruchstelle durch Injektion statt chirurgischer Mittel.
-
Allgemein
gesagt unterscheidet sich die Konfiguration von matrixfreien Vorrichtungen,
die für
die Verabreichung durch Injektion geeignet ist, von denjenigen,
die für
die Verwendung an einer offenen chirurgischen Stelle bevorzugt werden.
Zum Beispiel sind lyophilisierte Herstellungen von matrixfreien
Vorrichtungen eine gegenwärtig
bevorzugte Ausführungsform
für die
Reparatur dieser Art von Defekt. Die vorstehend beschriebenen matrixfreien
Vorrichtungen in Lösung
können
verwendet werden, um eine lyophilisierte Konfiguration herzustellen.
-
Die
Ausführung
der Erfindung wird noch vollständiger
durch die folgenden Beispiele verstanden, die hier nur zur Illustration
dargestellt sind und keinesfalls als Beschränkung der Erfindung verstanden
werden sollten.
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IV. BIOLOGISCHER TEST
-
A. Biologischer Test auf knochenbildende
Aktivität:
endochondrale Knochenbildung und verwandte Eigenschaften
-
Im
Folgenden werden innerhalb des Umfangs der Erfindung des Anmelders
liegende Protokolle für
die Identifikation und Charakterisierung bona fide von knochenbildenden
Proteinen oder morphogenen Proteinen des Knochens ebenso wie knochenbildenden
Vorrichtungen dargestellt.
-
Der
im Stand der Technik anerkannte biologische Test für die Knochenbildung,
wie beschrieben von Sampath und Reddi (Proc. Natl. Acad. Sci. USA
(1983) 80: 6591–6595)
und in dem
US-Pat. Nr. 4,968,590 , deren
Offenbarung durch Bezugnahme hier eingeschlossen ist, wird verwendet,
um die Wirksamkeit der Reinigungsprotokolle zu belegen. Wie nachstehend
gezeigt, besteht dieser Test in der Aufbringung der Testproben auf
subkutane Stellen bei allogenen Ratten unter Ätherbetäubung. In die Haut über dem
Bereich des Brustkorbs wird unter sterilen Bedingungen ein vertikaler
Einschnitt (1 cm) gemacht und mittels stumpfer Sektion eine Tasche
hergestellt. Unter gewissen Umständen
werden etwa 25 mg Testprobe tief in diese Tasche implantiert und
der Einschnitt mit einem Metallclip geschlossen. Die heterotrope
Stelle läßt die Untersuchung der
Induktion des Knochens zu ohne mögliche
Zweideutigkeiten, die bei Verwendung von orthotopen Stellen resultieren.
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Die
aufeinanderfolgenden zellulären
Reaktionen, die an der heterotropen Stelle auftreten, sind komplex.
Die vielstufige Kaskade der endochondralen Knochenbildung umfasst:
Bindung von Fibrin und Fibronectin an die implantierte Matrix, Chemotaxis
von Zellen, Proliferation von Fibroblasten, Differenzierung in Chondroblasten,
Knorpelbildung, Einwachsen von Blutgefäßen, Knochenbildung, Ummodellierung
und Knochenmarkdifferenzierung.
-
Bei
Ratten zeigt dieses biologische Modell eine kontrollierte Progression
durch die Stadien der Matrix-induzierten endochondralen Knochenentwicklung
einschließlich:
(1) transiente Infiltration durch polymorphonucleäre Leukocyten
am Tag eins; (2) die Wanderung und Proliferation von mesenchymalen
Zellen an den Tagen zwei und drei; (3) das Auftauchen von Chondrocyten
an den Tagen fünf
und sechs; (4) die Bildung von Knorpelmatrix am Tag acht; (5) Calcifizierung
des Knorpels am Tag acht; (6) Einwachsen von Gefäßen, Erscheinen von Osteoblasten
und Bildung von neuem Knochen an den Tagen neun und zehn; (7) Erscheinen von
Osteoblasten- und Knochen-Ummodellierung an den Tagen zwölf bis achtzehn;
und (11) hämatopoetische Knochenmarksdifferenzierung
in dem Knöchelchen
am Tag einundzwanzig.
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Histologische
Sezierung und Anfärbung
wird vorgezogen, um das Ausmaß an
Knochenbildung in den Implantaten zu bestimmen. Anfärbung mit
Toluidinblau oder Hämotoxylin/Eosin
zeigt klar die letztliche Entwicklung von endochondralem Knochen.
Biologische Tests von zwölf
Tagen sind üblicherweise
ausreichend, um zu bestimmen, ob eine Knochen-induzierende Wirkung
mit der Testprobe assoziiert ist.
-
Zusätzlich kann
die Aktivität
der alkalischen Phosphatase als Marker für die Knochenbildung verwendet
werden. Die Enzymaktivität
kann nach Homogenisierung des ausgeschnittenen Testmaterials spektrophotometrisch
bestimmt werden. Die Aktivität
hat ihren Höhepunkt
an den Tagen 9–10
in vivo und nimmt danach langsam ab. Proben, die bei der Histologie
keine Knochenentwicklung zeigen, sollten bei diesen Testbedingungen
keine Aktivität
der alkalischen Phosphatase haben. Dieser Test ist von Nutzen bei
der Quantifizierung und um eine Abschätzung der Knochenbildung sehr
schnell nach der Entnahme der Testproben von der Ratte zu bekommen.
Es wurden zum Beispiel Proben, die knochenbildendes Protein mit
mehreren verschiedenen Reinheitsstufen enthielten, getestet, um
die wirksamste Dosis/den wirksamsten Reinheitsgrad zu bestimmen,
um eine Formulierung zu finden, die im Industriemaßstab produziert
werden könnte.
Die Resultate, wie sie als Niveau der Aktivität der alkalischen Phosphatase
und der histologischen Bewertung gemessen werden, können als "knochenbildende Einheiten" dargestellt werden.
Eine knochenbildende Einheit stellt die Menge an Protein dar, die
für die
halb-maximale knochenbildende Aktivität am Tag 12 erforderlich ist.
Zusätzlich
können
Dosiskurven für
die Knochen induzierende Aktivität
in vivo bei jedem Schritt eines Reinigungsschemas konstruiert werden,
indem man verschiedenen Konzentrationen an Protein testet. Dementsprechend
kann der Durchschnittsfachmann repräsentative Dosiskurven unter
Verwendung von lediglich Routineversuchen konstruieren.
-
B. Knochenbildung nach der Implantierung
von knochenbildenden, matrixfreien OP-1-Vorrichtungen (Referenzbeispiel)
-
Knochenbildende
Vorrichtungen wurden mit 62,5 μg
lyophilisiertem OP-1 mit oder ohne 25 mg Kollagenmatrix hergestellt.
Diese Vorrichtungen wurden nach ihrer Fähigkeit bewertet, die Knochenbildung
unter Verwendung des vorstehend beschriebenen ectopischen Knochenbildungstests
an der Ratte an sowohl intramuskulären als auch subkutanen Stellen
zu fördern.
Zusätzlich
wurde die Masse an gebildetem Knochen durch Messung der Calciumgehalte
und Gewichte der entfernten Vorrichtungen bewertet. Die geschaffenen Daten
sind in den nachstehenden Tabellen 1 und 2 zusammengestellt.
-
Wie
aus der Histologie und dem Calciumgehalt offensichtlich bildete
sich Knochen als Antwort auf alle matrixfreien OP-1-Proben. Diese
Daten zeigen, dass die Implantierung einer matrixfreien OP-1-Vorrichtung
allein ausreichend ist, die endochondrale Knochenbildung an ectopischen
Stellen der Ratte zu induzieren. Tabelle 1. Knochenbildung gg. Konzentrationen
von OP-1 Intramuskuläre
Stelle
| Vorrichtung
()
Probengröße | 12-Tage-Implantat |
| Kollagen | OP-1 | Calcium
μg/mg Gewebe | Implantat
Gewicht,
mg | Histologie
%
Knochen |
| 25
mg (5) | 62,5 μg | 38,2–67,1 | | 70–90 |
| 0
mg | 51,7 μg | 48,6 | 430,7
mg | 90 |
| 0
mg | 61,3 μg | 35,8 | 256,1
mg | 90 |
| 0
mg | 18,6 μg | 66,3 | 457,8
mg | 90 |
| 0
mg | 59,2 μg | 53,9 | 580,0
mg | 90 |
| 0
mg | 59,5 μg | 25,9 | 383,1
mg | 90 |
Tabelle 2. Knochenbildung gg. Konzentrationen
von OP-1 Subkutane Stelle
| Vorrichtung
()
Probengröße | 12-Tage-Implantat |
| Kollagen | OP-1 | Calcium
μg/mg Gewebe | Implantat
Gewicht,
mg | Histologie
%
Knochen |
| 25
mg (5) | 62,5 μg | 28,4–54,6 | 500,6–1472,6 | 60–80 |
| 0
mg | 40,4 μg | 44,4 | 132,7
mg | 90 |
| 0
mg | 36,7 μg | 43,9 | 337,7
mg | 80 |
| 0
mg | 35,2 μg | 37,4 | 310,7
mg | 90 |
| 0
mg | 51,0 μg | 57,5 | 195,8
mg | 90 |
| 0
mg | 51,4 μg | 29,7 | 721,9
mg | 90 |
-
C. Matrixfreie OP-1-Vorrichtungen, die
wasserlösliche
Träger
enthalten (Referenzbeispiele)
-
Auch
OP-1, das wasserlöslichen
Trägern
zugemischt ist, fördert
die Knochenbildung. Bei dieser Untersuchung wurden Mannitol, Carboxymethylcellulose,
Dextrin, PEG3350, ein Pluronic-Gel und Kollagen durch Zugabe von
0,9%-iger steriler Salzlösung
zu einer Paste formuliert. Zehn μg
an in Wasser aufgelöstem
OP-1 wurden zu der Paste zugegeben, um eine matrixfreie Vorrichtung
herzustellen, und die Vorrichtung wurde unmittelbar intramuskulär in Ratten
injiziert. Nach 12 Tagen, wurden die implantierten Vorrichtungen
entfernt und mittels Calciumgehalt und Histologie auf Knochenbildung
bewertet. Diese Daten bestätigen
die vorstehend beschriebene Beobachtung, dass eine Kollagenmatrix
für die
Induktion einer volumenfüllenden
Knochenbildung nicht essentiell ist. Von den bewerteten wasserlöslichen
Trägern
zeigt Mannitol insgesamt die besten Resultate, wobei die anderen
relativ vergleichbar erschienen. TABELLE 3
| | Calcium, μg/mg Implantat | Implantat μg, mg | Histologie
(%) |
| Mannitol | 100–200 | 28–48 | > 90 |
| CMC | 50–200 | 28–52 | > 80–80 |
| Dextrin | 20–80 | 8–12 | > 90 |
| Kollagen | 550–800 | 20–45 | > 90 |
| PEG | 100–150 | 10–12 | > 90 |
| Pluronic | 50–150 | 14–28 | > 90 |
-
D. Matrixfreie OP-1-Vorrichtungen in Lösung
-
Von
matrixfreien knochenbildenden Vorrichtungen in Lösung wurde auch gezeigt, dass
sie die Knochenbildung induzieren, wenn sie intramuskulär (IM) oder
intradermal (ID) verabreicht werden. In einem beispielhaften Experiment
wurden matrixfreie OP-1-Vorrichtungen in 20 mM Acetatpuffer, pH
4,5, hergestellt. Die Vorrichtungen wurden so hergestellt, dass
die gewünschte
Dosis (5–50
mg) an OP-1 in 100 μl
Injektionsvolumen verabreicht würde.
Beide Arten der Verabreichung induzierten die Knochenbildung, wie
mittels Calciumgehalt, Histologie und Explantatgewicht gemessen.
-
V. TIERSTUDIEN: VERFAHREN DER VERWENDUNG
VON MATRIXFREIEN OP-1-VORRICHTUNGEN UND -IMPLANTATEN
-
A. Heilung von segmentalen Defekten kritischer
Größe in Hunden
unter Verwendung von matrixfreien knochenbildenden Vorrichtungen
-
1. Experiment 1
-
Die
folgenden Experimente zeigen die Wirksamkeit von injizierbaren und
gefriergetrockneten Formulierungen von rhOP-1 für die Heilung von segmentalen
Defekten kritischer und unkritischer Größe in einem etablierten Ulna-Defektmodell
des Hundes. Drei Formulierungen von matrixfreien knochenbildenden
Vorrichtungen, die alle OP-1 enthielten, wurden in Defekten kritischer
Größe (2,5
cm) und/oder Defekten unkritischer Größe (5 mm, 3 mm, 1,5 mm) bewertet.
Wie vorstehend beschrieben, sind Defekte kritischer Größe Defekte, die
nicht spontan heilen. Die drei bewerteten Formulierungen waren (1)
20 mM Acetatpufferlösung
(pH 4,5); (2) phosphatgepufferte Salzlösung (PBS, etwa pH 7,5); und
(3) lyophilisiertes (gefriergetrocknetes) Protein allein. Die Menge
an OP-1, die an den Defekten kritischer Größe bereitgestellt wurde, war
1,75 mg; 0,35 mg Protein wurde an den Defekten mit unkritischer
Größe bereitgestellt.
Unmittelbar vor dem Verschluß der
Wunde wurde OP-1 mit Acetat oder PBS zugemischt und dann mit insgesamt
1 ml an der defekten Stelle injiziert. Lyophilisierte Proben wurden
entlang der Länge
des Defekts in 5 separaten Teilmengen in diskreten, nicht zusammenhängenden
Orten entlang der Länge
des Defekts plaziert.
-
Unter
Verwendung von chirurgischen Standardverfahren wurden osteoperiosteale
segmentale Defekte der zuvor beschriebenen Größe bilateral in der mittleren
Region der Ulna von zwanzig erwachsenen, zu diesem Zweck gezüchteten
Mischlingshunden geschaffen. Alle Tiere waren zwischen einem und
zwei Jahren alt, wogen 35 bis 50 Pfund und wurden von Lieferanten
mit USDA-Lizenz bereitgestellt. Eine spezielle Aufmerksamkeit wurde
darauf gerichtet, Tiere einheitlicher Größe und einheitlichen Gewichts
auszuwählen,
um Abweichungen bei der Knochengeometrie und -last zu beschränken. Die
Tiere wurden vor der Operation radiographisch durchmustert, um sich
der richtigen Größe und der
Reife des Skeletts zu versichern und dass keine offensichtlichen
Abnormalitäten
der Knochen existierten. Die Tiere wurden auch klinisch überprüft, um akute und
chronische medizinische Zustände
während
einer Quarantänezeit
von zwei Wochen auszuschließen.
Ein vollständiges
Blutbild mit Zelldifferenzierung wurde vor der Chirurgie durchgeführt.
-
Die
Speiche wurde wegen der mechanischen Stabilität erhalten, aber es wurde keine
interne oder externe Fixierung verwendet. Die Stelle wurde mit Salzlösung gespült, um Knochensplitter
und ausgetretene Markzellen zu entfernen, dann getrocknet und vor
der Bereitstellung der Formulierung an der Stelle wurde Homöostase erreicht.
Die weichen Gewebe wurden vor der Injektion der Formulierungen 1
oder 2 (Acetat oder PBS) sorgfältig
in Schichten geschlossen. Die Vorrichtungen der Formulierung 3 (lyophilisiertes
Protein allein) wurden vor der Schließung der Gewebeschichten entlang
dem Raum zwischen den Knochen plaziert, um das Implantat zu enthalten.
Das Verfahren wurde dann auf der contralateralen Seite wiederholt,
außer
dass vor dem Wundverschluß keine
OP-1-Vorrichtung bereitgestellt wurde.
-
Den
Tieren wurden nach der Chirurgie intramuskulär vier Tage lang Antibiotika
verabreicht und unmittelbar nach dem Eingriff wurden routinemäßig vorher-nachher-Radiogramme aufgenommen,
um sich einer einwandfreien Plazierung zu versichern.
-
Die
Tiere wurden nach der Operation für 24 bis 72 Stunden in 3 × 4 Erholungskäfigen gehalten,
danach wurden sie in Geläufe
transferiert und ihnen die uneingeschränkte Bewegung erlaubt.
-
Es
wurden zweiwöchige
Radiogramme aufgenommen, um den Fortschritt der Heilung zu untersuchen. Zusätzlich wurde
zweiwöchig
vor der Operation bis zur Tötung
Blut (Serum) entnommen, um die Antikörperbildung durch den Sponsor
zu untersuchen. Bei der Tötung
wurde alle Ulnae en bloc entnommen und diejenigen, die ausreichend
geheilt waren, wurden durch Torsion mechanisch getestet. Segmente
wurden mittels Histologie auf Gewebeantwort, Knochenarchitektur
und Ummodellierung, und Qualität
und Menge an neuer Knochenbildung und -heilung bewertet.
-
Die
Tiere wurden 4, 6, 8 oder 12 Wochen nach der Operation getötet.
-
1b(3). Radiogramme
-
Radiogramme
der Vorderglieder wurden zweiwöchig
bis acht Wochen nach der Operation aufgenommen und dann wiederum
bei der Tötung
an Woche zwölf
nach der Operation. Es wurden Standardaufnahmezeiten und -intensitäten verwendet,
und es wurden Sandsäcke
verwendet, um die Extremitäten
in konsistenter Weise zu positionieren. Die Radiogramme wurden bewertet
und mit früheren
Radiogrammen verglichen, um die Qualität und Geschwindigkeit der Defektheilung
einzuschätzen.
-
Mechanische Testung
-
Unmittelbar
nach der Sektion, wenn die Heilung durch Befühlen mit der Hand ausreichend
erschien, wurden Proben auf Versagen bei Verdrehung auf einer MTS
hydraulischen Testmaschine mit geschlossenem Kreislauf (Minneapolis,
MN) getestet, die unter Hubkontrolle bei einer konstanten Vorschubrate
von 50 mm/Min. in einer zylindrischen Aluminiummuffe und einzementiert
mit Methylmethacrylat geführt
wurde, unter Verwendung des Protokolls des Herstellers. Ein Ende
war starr fixiert und das andere wurde gegen den Uhrzeigersinn gedreht.
Da die Ulna des Hundes eine leichte Krümmung hat, wurden die Proben
exzentrisch montiert, um die Drehung der Proben coaxial mit der
der Testvorrichtung zu halten. Die Torsionskraft wurde mittels eines
Hebelarms von sechs cm eines servohydraulischen Materialtestsystems übertragen.
Es wurden gleichzeitig Aufzeichnungen von der Verdrehung des Implantats
vorgenommen, gemessen durch die Hubkontrolle der Maschine, während die
Last von der Belastungszelle aufgezeichnet wurde. Die Daten wurden
mittels eines Analog-Digital-Wandlers und eines PC und einer online
Aufnahmesoftware aufgezeichnet. Es wurden Kurven der Kraft-Winkel-Verdrehung
erzeugt, aus denen das Drehmoment und die Winkeldeformation bis
zum Versagen erhalten wurden, und die Energieaufnahme bis zum Versagen
als die Fläche
unter der Last-Verdrehungskurve
berechnet wurde.
-
Ergebnisse
-
Die
Knochenheilungscharakteristika, mechanische Stärke und Histologie von Ulna-Defekten
kritischer Größe, die
mit rhOP-1 ohne Trägermaterial
behandelt worden waren, waren ähnlich
denen von Defekten, die mit der Standard-OP-1-Vorrichtung behandelt worden waren.
In Kürze
waren die experimentellen Beobachtungen wie folgt: die radiographisch
beobachteten Knochenneubildung und Heilmuster bei Defekten, die
mit rhOP-1 ohne Marix behandelten wurden, waren ähnlich den Heilmustern, die
vorstehend mit der herkömmlichen,
Kollagen enthaltenden OP-1-Vorrichtung beobachtet wurden. Im Allgemeinen
war die Knochenneubildung schon zwei Wochen nach der Operation offensichtlich.
Der neue Knochen fuhr bis zur Tötung
zwölf Wochen
nach der Operation fort, sich zu verdichten, zu konsolidieren und
sich umzugestalten. Diese Untersuchung zeigte, dass eine funktionelle
Knochenvereinigung mit menschlichen OP-1-Vorrichtungen ohne Matrix möglich ist.
Außerdem
waren das Erscheinungsbild und die Charakteristika der Histologie
nach zwölf
Wochen ähnlich
dem, wie sie mit der herkömmlichen,
Kollagen enthaltenden Matrix OP-1-Vorrichtung beobachtet wurden.
Von den sechs Defekten, die mit einer matrixfreien OP-1-Vorrichtung
behandelt worden waren, hatten vier zwölf Wochen nach der Operation
solide knochige Verbindungen. Die restlichen beiden Defekte in demselben Tier
zeigten radiographisch etwas frühe
Knochenneubildung, waren jedoch bei der Tötung unvollständig überbrückt oder
gefüllt
mit neuem Knochen. Die mittlere Torsionslast bis zum Versagen des
geheilten Defekts war 40,05 N (Dies stellt das Äquivalent von etwa 79% von
zuvor getesteten segmentalen Defekten dar, die mit der herkömmlichen,
Kollagen enthaltenden OP-1-Vorrichtung behandelt worden waren und
61% von zuvor getesteter intakter Kontroll-Ulna).
-
Radiographisch
wurde bei allen drei Formulierungen zwei Wochen nach der Operation
eine extensive Knochenneubildung beobachtet. Zwischen zwei bis 12
Wochen erhöhte
der neue Knochen sein Volumen und seine Radiodichtigkeit und füllte und überbrückte die
Defekte. 12 Wochen nach der Operation (Tötung) hatte der radiodichte
neue Knochen die Defekte, die mit rhOP-1-Formulierungen behandelt
worden waren, signifikant gefüllt
und überbrückt. Alle
rhOP-1-Defekte waren bei der Tötung
nach 12 Wochen mechanisch stabil und mit neuem Knochen überbrückt. Bei
dem radiographischen Erscheinungsbild wurden zwischen den drei Formulierungen
keine signifikanten Unterschiede gefunden, obwohl die Formulierungen
1 und 2 zu allen Zeitpunkten leicht besser wirkten als Formulierung
3.
-
Histologisch
war proliferierender neuer Knochen innerhalb und in der Umgebung
der Defekte vorhanden, die mit rhOP-1 behandelt worden waren. Die Überbrückung der
Defekte und knochige Heilung waren im Wesentlichen 12 Wochen nach
der Operation vollständig
mit Lücken
von Fibroknorpel zwischen Flächen
von neuem signifikanten Knochenwachstum. Anzeichen für frühe Cortexentwicklung
mit Verdichtung der Ränder von
neuem Knochen waren bei allen rhOP-1-Defekten vorhanden. Es gab
keine Unterschiede in der Bewertung der histologischen Reihenfolge,
basierend auf der Art der Formulierung, obwohl Formulierung 2 bei
der Qualität
der Verbindung besser abschnitt als die Formulierungen 3 und 1.
-
Die
mittlere Belastung bis zum Versagen der Defekte der Formulierung
1 war 47,64 N (94% der Defekte, die mit der Standard-OP-1-Vorrichtung
behandelt worden waren und 73% der zuvor getesteten intakten Kontrollen).
Die mittlere Belastung bis zum Versagen der Defekte der Formulierung
2 war 51,96 N (102% der Defekte, die mit der Standard-OP-1-Vorrichtung
behandelt worden waren und 80% der zuvor getesteten intakten Kontrollen).
Die mittlere Belastung bis zum Versagen der Defekte der Formulierung
3 war 50,86 N (100% der Defekte, die mit der Standard-OP-1-Vorrichtung behandelt
worden waren und 78% der zuvor getesteten intakten Kontrollen).
Es wurden keine signifikanten Unterschiede bei den mechanischen
Testergebnissen zwischen den Formulierungsarten festgestellt. Defekte
der Formulierung 2 waren bei der maximalen Last beim Versagen etwas
besser als Formulierungen 3 und 1. Tabelle 4.
| Mechanische
Testergebnisse für
Defekte mit kritischer und unkritischer Größe, die mit rhOP-1 behandelt wurden,
gegenüber
nicht behandelten Kontrollen. Mittel ± SD (Probengröße) |
| Defektgröße
(Behandlung) | Maximale
Belastung
(N) | Drehmoment
(Nm) | %
intakte
Ulna |
| 2,5
cm | 46,11± | 2,77± | 70,64± |
| (rhOP-1) | 17,42(10) | 1,05(10) | 26,69(10) |
| 2,5
cm | * | * | * |
| (Kontrolle) | | | |
| 5,0
mm | 51,81 | 3,11± | 79,37± |
| (rhOP-1) | 17,94 | 1,08(6) | 27,48(6) |
| 5,4
mm | 9,20± | 0,55± | 14,09± |
| (Kontrolle) | 6,62(5) | 0,40(5) | 10,14(5) |
| 3,0
mm | 64,10± | 3,85± | 98,21± |
| (rhOP-1) | 49,12(4) | 2,95(4) | 75,25(4) |
| 3,0
mm | 21,91± | 1,31± | 33,57± |
| (Kontrolle) | 26,46(3) | 1,59(3) | 40,54(3) |
| 1,5
mm | 62,17± | 3,73± | 95,25± |
| (rhOP-1) | 30,48(4) | 1,83(4) | 46,70(4) |
| 1,5
mm | 19,43± | 1,17± | 29,76± |
| (Kontrolle) | 19,11(4) | 1,15(4) | 29,28(4) |
- *Wegen Instabilität Defekte nicht getestet
-
Es
wurden auch Formulierungen getestet, die 20 mM Acetatpuffer, pH
4,5 und 5% Mannitol verwendeten. Untersuchungen unter Verwendung
von unkritischen Defekten (5 mm Lücken) zeigten eine klare Verbesserung
bei der Heilungsrate, wenn OP-1 anwesend war, im Vergleich mit Kontrollen.
Spezifisch zeigten die Kontrollen im Durchschnitt nach 8 Wochen
14% der Stärke
von intakten Ulnae, während
mit OP-1 behandelte Defekte im Durchschnitt 79% zeigten. Radiographisch
war schon zwei Wochen nach der Operation neuer Knochen offensichtlich
und begann nach acht Wochen signifikant die Defekte zu füllen und
zu überbrücken, die
mit rhOP-1-Formulierungen
behandelt worden waren. Keiner der sechs unbehandelten Kontrolldefekte
war am Ende des Untersuchungszeitraums komplett geheilt. Einer der
drei Defekte mit Formulierung 1 (Acetatpuffer) und drei der drei
Defekte, die mit Formulierung 2 (PBS) behandelt worden waren, waren
nach 8 Wochen vollständig
mit neuem Knochen gefüllt
und überbrückt. Alle
sechs Defekte, die OP-1 erhielten, hatten Knochenneubildung und
waren mechanisch stabil. Defekte mit Formulierung 2 waren signifikant
besser bei den Resultaten der radiographischen Bewertung, bei der
bis zum Versagen absorbierten Energie und bei der histologischen
Qualität
der Verbindung als mit Formulierung 1 behandelte Defekte. Andererseits
wurden zwischen den beiden Formulierungen keine Unterschiede bei
der mittleren Belastung beim Versagen, der Winkeldeformation und
der histologischen Gesamterscheinung gefunden. Beide Formulierungen
waren bei allen Kategorien signifikant besser als Kontrolldefekte.
Histologisch war proliferierender neuer Knochen innerhalb und in
der Umgebung der Defekte vorhanden, die mit rhOP-1 behandelt worden
waren. Die Überbrückung der
Defekte und knochige Heilung waren 8 Wochen nach der Operation fast
vollständig
mit Lücken
von Fibroknorpel zwischen Flächen
von signifikantem neuem Knochenwachstum. Anzeichen für frühe Cortexentwicklung
und Knochenremodellierung waren bei einigen der rhOP-1-Defekte vorhanden.
Alle unbehandelten Kontrollen führten
zu unvollständigen
Vereinigungen, obwohl potentiell eine längerfristige Heilung durch
eine gewisse Knochenneubildung an den Wirtsknochenenden und endostealen
Regionen angezeigt wurde. Die mittlere Belastung bis zum Versagen
der Defekte der Formulierung 2 war 53,23 N (104,5% der Defekte mit
kritischer Größe, die
mit der Standard-OP-1-Vorrichtung behandelt worden waren und 81,6%
der zuvor getesteten intakten Kontrollen). Der Vergleich von Defekten
unkritischer Größe, die
mit 0,35 mg OP-1 behandelt worden waren, mit zuvor getesteten Defekten
kritischer Größe, die
mit 1,5 mg OP-1 ohne Trägermaterial
behandelt worden waren (injizierbare Formulierungen) zeigten keinen
signifikanten Unterschied bei der mittleren Beladung beim Versagen.
-
C. Heilung von Bruchdefekten unter Verwendung
von matrixfreien knochenbildenden Vorrichtungen
-
1. Bruchuntersuchung am Kaninchen
-
Die
Untersuchung eines Reparaturmodells von Brüchen bei Kaninchen (Mittelschaftbruch
der Ulna) zeigt auch die Wirksamkeit der Verfahren und Vorrichtungen
der Erfindung. Diese Untersuchung verglich die Wirkung der Verabreichung
von matrixfreien OP-1-Vorrichtungen in drei Konfigurationen: 1)
Acetatpuffer pH 4,5 (lösliches
OP-1), 2) PBS (Suspension von OP-1) und 3) Pluronic-Gel. Vier Kaninchen
wurden in jeder Gruppe unmittelbar nach der Bildung des Bruchs behandelt;
contralaterale Kontrollen waren Gliedmaßen ohne Defekt. Die Tiere
wurden 3 Wochen nach der Behandlung getötet. Zusammenfassend zeigten
Tiere, denen die Acetat oder Pluronic enthaltenden OP-1-Vorrichtungen
injiziert worden waren, einen signifikant größeren Bruchkallus bei radiographischer,
Tast- und histologischer Untersuchung. Die mittlere Torsionsbelastung
bis zum Versagen für
alle Ulnae, die mit OP-1 behandelt worden waren, war 8,89 ± 2,99
N (Mittelwert ± Standardabweichung)
(8 Proben). Während
die mittlere Torsionsbelastung bis zum Versagen für unbehandelte
Kontroll-Ulna 7,9 2,92 N war (9 Proben).
-
1a. Beschreibung des Testmaterials
-
Matrixfreie
OP-1-Vorrichtungen in Lösung
wurden verwendet. Die drei bewerteten Lösungskonfigurationen waren:
(1) rhOP, zugemischt einer phosphatgepufferten Salzlösung, 8,71
mg OP-1/ml. Die Vorrichtungen wurden in einzelne Röhrchen verpackt.
Der geschätzte
Bereich des verabreichten Vorrichtungsvolumens war zwischen 30 μl und 110 μl pro Stelle;
(2) rhOP, zugemischt 20 mM Acetatpuffer, pH 4,5, 0,99 mg OP-1/ml. Die
Vorrichtungen wurden in einzelne Röhrchen verpackt, die 130 μl enthielten.
Die Vorrichtung wurde in eine Spritze gezogen. In allen Fällen wurden
weniger als 100 μl
an jeder Stelle verabreicht. Der geschätzte Bereich von verabreichtem
Implantatvolumen war zwischen 60 μl
und 90 μl
pro Stelle; und (3) rhOP in Pluronic-Gel, 0,87 mg OP-1/ml. Die Vorrichtung
wurde in eine Spritze gepackt. Die Vorrichtung wurde bis zur Verabreichung an
der defekten Stelle gekühlt
aufbewahrt (verstrichene Zeit weniger als eine Minute). Jedes Dicke
Gel wurde in allen Fällen
unter Verwendung einer Nadel mit großer Kalibrierung (18) verabreicht.
-
In
allen Fällen
wurden die Dosierungen kalibriert, um etwa 100 μg rhOP-1 an jeder Bruchstelle
zu verabreichen.
-
Insgesamt
wurden zwölf
erwachsene männliche
While New Zealand-Kaninchen,
die zu diesem Zweck gezüchtet
worden waren und die beim Beginn der Untersuchungen mindestens 9
Monate alt waren, verwendet. Alle Tiere waren vom Skelett her reif
und wogen zwischen 2,4 und 3,0 kg und wurden von Lieferanten mit USDA-Lizenz
bereitgestellt. Die Tiere wurden während einer Quarantäneperiode
untersucht, um akute oder chronische medizinische Zustände auszuschließen und
wurden radiographisch untersucht, um sich einer geeigneten Größe, Reife
des Skeletts zu versichern und das keine offensichtlichen Anormalitäten im Knochenbau existierten.
Spezielle Aufmerksamkeit wurde darauf gerichtet, Tiere von einheitlichem
Geschlecht, einheitlicher Größe und einheitlichem
Gewicht auszuwählen,
um Abweichungen bei der Stärke
der geheilten Brüche
zu beschränken.
Expertimentelle traverse Brüche
wurden unter Verwendung chirurgischer Standardverfahren bilateral
in der zentralen Ulna von jedem Tier geschaffen. Die linke Ulna
diente bei jedem Tier als unbehandelte Kontrolle. In Kürze wurden
unter Verwendung von aseptischen Standardverfahren bilaterale Brüche induziert, indem
laterale Schnitte von etwa 2,0 cm Länge gemacht wurden und die
Freilegung der rechten Ulna wurde durch scharfe und stumpfe Sektion
erreicht. Eine transverse Osteotomie wurde in der Mitte der Ulna
unter Verwendung einer elektrischen chirurgischen Säge erzeugt.
Die Stelle wurde dann mit resorbierbarem Faden geschlossen. Eine
matrixfreie OP-1-Vorrichtung in Lösung wurde dann durch die weichen
Gewebe in die Bruchstelle injiziert. Das Verfahren wurde dann auf
der linken Seite wiederholt mit der Ausnahme, dass diese Bruchstellen
nicht mit einer OP-1-Vorrichtung versehen wurden.
-
Den
Tieren wurden intramuskulär
vier Tage lang nach der Chirurgie Antibiotika verabreicht. Die Tiere wurden
nach der Operation in Erholungskäfigen
gehalten, bis sie bei vollem Bewußtsein waren und ihr Gewicht trugen,
wonach sie in Standardkäfige
transferiert wurden und ihnen die uneingeschränkte Bewegung erlaubt wurde.
Die Glieder wurden nicht ruhiggestellt.
-
Wöchentliche
Radiogramme wurden aufgenommen, um das Fortschreiten der Heilung
zu beobachten. Alle Tiere wurden drei Wochen nach der Operation
getötet.
Alle Ulnae wurden en bloc gewonnen und mechanisch durch Torsion
getestet. Die Bruchheilung wurde weiterhin mittels Histologie auf
die Qualität
und Menge von Knochenneubildung und Heilung bewertet.
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Eine
Woche nach der Operation war bei allen Brüchen die frühe Knochenneubildung offensichtlich. Spuren
von leicht radiodichtem Material waren entlang den periostealen
Grenzen anwesend. Die Menge an Knochenneubildung war eine Woche
nach der Operation bei den Brüchen
mit matrixfreien OP-1-Vorrichtungen signifikant größer als
bei den (unbehandelten) Brüchen.
Zwei Wochen nach der Operation war bei allen Brüchen, die mit der matrixfreien
OP-1-Vorrichtungen behandelt wurden, ein Fortschreiten der Knochenneubildung
offensichtlich. Nach drei Wochen war der Knochenkallus groß und die
Brüche
waren in der Gegenwart von OP-1 im Wesentlichen oder vollständig geheilt.
Auf der linken (unbehandelten) Stelle war die Bruchstelle nach drei
Wochen jedoch noch offensichtlich und die Menge an gebildetem Kallus
weniger.
-
Die
mittlere Torsionslast bis zum Versagen für alle Ulnae, die mit einer
OP-1 Vorrichtung behandelt worden waren, war 8,89 ± 2,99
N (8) (Mittelwert ± Standardabweichung
(Probengröße)). Die
mittlere Torsionslast bis zum Versagen für unbehandelte Kontrollulna
war 7,91 ± 2,92
N (9).
-
Ein
größeres Volumen
an neuem Knochen und eine vollständige Überbrückung der
Bruchstelle wurden bei allen rechten (mit OP-1-Vorrichtung behandelten)
Brüchen
im Vergleich mit links beobachtet. Die Proliferation von Kallus
wurde beobachtet, die sich in das weiche Gewebe der behandelten
Brüche
ausdehnte. Die linken (unbehandelten) Stellen zeigten einheitlich
Proliferation von neuem Knochen an den periostealen und endostealen
Grenzen und frühe
Knorpelbildung am Bruch, zeigten aber nicht konsistent vollständige knochige Überbrückung des
Bruchs.
-
Konsistent
mit den radiographischen Resultaten, wurde ein größeres Volumen
von neuem Knochen bei den Stellen beobachtet, die mit OP-1-Vorrichtungen
behandelt worden waren.
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2. Bruchuntersuchung bei der
Ziege
-
Noch
ein anderes Tiermodell für
die Bewertung der verbesserten Bruchreparatur unter Verwendung von
matrixfreien OP-1-Vorrichtungen ist ein Ziegen-Modell (akuter Bruch
des mittleren Schafts der Tibia). Die Untersuchung vergleicht 0,5
mg OP-1 in Acetatpuffer und 1 mg OP-1 in Acetatpuffer und 1 mg OP-1
präzipitiert in
PBS, unmittelbar nach der Schaffung des Bruchs unter Verwendung
von chirurgischen Standardverfahren injiziert. Die Tiere werden
beobachtet und versorgt wie bei den vorstehend beschriebenen Hunde-
und Kaninchenuntersuchungen und werden typischerweise 2, 4 und 6
Wochen nach der Behandlung getötet.
-
Es
wird erwartet, dass durch den Einschluß von matrixfreien knochenbildenden
Vorrichtungen bei diesen Tieren eine verbesserte Knochenreparatur
resultiert, wie bei den Kaninchenuntersuchungen gezeigt.
-
D. Reparatur von osteochondralen Defekten
unter Verwendung matrixfreier OP-1-Vorrichtungen (Referenzbeispiel)
-
1. Osteochondrale Defekte
in Kaninchen
-
Die
folgende Untersuchung zeigt, dass matrixfreie knochenbildende Vorrichtungen
sowohl die Reparatur des artikulären
Knorpel, der den Knochen überzieht,
als auch die Reparatur des darunter liegenden Knochens verbessern
kann. In dieser Untersuchung wurde ein osteochondrales Standarddefektmodell
des Kaninchens verwendet, um die verschiedenen injizierbaren Formen
von OP-1 bei der Heilung dieser Art von Defekt zu bewerten.
-
Matrixfreie
Vorrichtungen, die OP-1 enthalten, wurden in zwei verschiedenen
injizierbaren Bereitstellungsformulierungen und in einer gefriergetrockneten
Formulierung hergestellt. Alle Proben enthielten 125 μg OP-1. Formulierung
1: 20 mM Acetatpuffer, pH 4,5, mit 5% Mannitol, Gesamtvolumen 50 μl; Formulierung
2: Suspension in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS); und Formulierung
3: gefriergetrocknet in Teilmengen von einer Probe.
-
Insgesamt
sechs erwachsene männliche
Kaninchen wurden verwendet. Osteochondrale Defekte mit einer vollen
Dicke von 4 mm im Durchmesser wurden bilateral im Sulcus der Kniescheibe
von jedem Tier erzeugt, insgesamt 12 Defekte unter Verwendung von
chirurgischen Standardverfahren. Der linke Defekt erhielt eine der
drei OP-1-Formulierungen und die Defekte der rechten Seite dienten
als unbehandelte Kontrolle. Alle Tiere wurden zwölf Wochen nach der Operation
getötet
und die distalen Schienbeine en bloc entnommen. Die Defektstellen
wurden histologisch und durch Betasten bewertet, wie hier vorstehend
beschrieben.
-
Bei
allen Defekten außer
einem Defekt der PBS-Gruppe zeigt die OP-1-Seite eine signifikante
Heilung mit Regenerierung von Knochen und Knorpel. Obwohl auch bei
den meisten der Kontrolldefekte ohne OP-1 eine Heilung beobachtet
werden kann, ist die Reparatur unterlegen; üblicherweise ist die Heilung
des darunter liegenden Knochens unvollständig und es liegt eine signifikante
Unterproduktion von Glycosaminoglycanen (GAG) im Knorpel vor (wie
durch leichtes Anfärben
mit Toluidin zu sehen ist).
-
2. Schafmodell
-
Reparatur
von osteochondralen und chondralen Defekten kann auch in einem Standard-Ziegen-
oder -Schafmodell bewertet werden. Zum Beispiel wird unter Verwendung
von chirurgischen Standardverfahren jedes Schaf in einer Untersuchung
an beiden Gelenken des vorderen Knies operiert und es werden zwei
Defekte per Gelenk geschaffen (einer auf dem medialen Kondylus und
einer auf dem lateralen Kondylus). Eines der Gelenke hat einen chondralen
Defekt mit standardisierter partieller Dicke (5 mm im Durchmesser)
auf jedem Kondylus, während
das andere Gelenk zwei ähnliche,
aber tiefere chondralen Defekt mit voller Dicke hat (etwa 1–2 mm im
subchondralen Knochen). Ein Gelenk des Tieres wird mit einer matrixfreien
knochenbildenden Vorrichtungsformulierung behandelt und das andere
Gelenk wird als unbehandelte Kontrolle gelassen. Jede Gruppe hat
eine Untergruppe, die früh
nach 8 Wochen getötet
wird und eine andere, die für
eine Langzeitbewertung 6–7
Monate gehalten wird. Es wird erwartet, dass die matrixfreien Vorrichtungen,
die jede der hier beschriebenen Formulierungen verwendet, die Geschwindigkeit
und die Qualität
der Reparatur sowohl des artikulären Knorpel
als auch des darunter liegenden Knochens erhöhen, in Übereinstimmung mit den hier
vorstehend beschriebenen Resultaten.
-
E. Heilung von segmentalen Defekten unkritischer
Größe in Hunden
unter Verwendung von matrixfreien knochenbildenden Vorrichtungen
(Referenzbeispiel)
-
1. Experiment 2
-
Wie
bereits in Experiment 1 beispielhaft dargestellt (vgl. Sektion V.A.1.)
können
injizierbare Formulierungen von rhOP-1 verwendet werden, um Defekte
unkritischer Größe (d. h.
5 mm, 3 mm, 1,5 mm) zu heilen. Das folgende Experiment ist eine
Erweiterung von Experiment 1 und konzentriert sich auf das Defektmodell von
3 mm. Wie nachstehend detaillierter beispielhaft dargestellt ist,
zeigten Defekte unkritischer Größe (3 mm), die
mit rhOP-1 behandelt wurden, eine verbesserte Heilung und extensivere
Knochenneubildung. Wie nachstehend gezeigt, stellt ein Defekt von
3 mm ein konsistentes und reproduzierbares Modell für die Bewertung der
Beschleunigung von Prozessen der Bruchreparatur dar.
-
Dieses
Experiment bewertet die Heilung von Defekten unkritischer Größe, die
mit zwei OP-1-Formulierungen behandelt werden, rhOP-1 in Acetat/Lactosepuffer
(OP/Puffer) und rhOP-1 in einem Carboxymethylcellulose (CMC) (OP/CMC)-Gel
etwa vier Wochen nach der Operation. Die nachstehend zusammengefaßten Resultate
zeigen, dass Defekte unkritischer Größe, die mit injizierbarem rhOP-1
in CMC-Lösung
und in Acetatpufferlösung
behandelt wurden, signifikant schneller heilten im Vergleich mit
Kontrollen mit CMC und Pufferträger
und unbehandelten Kontrollen. Radiographisch zeigten die Defekte
in beiden Gruppen mit OP-1-Behandlung (OP/CMC und OP/Puffer) eine
frühe radiodichte
Knochenbildung und Knochenüberbrückung 4
Wochen nach der Operation. Die mit OP/CMC behandelten Defekte waren
entlang der lateralen Ulna fast vollständig gefüllt und überspannt mit Knochen nicht
einheitlicher Dichte und unter Einbau der Ränder des Wirtsknochens. Proliferativer
neuer Knochen war bei den mit OP/Puffer behandelten Defekten vorhanden.
Keiner der Kontrolldefekte mit Träger (CMC und Puffer allein)
zeigte nach 4 Wochen Anzeichen von Knochendefektheilung. Das histologische
Aussehen von mit OP/CMC und OP/Puffer behandelten Defekten war ähnlich.
Bei den mit OP behandelten Defekten hatten sich an den Defekträndern und
entlang der Knochenhaut der Ulna, die sich über die defekte Stelle erstreckte,
signifikante Mengen an neuem Knochen gebildet. Die Überbrückung des
Knochendefekts war nach dem Zeitabschnitt von 4 Wochen nahezu vollständig. Mineralisierender
Knorpel und fibröses
Gewebe waren bei den mit OP behandelten Defekten vorhanden. Im Gegensatz
dazu waren die Defekte mit Trägerkontrolle
mit fibrösem
Gewebe gefüllt
und davon umgeben und hatten minimale Mengen von Knochenneubildung
an den Defekträndern.
Durchschnittlich hatten die mit OP/CMC behandelten Defekte nach 4
Wochen eine Torsionsstärke,
die 51% der Stärke
von intakten Ulna war, im Vergleich zu 14% bei den CMC-Trägerkontrollen.
Defekte, die mit der OP/Pufferlösung
behandelt wurden, hatten eine mittlere Torsionsstärke, die
44% der Stärke
von intakten Ulna, während
die Defekte mit Pufferkontrolle nur 9% der Torsionsstärke von
intakten Ulna erreichten. Die mit OP/CMC und OP/Puffer behandelten
Gruppen hatten nach 4 Wochen (9%) und 8 Wochen (27%) höhere mechanische
Stärken
als die unbehandelten Kontrollen.
-
Experimenteller Aufbau
-
Die
Testproben bestanden aus rekombinantem menschlichem knochenbildendem
Protein-1 (rhOP-1) in einem injizierbaren Verabreichungs-Matrixsystem. Die
beiden rhOP-1-Formulierungen und die beiden Kontrollen mit nur Träger wurden
bewertet und mit zuvor getesteten und berichteten unbehandelten
Kontrolldefekten verglichen. Nur über zwei dieser drei Formulierungen
wird hier berichtet. Eine Formulierung (OP/CMC) bestand aus 0,35
mg rhOP-1 in 100 μl
Carboxymethylcellulose(CMC)-Gel, und wurde in drei sterilen Spritzen
bereitgestellt. Eine zweite Formulierung (OP/Puffer) bestand aus
0,35 mg rhOP-1 in 100 μl
Acetatpuffer und wurde als OP-1-Lösung bereitgestellt. Die Kontrolle
aus nur Träger
bestand aus 100 μl
CMC-Gel (CMC-Kontrolle), die in drei sterilen Spritzen bereitgestellt
wurde und aus 100 μl
Acetatpuffer (Pufferkontrolle), die als Kontrolllösung bereitgestellt
wurde. Proben mit bekannten Mengen und Inhalt wurden von Creative
BioMolecules, Inc. (Hopkinton, MA) hergestellt und geliefert.
-
Bilaterale
segmentale Defekte der Ulna, 3,0 mm lang, wurden in allen Tieren
geschaffen. Die rechten Defekte erhielten eine der beiden rhOP-1-Formulierungen,
so dass drei Stellen von jeder Formulierung untersucht wurden. Die
linken Defekte erhielten die Kontrolle mit nur Träger, die
kein rhOP-1 enthielt. Es wurden wöchentliche Radiogramme aufgenommen,
um den Fortschritt der Heilung zu untersuchen. Bei der Tötung wurden
alle Ulnae en bloc gewonnen und wurden, wenn ausreichend geheilt,
mechanisch durch Torsion getestet. Segmente wurden mittels Histologie
auf Gewebeantwort, Qualität
und Menge an Knochenneubildung und Ausmaß an Heilung bewertet. Erwachsene
männliche
Mischlingshunde, die für
diesen Zweck gezüchtet worden
waren, wurden wegen ihrer Verfügbarkeit,
der leichten Behandlung, der anatomischen Größe und wegen der bekannten
Charakteristika der Knochenreparatur und der Remodellierung bei
dieser Untersuchung verwendet. Alle Tiere waren vom Skelett her
reif, wogen zwischen 44 und 63 Pfund (im Mittel 54 lb) und wurden von
Martin Creek Kennels, USDA Nummer 71-B-108 (Willowford, AK) geliefert.
Es wurde insbesondere darauf Wert gelegt, Tiere von einheitlicher
Größe und einheitlichem
Gewicht auszusuchen, um Unterschiede in der Knochengeometrie und
Belastung zu beschränken.
-
Chirurgie
-
Anästhesie
wurde durch intravenöse
Injektion von Natriumpentothal mit der Dosis von 5,0 mg/lb Körpergewicht
verabreicht. Nach der Induktion wurde ein endotrachealer Tubus plaziert
und die Anästhesie
mittels Inhalation von Isofluoran aufrechterhalten. Beide Vorderläufe wurden
auf sterile Weise vorbereitet und zurechtgelegt. Es wurde ein lateraler
Schnitt von etwa 2 Zentimeter Länge
vorgenommen und die Freilegung der Ulna wurde durch stumpfe und
scharfe Sektion erreicht. Der Defekt von 3,0 mm wurde in der mittleren
Ulna unter Verwendung einer Stichsäge erzeugt. Die Speiche wurde
für mechanische
Untersuchungen erhalten und es wurde keine interne oder externe
Fixierung verwendet. Die Stelle wurde mit Salzlösung gespült, um Knochensplitter und
ausgetretene Markzellen zu entfernen. Die weichen Gewebe wurden
sorgfältig
in Schichten um den Defekt geschlossen. Die geeignete Probenformulierung
wurde dann entsprechend dem Behandlungsschema in die defekte Stelle
injiziert. Die Prozedur wurde dann auf der contralateralen Seite
mit der geeigneten Probe wiederholt.
-
Radiogramme
-
Es
wurden wöchentlich
Radiogramme der Vorderläufe
bis vier Wochen nach der Operation erhalten. Es wurden Standardaufnahmezeiten
und -intensitäten
verwendet. Um die radiographischen Resultate zu quantifizieren wurde
jedem Radiogramm ein numerischer Wert zugeteilt, der auf der in
Tabelle 5 beschriebenen Bewertungsskala beruhte. Tabelle 5
| RADIOGRAPHISCHE
BEWERTUNGSSKALA | |
| | Grad: |
| Keine
Veränderung
gegenüber
Aussehen unmittelbar nach der Operation | 0 |
| Spur
von radiodichtem Material im Defekt | 1 |
| Flockige
Radiodichte mit Flecken neuer Verkalkung | 2 |
| Der
Defekt ist zumindest an einem Punkt mit Material nicht einheitlicher
Radiodichte überbrückt | 3 |
| Der
Defekt ist auf der medialen und lateralen Seite des Defekts mit
Material nicht einheitlicher Radiodichte überbrückt, die Schnittenden des Randes
bleiben sichtbar | 4 |
| Wie
Grad 3; mindestens einer von vier Rändern wird von neuem Knochen
verdeckt | 5 |
| Der
Defekt wird von einheitlichem neuen Knochen überbrückt; die Schnittenden des Randes
sind nicht mehr sichtbar | 6 |
-
Tötung
-
Die
Tiere wurden unter Verwendung einer intravenösen Überdosis an Barbiturat getötet. Die
Ulna und die Speiche wurden unmittelbar en bloc entnommen und in
mit Salzlösung
getränkten
Windeln plaziert. Beide Ulnae wurden einer Makrophotographie unterzogen
und Kontaktradiogramme aufgenommen. Weiche Gewebe wurden sorgfältig von
der defekten Stelle weggeschnitten. Eine wassergekühlte Säge wurde
verwendet, um die Ulna in Stücke
einheitlicher Länge
von 9 cm zu zersägen,
wobei die defekte Stelle in der Mitte der Testprobe gelegen ist.
-
Mechanische Testung
-
Unmittelbar
nach der Sektion, wenn die Heilung durch Befühlen mit der Hand ausreichend
erschien, wurden Proben auf Versagen bei Verdrehung auf einer MTS
hydraulischen Testmaschine mit geschlossenem Kreislauf (Minneapolis,
MN) getestet, die unter Hubkontrolle bei einer konstanten Vorschubrate
von 50 mm/Min. geführt
wurde. Jedes Ende des Knochensegments war in eine zylindrische Aluminiummuffe
montiert und mit Methylmethacrylat einzementiert. Ein Ende war starr
fixiert und das andere wurde gegen den Uhrzeigersinn gedreht. Da
die Ulna des Hundes eine leichte Krümmung hat, wurden die Proben
exzentrisch montiert, um die Drehung der Proben coaxial mit der
der Testvorrichtung zu halten. Die Torsionskraft wurde mittels eines Hebelarms
von sechs cm eines servohydraulischen Materialtestsystems übertragen.
Es wurden gleichzeitig Aufzeichnungen von der Verdrehung des Implantats
vorgenommen, gemessen durch die Hubkontrolle der Maschine, während die
Last von der Belastungszelle aufgezeichnet wurde. Die Daten wurden
mittels eines Analog-Digital-Wandlers und eines PC und einer online
Aufnahmesoftware aufgezeichnet. Es wurden Kurven der Kraft-Winkel-Verdrehung
erzeugt, aus denen das Drehmoment und die Winkeldeformation bis
zum Versagen erhalten wurden, und die Energieaufnahme bis zum Versagen
als die Fläche
unter der Last-Verdrehungskurve berechnet wurde.
-
Histologie
-
Getestete
und nicht getestete Proben wurden für die histologische Bewertung
vorbereitet. Die einzelnen Proben wurden unmittelbar nach der mechanischen
Testung oder bei nicht getesteten Proben nach der Sektion durch
Eintauchen in 10%-ige gepufferte Formalinlösung fixiert. Auf einer wassergekühlten Diamantensäge wurden
die Proben durch Durchschneiden der Proben entlang ihrer langen
Achse geteilt. Dieses Verfahren resultierte in zwei Portionen von
jeder Probe für
verschiedene histologische Präparationen,
einschließlich nicht
entkalkter Grundschnitte und nicht entkalkter Mikrotomschnitte.
-
Nach
der Fixierung wurden die Proben, die für die nicht entkalkten Schnitte
vorgesehen waren, in graduierten Ethylalkohollösungen von 70% bis 100% hydriert.
Die Proben wurden dann in Methylmethacrylatmonomer plaziert und
die Polymerisation zugelassen. Die Grundschnitte wurden durch Schneiden
der Proben auf einer wassergekühlten
Mark V CS600-A (East Grandy, CT) Sektionssäge hoher Geschwindigkeit in
Schnitte von etwa 700 bis 1.000 Micron Dicke erhalten. Diese Schnitte
wurden auf einen Acrylobjektträger
montiert und unter Verwendung einer metallurgischen Schleifscheibe
auf 100 Micron Dicke abgeschliffen und Mikroradiogramme wurden unter
Verwendung von Standardverfahren aufgenommen. Nach der Mikroradiographie
wurden die Schnitte weiter auf etwa 50 Micron abgeschliffen und
mit basischem Fuchsin und Toluidinblau für die histologische Bewertung
angefärbt,
die die Qualität
der Verbindung, das Aussehen und die Qualität des Knochenrands und des
gitterförmigen
Knochens, die Anwesenheit von Knochenmarkselementen, die Remodellierung
des Knochens und die entzündliche
Reaktion bewertete (Tabelle 6). TABELLE 6 HISTOLOGISCHE BEWERTUNGSSKALA
| Qualität der Verbindung: | | Grad: |
| | Keine
Anzeichen einer fibrösen
oder anderen Verbindung | 0 |
| | fibröse Verbindung | 1 |
| | osteochondrale
Verbindung | 2 |
| | Knochenverbindung | 3 |
| | Knochenverbindung
mit Reorganisation der Ränder | 4 |
| Randentwicklung: | | |
| | im
Defekt nicht vorhanden | 0 |
| | Verdichtung
der Grenzen | 1 |
| | erkennbare
Bildung | 2 |
| | intakte
Ränder,
aber nicht vollständig | 3 |
| | vollständige Bildung
normaler Ränder | 4 |
| Entzündungsreaktion: | | |
| | ernsthafte
Reaktion | 0 |
| | ernsthafte/moderate
Reaktion | 1 |
| | moderate
Reaktion | 2 |
| | milde
Reaktion | 3 |
| | keine
Reaktion | 4 |
| GESAMTPUNKTE: | | 12 |
-
EXPERIMENTELLE ERGEBNISSE
-
Radiographische Bewertung
-
Eine
Zusammenfassung der radiographischen Grade für jede Stelle wird in Tabelle
7 bereitgestellt. 4 Wochen nach der Operation hatten die Defekte,
die mit OP/CMC behandelt waren, einen mittleren radiographischen
Grad von 3 von 6 möglichen
Punkten. Mit OP/Puffer behandelte Defekte hatten einen mittleren
radiographischen Grad von 4. Defekte, die mit der CMC-Trägerkontrolle
und nur mit Puffer behandelt waren, hatten im Schnitt endgültige radiographische
Grade von 1,33 und 1,0. Bei beiden Gruppen, die mit OP-1 behandelt waren,
OP/CMC und OP/Puffer, gab es schon drei Wochen nach der Operation
Anzeichen von radiodichter Knochenneubildung in den Defekten und
entlang den lateralen Rändern
des Defekts. Nach vier Wochen hatten sich in den Defekten und in
dem umgebenden subkutanen Gewebe signifikante Mengen an neuem Knochen gebildet.
Die OP/CMC-Defekte waren fast vollständig gefüllt und mit Knochen uneinheitlicher
Dichte entlang der lateralen Grenze der Ulna überbrückt. Der neue Knochen wurde
signifikant mit den defekten Rändern
eingebaut. In zwei der drei mit OP/Puffer behandelten Defekte blieben
die Ränder
des Wirts sichtbar, obwohl proliferativer neuer Knochen anwesend
war. Im Gegensatz dazu war vier Wochen nach der Operation keiner
der OP/CMC- oder
OP/Puffer-Defekte vollkommen überbrückt oder
gefüllt.
In der CMC-Kontrollgruppe überlagerte nach
drei Wochen früher
neuer Knochen die Knochenränder
des Wirts und nahm weiterhin an Radiodichte zu. Erneut zeigten die
Pufferkontrolldefekte nach vier Wochen im Gegensatz dazu an den
Defekträndern
nur ein leichtes Anwachsen der Radiodichte. Keiner der Kontrolldefekte
in den Gruppen zeigte Anzeichen von knochiger Defektheilung. TABELLE 7
| RESULTATE
DER RADIOGRAPHISCHEN BEWERTUNG |
| Art
des Implantats | 1
Woche | 2
Wochen | 3
Wochen | 4
Wochen |
| OP/CMC | 0 | 1 | 2 | 3 |
| OP/CMC | 0 | 0 | 1 | 3 |
| OP/CMC | 0 | 1 | 2 | 3 |
| CMC-Kontrolle | 0 | 0 | 1 | 1 |
| CMC-Kontrolle | 0 | 1 | 1 | 2 |
| CMC-Kontrolle | 0 | 0 | 0 | 1 |
| OP/Puffer | 0 | 1 | 2 | 3 |
| OP/Puffer | 0 | 1 | 2 | 4 |
| OP/Puffer | 0 | 1 | 2 | 5 |
| Pufferkontrolle | 0 | 0 | 0 | 1 |
| Pufferkontrolle | 0 | 0 | 0 | 1 |
| Pufferkontrolle | 0 | 0 | 1 | 1 |
| OP/CMC | 0,0 ± 0,0 | 0,67 ± 0,58 | 1,67 ± 0,58 | 3.0 ± 0,0 |
| Mittelwert ± St.-Abw.
(n) | (3) | (3) | (3) | (3) |
| CMC-Kontrolle | 0,0 ± 0,0 | 0,33 ± 0,58 | 0,67 ± 0,58 | 1,33 ± 0,58 |
| Mittelwert ± St.-Abw.
(n) | (3) | (3) | (3) | (3) |
| OP-Puffer | 0,0 ± 0,0 | 1,0 ± 0,0 | 2,0 ± 0,0 | 4,0 ± 1,0 |
| Mittelwert ± St.-Abw.
(n) | (3) | (3) | (3) | (3) |
| Pufferkontrolle | 0,0 ± 0,0 | 0,0 ± 0,0 | 0,33 ± 0,58 | 1,0 ± 0,0 |
| Mittelwert ± St.-Abw.
(n) | (3) | (3) | (3) | (3) |
| OP/CMC =
0,35 mg rhOP-1 in 100 μl
CMC-Gel
CMC-Kontrolle = 100 μl
CMC-Trägergel
allein
OP/Puffer = 0,35 mg rhOP-1 in 100 μl Acetatpufferlösung
Pufferkontrolle
= 100 μl
Acetatpufferträgerlösung allein
OP/CMC – 4 Wochen |
-
Eine
Woche nach der Operation gab es bei keinem der OP/CMC-Defekte Veränderungen
beim radiographischen Aussehen. Nach 2 Wochen waren Spuren von radiodichten
Gebieten an den abgeschnittenen Knochenenden vorhanden. Nach 3 Wochen
war ein Anwachsen von Radiodichte von neuem Knochen zu beobachten,
der sich in den Defekten und entlang den lateralen Defekträndern bildete.
Ein Defekt zeigte Anzeichen von früher knochiger Überbrückung. Nach
4 Wochen hatten die OP/CMC-Defekte eine signifikante Menge an radiodichtem
neuen Knochen in dem Defekt. Die Defekte waren entlang der lateralen
Grenze der Ulna fast vollständig
mit Knochen nicht einheitlicher Dichte gefüllt und überbrückt. Neuer Knochen wurde signifikant mit
den Defekträndern
eingebaut. Keiner der mit OP/CMC behandelten Defekte war 4 Wochen
nach der Operation vollständig
mit neuem Knochen gefüllt
oder solide davon überbrückt. Der
letztliche radiographische Grad für jeden Defekt war 3 von 6
möglichen
Punkten (Mittelwert 3,0 ± 0,0,
n = 3).
-
CMC-Kontrolle – 4 Wochen
-
Zwei
Wochen nach der Operation gab es keine signifikanten Veränderungen
beim radiographischen Aussehen der CMC-Kontrolldefekte. Nach 3 Wochen
begannen bei 2 von 3 Defekten die Ränder des Wirts mit neuem Knochen überlagert
zu werden. Nach 4 Wochen zeigten die CMC-Defekte ein gewisses Anzeichen
der Aktivität
für neuen
Knochen an den Defekträndern,
aber kein Anzeichen von knochiger Defektheilung. Die letztlichen
radiographischen Grade waren 1, 2 und 1 von 6 möglichen Punkten (Mittelwert
1,33 ± 0,58,
n = 3).
-
OP/Puffer – 4 Wochen
-
Eine
Woche nach der Operation gab es bei keinem der mit OP/Puffer behandelten
Defekte Veränderungen
beim radiographischen Aussehen. Zwei Wochen nach der Operation waren
Spuren von radiodichten Gebieten in den OP/Puffer-Defekten und entlang
den Defektgrenzen anwesend. Eine signifikante Knochenneubildung
wurde auch in den subkutanen Geweben um die Defekte gesehen. Nach
3 Wochen erschienen Flocken an neuem Knochen in den Defekten und
in den darüberliegenden
weichen Geweben bildete sich neuer Knochen. Nach 4 Wochen gab es
ein signifikantes Anwachsen bei der Bildung von radiodichtem neuen
Knochen, der die mit OP-1 behandelten Defekte füllte und überbrückte. In zwei von drei Defekten
blieben die Ränder
sichtbar, obwohl proliferativer neuer Knochen die Defekte füllte und überbrückte. Keiner
der mit OP/Puffer behandelten Defekte war zum Zeitpunkt der Tötung nach
4 Wochen vollständig
gefüllt
mit neuem Knochen oder davon solide überbrückt. Die letztlichen radiographischen
Grade waren 3, 4 und 5 von 6 möglichen
Punkten (Mittelwert 4,0 ± 1,0,
n = 3).
-
Pufferkontrolle – 4 Wochen
-
3
Wochen nach der Operation gab es bei keinem der nur mit der Pufferkontrolle
behandelten Defekte signifikante Veränderungen beim radiographischen
Aussehen. Nach 4 Wochen wurde eine Erhöhung bei der Radiodichte an
den Rändern
beobachtet, obwohl keine Anzeichen der Defektheilung evident waren.
Der letztliche radiographische Grad für jede Stelle war 1 von 6 möglichen
Punkten (Mittelwert 1,0 ± 0,0,
n = 3).
-
Grobe Beobachtungen
-
OP-1-Defekte:
Alle mit OP/CMC und OP/Puffer behandelten Defekte waren manuell
stabil und hatten sichtbar eine Masse von Knochenneubildung an der
Defektstelle.
-
Trägerkontrolldefekte:
Keiner der CMC- und nur Pufferkontrolldefekte war nach 4 Wochen
manuell stabil, obwohl alle mechanisch getestet wurden.
-
Mechanische Testung
-
Eine
Zusammenfassung der mechanischen Testresultate erscheint in Tabelle
8
-
OP/CMC
-
4
Wochen nach der Operation war die mittlere Belastung bis zum Versagen
von Defekten von 3 mm, die mit OP/CMC behandelt waren, 33,08 ± 16,41
N (n = 3). Dies bedeutet 51% der Kraft von intakten Kontrollen,
die zuvor getestet wurden. Die mittlere Winkeldeformation war 31,13 ± 15,32
Grad. Die mittlere Energie, die bis zum Versagen aufgenommen wurde,
war 41,64 ± 30,52
Nm-Grad.
-
CMC-Kontrolle
-
4
Wochen nach der Operation war die mittlere Belastung bis zum Versagen
von Defekten von 3 mm, die mit CMC-Kontrolle behandelt waren, 9,32 ± 16,41
N (n = 3). Dies bedeutete 14% der Kraft von intakten Kontrollen,
die zuvor getestet wurden. Die mittlere Winkeldeformation war 33,36 ± 25,95
Grad. Die mittlere Energie, die bis zum Versagen aufgenommen wurde,
war 10,53 ± 8,62
Nm-Grad.
-
OP/Puffer
-
4
Wochen nach der Operation war die mittlere Belastung bis zum Versagen
von Defekten von 3 mm, die mit OP/Puffer behandelt waren, 29,03 ± 16,79
N (n = 3). Dies bedeutet 44% der Kraft von intakten Kontrollen,
die zuvor getestet wurden. Die mittlere Winkeldeformation war 36,14 ± 14,71
Grad. Die mittlere Energie, die bis zum Versagen aufgenommen wurde,
war 37,87 ± 27,73
Nm-Grad.
-
Pufferkontrolle
-
4
Wochen nach der Operation war die mittlere Belastung bis zum Versagen
von Defekten von 3 mm, die mit Pufferkontrolle behandelt waren,
5,62 ± 1,65
N (n = 3). Dies bedeutet 9% der Kraft von intakten Kontrollen, die
zuvor getestet wurden. Die mittlere Winkeldeformation war 24,91 ± 12,03
Grad. Die mittlere Energie, die bis zum Versagen aufgenommen wurde,
war 3,94 ± 4,12
Nm-Grad. TABELLE 8
| MECHANISCHE
TESTRESULTATE |
| Implantat | Maximale Belastung bis
zum Versagen (N) | Drehmoment
(Nm) | Prozent
intakte Kontrolle (%) | Winkelbildung | Bis
zum Versagen absorbierte Energie (Nm-Grad) |
| OP/CMC | 49,37 | 2,96 | 75,65 | 35,72 | 63,57 |
| OP/CMC | 16,56 | 0,99 | 25,37 | 14,04 | 6,78 |
| OP/CMC | 33,32 | 2,00 | 51,05 | 43,62 | 54,56 |
| MITTELWERT ± STANDARDABWEICHUNG | 33,08 ± 16,41 | 1,99 ± 0,98 | 50,69 ± 25,14 | 31,13 ± 15,32 | 41,64 ± 30,52 |
| CMC-Kontrolle | 12,81 | 0,77 | 19,63 | 33,26 | 14,06 |
| CMC-Kontrolle | 11,00 | 8,00 | 16,85 | 59,35 | 16,83 |
| CMC-Kontrolle | 4,14 | 0,25 | 6,34 | 7,46 | 0,70 |
| MITTELWERT ± STANDARDABWEICHUNG | 9,32 ± 4,57 | 3,01 ± 4,33 | 14,27 ± 7,01 | 33,36 ± 25,95 | 10,53 ± 8,62 |
| OP/Puffer | 32,47 | 1,95 | 49,75 | 50,11 | 55,91 |
| OP/Puffer | 43,83 | 2,63 | 67,15 | 37,53 | 51,77 |
| OP/Puffer | 10,79 | 0,65 | 16,53 | 20,78 | 5,94 |
| MITTELWERT ± STANDARDABWEICHUNG | 20,03 ± 16,79 | 1,74 ± 1,01 | 44,48 ± 25,72 | 36,14 ± 14,71 | 37,87 ± 27,73 |
| Pufferkontrolle | 4,82 | 0,29 | 7,38 | 11,12 | 0,73 |
| Pufferkontrolle | 4,53 | 0,27 | 6,94 | 30,32 | 2,50 |
| Pufferkontrolle | 7,52 | 0,45 | 11,52 | 33,29 | 8,59 |
| MITTELWERT ± STANDARDABWEICHUNG | 5,62 ± 1,65 | 0,34 ± 0,10 | 8,62 ± 2,53 | 24,91 ± 12,03 | 3,94 ± 4,12 |
-
Histologie
-
Eine
Zusammenfassung der Resultate der histologischen Bewertung ist in
Tabelle 9 dargestellt. Von 12 Gesamtpunkten war der mittlere histologische
Grad der Defekte, die mit OP/CMC behandelt waren, 7,00 ± 0,87.
Der mittlere histologische Grad der CMC-Kontrolldefekte war 4,50 ± 0,87.
Die mittleren histologischen Grade der OP/Pufferdefekte und der
Pufferkontrollen waren 6,08 ± 0,14
und 4,0 ± 1,0.
-
OP/CMC
-
Die
Behandlung resultierte nach vier Wochen in einer frühen osteochondralen Überbrückung mit
Gebieten an mineralisierendem Knorpel. In mit OP/CMC behandelten
Defekten wurde eine signifikante Knochenneubildung in den periostealen
und endostealen Bereichen der Ulna beobachtet, die sich über die
Grenzen des Defekts ausbreitete. Gebiete von mineralisierendem Knorpel
und etwas fibröses
Gewebe waren in den Defekten vorhanden. Die Überbrückung der Defekte war nach
vier Wochen nicht erreicht. Die Ränder des Wirts blieben sichtbar,
obwohl es Anzeichen des Einbaus von neuem Knochen und Remodellierung
gab.
-
CMC-Kontrolle
-
Nach
vier Wochen wurde in den CMC-Kontrolldefekte keine vollständige knochige
Heilung beobachtet. Die Kontrolldefekte resultierten in fibrösen Verbindungen
mit keinen Anzeichen von knochiger Überbrückung. Es wurde beobachtet,
dass fibröses
Gewebe und mineralisierender Knorpel die Defekte füllten und
umgaben. Sehr kleine Mengen an neuem Knochen hatten sich entlang
der Knochenhaut der Ulna und am der endostealen Region der Ulna
in der Nähe
der Ränder
des Wirts gebildet. Es wurden Anzeichen an Resorption des Rands
des Wirts an den Enden des Defekts beobachtet.
-
OP/Puffer
-
Behandelte
Defekte wurden mit mineralisierendem Knorpel und fibrösem Gewebe
gefüllt.
In den endostealen und periostealen Regionen der Ulna in der Nähe der Grenzen
des Defekts bildete sich neuer Knochen und frühe Zeichen von Überbrückung mit
neuem Knochen waren evident, obwohl keiner der Defekte vollkommen überbrückt war.
Die Knochenränder
des Wirts zeigten Anzeichen von Einbau mit neuem Knochen, wurden
aber nach vier Wochen nicht völlig überdeckt.
Es wurde eine gewisse Remodellierung der Knochenränder des
Wirts und eine frühe
Verdichtung entlang der Grenzen des neuen Knochens beobachtet. Neuer Knochen
bildete sich auch in den subkutanen Gewebeschichten, die die defekte
Stelle überlagerten
und sich über
die Defektgrenzen erstreckten.
-
Pufferkontrolle
-
In
keinem der Pufferkontrolldefekte wurde vier Wochen nach der Operation
vollständige
knochige Heilung beobachtet. Nicht behandelte Defekte zeigten fibröse Verbindungen
mit keinen Anzeichen von knochiger Überbrückung; es wurde fibröses Gewebe
beobachtet, das die Defekte füllte
und sie umgab. Andere nicht behandelte Defekte zeigten kein Anzeichen
einer fibrösen
oder anderen Verbindung. Sehr wenig Knochenneubildung wurde bei
den Pufferkontrolldefekten beobachtet. Endostealer neuer Knochen
erstreckte sich aus der Markhöhle
der Ulna und entlang den lateralen Defektgrenzen bildete sich periostealer
neuer Knochen. Die Knochenenden des Wirts waren sichtbar mit Anzeichen
von Randresorption. TABELLE 9
| RESULTATE
DER HISTOLOGISCHEN BEWERTUNG |
| | Qualität der Verbindung | Randentwicklung | Entzündungsreaktion | Gesamtbewertung |
| Implantat | | | | |
| OP/CMC | 1,5 | 1 | 4 | 6,5 |
| OP/CMC | 3 | 1 | 4 | 8 |
| OP/CMC | 1,5 | 1 | 4 | 6,5 |
| MITTELWERT ± STANDARDABWEICHUNG | 2,0 ± 0,87 | 1,0 ± 0,0 | 4,0 ± 0,0 | 7,0 ± 0,87 |
| CMC-Kontrolle | 1 | 0 | 4 | 5 |
| CMC-Kontrolle | 1 | 0 | 2,5 | 3,5 |
| CMC-Kontrolle | 1 | 0 | 4 | 5 |
| MITTELWERT ± STANDARDABWEICHUNG | 1,0 ± 0,0 | 0,0 ± 0,0 | 3,50 ± 0,87 | 4,50 ± 0,87 |
| OP/Puffer | 1,25 | 1 | 4 | 6,25 |
| OP/Puffer | 1 | 1 | 4 | 6 |
| OP/Puffer | 1 | 1 | 4 | 6 |
| MITTELWERT ± STANDARDABWEICHUNG | 1,08 ± 0,14 | 1,0 ± 0,0 | 4,0 ± 0,0 | 6,08 ± 0,14 |
| Pufferkontrolle | 1 | 0 | 2 | 3 |
| Pufferkontrolle | 1 | 0 | 4 | 5 |
| Pufferkontrolle | 0 | 0 | 4 | 4 |
| MITTELWERT ± STANDARDABWEICHUNG | 0,67 ± 0,58 | 0,0 ± 0,0 | 3,33 ± 1,15 | 4,0 ± 1,0 |
-
2. Experiment 3
-
Von
rekombinantem menschlichem knochenbildendem Protein-1 (rhOP-1),
wenn implantiert in Kombination mit Knochenkollagenmatrix, wurde
gezeigt, dass es diaphyseale segmentale Defekte kritischer Größe in Tieren
durch die Bildung von neuem Knochen heilt, der biologisch und biomechanisch
funktionell ist. Der Zweck dieser Untersuchung war die Bewertung
der Wirksamkeit von matrixfreien injizierbaren Formulierungen von
rhOP-1 für
die Beschleunigung der Knochenheilung in einem Hundemodell für Defekte
unkritischer Größe.
-
Bilaterale
osteoperiosteale segmentale Defekte von 3,0 mm Länge wurden in der mittleren
Ulna von 18 erwachsenen männlichen
Mischlingshunden erzeugt. Die Speiche wurde ohne zusätzliche
Fixierung wegen der mechanischen Stabilität erhalten. Weiche Gewebe wurden
vor der Injektion von rhOP-1 geschlossen. Neun Tiere erhielten rhOP-1-Formulierungen
in einen Defekt und die Trägerkontrollen
in den contralateralen Defekt und sie wurden 4 Wochen nach der Operation
getötet.
Neun unbehandelte Kontrolldefekte wurden in Zeiträumen von
4, 8 und 12 Wochen für
den Vergleich mit der rhOP-1-Behandlung bewertet. In regelmäßigen Abständen wurden
Radiogramme aufgenommen, um das Fortschreiten der Heilung zu untersuchen.
Bei der Tötung
wurden alle Ulnae durch Torsion mechanisch getestet, ob die Heilung
ausreichend war. Nicht entkalkte histologische Schnitte wurden für die Qualität und Menge
an Knochenneubildung und das Ausmaß an Heilung bewertet.
-
Radiographisch
war die Knochenneubildung schon zwei Wochen nach der Operation in
mit rhOP-1 behandelten Defekten evident und nach 4 Wochen überbrückte neuer
Knochen den Defekt. Im Gegensatz dazu zeigten Stellen mit Trägerkontrollen
4 Wochen nach der Operation wenig oder keine Knochenbildung. Darüber hinaus
waren die Torsionsstärken
von mit rhOP-1 behandelten Defekten nach 4 Wochen signifikant größer als mit
Träger
behandelte oder unbehandelte Kontrollen. Weiterhin waren die Torsionsstärken von
behandelten Defekten nach 4 Wochen praktisch gleich der Stärke von
nicht behandelten Kontrollen nach 12 Wochen. Eine eindeutige Beschleunigung
der Defektheilung und der Knochenbildung resultierte aus der Behandlung
mit rhOP-1. Die histologischen Befunde korrelierten mit den radiographischen
und mechanischen Testergebnissen.
-
Die
Resultate dieser Untersuchung bestätigen, dass knochenbildende
Proteine, die in Defekte unkritischer Größe injiziert werden, die Defektheilung
beschleunigen können,
einschließlich
Kallusbildung am Bruch und Bildung von überbrückendem Knochen. Defekte, die
mit rhOP-1 behandelt wurden, bildeten neuen Knochen signifikant
schneller und stellten die Stärke
und Steifheit des Bruchs früher
wieder her als unbehandelte Kontrollen.
-
Zusammenfassend
hat die Fähigkeit
der hier vorstehend beschriebenen matrixfreien Vorrichtungen, die
Defektreparatur zu verbessern, einschließlich der Beschleunigung der
Rate und der Verbesserung der Qualität von neu gebildetem Knochen,
Auswirkungen für
die Verbesserung der Knochenheilung bei betroffenen Individuen wie
Diabetikern, Rauchern, fettleibigen Individuen, alten Individuen,
von Osteoporose betroffenen Individuen, Benutzern von Steroiden
und anderen, die wegen eines erworbenen oder angeborenen Zustands
eine reduzierte Fähigkeit
haben, Knochenbrüche
zu heilen, einschließlich
Individuen mit gestörtem Blutfluß zu ihren
Extremitäten.
Solche Individuen erleben eine gestörte Heilung, was von einer
reduzierten Fähigkeit
resultiert, Vorläuferzellen
zu fördern,
und erleben Nekrose und/oder Sepsis.
-
Die
hier offenbarten Verfahren und Formulierungen stellen durch beschleunigte
Knochenbildung eine verbesserte Knochenbildung bereit. Spezifisch
kann bei Befolgung der hier offenbarten Verfahren und Protokolle
die Rate der Knochenbildung, einschließlich Bildung von Knochenkallus
und Überbrückung, beschleunigt werden.
Wie hier beispielhaft dargestellt, erfolgt die Brückenbildung
schneller und in einem kürzeren
Zeitrahmen, was die stabilere Knochenbildung zuläßt, und dabei die biomechanische
Stärke
von sich neu bildendem Knochen verbessert.
-
Es
ist auf dem Fachgebiet bekannt, dass die Kallusbildung eine Stufe
in dem vielstufigen Heilungsprozess ist, der in der Knochenbildung
kulminiert. Spezifisch umfasst der Heilungsprozess fünf Stufen:
Ereignis, Entzündung,
Bildung von weichem Kallus, Bildung von hartem Kallus und Remodellierung.
Das Ereignis beginnt mit der Einleitung des Bruchs und geht weiter,
bis die Energie völlig
verteilt ist. Das Entzündungsstadium ist
durch Hämatombildung
an der Bruchstelle charakterisiert, Knochennekrose an den Enden
der Fragmente und einem Entzündungsinfiltrat.
Granulationsgewebe ersetzt nach und nach das Hämatom, Fibroblasten produzieren
Kollagen und Osteoclasten beginnen, nekrotischen Knochen zu entfernen.
Das Abflauen von Schmerz und Schwellung markiert den Beginn der
dritten Stufe des weichen Kallus. Diese Stufe ist durch eine erhöhte Vaskularisierung
und reichliche Bildung von neuem Knorpel charakterisiert. Das Ende
der Stufe des weichen Kallus geht einher mit der Verbindung der
Fragmente durch fibröses
oder Knorpelgewebe. Während der
vierten Stufe oder der des harten Kallus wandelt sich der Kallus
in Geflechtknochen um und erscheint klinisch geheilt. Die letzte
Stufe des Heilungsprozesses umfasst die langsame Remodellierung
von Geflecht- zu Lamellenknochen und die Rekonstruktion des medullaren
Kanals (vgl. "Current
Diagnosis & Treatment
in Orthopedics," Hrsg.
H. B. Skinner (LANGE Medical Book Publ.)).
-
F. Reparatur von chondralen Defekten mit
matrixfreien knochenbildenden Vorrichtungen (Schaf)
-
1. Experiment 1
-
Unter
Verwendung von ähnlichen
Verfahren und Materialien wie vorstehend beschrieben (vgl. die entsprechenden
Teile von D.2) wurde die folgende Untersuchung durchgeführt, um
weiter hin zu zeigen, dass das beispielhafte knochenbildende Protein
OP-1, wenn es in einer matrixfreien Vorrichtungen verabreicht wird,
die aktive Knorpelbildung und die Reparatur von chondralen Defekten
in gewichttragenden Gelenken induzieren kann.
-
Wie
bereits vorstehend beschrieben ist ein Defekt eine strukturelle
Zerstörung
des Knorpels und kann die Konfiguration eines Hohlraums annehmen,
eines dreidimensionalen Defekts, wie zum Beispiel einer Lücke, einer
Höhle,
eines Lochs oder einer anderen substantiellen Zerstörung der
strukturellen Integrität.
Defekte im artikulären
Knorpel können
sich durch die gesamte Tiefe des artikulären Knorpel erstrecken und/oder
in den Knochen unter dem Knorpel (osteochondrale Defekte) oder die
Defekte können
oberflächlich
sein und beschränkt
auf das Knorpelgewebe selbst (chondrale oder subchondrale Defekte).
-
Am
Anfang erfährt
beschädigte
Knorpelmatrix einen Abbau durch Metalloproteinasen, die durch zelluläre Bestandteile
in der Nähe
freigesetzt werden. Der proteolytische Abbau befreit von beschädigten Matrixkomponenten
und setzt dabei anabolische Cytokine frei, die in der Matrix eingeschlossen
sind. Wie es gegenwärtig
verstanden wird, stimulieren von der Matrix freigesetzte Cytokine
die Proliferation von Chondrocyten und, was wichtig ist, die Synthese
einer neuen makromolekularen Matrix. Die Anwesenheit von Zusammenlagerungen
von proliferierenden Chondrocyten, wie mikroskopisch bestimmt, ist
einer der ersten Indikatoren der Reparaturantwort des Knorpels.
Vermutlich wirkt diese Reparatur der katabolischen Wirkung der Proteasen entgegen
und stabilisiert das Gewebe durch erhöhte Matrixsynthese.
-
Der
artikuläre
Knorpel und die Reparatur des artikulären Knorpel sind durch Standardverfahren
der Histologie und Histochemie leicht zu untersuchen. Diese Verfahren
sind im Fachgebiet bekannt und umfassen mikroskopische Untersuchungen
von Schnitten von Knorpel, die durch eines einer Zahl von histochemischen Färbemitteln
gefärbt
sind, einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf, Toluidinblau, Hämatoxylin
und Eosin, von Kossa, Safranin O und Masson's Trichromfarbe. Nach der Anwendung
von verschiedenen Farbstoffen kann der Durchschnittsfachmann die
Reparaturantwort des Knorpels durch die Identifikation von proliferierenden Chondrocyten
und die Bestimmung der Qualität
und Menge an Matrix wie Kollagen und Proteoglycanen bewerten, die
von den Chondrocyten synthetisiert werden.
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Wie
hier verwendet, betrifft artikulärer
Knorpel spezifisch Hyalin-Knorpel, ein nicht vaskuläres, nicht mineralisiertes
Gewebe, welches die artikulierenden Oberflächen der Teile von Knochen
in Gelenken bedeckt. Unter physiologischen Bedingungen liegt artikulärer Knorpel über stark
vaskulärem
mineralisiertem Knochen, der als subchondraler Knochen bezeichnet
wird. Artikulärer
Knorpel ist durch spezialisierte knorpelbildende Zellen charakterisiert,
Chondrocyten genannt, die eingebettet sind in eine extrazelluläre Matrix,
die Fasern von Kollagen (vorwiegend Typ II Kollagen, ebenso wie
die seltenen Typen wie die Typen IX und XI) umfasst, verschiedene
Proteoglycane, einschließlich
Glycosaminoglycane, andere Proteine und Wasser.
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In
dieser Untersuchung wurden Schafe als ein Modell zur Bewertung der
Reparatur von chondralen Defekten von 1–2 mm Gesamttiefe × 7 mm Gesamtdurchmesser
auf der gewichttragenden kondylären
Oberfläche
des Knies verwendet. Die Defekte waren chondrale Defekte partieller
Tiefe und umfassten nicht den subchondralen Knochen, was durch das
Fehlen einer Blutung nach der Schaffung des Defekts evident war. Eine
weitere Bestätigung
wurde durch die Histologie von dünnen
Schnitten zum Zeitpunkt der Tötung
erhalten; die Defekte erstreckten sich nicht in den subchondralen
Knochen.
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Das
experimentelle Protokoll wird in Tabelle 10 bereitgestellt. Unter
Verwendung von standardisierten Chirurgieverfahren wurde ein Defekt
2 mm Gesamttiefe × 7
mm Gesamtdurchmesser auf der gewichttragenden kondylären Oberfläche des
rechten und linken Knies chirurgisch gemacht. Das rechte Knie diente
als Kontrollknie. Eine flüssige
matrixfreie OP-1-Vorrichtung (50 oder 250 μg OP-1) in 20 mM Natriumacetat,
pH 4,5, wurde entweder als ein einziger Bolus mittels Injektion
in das intraartikuläre
Gelenk verabreicht oder intermittierend mittels einer lokal implantierten
subkutanen Minipumpe (ALZET
® 2002, ALZA Scientific
Products, Palo Alto, CA) verabreicht (0,5 μl pro Stunde für 2 Wochen
Dauer; insgesamt 200 μl).
Zahlreiche geeignete Minipumpen sind leicht verfügbar und werden vom Durchschnittsfachmann
routinemäßig für die Verabreichung
von pharmazeutischen und/oder therapeutischen Mitteln verwendet;
der Durchschnittsfachmann wird die bevorzugte Art und Rate der Verabreichung
unter den Umständen
einschätzen
können.
Die Heilung der chondralen Defekte wurde mit histologischen und
histochemischen Standardverfahren bewertet. Tabelle 10
| Reparatur
von chondralem Defekt beim Schaf |
| Gruppe | Linkes
Knie (matrixfreie Vorrichtung) | Rechtes
Knie (Kontr.) |
| I | 50 μg OP-1 | Kein
Rx |
| II | 250 μg OP-1 | Kein
Rx |
| III | 50 μg OP-1 mittels
Minipumpe | Träger mittels
Minipumpe |
| IV | 250 μg OP-1 mittels
Minipumpe | Träger mittels
Minipumpe |
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Die
bisher gesammelten Daten einer 3-monatigen Untersuchung mit Minipumpe
(Gruppe III und IV) offenbaren, dass matrixfreie OP-1-Vorrichtungen
die Knorpelbildung und die anschließende Reparatur von chondralen
Defekten induzieren können.
Nach zwölf
Wochen wurde bei den Kontrolldefekten nur wenig Hinweise für die chondrale
Defektreparatur beobachtet. Mittels der histologischen und histochemischen
Standardbewertung wurde jedoch in dem mit matrixfreiem OP-1 behandelten
Tier sowohl die Bildung von neuem Knorpel als auch die Fusion von
altem und neuem Knorpel beobachtet. Unter Verwendung von im Stand
der Technik anerkannten histologischen und histochemischen Indizes
als Maß für die chondrale
Reparatur, stimulierte OP-1 das Einwachsen von synovialen Zellen
in das defekte Gebiet. Diese Zellen differenzierten zu Proteoglycan-reichen
artikulären
Chondrocyten voller Dicke und davon resultierte die Reparatur des
chondralen Defekts.
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Die
Heilung eines Knorpeldefekts partieller Dicke ohne Beteiligung von
subchondralem Knochen in einem erwachsenen Tier ist ohne Präzedenzfall
und zeigt, dass die aktive Knorpelbildung eine Eigenschaft des Reparaturprozesses
ist, der von einer matrixfreien knochenbildenden Vorrichtung induziert
wird. Aus diesen Untersuchungen wird geschlossen, dass eine matrixfreie
knochenbildende Vorrichtung verwendet werden kann, um chondrale
Defekte in vivo zu reparieren. Es ist insbesondere wichtig, dass
eine solche Reparatur an einem gewichttragenden Gelenk in einem
großen
Tiermodell wie dem Schaf vorkommen kann.
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Andere
Untersuchungen der Reparatur von chondralen Defekten unter Verwendung
von matrixfreien OP-1-Vorrichtungen (zum Beispiel die Experimente,
die vorstehend in Gruppe I und II dargestellt sind) sind gegenwärtig noch
in der Durchführung.
Es werden ähnliche
Ergebnisse erwartet wie die, die mit dem vorstehend beschriebenen
experimentellen Beispiel der Verabreichung mit einer Minipumpe erhalten
wurden, das heißt, es
wird erwartet, dass ein einziger Bolus von injizierbarer matrixfreier
Vorrichtung in das intraartikuläre
Gelenk einen chondralen Defekt in gewichttragenden Gelenken repariert.
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G. Alternative Verfahren zur Heilung von
segmentalen Defekten unkritischer Größe unter Verwendung von matrixfreien
knochenbildenden Vorrichtungen (Referenzbeispiel)
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1. Experiment 1: Die Wirkungen der verzögerten Verabreichung
von matrixfreier knochenbildender Vorrichtung auf die Reparatur
von Defekten unkritischer Größe (Hunde)
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Der
Zweck dieser Untersuchung war die Beurteilung der Heilung von Defekten
unkritischer Größe, die zu
verschiedenen verzögerten
Verabreichungszeiten nach der Verletzung mit matrixfreien OP-1-Vorrichtungen behandelt
wurden. Die nachstehend beispielhaft dargestellte besondere Vorrichtung
ist eine injizierbare Formulierung der matrixfreien knochenbildenden
Vorrichtung. Es wird erwartet, dass andere Ausführungsformen der Vorrichtung ähnliche
Resultate ergeben.
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In
Kürze sind
die experimentellen Beobachtungen wie folgt: im Allgemeinen heilten
segmentale Defekte unkritischer Größe, die mit matrixfreien OP-1-Vorrichtungen behandelt
wurden, 4 Wochen nach der Verletzung in signifikant höherem Maß im Vergleich
mit Kontrollen mit injizierbarem Träger. Von besondere Signifikanz
sind die unerwarteten Resultate, die anzeigen, dass mindestens ein
Indiz für
die Defektheilung, speziell die erhöhte mechanische Stärke der
Ulna, durch die Manipulation der Zeit nach der Verletzung, zu der
die matrixfreien OP-1-Vorrichtungen
verabreicht werden, erhöht
werden kann.
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Zum
Zwecke dieses Experiments und wie hier verwendet, bedeutet Verletzung
das zufällige
Auftreten eines Defekts (wie ein unerwarteter physischer Unfall,
der im Auftreten von Defekten unkritischer Größe resultiert), das beabsichtigte
Auftreten eines Defekts (wie die chirurgische Manipulation, die
im Auftreten von Defekten unkritischer Größe resultiert), oder nicht
traumatisch induzierte Defekte, die von einer oder von mehreren
der folgenden Krankheiten oder Störungen verursacht sein können: Sauerstoffmangel;
Ischämie;
primäre und
metastatische Tumorbildung; infektiöse Krankheiten; entzündliche
Krankheiten; sogenannte Kollagenerkrankungen (einschließlich Defekten
der Kollagensynthese, des Kollagenabbaus oder bei normaler Matrix); angeborene,
genetische oder Entwicklungskrankheiten; Ernährungskrankheiten; metabolische
Krankheiten; idiopathische Krankheiten; und Krankheiten in Zusammenhang
mit abnormer mineralischer Homöostase,
um nur einige zu nennen.
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Einige
der hier beispielhaft dargestellten Verfahren beinhalten den Schritt
der Verabreichung einer matrixfreien Vorrichtung an einer defekten
Stelle nach dem Beginn des Heilungsprozesses; die Stufen des Heilungsprozesses
und die damit verbundenen physiologischen Ereignisse wurden früher beschrieben.
Ein anderes der Verfahren umfasst den Schritt der Verabreichung
einer matrixfreien Vorrichtung an einer defekten Stelle während der
Reifung der endogenen Matrix an der Stelle; die Ereignisse, die
mit der endogenen Matrixbildung während der endochondralen Knochenbildung
einhergehen, wurden auch früher
beschrieben. In einer gegenwärtig
bevorzugten Ausführungsform
stellt die vorliegenden Erfindung die Verwendung einer matrixfreien
Vorrichtung für
die Herstellung eines Medikaments für die Reparatur eines Knochendefekts,
eines chondralen Defekts oder eines osteochondralen Defekts bereit,
die den Schritt der Verabreichung einer matrixfreien Vorrichtung
zu Zeiten nach der Verletzung umfassen, die verzögert sind. Solche Verzögerungen
können
kurzfristig sein, mittel- oder langfristig, wie nachstehend beschrieben.
Das Ausmaß,
um das die Verabreichung verzögert ist,
hängt von
den Umständen
ab und der Durchschnittsfachmann wird leicht die Bedeutung davon
verstehen.
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Wie
nachstehend gezeigt ist die verbesserte Heilung und Defektreparatur
das Ergebnis der Verabreichung einer matrixfreien Vorrichtung an
einer defekten Stelle nach Ablauf von bestimmten Zeiträumen nach der
Verletzung. Zum Beispiel kann die verzögerte Verabreichung Zeiten
von mindestens 0,5 Stunden bis zu mindestens 6 Stunden nach der
Verletzung umfassen; in einer anderen Ausführungsform können die
verzögerten
Verabreichungszeiten Zeiten von mindestens 6 Stunden bis zu 24 Stunden
umfassen, oder von mindestens 24 Stunden bis zu 48 Stunden nach
der Verletzung. In einer gegenwärtig
bevorzugten Ausführungsform
ist die Verzögerung
mindestens 6 Stunden. Andere Verabreichungzeiten nach der Verletzung
werden durch die vorliegenden Erfindung ebenfalls in Betracht gezogen.
In gewissen anderen gegenwärtig
bevorzugten Ausführungsformen
können
die verzögerten
Verabreichungszeiten von mindestens 48 Stunden bis zu mindestens
72 Stunden nach der Verletzung betragen. In noch anderen Ausführungsformen
können
die Verabreichungszeiten signifikant über 72 Stunden hinausreichen,
d. h. knochenbildende Vorrichtungen könne an der defekten Stelle
erst in der Stufe der Remodellierung der Knochenheilung verabreicht
werden. Es werden auch Verfahren in Betracht gezogen, bei denen
matrixfreie knochenbildende Vorrichtungen an der Stelle eines Defekts
unkritischer Größe zu vielen
Zeitpunkten nach der Verletzung verabreicht werden. Zum Beispiel
ist eine gegenwärtig
bevorzugte Vielzahl von 0,5 bis 6 Stunden und 7 Tage nach der Verletzung.
Eine Vielzahl von verzögerten
Verabreichungen kann mittels manueller Verabreichung an die defekte
Stelle oder mittels automatischer Verabreichungen unter Verwendung
einer früher
beschriebenen Minipumpe erreicht werden.
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Experimenteller Aufbau
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Insgesamt
12 erwachsene Mischlingshunde wurden verwendet. Wie früher beschrieben
wurden bilaterale segmentale Defekte der Ulna von 3 mm Länge in allen
Tieren erzeugt. Wie in dieser besonderen Untersuchung beispielhaft
dargestellt war die verwendete matrixfreie Formulierung von OP-1
3,5 mg OP-1/ml, die in 100 Mikroliter Lactose/Acetatpuffer verabreicht
wurde, wie vorstehend beschrieben. Zwölf Tieren wurden in den rechten
Defekt matrixfreie Vorrichtungen zu verschiedenen Zeitpunkten nach
der Verletzung verabreicht und Kontrollvorrichtungen wurden in den
linken Defekt zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Verletzung verabreicht.
Drei Tiere wurden bei der Schaffung des Defekts behandelt (0 Stunden),
drei 6 Stunden nach der Verletzung und drei 48 Stunden nach der
Verletzung. Alle Tiere wurden 4 Wochen nach der Chirurgie getötet. Es wurden
wöchentlich
Radiogramme aufgenommen, um den Fortschritt der Heilung zu untersuchen.
Bei der Tötung
wurden Knochensegmente mittels Histologie auf Gewebereaktion, Qualität und Menge
an Knochenneubildung und Ausmaß an
Heilung beurteilt. Alle Ulnae wurden en bloc gewonnen und in Torsion
mechanisch getestet.
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Wie
früher
beschrieben wurden die Ulnae direkt nach der Sektion durch Torsion
auf Versagen in einer MTS hydraulischen Testmaschine mit geschlossenem
Kreislauf unter Hubkontrolle bei einer konstanten Vorschubrate von
50 mm/Min. getestet. Ein Ende war starr fixiert und das andere wurde
gegen den Uhrzeigersinn gedreht. Die Torsionskraft wurde mittels
eines Hebelarms von sechs cm eines servohydraulischen Materialtestsystems übertragen.
Es wurden gleichzeitig Aufzeichnungen von der Verdrehung des Implantats
vorgenommen, gemessen durch die Hubkontrolle der Maschine, während die
Last von der Belastungszelle aufgezeichnet wurde. Die Daten wurden
mittels eines Analog-Digital-Wandlers und eines PC und einer online
Computeraufnahmesoftware aufgezeichnet. Es wurden Kurven der Kraft-Winkel-Verdrehung
erzeugt, aus denen das Drehmoment und die Winkeldeformation bis
zum Versagen erhalten wurden und die Energieaufnahme bis zum Versagen
als die Fläche
unter der Last-Verdrehungskurve berechnet wurde.
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Resultate
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Alle
Proben wurden 4 Wochen nach der Chirurgie mechanisch getestet. Mechanisch
hatten die Defekte, die die matrixfreie OP-1-Vorrichtung 6 Stunden
nach der Verletzung erhielten, die höchste Torsionskraft; 73% von
intakten Ulnae verglichen mit 64% nach 48 Stunden und 60% zur Stunde
0. Die Kontrolldefekte bei 0 Stunden, 6 Stunden und 48 Stunden nach
der Verletzung hatten Kräfte
von 23%, 28% und 24%.
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Diese
Untersuchung zeigt das überraschende
Resultat, dass eine verbesserte Heilung eines Defekts unkritischer
Größe durch
eine verzögerte
Verabreichung einer matrixfreien knochenbildenden Vorrichtung an der
defekten Stelle nach der Verletzung erreicht werden kann. Dieses
unerwartete Resultat steht in Beziehung zum Stadium der Knochenheilung
oder der endogenen Matrixbildung an der defekten Stelle, einschließlich, aber
nicht beschränkt
auf, Ereignissen wie Klümpchenbildung,
Infiltration von Vorläuferzellen
und Kallusbildung, insbesondere weicher Kallus, um nur einige zu
nennen. Darüber
hinaus wird erwartet, dass andere Defektreparaturprozesse unter
Einschluß des
Knochens, wie die Reparatur von osteochondralen Defekten ähnlich denen,
wie sie hier beschrieben wurden, durch eine verzögerte Verabreichung von matrixfreien
knochenbildenden Vorrichtungen an der defekten Stelle nach der Verletzung
verbessert werden können.
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H. Weitere Untersuchungen der Reparatur
von chondralen Defekten unter Verwendung von matrixfreien knochenbildenden
Vorrichtungen (Schaf) (Referenzbeispiel)
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1. Experiment 1: Glycosaminoglycane und
andere Polymere als Träger
für knochenbildendes
Protein
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Wie
früher
beschrieben sind gewisse bevorzugte Kategorien von Verbindungen
als Träger
in den hier betrachteten matrixfreien Vorrichtungen geeignet. Unter
den gegenwärtig
bevorzugten Kategorien sind Verbindungen, die im Fachgebiet als
Gleitmittel anerkannt sind, speziell diejenigen, die natürlicherweise vorkommen und
natürlicherweise
physiologische Funktionen wie der Schutz und die Schmierung von
Zellen und die Erhaltung der Integrität von Gewebe erfüllen, um
nur einige zu nennen. Solche Verbindungen sind im Allgemeinen auch
Befeuchtungsmittel und die Feuchtigkeit haltende Mittel. Eine Subkategorie
von gegenwärtig
bevorzugten Gleitmitteln umfasst die Biopolymere, die als Glycosaminoglycane
bekannt sind. Glycosaminoglycane, die bei der vorliegenden Erfindung
in Betracht kommen, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf,
Hyaluronsäure, Chondroitin,
Dermatan und Keratan, um nur einige zu nennen. Es können sowohl
sulfonierte als nicht sulfonierte Formen in der vorliegenden Erfindung
verwendet werden. Andere Glycosaminoglycane sind für die Formulierung
von matrixfreien Vorrichtungen geeignet, und der Durchschnittsfachmann
wird andere geeignete Verbindungen entweder wissen oder in der Lage
sein, sich ihrer unter Verwendung von lediglich Routineexperimenten
zu versichern. Für
eine detaillierte Beschreibung von Glycosaminoglycanen vgl. Aspinall,
Polysaccharides, Pergamon Press, Oxford (1970).
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Ein
insbesondere bevorzugtes Glycosaminoglycan ist Hyaluronsäure (HA).
HA ist ein natürlicherweise vorkommendes
anionisches Polysaccharid oder komplexer Zucker. Sie wird in Knorpel
und synovialer Flüssigkeit
gefunden. HA ist im kosmetischen Grad und im medizinischen Grad
erhältlich;
zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung ist der medizinische
Grad im Allgemeinen bevorzugt. HA kann beim Molekulargewicht von
niedrig bis hoch reichen. In gewissen Ausführungsformen der vorliegenden
Erfindung ist Material mit hohem Molekulargewicht vorzuziehen; nur
als Beispiel kann HA 190 (1,9 a 106 Da;
1% wird gegenwärtig
bevorzugt, es sind aber Konzentrationen geeignet, die von 0,5–2% reichen),
der Salzlösung
zugemischt wurde, zweimal wöchentlich
intraartikulär
verabreicht werden (0,1 ml/kg), um chondrale Defekte zu reparieren.
In anderen Ausführungsformen
kann HA mit niedrigem Molekulargewicht (wie HA80, 0,8 × 106 Da; 1% wird bevorzugt, es sind aber Konzentrationen
geeignet, die weniger als oder gleich 4% sind) verwendet werden.
Unter Verwendung der hier bereitgestellten Lehren kann der Durchschnittsfachmann
die Umstände
beurteilen, unter denen die HA mit hohem Molekulargewicht dem Material
mit niedrigem Molekulargewicht für
die Defektreparatur vorzuziehen ist, und umgekehrt. Darüber hinaus
wird dem Durchschnittsfachmann bewußt sein, dass HA in Lösung eine
viskose Flüssigkeit
ist, und dass die Viskosität
durch Einstellung des Molekulargewichts und des Gehalts an HA manipuliert
werden kann. Zum Beispiel ist es in einigen Ausführungsformen bevorzugt, sich der
Viskosität
der synovialen Flüssigkeit
im Gelenk anzugleichen. Unter Verwendung von Fachwissen und Routineexperimenten,
zusammen mit den hier bereitgestellten Lehren, kann der Durchschnittsfachmann
matrixfreie knochenbildende Vorrichtungen für die Reparatur von chondralen
Defekten formulieren, die HA als Träger verwenden; die Viskosität der Vorrichtung
ebenso wie der Proteingehalt können,
wie durch die Umstände
erforderlich und wie hier gelehrt, leicht angepaßt werden. HA ist kommerziell
von mehreren Quellen erhältlich,
einschließlich
Sigma Chemical Company (St. Louis, MO), Genzyme Pharmaceuticals
(Cambridge, MA) und Collaborative Laboratories (East Setauket, NY).
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Glycosaminoglycan
und andere polymere Träger
wie Hyaluronsäure,
die zur Verwendung mit den vorliegenden matrixfreien knochenbildenden
Vorrichtungen geeignet sind, können
in dem Schafmodell für
chondrale Defekte beurteilt werden, das vorstehend beschrieben ist.
Zum Beispiel werden mittels chirurgischer Standardverfahren in der
gewichttragenden Oberfläche
des medialen und lateralen Kondylus von beiden Kniegelenken in einem
Schaf Defekte von 2 × 7
mm gemacht. Ein Kniegelenk wird durch intraartikuläre Verabreichung
einer matrixfreien Vorrichtung mit OP-1/Hyaluronsäure behandelt
und das andere Gelenk wird mit Hyaluronsäure allein behandelt.
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Zwei
Gruppen an Schafen werden untersucht: Gruppe I wird nach 8 Wochen
getötet
und Gruppe II wird nach 6 Monaten getötet. Wie früher beschrieben kann die Heilung
von chondralen Defekten mittels Radiologie und histologischen und
histochemischen Standardverfahren beurteilt werden. Von jedem Knie
werden monatlich Radiogramme aufgenommen. Eine arthroskopische Untersuchung
wird unter Verwendung von Standardverfahren und Standardausrüstung unter
Anästhesie
unmittelbar vor der Tötung
vorgenommen. Unmittelbar nach der Tötung werden Proben des Kniegelenks
in 10%-igem gepuffertem Formalin fixiert. Die Proben werden longitudinal
geteilt und ein Teil in graduierter Ethylalkohollösung von
70–100%
entkalkt und in Methylmethacrylat eingebettet, geschnitten und für die histologische
Beurteilung angefärbt.
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Es
wird erwartet, dass Hyaluronsäure
enthaltende matrixfreie Vorrichtungen die Rate der Reparatur von
chondralen Defekten erhöhen
und das erreichte Maß an
Reparatur verbessern. Die Reparatur kann in Tiermodellen durch Standardverfahren
der Knorpelcharakterisierung beurteilt werden, einschließlich der
histologischen Bewertung von gefärbten
und fixierten Gewebeschnitten, der Lokalisierung von knorpelspezifischen Makromolekülen (wie
Typ II Kollagen und Aggrecan), der Bestimmung des Profils an Proteoglycan
und der mechanischen Testung. Alles Vorstehende kann durch einen
Durchschnittsfachmann unter Verwendung von Routineexperimenten und
dem Wissen auf dem Fachgebiet durchgeführt werden.
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