KR20150129717A - 열-감수성 골 성장 조성물 - Google Patents

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KR20150129717A
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쿠버 티. 샘패스
마이클 필브룩
아비바 쉬들린
존 엠. 맥퍼슨
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젠자임 코포레이션
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Abstract

본 발명은 수성 비히클 중에 유형 I 콜라겐, 골형성 성장 인자 (OSF), 예컨대 골 형태발생 단백질, 및 역 열-감수성 생분해성 중합체, 예컨대 폴록사머 407을 함유하는 비-침습성 주사가능 조성물에 관한 것이다. 상기 제제는 예컨대 주사에 의해 비-침습성으로 투여됨으로써, 많은 현재 시판되고 있는 골-유도 제품들의 한계를 극복할 수 있다. 상기 주사가능 골형성 제제는 원하는 부위에서 효과적으로 골 형성을 유도한다. 이와 같은 주사가능 현탁액은 생체재흡수성 골 복합재 (예컨대 히드록시아파타이트, 트리-칼슘 포스페이트) 및/또는 글리코사미노글리칸 (예컨대 히알루론산, 헤파린 술페이트)과 함께 골절 치유 및 척추 유합 절차에서 새로운 골 형성을 유도하기 위한 골 이식편 대체제 이식물로서의 퍼티 및/슬래브로 성형하는 데에 사용될 수 있다.

Description

열-감수성 골 성장 조성물 {THERMO-SENSITIVE BONE GROWTH COMPOSITIONS}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2013년 3월 14일에 출원된 미국 출원 일련 번호 61/783,803을 우선권 주장하며, 상기 출원은 본원에 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명은 골 성장을 촉진하기 위한 조성물, 더 구체적으로는 새로운 골 형성을 유도하기 위한 골 이식편 대체제 (BGS)에 관한 것이다.
예를 들어 골절 복구 또는 척추 유합을 위한 현행 BGS 제제의 외과적 적용은 골형성 성장 인자를 전달하도록 개발되어 있는 전달 시스템의 설계 및 구성으로 인하여 침습성이고, 시간이 소요되며, 까다로울 수 있다.
수성 비히클 중에 유형 I 콜라겐, 골형성 성장 인자 (OSF), 및 역 열-감수성 생분해성 중합체를 함유하는 비-침습성의 주사가능 조성물을 개발하였다. 상기 제제는 예컨대 주사에 의해 비-침습성으로 투여됨으로써, 많은 현재 시판되고 있는 골-유도 제품들의 한계를 극복할 수 있다. 예를 들어 전위 골 제제의 표준 래트 모델에 의해 확립되는 바와 같이, 상기 주사가능 골형성 제제는 골 형성을 효과적으로 유도한다. 상기 열-감수성 생분해성 중합체는 조성물의 유변물성을 조절함으로써 실온에서 주사될 수 있으며, 그의 온도가 체온 (37℃)으로 증가하면서 전달 부위에 OSF를 함유하는 생체적합성 겔을 형성함으로써 그것이 소용되는 곳에 조성물 (특히 OSF)을 국소화한다. 조성물에서의 골 콜라겐 분말의 사용은 OSF를 위한 적절한 전달 매트릭스를 제공하고, 골 제제를 촉진하는 생물학적 환경을 제공한다. 이와 같은 주사가능 조성물은 상대적으로 낮은 OSF 농도에서 새로운 골의 형성을 가능케 한다.
상기 조성물의 바람직한 실시양태에서, OSF는 BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-7 (OP-1)과 같은 골 형태발생 단백질 (BMP)이다. BMP-2 또는 BMP-4 또는 BMP-6 또는 BMP-7 (OP-1)의 동종이량체가 사용될 수 있으며, BMP-2/7 이종이량체와 같은 선택된 BMP의 이종이량체도 마찬가지일 수 있다. 선택된 BMP들의 조합 역시 사용될 수 있다. 이들 단백질은 인간 단백질일 수 있으며, 재조합 수단에 의해 제조될 수도 있는데; 열-감수성 콜라겐 스캐폴드 g 당 3.5 mg 미만의 농도로 존재할 수 있다. 조성물은 또한 트리칼슘 포스페이트 또는 히드록실아파타이트와 같은 미네랄을 포함할 수 있다. 조성물은 추가로 증량제 또는 점도 보충제, 예컨대 히알루론계 화합물, 특히 >500 Da의 분자량을 갖는 것을 포함할 수 있다. 상기 히알루론계 화합물은 이식 부위에서 몰드 또는 슬래브의 형성을 촉진하기 위하여, 가교 히알루론산과 같이 가교될 수 있다. 콘드로이틴 술페이트 또는 키토산과 같은 글리코사미노글리칸이 포함될 수도 있다.
역시 바람직한 실시양태에서는, 실온 이하에서 조성물 점도가 시린지로부터의 주사에 적합한데, 예를 들어 조성물은 20 G-1.5"의 바늘 크기를 갖는 5 cc 시린지로부터 전달될 때, ≤30 뉴턴의 시린지 압출력을 나타낸다. 상기 조성물은 가단성 퍼티일 수 있다. 조성물은 50 내지 80 중량%의 액체를 포함한다. 콜라겐의 평균 입자 크기는 입자 체에 의해 측정하였을 때, 70 내지 425 ㎛이다. 조성물 성분들은 완충된 용액 또는 멸균수 중에 용해/현탁된다. 조성물은 방사성-조영제를 포함할 수 있으며, 조성물이 히알루론계 화합물을 포함할 필요는 없다.
상기 조성물은 원하는 골 성장 부위, 예컨대 골절 부위에, 또는 척추 유합 절차를 받고 있거나 받은 적이 있는 환자의 경우 척추 유합 부위에 조성물을 주사하는 것에 의해 골 성장 유도를 필요로 하는 환자를 치료하는 데에 사용될 수 있다.
정의:
히알루론계 화합물이라는 용어는 글리코사미노글리칸 (예컨대 조류 또는 세균 공급원과 같은 살아있는 공급원 유래의 천연 HA, 또는 합성 HA)은 물론, 중합된 겔, 가교된 겔, 및 유도체화된 히알루론산을 포함한 전기의 히알루론산염 및 유도체를 포함한다.
골형성 성장 인자 (OGF)는 성장 및 분화 인자 (GDF), 골형성 단백질 (OP), 골유도 인자 (OIF)와 같이 자연의 골 형성 과정에 영향을 주는 화합물을 의미한다. 상기 용어는 BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-7 (OP-1)과 같은 골 형태발생 단백질 (BMP)을 포함한다. 일반적으로, 이들 인자에 대해서는 잘 알려져 있으며, 시중에서 구입가능하다.
폴록사머는 폴리옥시에틸렌 (폴리(에틸렌 옥시드))의 2개 친수성 사슬에 의해 측접되는 폴리옥시프로필렌 (폴리(프로필렌 옥시드))의 중심 소수성 사슬로 구성되는 비이온계 3블록 공중합체일 수 있다. 일반적으로는, US 3,740,421호를 참조하라. 폴록사머에는 신페로닉스(Synperonics) (크로다 인크. (Croda Inc.) 사, 뉴저지 에디슨 소재), 특히 폴록사머 407; 플루로닉(Pluronic) (바스프 코포레이션(BASF Corporation) 사, 뉴저지 플로람 파크 소재); 및 콜리포르(Kolliphor) (바스프 코포레이션 사, 뉴욕 태리타운 소재), 폴리에톡실화 피마자유, 및 20% (식염수 중 중량%)의 정제 폴록사머 407로 구성되는 레구(LeGoo)® 혈관내 폐쇄 겔의 제품들이 포함된다. 폴록사머는 역 열-감수성 특성 (즉 온도가 증가하면서 점도가 증가함)을 보유하는 생체적합성의 수용성인 중합체 계열이다. 구체적으로, 사용되는 폴록사머는 비-독성이며, 생체적합성이고, 수용성이며, 사용 범위에서 온도가 증가함에 따라 그의 점도가 감소한다. 실온에서, 조성물은 주사가능하나 점성이다. 체온으로 가열시, 그것은 유효한 화학적 조성의 변경 없이 - 경화 없이 - 온도-유도 상 변화를 겪음으로써 중합체 플러그(plug) 또는 슬래브를 형성한다.
하나 이상 본 발명 실시양태의 세부사항을 첨부 도면 및 하기의 상세한 설명에 제시한다. 본 발명의 기타 특징, 목적 및 장점들은 상세한 설명 및 도면, 그리고 청구범위에서 드러나게 될 것이다.
도 1은 새로운 골 형성의 조직학 점수를 나타낸다: PBS 중 BBC에 적재된 BMP-2 (양성 대조)에 대비한 20% 플루로닉 F-127 중 BBC에 적재된 BMP-2의 골 형성을 유도하는 능력의 평가; BBC, 소 골 콜라겐.
도 2a는 새로운 골 형성의 조직학 점수를 나타낸다: BBC를 포함하는 스캐폴드에 첨가되었을 때의 히알루론산 및 플루로닉 F-127의 골 형성을 유도하는 BMP-2의 능력에 대한 효과.
도 2b는 피하 이식물에서의 새로운 골 형성에 대한 조직학 점수를 나타낸다. BBC/플루론산을 포함하는 스캐폴드로서의 다양한 시중에서 구입가능한 히알루론산들의 평가: 각 점은 개별 동물을 나타내며, 수평 막대는 군 중간 점수를 나타냄. 어떠한 군들 사이에도 새로운 골/연골 형성에 있어서의 군 중간 점수의 유의성 있는 차이는 없었다 (P>0.05).
도 3은 피하 이식물에서의 새로운 골 형성에 대한 조직학 점수를 나타낸다: BBC/22.% 플루론산과의 조합으로써의 방사성-조영제 (Isov)의 평가: 각 점은 개별 동물을 나타내며, 수평 막대는 군 중간 점수를 나타냄. 핵심: + 군 1 대조 (22.5% PL + 0 ㎍ BMP-2) 대비 P<0.01; # 군 1 대조 대비 #P<0.001; ^ DGE 군 대비 P<0.05; PL = 플루로닉.
도 4는 피하 이식물에서의 새로운 골 형성의 조직학 점수를 나타낸다: BBC/플루론산 IBMP와의 조합으로써의 산호-히드록시아파타이트 스캐폴드의 평가. 각 원은 개별 동물을 나타내며, 수평 막대는 군 중간이다. 핵심: 25 BBC + 0 ㎍ BMP + P 대조 (군 1) 대비, + P<0.01이며 # P<0.001; P = 플루로닉.
도 4a는 피하 이식물에서의 새로운 골 형성에 대한 조직학 점수를 나타낸다. 임상적으로 사용된 소 아킬레스건 유래 콜라겐 (헬리오스타트-인퓨즈(Heliostat-InFuse), 메드트로닉(Medtronic) 사)의 다양한 용량의 BMP-2를 포함하는 BBC/플루론산 스캐폴드와의 비교. 각 점은 개별 동물을 나타내며, 수평 막대는 군 중간 점수를 나타낸다. 핵심: I = 인퓨즈®, BBC = 소 골 콜라겐/플루로네이트, ~ 양 0 ㎍ 군 대비 P<0.05; ^ 양 0 ㎍ 군 대비 P<0.01; # 양 0 ㎍ 군 대비 P<0.001; + H-5.4 ㎍ 군 대비 P<0.01; ++ H-5.4 ㎍ 군 대비 P<0.001; * H-5.4 ㎍ 군 대비 P<0.05.
도 5는 병리학 점수를 나타낸다. 각 원은 개별 동물을 나타내며, 수평 막대는 새로운 골/연골 생성에 대한 군 중간 점수를 나타낸다. >1 ㎍의 BMP-2 (군 2-12)를 함유하는 이식물을 이식받은 어떠한 군들 사이에도 군 중간 점수에 있어서의 유의성 있는 차이는 없었다. 핵심: + 군 1 대비 P<0.001; * 군 1 대비 P<0.01; # 군 1 대비 P<0.05.
도 6은 샘플에서의 단백질 그램 당 알칼리성 포스파타제 활성에 대한 BBC 로트 및 스캐폴드 크기의 효과를 나타낸다.
도 7은 단백질 그램 당 알칼리성 포스파타제 활성에 대한 HA와 플루로닉 F-127의 상이한 비의 효과를 나타낸다.
도 8은 샘플에서의 칼슘 농도에 대한 상이한 BBC 로트 및 스캐폴드 크기의 효과를 나타낸다.
도 9는 샘플 중 칼슘에 대한 상이한 HA/플루로닉 F-127 농도의 효과를 나타낸다.
도 10은 래트 전위 모델 (캐리어로는 22.5% 플루로닉 F-127)에서의 BMP-2의 골-유도 효율에 대한 상이한 콜라겐 스캐폴드들의 효과를 나타낸다.
도 11은 래트 전위 모델 (스캐폴드로는 BBC, 70-425 um)에서의 BMP-2의 골-유도 효율에 대한 캐리어들의 효과를 나타낸다.
도 12는 새로운 골/연골 형성에 대한 병리학 점수를 나타낸다. 각 점은 개별 동물을 나타내며, 수평 막대는 군 중간 점수를 나타낸다. 어떠한 군들 사이에도 새로운 골/연골 형성에 대한 군 중간 점수에 있어서의 유의성 있는 차이는 없었다 (P>0.05).
도 13은 28일 후의 HA 시중 제품 이식물들에서의 칼슘 농도를 나타낸다.
도 14는 래트 전위 모델에서의 BMP-2용 스캐폴드로서의 기존의 BBC 배치 로트 # 11848-79에 대비한 새로운 BBC 배치 로트 # 17075-43의 골유도 효율을 나타낸다.
도 15는 래트 전위 모델에서의 BMP-2의 골유도 효율에 대한, 대조에 대비한 캐리어 완충제 글루타메이트 및 PBS의 평가를 나타낸다.
도 16은 2종의 새로운 캐리어인 2.5% HA, 및 20%의 플루로닉 F-127을 포함하는 20% 플루로닉 F-127/2.5% HA의 비교이다.
도 17은 골 형성을 유도하는 rhBMP-2의 능력에 대한 상이한 캐리어들의 효과를 나타낸다.
도 18은 하기 2종 래트 전위 모델의 비교이다: 상이한 캐리어 중에서의 피하 (SQ) 대 근육내 (IM) 이식.
도 19는 병리학 점수의 산점도 그래프이다. 각 점은 개별 동물을 나타내며, 수평 막대는 군 중간 점수를 나타낸다. 핵심: + 군 1 대조 (22.5% PL + 0 ㎍ rhBMP-2) 대비 P<0.01; # 군 1 대조 대비 P<0.001; ^ DGE 군 대비 P<0.05; PL = 플루로닉.
도 20은 칼슘 농도에 대한 상이한 캐리어들의 효과를 나타낸다.
도 21은 이식물에서의 새로운 골/연골에 대한 병리학 점수를 나타낸다. 각 점은 개별 동물을 나타내며, 수평 막대는 군 중간 점수를 나타낸다. 기호들은 대조 군 1에 대비한 통계적 유의성을 나타낸다. >3 ㎍의 rhBMP-2를 제공받은 어떠한 처리 군들 사이에도 유의성 있는 차이는 없었다 (P>0.05). 핵심: ^ 군 1 대비 P<0.05; + 군 1 대비 P<0.01; # 군 1 대비 P<0.001.
도 22는 칼슘 농도에 대한 RBC 및 BBC의 효과를 나타낸다.
도 23은 칼슘 농도에 대한 캐리어 중 상이한 BBC 입자 크기, 스캐폴드 크기 및 조영제의 효과를 나타낸다.
도 24는 피하 이식물에서의 골/연골 생성에 대한 병리학 점수의 산점도 그래프이다. 각 점은 개별 동물을 나타내며, 수평 막대는 군 중간 점수이다. 핵심: + (BMP-4 3 ㎍에 대비한 P<0.05); # (BMP-4 0.3 ㎍에 대비한 P<0.05); * (BMP-4 3 ㎍에 대비한 P<0.01); ^ (BMP-4 3 ㎍ 및 0.3 ㎍에 대비한 P<0.001); a (BMP-4 1 ㎍에 대비한 P<0.05); b (BMP-4 0.3 ㎍에 대비한 P<0.01); PL = 22.5% 플루로닉; sqi = 피하 주사.
일반적으로, 하기의 프로토콜은 주사가능 골형성 조성물의 형성에 대해 예시한다. OGF, 유형 I 콜라겐 및 중합체 성분에 대해서는 간단하게 예시될 것인 바, 통상의 기술자라면, 임상적인 사용을 위하여, 인간 임상 용도로 승인된 것들에서 성분들이 선택될 것임을 이해하고 있을 것이다.
골형성 용액 제조:
멸균된 불용성 미립자인 소 골-유래 유형 1 콜라겐을 0.01 N HCl 중 30-40% 에탄올 (수중 v/v)에 흡수시키고, 거기에 0.01 N HCl 또는 글루타메이트 완충제 (pH 4.8) 중 BMP 용액을 무균으로 첨가하여, 3회 보르텍싱한 후, 4℃에서 1시간 동안 인큐베이팅한 다음, 동결건조에 적용하였다. 농축물로 첨가된 BMP의 양은 콜라겐 25-200 mg에 대하여 1-100 ㎍의 범위이다. 다음에, 동결건조된 콜라겐/BMP 매트릭스 (~25 mg)를 PBS (pH 7.4) 중 20-40%의 플루로닉 중합체 (v/v) 150 μl에 흡수시키고, 주사를 위하여 실온 (RT)에서 철저하게 혼합하였다. 일부 경우에서는, 콜라겐-BMP-플루로닉 혼합물을 증량제 (예컨대 히알루론산, 골 미네랄 또는 이들의 조합)와 조합하였다. 다르게는, BMP-골 콜라겐-플루로닉 중합체, 미네랄 및 글리코사미노 글리칸이 방사성 조영제 혼합물과 함께 멸균 환경에서 동결건조될 수 있으며, 작업실에서 사용 전에 물 또는 완충된 용액 중에 현탁될 수 있다.
골 유도 검정:
주사가능 골형성 제제의 골-유도 활성은 피하 부위에의 이식에 의해, 또는 설치류의 복부 근막 또는 골격근 파우치에 경피로 주사하는 것에 의해 평가될 수 있다. 주사 12-21일 후, 이식물을 수확하고, 기술되어 있는 바와 같이 (문헌 [Sampath. T.K. and Reddi, A.H. 1981]) 생화학적 분석 (알칼리성 포스파타제 및 칼슘 함량) 및 조직학에 의해 골 형성 활성에 대하여 검정하였다.
OGF :
OGF, 예컨대 천연 또는 재조합 인간 BMP, 예컨대 BMP-2 또는 BMP-7 (OP-1) 또는 BMP-4 또는 BMP-6, 또는 혼합물은 시중의 공급원으로부터 입수될 수 있다.
콜라겐성 매트릭스:
유형 I 콜라겐은 수많은 시중의 공급원으로부터 입수될 수 있다. 하기하는 실시예는 기술되어 있는 바와 같이 (문헌 [Sampath. T.K. and Reddi, A.H. 1981]) 제조된 소 골 유형 I 콜라겐을 사용한다. 임상 용도에서, 유형 I 콜라겐은 인간을 치료하는 데에 사용될 수 있는 것이어야 한다.
3-6개월령의 소로부터 표준 절차를 사용하여, 소 탈미네랄화 골간 골 매트릭스인 DBM (70-420 ㎛)을 제조하였다. 이후, 상기 소 DBM을 4℃에서 수시간 (16-24시간) 동안 6 M 구아니딘 HCl에 적용한 다음, 물로 세척하고, 산성 환경에서 1시간 동안 가열한 후, 물로 세척하고, 동결건조 전에 에탄올 처리하였다. 탈미네랄화된 불용성의 구아니딘-HCl 추출되고 산 처리된 소 골 유형 I 콜라겐을 사용 전에 3.5 메가 RAD의 감마 방사선에 적용함으로써 멸균한 다음, 자유 라디칼 포집제를 포함하는 멸균수 세척 및 동결건조에 적용하였다.
히알루론산 (HA) 생성물:
매사추세츠 프래밍햄 소재 겐자임(Genzyme) 사 시설에서 스트렙토코쿠스 주에피데미쿠스 (Streptococcus zooepidemicus )의 발효에 의해 세균 유래 HA (평균 분자량 3,000,000)를 정제하였다. 힐란(Hylan) A (평균 분자량 6,000,000)는 뉴저지 리지필드 소재 겐자임 사 시설에서 닭 벼슬로부터 제조하였다.
프레벨 실크(Prevelle Silk) 및 더말 겔 엑스트라(Dermal Gel Extra) (DGE)는 피부 충전재이다. 이들은 뉴저지 리지필드 소재 겐자임 사 시설에서 제조하였다.
힐라스탄(Hylastan)은 골관절염으로 인한 통증의 치료에 사용될 점도-보충제이다. 이것은 뉴저지 리지필드 소재 겐자임 사 시설에서 제조하였다. 레스틸란(Restylane)은 피부 충전재로써, 스웨덴 소재 QMED 사로부터 구매하였다.
시중 히알루론산 ( HA ) 제품들의 특성
Figure pct00001
폴록사머 407 중합체:
폴록사머 407/플루로닉 F-127 공중합체 (에틸렌 옥시드 및 프로필렌 옥시드 블록)는 바스프 사 (뉴저지 마운트 올리브 소재)로부터 구매하였다.
상기 중합체를 20-30% 중량/부피의 최종 중합체 농도로 PBS 중에 용해시켰다. 이와 같은 농도에서, 중합체는 열-가역적 특성, 실온에서의 유체 상태 및 체온에서의 겔 상태를 나타낸다. 20 g의 플루로닉 F-127을 100 mL의 저온 PBS에 첨가함으로써 20% 겔을 제조하고, 적정한 가용화를 위하여 4℃에서 밤새 교반하에 방치하였다. 다음에, 멸균을 위하여, 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 용액을 여과하였다.
조성물의 특징:
상기 조성물은 시린지에서의 그의 사용을 가능케 하는 점도 및 압출력을 갖는다. 예를 들어, 그것은 30 뉴턴 미만의 압출력으로 20 G-1.5"의 바늘 크기를 갖는 5 cc 시린지로부터 전달된다.
실시예
실시예 1. 주사가능 골형성 제제는 전위 골 형성의 래트 모델로부터의 샘플 체외이식편의 알칼리성 포스파타제 활성, 칼슘 함량 및 조직학적 평가에 의해 판단하였을 때, 연골내 골 형성을 유도하였다. 골-유도 활성의 수준은 BMP 단백질의 농도에 따라 달랐다 (도-1).
실시예 2. 본 연구에서는, 20-30% 범위의 폴록사머 407 농도를 조사하였다. 모든 폴록사머-함유 제제가 골 형성을 유도하기는 하였지만, 관찰된 폴록사머 407의 최적 농도는 생체 내에서 겔 형성을 촉진하는 20-25%이다 (도-2a).
실시예 3. 플루론산이 있거나 없이 고분자량 히알루론산 (히알-A 또는 힐라스틴) 용액을 포함하는 콜라겐-BMP 매트릭스의 경피 주사 역시 새로운 골 형성을 유도하였다 (도-2b).
실시예 4. 주사가능 골형성 제제의 임상적 사용은 예정 전달 부위에의 형광투시 안내를 필요로 할 수 있기 때문에, 제제에 대한 방사성-조영제의 첨가가 생체 내에서 골 형성을 방해하지 않는다는 것을 입증하였다. 주사가능 골형성 제제에 임상적으로 적절한 농도의 방사성-조영제 (예컨대 이소뷰(Isovue)-370)를 보충하고, 전위 골 제제의 래트 모델을 시험하였다. 이와 같은 연구의 결과는 방사성-조영제가 이와 같은 골 형성 동물 모델에서 골 유도를 방해하지 않는다는 것을 밝혔다 (도 3).
실시예 5. 산호-유래 히드록시아파타이트가 자가 골 이식편과 함께 골 막음 충전재(bone avoid filler) 및 증량 미네랄 스캐폴드로 사용되었기 때문에, 새로운 골 형성에 대한 프로오스테온(ProOsteon)® 500R (인터포어, 크로스 인터내셔널(Interporc, Cross International) 사)의 효과를 조사하였다. 결과는 산호-히드록시아파타이트가 BBC/플루론산과 함께 생체적합성이며, 척추 유합용 골 이식편 대체제로 사용하기 위한 성형가능한 퍼티를 형성한다는 것을 암시한다 (도 4).
실시예 6. 인퓨즈(InFuse) 사 (미네소타 메드트로닉 소재)는 요추에 대한 신체간 유합의 사용에 대하여 승인되어 있다. 인퓨즈 사는 소 아킬레스건 유래 유형 I 콜라겐의 시트를 사용하여 침지된 BMP-2 12 mg, 및 새로운 골 형성을 자극하고 인접 요추 분절을 유합시키기 위하여 실 모양으로 꿰어 얽은 티타늄 금속 케이지를 사용한다. 피하 이식물에서, 인퓨즈-소 아킬레스 콜라겐을 다양한 용량의 BMP-2를 포함하는 BBC/플루로닉 주사가능 현탁액과 비교하였다. 결과는 조직학적 점수로 입증되는 바와 같이, BBC/플루론산 현탁액이 주어진 부피의 콜라겐 이식물에 대하여 유사한 새로운 골 형성을 도출하는 데에 10-50 배 더 적은 BMP-2를 사용한다는 것을 보여준다 (도 5).
실시예 7 (09-4662):
본 실시예는 하기를 조사한다:
* 래트 전위 모델에서의 콜라겐 캐리어 로트(lot)들의 골-유도 효율
* 콜라겐/BMP 비, 및 골-유도 효율에 대한 스캐폴드 물질의 효과
* 래트 전위 모델에서의 골-유도에 있어서의 캐리어/중합체 비의 변이
연구 설계: 4-5주령 수컷 롱 에반스(Long Evans) 래트의 12개 군 (n=4)의 가슴에 양측 피하 이식물을 이식하였다. 외과적 이식물은 가변 농도의 HA/플루로닉 F-127 (캐리어) 및 가변량의 BBC (스캐폴드) 중에 0-10 ㎍의 BMP-2 (신호)를 함유하였다.
연구 설계의 세부사항은 하기 표 1에 개괄한다.
14일차에 CO2 질식을 통하여 모든 래트를 희생시키고, 분석용 샘플을 수확하였다.
<표 1>
연구 설계
Figure pct00002
*로트 # 18034-124
**로트 #18034-104
각 샘플을 2개의 조각으로 절단하였다. 샘플의 2분의 1을 10% 중성 완충 포르말린에 고정하고, 메틸메타크릴레이트에 매립하여, 대략 5 마이크로미터로 절제한 후, 헤마토크실린 및 에오신 (H&E), 본 코싸(von Kossa) 및 톨루이딘 블루로 염색하였다. 조직병리학적 평가는 표 2에 개괄된 점수화 시스템을 사용한 샘플에서의 새로운 연골 및 골 형성의 정성 및 반-정량적 평가를 포함하였다. 각 샘플에 대하여 새로운 골/연골 형성의 분포 패턴도 점수화하였다 (표 3) (루시 필립스(Lucy Phillips), B.V.Sc, A.C.V.P, 병리학과, 겐자임 코포레이션 사).
<표 2>
새로운 골/연골에 대한 점수화 시스템
Figure pct00003
<표 3>
새로운 골/연골의 분포 패턴
Figure pct00004
샘플의 나머지 2분의 1에서 부착 조직을 제거하였다. 샘플을 2 ml의 빙냉 0.15 M NaCl/3 mM NaHCO3에 위치시킨 다음, 폴리트론(Polytron) 균질화기를 사용하여 균질화하였다. 다음에, 그것을 원심분리하여; 상청액을 따라내고, 란독스 데이토나(Randox Daytona) 화학 분석기에 의해 총 단백질 농도 (TP) 및 알칼리성 포스파타제 활성 (ALP)에 대하여 분석하였다 (미셸 셔얼레스(Michelle Searles), 약리학/독성학과; 겐자임 코포레이션 사).
잔류물을 5 ml의 20 mM 포스페이트 완충제 중에서 2회 세척한 다음, 5 ml의 0.6 N HCl 중에서 4℃로 밤새 추출하였다. 다음에, 그것을 원심분리하여; 상청액을 따라내고, 칼슘 분석으로 전송하였다. 샘플은 겐자임 코포레이션 사 분석 연구개발과 마르틴 하누스(Martin Hanus)가 바리안(Varian) ICP-OES에서 396 nm 방출로 분석하였다.
결과: 조직병리학적 평가
병리학 점수의 산점도(scatter plot) 그래프를 도 5에 나타낸다.
새로운 골/연골의 정도 및 분포 패턴은 25 또는 50 mg의 BBC, 로트 # 18034-124를 함유하는 샘플들에서, 그리고 로트 # 18034-124 (신) 또는 로트 # 10834-104 (구)를 함유하는 샘플들에서 유사하였다.
가변 농도의 HA/플루로닉 F-127 캐리어를 함유하는 샘플들의 경우, 새로운 골 생성의 정도에 있어서는 차이가 없었으나; HA 농도가 증가하면서, 새로운 골이 BBC 스캐폴드를 함유하는 공동화된 중심 주위에 테두리를 형성한다는 주목할만한 경향, 및 출혈이 존재하였다.
알칼리성 포스파타제 활성
* 3 ㎍의 BMP-2를 함유하는 이식물들의 경우, 알칼리성 포스파타제 농도에 있어서 차이가 존재하지 않았음
* BBC 스캐폴드를 25에서 50 mg으로 증가시키는 것은 (동일한 BBC/BMP-2 비를 가짐) 더 높은 알칼리성 포스파타제 농도로 이어지지 않았음
* 5 ㎍의 BMP-2에서, 캐리어 중 HA의 농도를 증가시키는 것 및 플루로닉 F127의 농도를 감소시키는 것은 알칼리성 포스파타제 농도의 차이로 이어지지 않았음
* 10 ㎍의 BMP-2 적재량에서, 더 높은 HA 농도 (6%)를 갖는 샘플은 더 높은 알칼리성 포스파타제 농도를 가졌으나, 검정의 진폭을 넘지는 않았음
칼슘 평가
* 3 ㎍의 BMP-2를 함유하는 이식물들의 경우, BBC의 구 로트 (로트 # 10834-104)에서 신 로트 (로트 # 10834-124)에 비해 더 높은 Ca 함량에 대한 약간의 경향이 존재하였음
* BBC 스캐폴드를 25에서 50 mg으로 증가시키는 것은 (동일한 BBC/BMP-2 비를 가짐) 더 높은 Ca 함량으로 이어지지 않았음
* 5 ㎍의 BMP-2에서, 캐리어 중 HA의 농도를 증가시키는 것 및 플루로닉 F-127의 농도를 감소시키는 것은 어떠한 Ca 농도의 차이로도 이어지지 않았음
* 10 ㎍의 BMP-2 및 1.5% F-127/6% HA 캐리어를 포함하는 샘플은 시험된 다른 제제들에 비해 25% 더 높은 Ca 농도를 가졌음
결론:
* 새로운 골/연골의 정도 및 분포 패턴, 칼슘 및 알칼리성 포스파타제 농도는 25 및 50 mg의 BBC를 함유하는 이식물들에서, 그리고 로트 # 18034-124 및 로트 # 10834-104 BBC 스캐폴드를 함유하는 이식물들에서 유사하였음
* 캐리어 중에 가변 농도의 HA 및 플루로닉 F-127을 함유하는 이식물들의 경우, 새로운 골 생성의 정도에 있어서는 차이가 없었으나; HA 농도가 증가하면서, 새로운 골이 BBC 스캐폴드를 함유하는 공동화된 중심 주위에 테두리를 형성한다는 주목할만한 경향, 및 출혈이 존재하였음
실시예 8 (09-3467):
본 실시예는 하기를 조사한다:
* 연골 입자 크기의 효과
* 골-유도에 대한 캐리어 중 중합체 농도의 효과
* 캐리어/중합체 비의 효과
* 조영제의 효과
연구 설계: 4-5주령 수컷 롱 에반스 래트의 12개 군의 가슴에 양측 피하 주사를 투여하였다.
3개의 군에는 상이한 비의 조영제 (이소뷰-370)/캐리어로서의 플루로닉 F-127을 포함하는 25 mg의 소 골 콜라겐 (BBC, 로트 # 17075-43, 스캐폴드)에 적재된 5 ㎍의 BMP-2 (신호)를 함유하는 외과적 이식물을 이식하였다 (군 1-3). 8개 군에는 PBS 내 플루로닉 F-127 (캐리어) 중 25 mg의 가변 콜라겐 (스캐폴드)에 적재된 5 ㎍의 BMP-2 (신호)를 함유하는 외과적 이식물을 이식하였다. 본 연구에서 사용된 콜라겐은 하기를 포함한다:
* BBC, 로트 # 17075-43, 70-425 um
* BBC, 로트 # 17075-128, 70-250 um
* 가용성 콜라겐 (MP 바이올로직스(Biologics) 사)
* 열성 콜라겐 (인스탄트(Instant) MCH, 에티콘(Ethicon) 사)
2개 군에는 20% 플루로닉 F-127/2.5% HA 또는 더말 겔 엑스트라 (DGE) 캐리어 중 25 mg의 BBC (로트 # 17075-43) 스캐폴드에 적재된 5 ㎍의 BMP-2 (신호)를 함유하는 외과적 이식물을 이식하였다.
14일차에 CO2 질식을 통하여 모든 래트를 희생시키고, 분석용 샘플을 수확하였다.
연구 설계의 세부사항은 하기 표 4에 개괄한다.
<표 4>
연구 설계
Figure pct00005
이식물을 수확하여, 40% 알콜에 고정하고, 메틸메타크릴레이트에 매립한 후, 대략 5 마이크로미터로 절제하고, 헤마토크실린 및 에오신 (H&E), 및 톨루이딘 블루로 염색하였다.
조직병리학적 분석은 쿠버 샘파스(Kuber Sampath) (겐자임 사)에 의해 수행되었는데, 표 5에 개괄된 점수화 시스템을 사용한 이식물에서의 새로운 골 생성의 반-정량적 평가를 포함하였다.
<표 5>
새로운 골에 대한 점수화 시스템
Figure pct00006
결과: 열성 콜라겐 스캐폴드를 포함하는 이식물은 수확 시점에 식별할 수 없었다. 따라서, 샘플을 채취하지 못하였다 (군 8).
데이터는 표 6, 및 도 10 및 11에 나타낸다.
<표 6>
조직학 점수
Figure pct00007
* 1 ㎍의 rhBMP-2 용량의 경우, 25 mg의 더 작은 입자 BBC를 함유하는 이식물이 용량-등가인 대형 입자 BBC 군 대비 더 큰 새로운 골 생성의 경향을 보였음
* 5 ㎍의 rhBMP-2 용량의 경우, 상이한 입자 크기를 가지는 BBC 이식물들이 유사한 새로운 골 생성을 나타내었음
* 가용성 콜라겐은 양 BBC 로트에 비해 매우 저조한 골 생성을 나타내었음
* 22.5% 플루로닉 F-127 캐리어에 대한 20 또는 40% 이소뷰의 첨가는 골유도 효율에 대하여 효과가 없었음
* 80%의 이소뷰가 플루로닉 F-127에 첨가된 경우, 이식물에서의 새로운 골/연골 생성의 경향이 더 낮았음
* HA가 플루로닉 F-127에 첨가된 경우, 또는 유일한 캐리어로서 DGE가 사용된 경우, 이식물에서의 새로운 골/연골 생성의 경향이 더 낮았음
결론:
* BBC 입자 크기는 BMP-2 골유도 효율에 효과가 없었음
* 가용성 콜라겐은 매우 저조한 새로운 골 생성을 나타내었음
* 22.5% 플루로닉 F-127 캐리어에 대한 이소뷰의 첨가는 골유도 효율에 대하여 효과가 없었음
* HA가 플루로닉 F-127에 첨가된 경우, 또는 유일한 캐리어로서 DGE가 사용된 경우, 이식물에서의 새로운 골/연골 생성이 더 낮았음
실시예 9 (09-3468):
본 실시예는 하기를 조사한다:
* 중합체가 있고 없는 BMP 용량 반응
* 재조합 BMP에 의한 골유도
* 캐리어의 가변화
연구 설계: 4-5주령 수컷 롱 에반스 래트의 13개 군 (n=4/군)의 가슴에 양측 피하 이식물을 이식하였다.
외과적 이식물을 이식받은 8개 군은 25 mg의 소 골 콜라겐 (BBC, 로트 # 17075-43, 스캐폴드)에 적재된 10 ㎍의 BMP-2 (신호)를 함유하였으며, 상이한 히알루론산 (HA) 시중 제품들 (캐리어)을 사용하여 제제화되었다.
5개 군에는 플루로닉® F-127를 포함하는 25 mg의 BBC에 적재된 3-10 ㎍의 BMP-2 또는 BMP-4를 함유하는 외과적 이식물을 이식하였다.
14일 또는 28차에 CO2 질식을 통하여 모든 래트를 희생시키고, 분석용 샘플을 수확하였다.
연구 설계의 세부사항은 하기 표 7에 개괄한다.
<표 7>
연구 설계
Figure pct00008
평가:
검시 시점 (14일 또는 28일)에 각 시험 부위로부터 샘플을 수집하였다. 각 샘플을 2개의 조각으로 절단하였다. 샘플의 2분의 1을 10% 중성 완충 포르말린에 고정하고, 메틸메타크릴레이트에 매립하여, 대략 5 마이크로미터로 절제한 후, 헤마토크실린 및 에오신 (H&E), 본 코싸 및 톨루이딘 블루로 염색하였다. 조직병리학적 평가는 샘플에서의 새로운 연골 및 골 형성의 정성 및 반-정량적 평가를 포함하였으며, 표 8에 개괄된 점수화 시스템을 사용하였다. 각 샘플에 대하여 새로운 골/연골 형성의 분포 패턴도 점수화하였다 (표 9) (루시 필립스, B.V.Sc, A.C.V.P, 병리학과, 겐자임 코포레이션 사).
<표 8>
새로운 골/연골에 대한 점수화 시스템
Figure pct00009
<표 9>
새로운 골/연골의 분포 패턴
Figure pct00010
샘플의 나머지 2분의 1에서 부착 조직을 제거하였다. 샘플을 2 ml의 빙냉 0.15 M NaCl 3 mM NaHCO3에 위치시킨 다음, 폴리트론 균질화기를 사용하여 균질화하였다. 다음에, 그것을 원심분리하고; 상청액을 따라내었다.
잔류물을 5 ml의 20 mM 포스페이트 완충제 중에서 2회 세척한 다음, 5 ml의 0.6 N HCl 중에서 4℃로 밤새 추출하였다. 다음에, 그것을 원심분리하여; 상청액을 따라내고, 칼슘 분석으로 전송하였다. 샘플은 바리안(Varian) ICP-OES에서 396 nm 방출로 분석하였다 (마르틴 하누스, 분석 연구개발과; 겐자임 코포레이션 사).
결과:
14일의 검시 시점에, BMP-4를 포함하는 모든 이식물 (군 11 & 12)은 식별할 수 없었으며, 그에 따라 샘플을 채취하지 못하였다.
28일의 검시 시점에는, 22.5%의 플루로닉 F-127을 포함하는 모든 이식물 (군 10)이 식별할 수 없었으며, 그에 따라 샘플을 채취하지 못하였다.
조직병리학적 평가
14 및 28일차의 HA 생성물들에 대한 병리학 점수의 산점도 그래프를 도 12에 나타낸다.
* 사용된 HA 캐리어에 관계없이, 모든 군이 14 또는 28일차의 이식물에서의 새로운 골/연골 형성에 있어서 유사한 중간 점수를 나타내었음 (P>0.05)
* 어떤 군에서도 새로운 골/연골의 일관된 분포 패턴은 존재하지 않았음
칼슘 평가
DGE 및 프레벨 실크를 포함하는 이식물이 힐라스탄 및 레스틸란에 비해 더 높은%의 Ca 농도에 대한 경향을 가졌다.
결론:
* 14일에, BMP-4를 포함하는 이식물은 식별할 수 없었음
* 28일에, 22.5%의 플루로닉 F-127을 포함하는 이식물은 완전히 재흡수되었음
* 14 및 28일에, rhBMP-2, BBC 및 HA 시중 제품들을 포함하는 이식물들은 사용된 HA 캐리어에 관계없이 유사한 새로운 골/연골 형성을 나타내었음
* 28일에, rhBMP-2 및 HA 시중 제품들이 적재된 스캐폴드를 함유하는 이식물들은 사용된 HA 캐리어에 관계없이 유사한 Ca 농도를 나타내었음
실시예 10 (08-3212):
본 실시예는 하기를 조사한다
* 래트 전위 모델에서의 콜라겐 캐리어 로트의 골-유도 효율
* 골-유도에 대한 캐리어에서의 중합체 농도의 효과
* 캐리어/중합체 비의 효과
연구 설계: 본 연구에서는, 수컷 6주령 롱 에반스 래트의 16개 군을 사용하였다. 시험 항목들을 가슴 양측의 피하 주머니에 외과적으로 이식하였다.
* 2개 군에는 글루타메이트 완충제 (캐리어) 내 150 μl의 20% 플루로닉 F-127 중 25 mg의 BBC (로트 # 17075-43, 스캐폴드)에 적재된 1.5 또는 5 ㎍의 BMP-2 (신호)를 함유하는 이식물을 이식하였음 (군 1&2)
* 4개 군에는 PBS (캐리어) 내 150 μl의 20% 플루로닉 F-127 중 25 mg의 BBC (로트 # 17075-43, 스캐폴드)에 적재된 0-5 ㎍의 BMP-2 (신호)를 함유하는 이식물을 이식하였음 (군 3-6)
* 2개 군에는 글루타메이트 완충제 (캐리어) 내 150 μl의 20% 플루로닉 F-127 + 2.5% HA 중 25 mg의 BBC (로트 # 17075-43, 스캐폴드)에 적재된 1.5 또는 5 ㎍의 BMP-2 (신호)를 함유하는 이식물을 이식하였음 (군 7&8)
* 4개 군에는 40 μl의 PBS (양성 대조) 중 25 mg의 BBC (로트 # 17075-43, 스캐폴드)에 적재된 0-5 ㎍의 BMP-2 (신호)를 함유하는 이식물을 이식하였음 (군 9-12)
* 3개 군에는 PBS (캐리어) 내 150 μl의 20% 플루로닉 F-127 중 25 mg의 BBC (로트 # 11848-79, 스캐폴드)에 적재된 0-5 ㎍의 BMP-2 (신호)를 함유하는 이식물을 이식하였음 (군 13-15)
* 1개 군에는 글루타메이트 완충제 (캐리어) 내 150 μl의 2.5% HA 중 25 mg의 BBC (로트 # 17075-43, 스캐폴드)에 적재된 1.5 ㎍의 BMP-2 (신호)를 함유하는 이식물을 이식하였음 (군 16)
이식 후-14일차에 CO2 질식을 통하여 래트를 희생시키고, 이식물을 수확하였다.
연구 설계의 세부사항은 하기 표 10에 개괄한다.
<표 10>
연구 설계
Figure pct00011
* BBC, 로트 # 17075-43
**BBC, 로트 # 11848-79
평가:
이식물을 수확하여, 40% 알콜에 고정하고, 메틸메타크릴레이트에 매립한 후, 대략 5 마이크로미터로 절제하고, 헤마토크실린 및 에오신 (H&E), 및 톨루이딘 블루로 염색하였다.
조직병리학적 분석은 쿠버 샘파스 (겐자임 사)에 의해 수행되었는데, 표 11에 개괄된 점수화 시스템을 사용한 이식물에서의 새로운 골 생성의 반-정량적 평가를 포함하였다.
<표 11>
새로운 골 생성에 대한 점수화 시스템
Figure pct00012
결과:
데이터는 표 12, 및 도 14, 15 및 16에 나타낸다.
<표 12>
조직학 점수 표
Figure pct00013
* BBC, 로트 # 17075-43
**BBC, 로트 # 11848-79
5 ㎍ rhBMP-2 용량의 경우, 양 BBC 배치를 포함하는 이식물들이 유사한 골유도 효율을 나타내었다. 1.5 ㎍의 rhBMP-2 용량의 경우에는, 새로운 BBC 배치 (로트 # 17075-43)가 더 큰 골유도 효율을 나타내었다.
모든 rhBMP-2 용량에 있어서, 2종의 완충제는 유사한 골유도 효율을 나타내었다. 2.5% HA 및 20% 플루로닉 F-127/2.5% HA를 포함하는 이식물은 가변적인 조직학 점수를 가졌는데, 20% 플루로닉 F-127 군에서보다 더 작았다.
결론:
* 시험된 2종의 BBC 배치는 5 ㎍ BMP-2 용량에서 유사한 골유도 효율을 가졌음
* 20% 플루로닉 F-127/2.5% HA 및 2.5% HA는 20% 플루로닉 F-127에 비해 더 낮은 골-유도 효율을 가졌음
* 2종의 완충제인 글루타메이트 완충제와 PBS는 유사한 골유도 효율을 나타내었음
실시예 11 (09-2764):
연구 목적:
* 상이한 농도의 OGF 캐리어들을 평가하기 위함
연구 설계:
4-5주령 수컷 롱 에반스 래트의 12개 군의 가슴에 양측 피하 이식물을 이식하였다. 외과적 이식물 부피는 250 μl로 일정하게 유지하였으며, BMP-2를 5 ㎍의 용량으로 사용하였다 (신호). 캐리어는 BBC의 존재 또는 부재하에 시험하였다. 이식 후-14일차에 CO2 질식을 통하여 래트를 희생시키고, 이식물을 수확하였다.
연구 설계의 세부사항은 하기 표 13에 개괄한다.
<표 13>
연구 설계
Figure pct00014
평가:
이식물을 수확하여, 40% 알콜에 고정하고, 메틸메타크릴레이트에 매립한 후, 대략 5 마이크로미터로 절제하고, 헤마토크실린 및 에오신 (H&E), 및 톨루이딘 블루로 염색하였다.
조직병리학적 분석은 쿠버 샘파스 (겐자임 사)에 의해 수행되었는데, 표 14에 개괄된 점수화 시스템을 사용한 이식물에서의 새로운 골 생성의 반-정량적 평가를 포함하였다.
<표 14>
새로운 골 생성에 대한 점수화 시스템
Figure pct00015
결과:
BBC를 함유하지 않는 샘플 (군 2, 4, 7, 9 및 11), 및 캐리어를 함유하지 않는 샘플 (군 1)은 조직 수확시 실별할 수 없었으며, 그에 따라 이들 군에서는 샘플을 수집하지 못하였다.
병리학 점수는 표 15 및 도 17에 나타낸다.
<표 15>
조직학 점수 표
Figure pct00016
결론:
* BBC의 존재는 골 형성을 유도하는 rhBMP-2 적재 이식물의 능력에 필수적이었음
* 캐리어로서 20% 플루로닉을 함유하는 제제만이 일관된 방식으로 우수한 골 형성을 유도하였음
실시예 12 (08-2973):
연구 목적:
* 하기 2종의 래트 전위 모델을 비교하기 위함: 피하 (SQ) 대 근육내 (IM) 이식
* 상이한 농도의 OGF 캐리어들을 평가하기 위함
연구 설계:
4-5주령 수컷 롱 에반스 래트의 12개 군 (n=3/군)에 양측 이식물을 이식하였다. 이들 중 6개 군에는 가슴에 양측 피하 이식물을 이식하였으며 (군 1-6), 6개 군에는 등에 근육내 이식물을 이식하였다 (군 7-12). 2개의 외과적 이식물 (대조)은 25 mg의 BBC (스캐폴드)을 포함하는 125 μl의 글루타메이트 완충제 중에 5 ㎍의 BMP-2 (신호)를 함유하였다. 10개의 외과적 이식물 (대조)은 25 mg의 BBC (스캐폴드)을 포함하는 150 μl의 가변 캐리어 중에 5 ㎍의 BMP-2 (신호)를 함유하였다. 이식 후-14일차에 CO2 질식을 통하여 래트를 희생시키고, 이식물을 수확하였다.
연구 설계의 세부사항은 하기 표 16에 개괄한다.
<표 16>
연구 설계
Figure pct00017
평가:
이식물을 수확하여, 40% 알콜에 고정하고, 메틸메타크릴레이트에 매립한 후, 대략 5 마이크로미터로 절제하고, 헤마토크실린 및 에오신 (H&E), 및 톨루이딘 블루로 염색하였다.
조직병리학적 분석은 쿠버 샘파스 (겐자임 사)에 의해 수행되었는데, 표 17에 개괄된 점수화 시스템을 사용한 이식물에서의 새로운 골 생성의 반-정량적 평가를 포함하였다.
<표 17>
새로운 골 생성에 대한 점수화 시스템
Figure pct00018
결과:
데이터는 표 18 및 도 18에 나타낸다.
<표 18>
조직학 점수 표
Figure pct00019
* 2종 모델 사이의 새로운 골 생성에 있어서의 점수 차이는 없었음
* 상이한 플루로닉 F-127 농도를 갖는 제제들은 유사한 조직학 점수를 나타내었으며, 대조와 유사하였음
* 2.5% HA 및 힐란 A를 포함하는 이식물은 대조에 비해 더 낮은 조직학 점수를 가졌음
결론:
* 피하 및 근육내 이식 부위에 이식되는 제제들은 모든 캐리어에 있어서 유사한 골유도 점수를 나타내었음
* 모든 플루로닉 캐리어들은 양성 대조와 유사한 수준의 골 형성을 유도하였으며, 2종의 HA 캐리어는 양성 대조에 비해 더 적은 골 형성을 유도하였음
실시예 13 (09-4064):
연구 목적:
* 조영제의 효과
* 중합체 농도를 평가하기 위함
* 캐리어 OGF 비를 평가하기 위함
* 다양한 캐리어들을 평가하기 위함
연구 설계:
4-5주령 수컷 롱 에반스 래트의 10개 군 (n=4/군)의 가슴에 양측 피하 이식물을 이식하였다. 외과적 이식물은 150 μl의 부피를 가졌으며, 0 또는 10 ㎍의 BMP-2 (신호), 25 mg의 소 골 콜라겐 (BBC, 로트 # 17075-183, 스캐폴드) 및 가변 유형의 캐리어를 함유하였다.
연구 설계의 세부사항은 하기 표 19에 개괄한다. 14일차에 CO2 질식을 통하여 모든 래트를 희생시키고, 분석용 샘플을 수확하였다.
<표 19>
연구 설계
Figure pct00020
평가:
검시 시점에 각 시험 부위로부터 샘플을 수집하였다.
각 샘플을 2개의 조각으로 절단하였다. 샘플의 2분의 1을 10% 포르말린에 고정하고, 파라핀에 매립하여, 대략 5 마이크로미터로 절제한 후, 헤마토크실린 및 에오신 (H&E)으로 염색하였다.
조직병리학적 평가는 샘플에서의 새로운 연골 및 골 형성의 정성 및 반-정량적 평가를 포함하였으며, 표 20에 개괄된 점수화 시스템을 사용하였다. 각 샘플에 대하여 새로운 골/연골 형성의 분포 패턴도 점수화하였다 (표 21) (루시 필립스, B.V.Sc, A.C.V.P, 병리학과, 겐자임 코포레이션 사).
<표 20>
새로운 골/연골 생성에 대한 점수화 시스템
Figure pct00021
<표 21>
새로운 골/연골 생성의 분포 패턴
Figure pct00022
샘플의 나머지 2분의 1에서 부착 조직을 제거하였다. 샘플을 2 ml의 빙냉 0.15 M NaCl/3 mM NaHCO3에 위치시킨 다음, 폴리트론 균질화기를 사용하여 균질화하였다. 다음에, 그것을 원심분리하고; 상청액을 따라내었다.
잔류물을 5 ml의 20 mM 포스페이트 완충제 중에서 2회 세척한 다음, 5 ml의 0.6 N HCl 중에서 4℃로 밤새 추출하였다. 다음에, 그것을 원심분리하여; 상청액을 따라내고, 칼슘 분석으로 전송하였다. 샘플은 바리안 ICP-OES에서 396 nm 방출로 분석하였다 (마르틴 하누스, 분석 연구개발과; 겐자임 코포레이션 사).
결과:
조직병리학적 평가
병리학 점수의 산점도 그래프를 도 19에 나타낸다.
* 플루로닉 F-127 농도를 30%로 증가시키는 것은 중간인 새로운 골/연골 점수에 대하여 효과가 없었음 (P>0.05)
* 22.5% 플루로닉 F-127 캐리어에 대한 20% 또는 80% 이소뷰-370의 첨가는 중간인 새로운 골/연골 점수에 대하여 효과가 없었음 (P>0.05)
* 플루로닉 F-127에 2.5% 또는 5%의 HA를 첨가하는 것은 중간인 새로운 골/연골 점수를 낮추는 경향이 있었지만, 이것이 통계적으로 유의성이 있지는 않았음 (P>0.05)
* DGE 단독, 또는 플루로닉 F-127에 첨가된 것은 중간인 새로운 골/연골 점수를 낮추는 경향이 있었지만, 이것이 통계적으로 유의성이 있지는 않았음 (P>0.05)
* 프레벨 실크는 중간인 새로운 골/연골 점수를 낮추는 경향이 있었지만, 이것이 통계적으로 유의성이 있지는 않았음 (P>0.05)
* 플루로닉 F-127, 플루로닉 F-127 + 이소뷰 370 또는 플루로닉 F-127 + HA를 함유하는 군은 이식물 전체에 걸쳐 "조밀한" 골 분포를 가지거나, 또는 조밀한 영역 (패턴 C), 및 증식하는 중간엽 세포의 중심 초점 주위의 테두리 형성 영역 (패턴 B) 모두가 존재하는 혼합 패턴을 가지는 것 중 어느 하나인 경향이 있었음
* DGE 또는 프레벨 실크를 함유하는 군은 BBC 스캐폴드 및 DGE/프레벨 실크 물질을 함유하는 중심 공동화 영역 주위에 새로운 골의 테두리를 형성하는 경향이 있었음 (패턴 D & E)
칼슘 평가
* 캐리어에서의 증가된 HA/F-127 농도는 Ca 농도의 어떠한 차이로도 이어지지 않았음
* 22.5% 플루로닉 F-127에 대한 20% 또는 80% 이소뷰의 첨가는 Ca 농도에 대하여 효과가 없었음
* 플루로닉 F-127을 포함하는 이식물 (군 2-7 및 10)은 플루로닉 F-127이 없는 이식물 (군 8 & 9)에 비해 더 높은 칼슘 농도를 가졌음
결론:
* 플루로닉 F-127 함유 이식물은 주로 새로운 골/연골의 조밀한 분포 패턴을 갖는 경향이 있는 반면, DGE 및 프레벨 실크 이식물은 종종 스캐폴드 및 캐리어를 함유하는 중심 공동화 영역 주위에 형성되는 새로운 골의 테두리를 가졌음
* HA 또는 DGE가 플루로닉 F-127에 첨가되는 경우, 또는 DGE 또는 프레벨 실크가 유일한 캐리어로 사용되는 경우, 이식물에서의 새로운 골/연골 생성은 더 낮아지는 경향이 있었음
* 22.5% 플루로닉 F-127 캐리어에 대한 20% 또는 80% 이소뷰의 첨가는 골유도 효율에 대하여 효과가 없었음
* 플루로닉 F-127을 포함하는 이식물 (군 2-7 및 10)은 플루로닉 F-127이 없는 이식물 (군 8 & 9)에 비해 더 높은 칼슘 농도를 가졌음
실시예 14 (09-4063):
연구 목적:
1. 다양한 콜라겐들을 평가하기 위함
2. 조영제의 효과
3. 연골 입자 크기를 평가하기 위함
4. 연골 물질의 효과를 평가하기 위함
5. 래트 전위 모델에서 더말 겔 엑스트라 (DGE)를 포함하는 OGF를 평가하기 위함
6. 다양한 캐리어들을 평가하기 위함
연구 설계:
4-5주령 수컷 롱 에반스 래트의 12개 군 (n=4/군)의 가슴에 양측 피하 이식물을 이식하였다.
* 10개 군에는 0-10 ㎍의 BMP-2 (신호), PBS (캐리어) 중 150 μl의 22.5% 플루로닉® F-127, 및 가변 양 및 유형의 골 콜라겐 (스캐폴드)을 포함하는 이식물을 이식하였음
* 1개 군에는 3 ㎍의 BMP-2 (신호), 150 μl의 22.5% 플루로닉/80% 이소뷰 370 (캐리어), 및 25 mg의 BBC (스캐폴드)를 포함하는 이식물을 이식하였음
* 1개 군에는 150 μl의 DGE (캐리어) 중에 50 ㎍의 BMP-2 (신호)를 포함하는 이식물을 이식하였음
연구 설계의 세부사항은 하기 표 22에 개괄한다.
14일차에 CO2 질식을 통하여 모든 래트를 희생시키고, 분석용 샘플을 수확하였다.
<표 22>
연구 설계
Figure pct00023
평가:
각 샘플을 2개의 조각으로 절단하였다. 샘플의 2분의 1을 40% 알콜에 고정하고, 메틸메타크릴레이트에 매립하여, 대략 5 마이크로미터로 절제한 후, 헤마토크실린 및 에오신 (H&E)으로 염색하였다.
조직병리학적 평가는 샘플에서의 새로운 연골 및 골 형성의 정성 및 반-정량적 평가를 포함하였으며, 표 23에 개괄된 점수화 시스템을 사용하였다. 각 샘플에 대하여 새로운 골/연골 형성의 분포 패턴도 점수화하였다 (표 24) (루시 필립스, B.V.Sc, A.C.V.P, 병리학과, 겐자임 코포레이션 사).
<표 23>
새로운 골/연골 생성에 대한 점수화 시스템
Figure pct00024
<표 24>
새로운 골/연골 생성의 분포 패턴
Figure pct00025
샘플의 나머지 2분의 1에서 부착 조직을 제거하였다. 샘플을 2 ml의 빙냉 0.15 M NaCl/3 mM NaHCO3에 위치시킨 다음, 폴리트론 균질화기를 사용하여 균질화하였다. 다음에, 그것을 원심분리하고; 상청액을 따라내었다.
잔류물을 5 ml의 20 mM 포스페이트 완충제 중에서 2회 세척한 다음, 5 ml의 0.6 N HCl 중에서 4℃로 밤새 추출하였다. 다음에, 그것을 원심분리하여; 상청액을 따라내고, 칼슘 분석으로 전송하였다. 샘플은 바리안 ICP-OES에서 396 nm 방출로 분석하였다 (마르틴 하누스, 분석 연구개발과; 겐자임 코포레이션 사).
결과:
조직병리학적 평가
병리학 점수의 산점도 그래프를 도 21에 나타낸다.
평가된 처리 군들 중 어느 것 사이에도 중간 골 생성 점수에 있어서 유의성 있는 차이는 없었으나; 하기의 경향은 주목할만 하였다:
* 10 ㎍ rhBMP-2 용량의 경우, 25 mg의 더 작은 입자 BBC (군 8)를 함유하는 이식물이 용량-등가의 대형 입자 BBC 군 (군 3, P>0.05) 및 10 mg의 소형 입자 BBC 군 (군 6, P>0.05)에 비해 더 큰 새로운 골 생성의 경향을 나타내었음
* 25 mg BBC + 3 ㎍ rhBMP-2 + 22.5% 플루로닉 F-127을 함유하는 이식물의 경우, 이소뷰 조영제의 첨가는 새로운 골의 생성에 유의성 있는 영향을 주지 못하였음 (P>0.05, 군 4 대 군 2)
* 토끼 골 콜라겐 이식물은 새로운 골 생성의 평가를 위한 덜 강력한 모델인데, 3 및 10 ㎍ 군 (군 10 및 11)이 0 ㎍ 대조 (군 9)에 비해 통계적 유의성을 달성하지 못하였기 때문임
* 토끼 골 콜라겐 단편은 종종 70<420 mm 소 골 단편에 비해 더 큰 것으로 알려져 있는데, 이것이 이식물 당 새로운 골 생성의 양에 영향을 준 것일 수 있음
* 25 mg의 BBC를 함유하는 이식물은 10 mg의 BBC를 함유하는 이식물과 유사한 중간 골 생성 점수를 가졌음 (군 7&8 대 5&6)
* 본 연구에서는 스캐폴드가 없는 DGE 이식물이 최고 용량의 rhBMP-2를 함유하였지만, 새로운 골 생성 점수는 가변적이었음. 또한, 이와 같은 군에서의 새로운 골의 분포 패턴 역시 다른 군에 비해 더 가변적이었음
칼슘 평가
본 연구에서 사용된 2종의 BMP-2 용량에서, BBC 이식물 (군 2 및 3) 및 RBC 이식물 (군 10 및 11)은 유사한 Ca 농도를 나타내었다. 그러나, RBC에 비해 BBC를 함유하는 이식물에서 더 높은 Ca 농도의 경향이 존재하였다.
평가된 처리 군들 중 어느 것 사이에도 Ca 농도의 차이는 존재하지 않았다.
결론:
* 본 연구에서 사용된 2종의 BMP-2 용량에서, BBC 및 RBC 이식물은 유사한 중간 골 생성 점수 및 Ca 농도를 나타내었음. BBC 및 RBC-함유 군에서, 새로운 골 분포는 초점형 내지 다초점형 조밀 패턴인 경향이 있었음
* 캐리어인 22.5% 플루로닉 중 80%의 조영제는 새로운 골 생성 또는 Ca 농도에 영향을 주지 않았음
* 스캐폴드 물질을 변경하는 것은 새로운 골 생성 또는 Ca 농도에 영향을 주지 않았음
* 더 작은 입자의 BBC를 함유하는 이식물이 용량-등가의 대형 입자 BBC 군에 비해 더 큰 새로운 골 생성 경향을 나타내었음
* DGE 군 (스캐폴드를 함유하지 않았음)의 새로운 골 생성 점수는 낮고 가변적이었음
실시예 15 (09-3469):
연구 목적:
* 하기 2종 골 성장 인자의 골형성 효율을 비교하기 위함: rhBMP-2 및 rhBMP-4
* 다양한 캐리어들을 평가하기 위함
* 래트 전위 모델에서의 rhBMP-2의 골형성 효율에 대한 외과적 방법 (이식 대 주사)의 효과를 평가하기 위함
연구 설계:
4-5주령 수컷 롱 에반스 래트의 12개 군의 가슴에 양측 피하 이식물을 이식하였다. 외과적 이식물은 PBS 내 150 μl의 22.5% 플루로닉 F-127 중 0-3 ㎍의 BMP-2 (신호), PBS 또는 DGE (캐리어) 중 2.5% HA/22.5% 플루로닉 F-127, 및 25 mg의 소 골 콜라겐 (BBC, 로트 # 17075-114, 스캐폴드)을 함유하였다.
4-5주령 수컷 롱 에반스 래트의 3개 군의 가슴에 양측 피하 이식물을 이식하였다. 외과적 이식물은 PBS 내 150 μl의 22.5% 플루로닉 F-127 중 0.3-3 ㎍의 BMP-4 (신호) 및 25 mg의 BBC (스캐폴드)을 함유하였다.
4-5주령 수컷 롱 에반스 래트의 2개 군에 14G 또는 20G 바늘을 사용하여 피하로 주사하였다. 외과적 이식물은 PBS 내 150 μl의 22.5% 플루로닉 F-127 중 3 ㎍의 BMP-2 (신호) 및 25 mg의 BBC (스캐폴드)을 함유하였다.
14일차에 CO2 질식을 통하여 모든 래트를 희생시키고, 분석용 샘플을 수확하였다.
연구 설계의 세부사항은 하기 표 25에 개괄한다.
<표 25>
연구 설계
Figure pct00026
평가:
검시 시점에 각 시험 부위로부터 샘플을 수집하였다.
이식물을 10% 중성 완충 포르말린에 고정하였다. 조직의 석회질을 제거하고, 일상적으로 처리한 후, 파라핀에 매립하여, 5 마이크로미터로 절제하고, 광학 현미경 평가를 위하여 헤마토크실린 및 에오신 (H&E), 및 톨루이딘 블루로 염색하였다.
조직병리학적 평가는 샘플에서의 새로운 연골 및 골 형성의 정성 및 반-정량적 평가를 포함하였으며, 표 26에 개괄된 점수화 시스템을 사용하였다. 각 샘플에 대하여 새로운 골/연골 형성의 분포 패턴도 점수화하였다 (표 27) (루시 필립스, B.V.Sc, A.C.V.P, 병리학과, 겐자임 코포레이션 사).
<표 26>
새로운 골/연골에 대한 점수화 시스템
Figure pct00027
<표 27>
새로운 골/연골의 분포 패턴
Figure pct00028
결과:
조직병리학적 평가
병리학 점수의 산점도 그래프를 도 24에 나타낸다.
* 0-3 ㎍의 rhBMP-2가 적재된 외과적 이식물 내에는 새로운 골 및 연골 생성의 용량-반응성 증가가 존재하였음
* rhBMP-4 적재 스캐폴드 내에서는, 용량에 관계없이 최소한의 골 생성이 존재하였음
* 골/연골 생성의 중간 점수는 플루로닉 또는 HA/플루로닉을 사용하여 전달된 3 ㎍의 rhBMP-2를 함유하는 외과적 이식물에서 가장 높았음
* DGE를 포함하는 이식물은 약간 더 낮은 중간 점수를 가졌으며, 종종 DGE 및 BBC 스캐폴드를 함유하는 공동화된 중심 주위에 골 생성 테두리를 초래하였음
* 골/연골 생성의 중간 점수는 피하 주사에 비해 외과적 이식에 의해 전달된 rhBMP-2에서 약간 더 높은 경향이 있었음
* 또한, 외과적 이식은 주로 새로운 골의 확산 분포를 제공한 반면, 피하 주사는 다양한 분포 패턴으로 이어졌음 (확산, 또는 공동화되거나 세포성인 중심 주위에서의 새로운 골의 테두리 형성)
결론:
* 플루로닉 F-127을 포함하는 BBC에 적재된 0-3 ㎍의 rhBMP-2를 포함하는 이식물에서는, 조직학 점수의 용량 반응성 증가가 존재하였음
* rhBMP-4 적재 스캐폴드 내에서는, 용량에 관계없이 최소한의 골 생성이 존재하였음
* 3 ㎍의 rhBMP-2 및 플루로닉 F-127 또는 HA/플루로닉 F-127을 포함하는 스캐폴드는 DGE를 포함하는 것들에 비해 더 많은 골/연골 생성의 비-통계적인 경향을 나타내었음
* 플루로닉 F-127 또는 HA/플루로닉 F-127을 포함하는 이식물은 이식물 전체에 걸쳐 골의 확산 분포를 나타낸 반면, DGE 는 공동화된 중심 주위에 새로운 골의 테두리를 나타내었음
* 피하 주사보다는 외과적 이식에서 약간 더 많은 골/연골 생성의 비-통계적인 경향이 존재하였음. 또한, 피하 주사는 다양한 분포 패턴으로 이어졌음
본 발명의 수많은 실시양태들을 기술하였다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 기술사상 및 영역에서 벗어나지 않고도 다양한 변형들이 이루어질 수 있다는 것을 알고 있을 것이다.

Claims (24)

  1. 수성 비히클 중에 골형성 성장 인자 (OSF), 역 열-감수성 생분해성 폴록사머 및 유형 I 콜라겐을 포함하는 주사가능 조성물.
  2. 제1항에 있어서, OSF가 골 형태발생 단백질 (BMP)인 조성물.
  3. 제2항에 있어서, BMP가 BMP-2 또는 BMP-4 또는 BMP-6 또는 BMP-7 (OP-1)의 동종이량체, 또는 BMP-2/7 이종이량체, 또는 선택된 BMP들의 조합인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, BMP가 콜라겐-폴록사머 스캐폴드 g 당 3.5 mg 미만의 농도로 존재하는 것인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 미네랄을 추가로 포함하는 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 미네랄이 트리칼슘 포스페이트, 또는 합성 또는 천연 히드록실아파타이트인 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 히알루론계 화합물을 추가로 포함하는 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 히알루론계 화합물이 >500 Da의 분자량을 갖는 것인 조성물.
  9. 제1항 또는 제7항에 있어서, 히알루론계 화합물이 가교된 히알루론산인 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 실온에서의 조성물 점도가 시린지로부터의 주사에 적합한 것인 조성물.
  11. 제10항에 있어서, ≤30 뉴턴의 시린지 압출력을 나타내는 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 50 내지 80 중량%의 액체를 포함하는 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 콜라겐의 평균 입자 크기가 70 내지 425 ㎛인 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 가단성 퍼티인 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 수성 비히클이 OSF, 유형 I 콜라겐 및 중합체가 용해 및/또는 현탁되어 있는 완충된 용액인 조성물.
  16. 제1항에 있어서, 방사성-조영제를 추가로 포함하는 조성물.
  17. 제1항에 있어서, 동결건조된 혼합물인 조성물.
  18. 제1항에 있어서, 글리코사미노글리칸을 포함하는 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 글리코사미노글리칸이 콘드로이틴 술페이트 또는 키토산인 화합물.
  20. 골 성장이 요구되는 부위에 제1항의 조성물을 주사하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 환자의 치료 방법.
  21. 제20항에 있어서, 부위가 척추 유합을 받은 적이 있는 환자의 부위인 방법.
  22. 제20항에 있어서, 부위가 골절 부위인 방법.
  23. 제1항의 조성물을 포함하는, 척추 유합 또는 골절 부위를 치료하기 위한 의약의 제조 방법.
  24. 제1항의 조성물을 포함하는, 골 성장에 영향을 주기 위한 의약.
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