JP2005505311A - 多孔性β−リン酸三カルシウム顆粒および同一のものを生成する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
【0001】
(発明の背景)
ヒト体内の骨組織は、身体結合組織質量の最も大部分を構成する。しかし、他の結合組織とは異なり、そのマトリクスは、組織化コラーゲン構造中に分散されたヒドロキシアパタイトと呼ばれる基本的な炭酸塩含有リン酸カルシウムの、生理学的に石灰化された小さな結晶子(クリスタライト)からなる。この組織の修復は、足場の形成、ならびに欠損の石灰化、続く本来の構造に達するための欠損部位の最終的な再構築に向かって方向付けられた、多数の細胞内機能にかかわる複雑なプロセスである。
【0002】
生体材料に基づくリン酸カルシウムの移植は、一般的に適合性があり、そして、骨修復を助長することが見出されている。骨修復は、リン酸カルシウムに関連する多くの物理化学的可変物(例えば、リン酸に対するカルシウムのモル比に)により影響される。ヒドロキシアパタイトおよびリン酸三カルシウムは、骨移植において広範に使用される。ヒドロキシアパタイトは、化学式Ca10(PO4)6(OH)2を有し、そして、リン酸に対するカルシウムの比率は、約1.67である。リン酸三カルシウム(TCP)は、式Ca3(PO4)2を有し、そして、リン酸に対するカルシウムの比率は、約1.5である。リン酸三カルシウムは、非反応性および再吸収可能という生物学的特性を有する。このリン酸三カルシウムは、骨内殖のための足場として機能し、そして、骨による進行性の分解および置換を起こす(Langeら、Annals of Clinical and Laboratory Science,16,467頁〜472頁(1986))。TCPは、ヒドロキシアパタイトよりも10〜20倍速く分解される。TCP移植は、一般的に、骨形成の最終段階の間に、ヒドロキシアパタイトよりも優れた再構築を生じる。TCPは破骨細胞により再吸収される一方、ヒドロキシアパタイトの非常に遅い再吸収は、異物巨細胞により主に引き起こされるということは、注目すべきことである。巨細胞は、この巨細胞が再吸収するヒドロキシアパタイトの量に関して、限界を有する。
【0003】
多孔性セラミック材料は、骨移植のためのマトリクスとして、しばしば選択される。このような材料が移植部位に包埋される場合、この多孔性材料は、孔を浸潤する骨溶解性細胞によって再吸収される。同時に、骨組織は、骨芽細胞によって再生される。特定の孔の大きさは、移植材料の孔に浸潤するために、骨芽細胞にとって必要とされる。パラメーター(例えば、移植される材料の結晶化度、溶解度、粒子の大きさ、多孔性、孔構造および孔の大きさ)は、骨適合性および骨統合に非常に影響し得る。上記のパラメーターの不適切な組合せは、不適切な骨修復を引き起こし得る。
【0004】
骨置換のための移植可能な固体材料としての、通気孔を有する多孔性セラミックの使用は、記載されている(例えば、米国特許第5,171,720号を参照のこと;Frayssinetら、Biomaterials、14 423頁〜429頁(1993)もまた参照のこと)。しかし、このような多孔性セラミックは、脆性であり、そして、手術中に開業医によって容易に成形され得ない。
【0005】
セラミック材料の過度に大きい孔の大きさおよび高い多孔性は、過剰な再吸収速度を引き起こし得、従って、マトリクスが、新しく合成された骨に足場を提供することを防ぐ。再吸収速度が骨増殖速度よりも速い場合、このことは、しばしば、炎症応答を引き起こし得る。セラミック材料の小さい孔の大きさおよび低い多孔性は、低い再吸収速度を引き起こし、これは、新しい骨中でのマトリクス粒子のカプセル化を生じる。
【0006】
従って、欠損部位に適用され得、そして、再生プロセスを非常に増強し得る生体材料を同定することが、特に、他の生物活性剤(例えば、骨形成タンパク質および他の関連因子)とともに使用される場合、所望される。さらに、生物活性剤に対して機械的に耐久性のあるキャリアとして作用し、そして、治療を支持する、非常に耐性な骨置換材料であるマトリクスを同定し、そして使用することが所望される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【0007】
(発明の要旨)
本発明は、生体の骨組織の再生を改善するための組成物、細孔サイズ、多孔度および顆粒サイズを有する、多孔性のセラミック材料を同定すること、ならびにヒトまたは動物における骨欠損を修復することによって、これらの問題を解決する。本発明は、骨インプラント適用における使用のための多孔性のβ−リン酸三カルシウム(β−TCP)材料を提供する。本発明は、多孔性形態のβ−TCP顆粒を提供し、このβ−TCP顆粒は、生体適合性であり、かつその構造形態の全体にわたって新しい骨の発生を支援する。
【0008】
本発明はまた、骨伝導性を改善するために、形態形成タンパク質刺激因子(MPSF)の存在または非存在において生物活性剤(例えば、抗生物質、骨形成タンパク質(BMP)またはBMPをコードする配列を含む核酸分子)を有する多孔性のβ−TCPを含む組成物を提供する。好ましい実施形態において、この生物活性剤は、生分解性剤にカプセル化されている。好ましくは、生分解因子の粒径は、20〜500μmである。この多孔性のβ−TCP材料または多孔性β−TCP/生物活性剤混合物はまた、インプラント部位において成形する準備のための鋳造可能なパテ組成物を形成するためのバインダーと合わせて使用され得る。本発明はまた、多孔性のβ−TCP、および少なくとも1つ以上のさらなる構成要素(生物活性剤およびバインダーを含む)を含むキットを提供する。
【0009】
別の局面において、本発明はまた、多孔性のβ−TCP材料を含み、そして必要に応じて1つ以上のさらなる構成要素(BMPのような生物活性剤、抗生物質、またはバインダーを含む)を含むインプラント可能なデバイスを提供する。本発明はまた、多孔性のβ−TCP材料を含み、そして必要に応じて1つ以上のさらなる組成物(BMPのような生物活性剤、抗生物質、またはバインダーを含む)を含むインプラント可能なプロテーゼデバイスを提供する。多孔性のβ−TCPおよびBMPを含むプロテーゼデバイスまたはインプラント可能なデバイスは、必要に応じてMPSFを含み得る。
【0010】
本発明の他の目的は、多孔性β−TCP材料を生成する方法を提供することである。この方法は、TCP粉末を細孔形成剤と混合する工程、脆い塊を形成するための顆粒化溶液を加える工程、顆粒を形成するためにシーブを通して脆い塊を透過させる工程および、多孔性のβ−TCPを形成するために顆粒を燒結する工程を包含する。
【0011】
本発明はまた、哺乳動物において骨形成を誘導する方法を提供し、この方法は、哺乳動物の欠損部位に、多孔性のβ−TCPならびに必要に応じてバインダーおよび/または生物活性剤を含む組成物を移植する工程を包含する。本発明は、骨形成を必要とする部位に生物活性剤を送達する方法を記載し、この方法は、哺乳動物の欠損部位に、多孔性のβ−TCPおよび生物活性剤を含む組成物を移植する工程を包含し、ここで、生物活性剤は、必要に応じて生分解性剤にカプセル化される。本発明はまた、軟骨形成を必要とする部位に生物活性剤を送達する方法を記載し、この方法は、哺乳動物の欠損部位に、生物活性剤および生分解性剤を含む組成物を移植する工程を包含し、ここで、生物活性剤は、生分解性剤にカプセル化される。
【0012】
(発明の詳細な説明)
本明細書中に記載される発明が完全に理解されるために、以下の詳細な説明を示す。
【0013】
「アミノ酸配列相同性」は、アミノ酸配列の同一性および類似性の両方を含むことが理解される。相同な配列は、同一および/または類似のアミノ酸残基を共有し、ここで類似残基は、整列した参照配列中の対応するアミノ酸残基に対して保存的置換であるか、または整列した参照配列中の対応するアミノ酸残基の「許容された点変異」である。従って、参照配列と70%のアミノ酸相同性を共有する候補ポリペプチド配列は、任意の70%の整列した残基が、参照配列中の対応する残基と同一であるか、または参照配列中の対応する残基の保存的置換であるペプチド配列である。特に好ましい形態形成のペプチドは、C末端の102から106アミノ酸(これは、ヒトOP−1、BMP−2および関連タンパク質の保存された7つのシステインドメインを定義する)と少なくとも60%、そして好ましくは70%のアミノ酸配列同一性を共有する。
【0014】
アミノ酸配列相同性は、当該分野で周知の方法によって決定され得る。例えば、7つのシステインドメインの配列に対する候補アミノ酸配列の相同性パーセントを決定するために、2つの配列は初めに整列される。このアライメントは、例えば、the dynamic programming algorithm described in Needlemanら、J.Mol.Biol.,48,pp.443(1970)およびAlign Program(DNAstar,Inc.によって生産される市販のソフトウェアパッケージ)を用いて作成され得る。両方の供給源による教示は、本明細書中に参考として援用される。開始アライメントを、関連タンパク質のファミリーの複数配列アライメントとの比較によって精緻化し得る。一旦アライメントを作成し、そして精緻化すると、相同性パーセントスコアを、計算する。続いて、2つの配列の整列したアミノ酸残基をお互いの類似性について比較する。類似性因子は、類似の大きさ、形および電荷が挙げられる。アミノ酸類似性を決定する特に好ましい方法の1つは、Dayhoffら、Atlas of Protein Sequence and Structure,5,pp.345−352(1978 & Supp.)(これは、本明細書中で参考として援用される)中に記載されるPMA250マトリクスである。類似性スコアを、整列したペアのアミノ酸類似性スコアの合計として初めに計算する。挿入および欠損を、相同性パーセントおよび同一性パーセントの目的のために無視する。従って、ギャップペナルティーをこの計算において使用しない。次いで、未加工スコアを、候補配列および7つのシステインドメインの幾何学的平均スコアによる分離によって正規化する。幾何学的平均は、これらのスコアの産物の平方根である。正規化した未加工スコアは、相同性パーセントである。
【0015】
「生体適合性」とは、身体の種々の防御系(例えば、細胞性免疫応答および体液性免疫応答(例えば、炎症性応答および外来性の身体繊維症性応答))に関連する有害な効果を誘発しない材料をいう。この用語「生体適合性」はまた、その材料が患者内に移植された場合に、所望でない細胞傷害性または全身性の効果がその材料によって全く引き起こされないことを、意味する。
【0016】
「結合剤(binder)」とは、骨原性タンパク質および/または多孔性マトリクスと混合された場合に骨形成を促進する、任意の生体適合性材料をいう。特定の好ましい結合剤は、標準的な骨原性デバイスよりも、少ない量の骨原性タンパク質を使用してこのような修復を促進する。他の好ましい結合剤は、標準的な骨原性デバイスと、同じ量の骨原性タンパク質を使用して修復を促進し得、いくつかは、修復を促進するために、より多くの骨原性タンパク質を必要とする。本明細書中に教示されるように、当業者は、単なる慣用的な実験を使用して、任意の適切な結合剤と共に使用するためのタンパク質の有効量を決定し得る。好ましい結合剤の他の特徴としては、デバイスに、とりわけ、以下を付与する能力である:柔軟性、成形性および/または可鍛性;注入性;骨、軟骨、筋肉および他の組織に対する接着性;手術中の洗浄時および/または灌流時の崩壊に対する耐性;ならびに手術中、縫合中および術後の取り外れに対する耐性。さらに、特に好ましい実施形態において、結合剤は、低い割合で存在する場合に、上記の特徴および利点を達成し得る。
【0017】
「生分解性剤」とは、吸収可能な生体適合性の材料(例えば、移植部位で徐々に分解する材料)をいう。この材料は、生理活性因子をカプセル化し得、その生理活性因子の時限放出送達または持続放出送達を提供する。生分解性の材料には、天然ポリマーおよび合成ポリマーが包含される。生分解性の材料の例は、ポリ(L−ラクチド)(PLLA)、ポリ(D,L−ラクチド)(PDLLA)、ポリグリコリド(PGA)、ポリ(ラクチド−コ−グリコリド)(PLGA)およびこれらのコポリマーである。
【0018】
「骨」とは、主に、ヒドロキシアパタイトの形態の沈着されたカルシウムおよびリン酸の複合体、コラーゲン(主に、I型コラーゲン)ならびに骨細胞(例えば、骨芽細胞、骨細胞および破骨細胞)を含む、石灰化(鉱化)された結合組織、ならびに、実際の軟骨内骨の内側で形成される、骨髄組織をいう。骨組織は、他の組織(軟骨組織を含む)とは有意に異なる。特に、骨組織は、細胞および二相性媒体から構成される血管化された組織であり、この二相性媒体は、鉱化された無機成分(主に、ヒドロキシアパタイト結晶)および有機成分(主に、I型コラーゲン)を含む。グリコサミノグリカンは、この有機成分の2%未満ならびにこの二相性媒体自体または骨組織自体の1%未満を構成する。さらに、軟骨組織と比較して、骨組織に存在するコラーゲンは、高度に組織化された平行な配置で存在する。骨の欠損は、変性性、外傷性または癌性の病因に関係なく、再建手術に困難な問題を引き起こす。哺乳動物の関節に生じるような多組織複合体の一部を含む骨格部分の再生または修復は、特に困難である。
【0019】
「骨形成」は、軟骨内骨の形成または膜内骨の形成を意味する。ヒトにおいて、骨形成は、胎児発生の最初の6〜8週間の間に開始する。間葉系起源の前駆幹細胞が、所定の部位に移動し、ここで、これらの幹細胞が、(a)凝縮し、増殖し、そして骨形成細胞(骨芽細胞)に分化するか(頭蓋において観察される、「膜内骨形成」と呼ばれるプロセス)、または(b)凝縮し、増殖し、そして中間体として軟骨形成細胞(軟骨芽細胞)に分化し、その後、骨形成細胞に置換される。より詳細には、間葉系幹細胞は、軟骨細胞に分化する。次いで、これらの軟骨細胞が、石灰化され、肥大し、そして、ここでその部位に存在する、分化された骨芽細胞によって作製された、新しく形成された骨によって置換される。その後、この鉱化された骨が、広範に再構築され、その後、機能的な骨髄要素が満たされた小骨に占有される。このプロセスは、長骨において観察され、「軟骨内骨形成」といわれる。出生後、骨は、胎児の軟骨内骨発生の細胞プロセスを模倣することによって、損傷時にそれ自体を修復する能力を有する。つまり、骨髄、骨膜および筋肉由来の間葉系前駆幹細胞は、欠損部位に移動し、そして上記事象のカスケードを開始するよう誘導され得る。ここで、これらは、蓄積し、増殖し、そして軟骨に分化し、その後、軟骨は、新しく形成された骨と置換される。
【0020】
「骨形成タンパク質(BMP)」とは、DNA配列およびアミノ酸配列の相同性に基づいてTGF−βスーパーファミリーのBMPファミリーのタンパク質(BMPファミリー)に属するタンパク質をいう。タンパク質は、そのタンパク質が、BMPタンパク質ファミリーを特徴付ける保存されたC末端システインリッチドメイン内で、少なくとも1つの公知のBMPファミリーメンバーと、少なくとも50%のアミノ酸配列同一性を有する場合に、本発明に従うBMPファミリーに属する。BMPファミリーのメンバーは、全体で50%未満のDNA配列同一性またはアミノ酸配列同一性を有してもよい。
【0021】
「保存的置換」は、対応する参照残基に物理的または機能的に類似する残基である。つまり、保存的置換およびその参照残基は、類似のサイズ、形状、電荷、化学特性(共有結合または水素結合を形成する能力を含む)などを有する。好ましい保存的置換は、Dayhoffら、前出における受け入れられた点変異について規定された基準を満たす置換である。保存的置換の例は、以下のグループ内の置換である:(a)バリン、グリシン;(b)グリシン、アラニン;(c)バリン、イソロイシン、ロイシン;(d)アスパラギン酸、グルタミン酸;(e)アスパラギン、グルタミン;(f)セリン、トレオニン;(g)リジン、アルギニン、メチオニン;および(h)フェニルアラニン、チロシン。用語「保存的改変体」または「保存的改変」はまた、親アミノ酸配列に特異的な抗体が、得られた置換ポリペプチド配列にも特異的である(すなわち、「交差反応」または「免疫反応」する)、その所定の親アミノ酸配列におけるアミノ酸残基に代わる置換アミノ酸残基の使用を含む。
【0022】
「欠損」または「欠損部位」は、骨、関節、軟骨または靭帯の修復、構築、融合、再生または増強を必要とする部位をいう。この部位は、整形外科的な構造上の破壊または異常であり得るか、または骨が正常に成長しない部位であり得る。この欠損は、骨およびその上に存在する軟骨の両方の構造破壊を含む骨軟骨性欠損をさらに規定し得る。欠損は、「間隙」の構成をとり得、これは、三次元欠損(例えば、隙間、管腔、穴、または骨もしくは関節の構造的完全性における他の実質的な破壊)を意味することが理解される。欠損は、事故、疾患、外科的処置および/またはプロテーゼの不具合の結果であり得る。特定の実施形態において、この欠損は、内因性または自然発生的な修復を行い得ない容量を有する間隙である。長骨におけるこのような欠損は、被験体の骨の直径のほぼ2倍であり、「臨界サイズ」欠損とも呼ばれる。例えば、イヌ尺骨欠損モデルにおいて、従来技術は、このような欠損を約3〜4cmであると認識する。一般に、臨界サイズ欠損は、約1.0cmであり、自然修復し得ない。例えば、Schmitzら、Clinical Orthopaedics and Related Research,205,pp.299−308(1986);およびVukicevicら、Advances in Molecular and Cell Biology,6,pp.207−224(1993)(JAI Press,Inc.)を参照のこと。ウサギおよびサルの分節性欠損モデルにおいて、その隙間は、それぞれ、約1.5cmおよび2.0cmである。他の実施形態において、この欠損は、非臨界サイズの分節性欠損である。一般に、これらは自然修復し得る。特定の他の実施形態において、この欠損は、骨軟骨性プラグのような骨軟骨性欠損である。このような欠損は、上に存在する軟骨全体を横切り、そして少なくとも部分的に、下に存在する骨構造に侵入する。対照的に、軟骨または肋軟骨下の欠損は、それぞれ、部分的または全体的に、上に存在する軟骨を横切るが、下に存在する骨には関与しない。本発明を使用して修復され易い他の欠損としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:非癒着骨折;骨管腔;腫瘍切除;新たな骨折(伸延されているかまたはされていない);例えば、顔面床再構築、特に、眼窩床再構築、顎堤もしくは洞の増強、歯周欠損および抜歯槽における頭側、顎顔面側および顔面側の異常;頭蓋形成、頤形成、下顎増強、口蓋再構成および他の大骨再構築;顎椎、胸椎および腰椎における椎骨形成、椎体間融合、ならびに胸椎および腰椎における後外側融合;骨再生についての骨髄炎において;四肢融合、足根関節融合、全股関節部、膝および関節の融合または関節形成;腱および/または靱帯組織欠損(例えば、膝の前靱帯、後靱帯、外側靱帯および内側靱帯、膝蓋骨およびアキレス腱など)の矯正;ならびに疾患(例えば、癌、関節炎(変形性関節症を含む)、および他の骨変性障害(例えば、離断性骨軟骨炎))から生じる欠損。
【0023】
「顆粒化溶液」とは、特定の程度のコンシステンシーおよび粘着性を有し、顆粒の形成を促進する溶液をいう。
【0024】
「形態形成タンパク質」とは、形態形成活性を有するタンパク質をいう(以下を参照のこと)。好ましくは、本発明の形態形成タンパク質は、BMPタンパク質ファミリーに属する少なくとも1つのポリペプチドを含む。形態形成タンパク質は、局所環境の合図に依存して、前駆細胞を増殖するように誘導し得るか、そして/または、軟骨、骨、腱、靱帯、神経もしくは他の型の組織形成を導く分化経路に入るように誘導し得、従って、形態形成タンパク質は、異なる環境下で様々にふるまい得る。例えば、骨原性タンパク質は、ある処置部位で骨組織を誘導し得、そして異なる処置部位で神経組織を誘導し得る。
【0025】
「形態形成タンパク質刺激因子(MPSF)」とは、形態形成タンパク質が前駆細胞から組織形成を誘導する能力を刺激し得る因子をいう。MPSFは、形態形成タンパク質誘導活性の増強に対して直接的または間接的な効果を有し得る。MPSFは、活性化を誘導する形態形成タンパク質を増強する直接的または間接的な効果を有し得る。例えば、MPSFは、別のMPSFの生理活性を増強し得る。MPSFの生理活性を増強する因子としては、例えば、MPSFの合成、半減期、他の生体分子(例えば、結合タンパク質および結合レセプター)との反応性、またはバイオアベイラビリティーを増強する因子が挙げられる。
【0026】
「骨原性タンパク質(OP)」とは、前駆細胞が軟骨および/または骨を形成するのを誘導し得る、形態形成タンパク質をいう。骨は、膜内骨または軟骨内骨であり得る。多くの骨原性タンパク質は、BMPタンパク質ファミリーのメンバーであり、従ってBMPでもある。本明細書中、他で記載されるように、このクラスのタンパク質は、ヒト骨原性タンパク質(hOP−1)によって代表される。本発明の実施において有用な他の骨原性タンパク質としては、OP−1、OP−2、OP−3、BMP−2、BMP−3、BMP−4、BMP−5、BMP−6、BMP−9、DPP、Vg1、Vgr、60Aタンパク質、GDF−1、GDF−3、GDF−5、GDF−6、GDF−7、BMP−10、BMP−11、BMP−13、BMP−15、UNIVIN、NODAL、SCREW、ADMPまたはNEURALの骨原性活性形態、およびそれらのアミノ酸配列改変体が挙げられる。1つの現在好ましい実施形態において、骨原性タンパク質としては、以下のいずれか1つが挙げられる:OP−1、OP−2、OP−3、BMP−2、BMP−3、BMP−4、BMP−5、BMP−6、BMP−9、ならびにそれらのアミノ酸配列改変体およびホモログ(その種ホモログを含む)。特に好ましい骨原性タンパク質は、ヒトOP−1、BMP−2および関連するタンパク質のC末端102−106アミノ酸(保存された7つのシステインドメインを規定する)と少なくとも70%の相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質である。本発明の特定の好ましい実施形態は、骨原性タンパク質OP−1を含む。本明細書中、他でさらに記載されるように、本発明との使用に適切な骨原性タンパク質は、ReddiおよびSampath(Sampathら、Proc.Natl.Acad.Sci.,84、7109−13頁(本明細書中で参考として援用される))によって記載される当該分野で認識されているバイオアッセイを使用する、慣用的な実験手段によって同定され得る。
【0027】
本発明において有用なタンパク質としては、骨原性タンパク質として同定された真核生物タンパク質(米国特許第5,011,691号(本明細書中で参考として援用される)を参照のこと)(例えば、OP−1、OP−2、OP−3およびCBMP−2タンパク質)、ならびにアミノ酸配列関連タンパク質(例えば、DPP(Drosophila由来)、Vg1(Xenopus由来)、Vgr−1(マウス由来)、GDF−1(ヒト由来、Lee、PNAS、88、4250−4254頁(1991)を参照のこと)、60A(Drosophila由来、Whartonら、PNAS、88、9214−9218頁(1991)を参照のこと)、dorsalin−1(ニワトリ由来、Baslerら、Cell 73、687−702頁(1993)およびGenBank登録番号L12032を参照のこと)およびGDF−5(マウス由来、Stormら、Nature、368、639−643頁(1994)を参照のこと))が挙げられる。上記の参考文献の教示は、本明細書中に参考として援用される。BMP−3もまた、好ましい。さらなる有用なタンパク質としては、米国特許第5,011,691号(本明細書中に参考として援用される)に開示される、生合成性の形態形成構築物(例えば、COP−1、COP−3、COP−4、COP−5、COP−7およびCOP−16)ならびに当該分野で公知の他のタンパク質が挙げられる。なお他のタンパク質としては、以下の形態形成活性形態が挙げられる:BMP−3b(Takaoら、Biochem.Biophys.Res.Comm.、219,656−662頁(1996)を参照のこと)、BMP−9(WO95/33830を参照のこと)、BMP−15(WO96/35710を参照のこと)、BMP−12(WO95/16035を参照のこと)、CDMP−1(WO94/12814を参照のこと)、CDMP−2(WO94/12814を参照のこと)、BMP−10(WO94/26893を参照のこと)、GDF−1(WO92/00382を参照のこと)、GDF−10(WO95/10539を参照のこと)、GDF−3(WO94/15965を参照のこと)およびGDF−7(WO95/01802を参照のこと)。上記の参考文献の教示は、本明細書中に参考として援用される。
【0028】
「修復」は、欠損部の空隙または構造的不連続性を少なくとも部分的に充填するのに十分な、新しい骨および/または軟骨の形成を意味する。しかし、修復は、欠損をその欠損前の生理学的/構造的/機械的状態に回復するのに100%効果的である完全な治癒のプロセスまたは処置を意味せず、またその必要もない。
【0029】
「相乗的相互作用」とは、2以上の因子の合わせた効果が、それらの個々の効果の数的合計よりも多い、相互作用をいう。
【0030】
(多孔性β−TCP)
本発明は、ヒトまたは動物における欠損部位での骨形成、骨再生および骨修復に適切な細孔サイズおよび粒子サイズを有する、多孔性β−TCPを提供する。本発明に記載される多孔性β−TCP本体は、多くの細孔を有するβ−TCPを含む。各細孔は、壁によって分けられた単一の別々の空隙であり、相互連絡されていない。本発明の多孔性β−TCP自体は、隣接する細孔の間に毛細系の空隙路または相互連絡を含む、海綿状または開窓状の構造とは異なる。本発明の多孔性β−TCPの細孔直径は、20〜500μmの範囲である。1つの実施形態において、細孔直径は、410〜460μmの範囲である。好ましい実施形態において、細孔直径は、40〜190μmである。別の実施形態において、細孔直径は、20〜95μmの範囲である。より好ましい実施形態において、細孔直径は、50〜125μmの範囲である。これらの細孔は、β−TCP材料が生体内に包埋された場合に、浸潤する骨溶解細胞および骨芽細胞のための滞留空間を提供する。1つの実施形態において、細孔は、球形であり、かつ均一に分布している。20〜500μmの範囲の直径を有する球形の細孔が、骨芽細胞浸潤に適切である。球形の細孔はまた、その多孔性の本体に、新しい骨が合成されている期間中に必要な機械的強度を提供し、従って、この期間中の骨折を防止する。
【0031】
リン酸三カルシウム(TCP)は、Ca3(PO4)2の式を有し、そのCa/P比は、約1.5である。TCP粉末は、アパタイト結晶構造を有する。焼結時に、このアパタイト構造は、ひし形のβ−TCP構造に変換する。高温で、準安定なα−TCP構造もまた形成し得る。α−TCPは、過度の可溶性を有することが公知であり、このことは、吸収の速度が硬組織による置換速度に相補的であることを可能にしない。さらに、α−TCPは、有害な炎症性応答を生じ得る。好ましい実施形態において、TCPは、1100〜1200℃の高温で焼結される。1300℃より上では、TCPは、準安定なα−TCPに変換される。TCPの焼結は、体液中でのその可溶性を減少し、これは、その化学活性における、その対応する減少を導き、その結果、多孔性TCPは、身体中で十分に許容され、急性の炎症反応は回避される。従って、多孔性β−TCPは、好ましく焼結される。より好ましくは、β−TCPは、95〜100%純粋のβ−TCPを含む。
【0032】
本発明の多孔性β−TCP材料は、任意の形状およびサイズを有し得る。一つの実施形態において、多孔性β−TCPは、顆粒状であり、そして0.1mm〜2mmの間の粒子サイズを有する。好ましい実施形態において、この粒子サイズは、0.5mm〜1.7mmである。より好ましい実施形態において、この粒子サイズは、1.0mm〜1.7mmである。最も好ましい実施形態において、この粒子サイズは、0.5mm〜1mmである。0.1mm未満の顆粒サイズを有するβ−TCPは、適切ではない。なぜならば、これは、流れる体液によって容易に排出されるからである。一方、骨形成は、より大きな粒子においてより明白であるが、2mmよりも大きな顆粒サイズを有するβ−TCPもまた、適切ではない。なぜならば、多すぎる間隙または過剰に大きな間隙が、顆粒間に形成し、これにより、新しく合成された骨へのβ−TCPの効率的な結合が妨げられるからである。
【0033】
β−TCPの多孔性は、再吸収の速度に影響を与える。この多孔性が高すぎると、この顆粒の強度が下がる。この多孔性が低すぎると、再吸収の速度が下がる。全孔隙率を、水銀侵入パラメーター法(mercury intrusion parameter method)または同様の方法を使用して測定する。一つの実施形態において、この全孔隙率は、5%〜80%の範囲である。別の実施形態において、この全孔隙率は、40%〜80%の範囲である。より好ましい実施形態において、この全孔隙率は、65%〜75%である。最も好ましい実施形態において、この全孔隙率は、70%である。
【0034】
本発明の多孔性β−TCPはまた、1種以上の生物活性剤とともに合わされ得る。この生物活性剤は、骨の増殖を増強する薬剤もしくは医学的に有用である物質、またはそれらの組み合わせであり得る。この生物活性剤としては、以下が挙げられ得るがこれらに限定されないことが想定される:骨形成タンパク質、増殖因子(例えば、EGF、PDGF、IGF、FGF、TGF−αおよびTGF−β)、サイトカイン、MPSF、ホルモン、ペプチド、脂質、栄養剤、治療組成物(例えば、抗生物質および化学療法剤)、インスリン、化学誘引物質、化学走性因子、酵素、酵素インヒビター。生物活性剤(例えば、ビタミン、細胞骨格剤)、軟骨フラグメント、同種移植片、自家移植片、生細胞(例えば、軟骨細胞、骨髄細胞、間葉腫幹細胞)、組織移植片、免疫抑制剤が、多孔性β−TCPに添加され得ることもまた、想定される。
【0035】
一つの実施形態において、この生物活性剤は、骨形成タンパク質である。好ましい実施形態において、この骨形成タンパク質は、OP−1(BMP−7)、OP−2、OP−3、COP−1、COP−3、COP−4、COP−5、COP−7、COP−16、BMP−2、BMP−3、BMP−3b、BMP−4、BMP−5、BMP−6、BMP−9、BMP−10、BMP−11、BMP−12、BMP−13、BMP−14、BMP−15、BMP−16、BMP−17、BMP−18、GDF−1、GDF−2、GDF−3、GDF−5、GDF−6、GDF−7、GDF−8、GDF−9、GDF−10、GDF−11、GDF−12、MP121、ドルサリン−1(dorsalin−1)、DPP、Vg−1、Vgr−1、60Aタンパク質、NODAL、UNIVIN、SCREW、ADMP、NEURAL、およびTGF−βである。より好ましい実施形態において、この骨形成タンパク質は、OP−1である。
【0036】
別の実施形態において、この骨形成タンパク質の形態形成活性は、MPSFの添加によって増強される。好ましい実施形態において、このMPSFは、インスリン様増殖因子 I(IGF−I)、エストラジオール、線維芽細胞増殖因子(FGF)、成長ホルモン(GH)、成長および分化因子(GDF)、ヒドロコルチゾン(HC)、インスリン、プロゲステロン、副甲状腺ホルモン(PTH)、ビタミンD、レチン酸およびIL−6からなる群から選択される。好ましい実施形態において、このMPSFは、IGF−1、IL−6、FGF、PTHから選択される。より好ましい実施形態において、このMPSFは、IGF−1である。
【0037】
別の実施形態において、この生物活性剤は、好ましくは、抗菌剤または抗生物質であり、これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:エリスロマイシン、バシトラシン、ネオマイシン、ペニシリン、ポリミキシンB、テトラサイクリン、バイオマイシン、クロロマイセチンおよびストレプトマイシン、セファゾリン、アンピシリン、アザクタム、トブラマイシン、クリンダマイシンならびにゲンタマイシン。使用される抗生物質の濃度は、当該分野で周知である。このような抗生物質は、公知であり、そして骨セメント物質と組み合わせて使用される。例えば、Hoffら、J.Bone Joint Surq.、63A、798頁、(1981);およびDuelandら、Clin.Orthop.、169、264−268頁、(1982)を参照のこと。これらの2つの参考文献の開示は、本明細書中で参考として援用されている。
【0038】
別の好ましい実施形態において、この生物活性剤は、修復細胞である。好ましい実施形態において、この修復細胞は、哺乳動物の細胞、より好ましくは、修復または再構築される組織の細胞と同一の型のヒト細胞である。修復細胞の適切な例としては、骨細胞(bone cell)(例えば、骨髄幹細胞、骨細胞(osteocyte)、骨芽細胞、破骨細胞、および骨前駆体細胞)が挙げられる。別の実施形態において、この細胞は、BMPをコードする核酸分子でトランスフェクトされる。
【0039】
なお別の好ましい実施形態において、この生物活性剤は、BMPをコードする配列、好ましくは、OP−1(配列番号10)を含む、核酸分子である。好ましい実施形態において、この核酸分子は、RNA分子またはDNA分子にである。このBMPをコードする核酸配列は、組換え発現ベクターに挿入され得る。ベクターの例としては、pBR322、pH717、pH731、pH752、pH754およびpW24が挙げられるが、これらに限定されない。SP6ベクターは、RNAのインビトロ転写のために使用され得る。BMPを発現するために有用な転写プロモーターとしては、SV40初期プロモーター、アデノウイルスプロモーター(AdMLP)、マウスメタロチオネイン−Iプロモーター(mMT−I)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)長い末端反復(LTR)、マウス乳腺癌ウイルス長い末端反復(MMTV−LTR)、およびヒトサイトメガロウイルス大中間体−初期プロモーター(hCMV)が挙げられるが、これらに限定されない。これらのプロモーターの全てのDNA配列は、当該分野で公知であり、そして市販されている。DNA配列がまた、組換えウイルス(例えば、組換えアデノウイルス、アデノ随伴ウイルスまたはレトロウイルス)のゲノム中に挿入され得る。次いで、この修復細胞または骨前駆体細胞を、ベクターまたはウイルスを用いて、トランスフェクトするか、または感染させて、BMPタンパク質を発現する。この核酸配列は、修復細胞または骨前駆体細胞を、過渡的または安定的にトランスフェクトし得る。
【0040】
一つの実施形態において、この核酸分子は、移植部位に直接注入される。好ましくは、この核酸は、マンニトール、スクロース、ラクトース、トレハロース、リポソーム、タンパクリポソーム、(ウイルスエンベロープタンパク質を含む)およびポリリジン−糖タンパク質複合体からなる群から選択されるキャリアにおいてトラップされる。例えば、Ledley、J.Pediatrics 110、1頁(1987);Nicolauら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、80、1068頁(1983)を参照のこと。別の好ましい実施形態において、核酸は、身体から取り出された骨前駆細胞および修復細胞のような標的細胞に、トランスフェクトまたは感染される。次いで、このトランスフェクトされた細胞または感染された細胞は、身体内に再移植される。
【0041】
最も好ましい実施形態において、この生物活性剤は、生分解性剤中にカプセル化される。この生分解性剤が、この破骨細胞によってゆっくりと再吸収されると、このカプセル化された生物活性剤は、このマトリクスに徐々に放出される。この移植部位において、異なる生分解性剤、好ましくは、再吸収速度の異なる薬剤との組み合わせを介して、この生物活性剤を送達し、複数のブースト送達系を達成し得る。別の好ましい実施形態において、この生分解性剤は、多層である。各層は、異なる生分解性剤、好ましくは、再吸収速度の異なる薬剤と含む。生物活性剤をカプセル化する方法としては、エマルジョン−溶媒エバポレーション法(Grandfilsら、Journal of Biomedical Materials Research、26、467−479頁(1992))およびHerbertら、Pharmaceutical Research、15、357−361頁(1998)に記載の方法が挙げられるが、これらに限定されない。上記の参考文献は、本明細書中で参考として援用されている。後者の方法は、タンパク質をカプセル化するのに特に適切である。他の方法は、米国特許第6,110,503号、同第5,654,008号および同第5,271,961号に記載されており、これらは、本明細書中で参考として援用されている。好ましい実施形態において、このOP−1は、カプセル化プロセスの間に、ラクトースを添加することにより安定化される。
【0042】
本発明の生分解性剤は、ビーズ形態またはミクロスフェア形態であり得る。この生分解性剤は、天然ポリマーおよび合成ポリマーの両方を含む、再吸収可能な生体適合性ポリマーであり得る。天然ポリマーは、代表的に、身体において酵素分解によって吸収されるが、再吸収可能な合成ポリマーは、代表的に、加水分解性機構によって分解する。生分解性剤の粒子サイズは、20μm〜500μm、好ましくは、20μm〜140μm、より好ましくは、50μm〜140μm、そして最も好ましくは、75μm〜140μmであることが好ましい。
【0043】
一つの実施形態において、生分解性剤は、以下からなる群から選択される:エチレン酢酸ビニル、天然コラーゲンおよび合成コラーゲン、ポリ(グラキサノン)、ポリ(ホスファゼン)、ポリグラクチン、ポリグラクト酸(polyglactic acid)、ポリアルドン酸(polyaldonic acid)、ポリアクリル酸(polyacrylic acid)、ポリアルカノエート、ポリオルトエステル、ポリ(L−ラクチド)(PLLA)、ポリ(D,L−ラクチド)(PDLLA)、ポリグリコリド(PGA)、ポリ(ラクチド−コ−グリコリド(PLGA)、ポリ(ζ−カプロラクトン)、ポリ(トリメチレンカルボネート)、ポリ(p−ジオキサノン)、ポリ(ζ−カプロラクトン−コ−グルコリド)、ポリ(グルコリド−コ−トリメチレンカルボネート)、ポリ(D,L−ラクチド−コ−トリメチレンカルボネート)、ポリアリールエート、ポリヒドロキシブチレート(PHB)、ポリ無水物、ポリ(無水物−コ−イミド)およびそれらのコポリマー、アミノ酸のポリマー、ポリエチレン−コ−フマレート、1種以上のα−ヒドロキシカルボン酸モノマーのポリマー、生物活性ガラス組成物、それらの混合物、ならびにそれらの任意の誘導体および改変体。好ましくは、この改変体は、このポリマーの全体の構造の50%未満で変化する。
【0044】
好ましい実施形態において、この生分解性剤は、以下からなる群から選択される:ポリオルトエステル、ポリ(L−ラクチド)(PLLA)、ポリ(D,L−ラクチド)(PDLLA)、ポリグリコリド(PGA)、ポリ(ラクチド−コ−グリコリド(PLGA)、ポリ(ζ−カプロラクトン)、ポリ(トリメチレンカーボネート)、ポリ(p−ジオキサノン)、ポリ(ζ−カプロラクトン−コ−グリコリド)、ポリ(グリコリド−コ−トリメチレンカーボネート)、ポリ(D,L−ラクチド−コ−トリメチレンカーボネート)、ポリアクリレートおよびそれらのコポリマー。
【0045】
別のより好ましい実施形態において、この生分解性剤は、以下からなる群から選択される:ポリ(グラキサノン)、ポリ(ホスファゼン)、エチレン酢酸ビニル、ポリグラクチン、ポリグラクト酸、ポリアルドン酸、ポリアクリル酸、ポリアルカノエート、それらのコポリマー、ならびに天然コラーゲンおよび合成コラーゲン。
【0046】
なお別のより好ましい実施形態において、この生分解性剤は、以下からなる群から選択される:ポリヒドロキシブチレート(PHB)、無水物(ポリ無水物、ポリ(無水物−コ−イミド)およびそれらのコポリマー)、アミノ酸のポリマー、プロピレン−コ−フマレート、1種以上のヒドロキシカルボン酸モノマーのポリマー(例えば、α−ヒドロキシ酢酸(グリコール酸)および/またはα−ヒドロキシプロピオン酸(乳酸))、生物活性ガラス組成物。α−ヒドロキシプロピオン酸は、そのD体もしくはL体で、またはラセミ混合物として使用され得る。
【0047】
最も好ましい実施形態において、この生分解性剤は、ポリ(ラクチド−コ−グリコリド)(PLGA)である。生物活性剤の放出の所望の速度に依存して、ラクチドとグリコリドモノマーとのモル比が、調節され得る。好ましい実施形態において、このモル比は、50:50である。一般に、モル重量が高くなればなるほど、生分解は遅くなる。好ましくは、このポリマーの重量範囲は、約5,000ダルトン〜500,000ダルトンであり、より好ましくは、10,000ダルトン〜30,000ダルトンである。
【0048】
(多孔性β−TCPの製造方法)
本発明はまた、多孔性β−TCP顆粒を製造する方法に関する。この多孔性β−TCPを調製するのに使用されるTCPは、当該分野で公知の方法に従って調製される。TCPは、スプレー乾燥を介して、好ましくは、10μm未満の粒子サイズで収集される。粒子サイズが非常に大きい場合、細孔の形成を干渉する。
【0049】
次いで、微細なTCP粉末を、任意の固体残留物を残すことなく、高温度でガス分解生成物に分解する細孔形成剤と混合する。本発明の細孔形成剤は、ビーズ形態または樹脂形態であり得る。1つの実施形態において、細孔形成剤は、熱分解可能な物質(例えば、ナフタレン)、ポリアクリレートのプレポリマー、ポリメタクリレートのプレポリマー、ポリメチルメタクリレート、メチルアクリレートとメチルメタクリレートとのコポリマーおよびそれらの混合物、ポリスチレン、ポリエチレングリコール、結晶性セルロース粉末、繊維性セルロース、ポリウレタン、ポリエチレン、ナイロン樹脂、ならびにアルリル樹脂。より好ましい実施形態において、細孔形成剤は、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレンおよびポリエチレングリコールからなる群から選択される。細孔形成剤は、焼結後に、20μm〜500μm、より好ましくは、40μm〜190μm、そして最も好ましくは、50μm〜125μmの直径の細孔サイズを形成することが、好ましい。
【0050】
細孔形成剤の均整および粒子サイズは、空隙率およびポア構造に影響を与える。過剰な量の細孔形成剤は、相互に連絡する細孔をもたらし、そしてβ−TCPの密度およびそれにより焼結した本体の機械的強度を減少させる。不足した量の細孔形成剤は、不十分に展開した細孔構造を生じ得る。細孔形成剤の割合は、好ましくは、10重量%〜50重量%、より好ましくは、30重量%〜40重量%、最も好ましくは、37.5重量%である。
【0051】
次いで、顆粒化溶液を、TCP粉末と細孔形成剤との混合物に添加し、脆い塊を形成する。これは、続く篩手順を改善する。達成される所望の粘性および分散媒体の水性特性に依存して、顆粒化溶液を形成するために使用される化合物が、ポリビニルピロリドン、デンプン、ゼラチン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド、ヒドロキシエチルセルロース、ポリビニルブチラール、およびセルロースアセテートブチレートからなる群から選択され得る。好ましくは、顆粒化溶液中の化合物は、ポリビニルピロリドン、デンプンおよびゼラチンからなる群から選択される。
【0052】
次いで、この脆い塊を篩にかけ、顆粒サイズの範囲を選択する。この篩プロセスによって選択された顆粒のサイズは、250μm〜1700μm、より好ましくは、1000μm〜1700μm、最も好ましくは、500μm〜1000μmの範囲であり得る。次いで、この篩にかけた顆粒は、90℃〜110℃、より好ましくは、105℃で乾燥される。
【0053】
次いで、この乾燥した顆粒を、700℃〜800℃まで加熱し、細孔形成剤を除去する。次いで、この温度を、焼結のために、1000℃〜1200℃、より好ましくは、1150℃まで上昇させる。この焼結した顆粒を、ゆっくりとした冷却手順に供し、純粋な結晶性β−TCPを得た。好ましい実施形態において、この温度を、6時間で、1150℃から39℃まで下げる。焼結後、重量の減少および縮みが、このサンプルにおいて生じた。細孔が、TCPに形成され、そしてこの細孔が、燒結したTCPの骨格によって取り囲まれる。この焼結した顆粒を、以前に使用したように同じサイズの篩を使用して再度篩にかけ、そして上記のようにバインダーと混合して、成形可能なパテ組成物を形成する。
【0054】
あるいは、多孔性β−TCP顆粒を、TCP粉末を細孔形成剤と混合することによって調製し得る。この混合物を、均一性を達成するようにブレンドして、そしてプレス、回転式タブレットマシーンまたはチルソネータ(chilsonator)を使用して、スラッグへと圧縮する。このスラッグを、700℃〜800℃まで加熱して、細孔形成剤を除去し、そして1000℃〜1100℃、好ましくは、1150℃で焼結する。次いで、この多孔性スラッグを、250μm〜1700μm、より好ましくは、1000μm〜1700μm、そして最も好ましくは、500μm〜1000μmの範囲の適切な粒子サイズに粉砕する。次いで、多孔性顆粒を、バインダーとともに混合して、成形可能なパテ組成物を形成する。
【0055】
(成型可能なパテ組成物)
本発明の多孔性β−TCPは、生体適合性結合剤と組み合わされて、成型可能なパテ組成物を形成し得る。成型可能なパテは、十分な粘度を有するペーストまたは半固体の形態であり得る。成型可能なパテ組成物は、新たな骨成長が望ましい空隙、欠損または他の領域内に位置づけそして成形することを可能にする。パテの粘着性はまた、整形外科適用、顎顔面適用、および歯科適用のための移植材料に関連する粒子の移動の問題を防ぐ。
【0056】
本発明に従う結合剤は、生分解性で生体適合性でなければならず、流体流れ特性を有しなければならない。本明細書中において有用であると企図される結合剤としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:当該分野で認識される懸濁剤、粘度生成剤、ゲル形成剤、および乳化剤。他の候補は、局所的投与、経口投与、または非経口投与のために成分を懸濁するために使用される薬剤である。なお他の候補は、錠剤結合剤、崩壊剤またはエマルジョン安定化剤として有用な薬剤である。なお他の候補は、化粧品、化粧道具(toiletries)および食品において使用される薬剤である。USP XXII −NF XVII(The Nineteen Ninety U.S.Pharmacopeia and the National Formulary(1990))のような参考説明書は、このような薬剤を分類し、そして説明する。好ましい結合剤としては、生物学的供給源または合成供給源からの再吸収可能な高分子が挙げられ、これらには、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸、アルキルセルロース(メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウムまたは他の塩を含む)、ヒドロキシアルキルセルロース(ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースを含む)、アルキルヒドロキシアルキルセルロース(メチルヒドロキシエチルセルロースを含む)のようなセルロース誘導体、コラーゲン、ペプチド、ムチン、コンドロイチン(chrondroitin)硫酸などが挙げられる。
【0057】
カルボキシメチルセルロール(CMC)ナトリウムは、好ましい結合剤である。CMCは、以下のような供給業者から市販されるが、これらに限定されない:Hercules Inc.,Aqualone(登録商標)Division,Delaware;FMC Corporation,Pennsylvania;British Celanese,Ltd.,United Kingdom;およびHenkel KGaA,United Kingdom。カルボキシメチルセルロールナトリウムは、セルロースのポリカルボキシメチルエーテルのナトリウム塩であり、代表的な分子量は、90,000〜700,000の範囲である。異なる粘度を有する種々の等級のカルボキシメチルセルロールナトリウムが市販される。種々の等級のカルボキシメチルセルロールナトリウムの粘度は、Handbook of Pharmaceutical Excipients(第2版),American Pharmaceutical Association & Royal Pharmaceutical Society of Great Britainに報告される。例えば、低粘度50〜200cP、中程度粘度400〜800cP、高粘度1500〜3000cP。多数の等級のカルボキシメチルセルロールナトリウムが市販され、最も頻繁に使用される等級は、0.7の置換の程度(a degree of substitution)(DS)を有する。DSは、アンヒドログルコース単位当たりの置換されたヒドロキシル基の平均数として規定される。ポリマーの水溶性を決定するのはこのDSである。置換の程度および記載された濃度の水溶液の標準粘度は、任意のカルボキシメチルセルロールナトリウムラベル上に示される。低粘度CMC(Aqualone(登録商標)Division,Hercules Inc.,Wilmington,DE)が現在好ましい。現在好ましい置換の程度は、0.65〜0.90の範囲(DS=0.7、Aqualone(登録商標)Type 7L)である。
【0058】
室温で流動可能な結合剤の他に、結合剤としては、ゼラチンのような試薬が挙げられ、このゼラチンは、温かいかまたは熱い水溶液中で可溶化し、そして冷却時に非流動性のゲルに変換される。ゼラチン組成物は、この組成物が、移植のために哺乳動物の体温より上の温度で流動性であるが、このような体温においてまたはこのような体温よりわずかに高い温度で比較的非流動性のゲルに転移するように、処方される。
【0059】
1つの実施形態において、本発明の結合剤は、高分子量ヒドロゲルのクラスから選択され、これには、ヒアルロン酸ナトリウム(約500〜3000kD)、キトサン(約100〜300kD)、ポロキサマー(約7〜18kD)、およびグリコサミノグリカン(約2000〜3000kD)が挙げられる。好ましい実施形態において、グリコサミノグリカンは、N,O−カルボキシメチルキトサングルコサミンである。ヒドロゲルは、3次元ネットワークを有するゲルの形態の架橋親水性ポリマーである。ヒドロゲルマトリクスは、正味正または正味負の電荷を保有し得るか、あるいは中性であり得る。代表的な正味負の電荷のマトリクスは、アルギネートである。正味正の電荷を保有するヒドロゲルは、コラーゲンおよびラミニンのような細胞外マトリクス成分によって代表され得る。市販の細胞外マトリクス成分の例としては、MatrigelTM(50μg/mlのゲンタマイシンを有するダルベッコ改変イーグル培地)およびVitrogenTM(0.012N HCL中に溶解された、精製ペプシン可溶化ウシ真皮コラーゲンの滅菌溶液)が挙げられる。正味中性のヒドロゲルの例は、高架橋ポリエチレンオキシドまたはポリビニルアルコールである。
【0060】
別の実施形態において、本発明の結合剤はまた、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸およびポリグリコール酸のコポリマー、ポリヒドロキシ酪酸、ポリリンゴ酸、ポリグルタミン酸、およびポリラクトンを含む群より選択されるポリマーのクラスから選択され得る。数日〜数週間にわたるインサイチュ組織内方増殖(ingrowth)によりこの材料中において次第にポリマーを置換するために、ポリマーの分子量は、ポリマーの必要とされる分解速度と適合性であるべきである。
【0061】
別の好ましい実施形態において、結合剤は、ポリエチレングリコールである。低分子量ポリエチレングリコールおよび高分子量ポリエチレングリコールの混合物は、適切な粘度を有するペーストを生成し得る。例えば、分子量400〜600ダルトンのポリエチレングリコールおよび1500ダルトンのポリエチレングリコールの適切な比の混合物は、有効である。
【0062】
なお別の実施形態において、結合剤は、デキストラン、デキストラン硫酸、ジエチルアミノエチルデキストラン、デキストランリン酸、またはこれらの混合物からなる、約200,000〜5,000,000の平均分子量を有する多糖類のクラスから選択される。低分子量多糖類は、より速いデキストラン吸収速度という利点を有し、多孔性β−TCP材料のより速い暴露を生じる。デキストランが長期間その部位に残ることが望ましい場合、比較的高分子量のデキストランが使用され得る。他の好ましい多糖類としては、デンプン、分画された(fractionated)デンプン、アミロペクチン、寒天、アラビアゴム、パルラン(pullullan)、アガロース、カラゲナン、デキストリン、フルクタン、イヌリン、マンナン、キシラン、アラビナン、グリコゲン、グルカン、キサンタンガム、グアールガム、ローカストマメゴム、トラガカントゴム、カラヤゴム、ならびにこれらの誘導体および混合物が挙げられる。
【0063】
別の好ましい実施形態において、結合剤は、マンニトール、白色鉱油、マンニトール/デキストランの組み合わせ、マンニトール/白色鉱油の組み合わせ、ゴマ油、フィブリン膠(glue)、およびこれらの混合物からなる群より選択される。フィブリン膠が、現在好ましい結合剤であり、これは、哺乳動物フィブリノーゲンおよびトロンビンの混合物を含む。ヒトフィブリノーゲンは、限定しないが、Tissucol(登録商標)(Immuno AG,Vienna,Austria),Beriplast(登録商標)(Behringwerke,Marburg,Germany),Biocoll(登録商標)(Centre de Transfusion Sanguine de Lille,Pours,France)およびTransglutine(登録商標)(CNTS Fractionation Centre,Strasbourg,France)のような製品で市販される。フィブリン膠はまた、他の哺乳動物供給源(例えば、ウシ供給源およびマウス供給源)からのフィブリノーゲンおよびトロンビンから作製され得る。
【0064】
結合剤が、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、ゼラチン、コラーゲン、ペプチド、ムチン、コンドロイチン硫酸、キトサン、ポロキサマー、グリコサミノグリカン、多糖類、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸およびポリグリコール酸のコポリマー、ポリヒドロキシ酪酸、ポリリンゴ酸、ポリグルタミン酸、ポリラクトン、マンニトール、白色鉱油、マンニトール/デキストランの組み合わせ、マンニトール/白色鉱油の組み合わせ、ゴマ油、フィブリン膠、ならびにこれらの混合物からなる群より選択されることが好ましい。
【0065】
より好ましくは、結合剤は、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、およびこれらの混合物からなる群より選択される。最も好ましくは、結合剤は、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、およびカルボキシメチルセルロースカルシウムからなる群より選択される。
【0066】
最小量の結合剤は、容易な成形性を与え、そして組織内方増殖の間に十分な粒子粘着および形状保持を提供するのに必要な量である。1つの実施形態において、多孔性β−TCP:カルボキシメチルセルロールナトリウムの重量比は、1:0.1〜1:1.25の範囲である。好ましい実施形態において、多孔性β−TCP:CMCナトリウムの比は、1:0.4である。
【0067】
本発明はまた、骨移植のためのキットに関し、これは、本発明の多孔性β−TCP材料、ならびに骨形成タンパク質および抗生物質からなる群より選択される少なくとも1種のさらなる生理活性剤を含む。多孔性β−TCP材料および骨形成タンパク質を含むキットは、形態形成タンパク質刺激因子をさらに含み得る。1つの実施形態において、このキットは、結合剤をさらに含む。別の実施形態において、キットは、本発明の多孔性β−TCP材料および結合剤を含む。
【0068】
(骨形成タンパク質ファミリー)
BMPファミリー(その代表的な骨形成/骨原性タンパク質ファミリーメンバーについて名付けられる)は、TGF−βスーパーファミリーに属する。主に配列相同性に基づいて単離された、報告されている「BMP」(BMP−1〜BMP−18)のうち、BMP−1以外の全てが、骨形成タンパク質のBMPファミリーのメンバーとして分類されたままである(Ozkaynakら,EMBO J.,9,2085−93頁(1990))。
【0069】
BMPファミリーは、形態形成タンパク質である構造的に関連するメンバー(drosophilaデカペンタプレージック遺伝子複合体(DPP)産物、Xenopus laevisのVg1産物およびそのマウスホモログ、Vgr−1を含む)を含む(例えば、Massague,Annu.Rev.Cell Biol.,6,597−641頁(1990)(これは、本明細書中において参考として援用される)を参照のこと)。
【0070】
BMP−3、BMP−5、BMP−6およびOP−1(BMP−7)のC末端ドメインは、BMP−2のC末端ドメインと約60%同一であり、そしてBMP−6およびOP−1のC末端ドメインは、87%同一である。BMP−6は、マウスVgr−1のヒトホモログであるようであり(Lyonsら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,86,4554−59頁(1989));2つのタンパク質は、アミノ酸配列レベルで、全体的に、92%同一である(米国特許第5,459,047号、これは、本明細書中において参考として援用される)。BMP−6は、Xenopus Vg−1産物に対して58%同一である。
【0071】
(骨形成タンパク質の生化学的構造および機能的特性)
天然に存在する骨モルフォゲンは、それらのC末端領域(ドメイン)において、実質的なアミノ酸配列相同性を共有する。代表的には、上記天然に存在する骨原性タンパク質は、前駆体として翻訳され、この前駆体は、代表的に約30残基未満のN末端シグナルペプチド配列、続いて、約100〜140アミノ酸の成熟C末端ドメインを生じるように切断される「プロ」ドメインを有する。シグナルペプチドは、Von Heijne,Nucleic Acids Research,14,4683−4691頁(1986)の方法を使用して所与の配列において予測され得る切断部位において、翻訳時に迅速に切断される。プロドメインは、代表的に、完全にプロセスされた成熟C末端ドメインよりも約3倍長い。
【0072】
BMPタンパク質ファミリーのメンバーの別の性質は、二量化するそれらの見かけの能力である。いくつかの骨由来の骨原性タンパク質(OP)およびBMPは、それらの活性形態のホモダイマーおよびヘテロダイマーとして見出される。OPおよびBMPがヘテロダイマーを形成する能力は、形態形成タンパク質にさらなるまたは変更された形態形成誘導能力を与え得る。ヘテロダイマーは、OPレセプター分子およびBMPレセプター分子のホモダイマーとは定性的または定量的に異なる結合親和性を示し得る。次いで、変更された結合親和性は、異なるシグナル伝達経路を媒介するレセプターの異なる活性化を導き得、これは、最終的に、異なる生物学的活性または結果を導き得る。変更された結合親和性はまた、組織型特異的様式または細胞型特異的様式で示され得、これによって、特定の前駆体細胞型のみが増殖および/または分化を受けるように誘導し得る。
【0073】
好ましい実施形態において、形態形成ポリペプチドの対が、それぞれが、参照モルフォゲンのアミノ酸配列と規定の関係を共有する配列を含むアミノ酸配列を有する。本明細書中において、好ましい骨原性ポリペプチドは、骨原性的に活性なヒトOP−1(配列番号1)に存在する配列と規定の関係を共有する。しかし、本明細書中に開示される任意の1つ以上の天然に存在する配列または生合成配列が、参照配列として使用され得る。好ましい骨原性ポリペプチドは、少なくともヒトOP−1のC末端の6システインドメイン(配列番号1の残基335〜431)と規定の関係を共有する。好ましくは、骨原性ポリペプチドは、少なくともヒトOP−1のC末端の7システインドメイン(配列番号1の残基330〜431)と規定の関係を共有する。すなわち、骨形成活性を有する二量体タンパク質の好ましいポリペプチドは、それぞれ、参照配列に対応するかまたはそれらに対して機能的に等価な配列を含む。
【0074】
機能的に等価な配列は、参照配列内に配置されるシステイン残基の機能的に等価な配置を含み、これは、これらのシステインの直線的配置を変更するが、二量体形態形成タンパク質の折り畳み構造におけるそれらの関係(形態形成活性に必要であり得るような鎖内ジスルフィド結合または鎖間ジスルフィド結合を形成する能力を含む)を実質的に損なわないアミノ酸の挿入または欠失を含む。機能的に等価な配列は、1つ以上のアミノ酸残基が、参照配列(例えば、ヒトOP−1のC末端の7システインドメイン(本明細書中において、保存7システイン骨格(conserved seven cysteine skelton)とも呼ばれる)の対応する残基とは異なるが、但し、この差異は、骨形成活性を破壊しない配列を含む。従って、参照配列の対応するアミノ酸の保存的置換が好ましい。参照配列の対応する残基に対する保存的置換であるアミノ酸残基は、対応する参照配列に物理的または機能的に類似するアミノ酸残基(例えば、類似のサイズ、形状、電荷、化学的特性(共有結合または水素結合を形成する能力を含む)など)である。特に好ましい保存的置換は、Dayhoffら、上記(この教示は、本明細書中において参考として援用される)における受容される点変異について規定される基準を満たす置換である。
【0075】
保存的置換は、代表的に、類似の特性を有する別のアミノ酸に対する1つのアミノ酸の置換(例えば、以下の基内での置換:バリン、グリシン;グリシン、アラニン;バリン、イソロイシン、ロイシン;アスパラギン酸、グルタミン酸;アスパラギン、グルタミン;セリン、スレオニン;リジン、アルギニン;およびフェニルアラニン、チロシン)を含む。用語「保存的変動(variation)」はまた、非置換親アミノ酸の代わりの置換アミノ酸の使用を含むが、但し、この置換ポリペプチドに対して惹起される抗体はまた、非置換ポリペプチドと免疫反応する。
【0076】
骨原性タンパク質OP−1は、記載されている(例えば、Oppermannら、米国特許第5,354,557号(これは、本明細書中に参考として援用される)を参照のこと)。その成熟したネイティブ形態の、天然起源の骨原性タンパク質は、SDS−PAGEによって決定された場合に約30〜36kDaの見かけの分子量を代表的に有する、グリコシル化ダイマーである。還元された場合、この30kDaのタンパク質は、約16kDaおよび約18kDaの見かけの分子量を有する、2つのグリコシル化ペプチドサブユニットを生じる。還元状態において、このタンパク質は、検出可能な骨原性活性を有さない。非グリコシル化タンパク質(これもまた、骨原性活性を有する)は、約27kDaの見かけの分子量を有する。還元された場合、この27kDaのタンパク質は、哺乳動物において軟骨内性骨の形成を誘導し得る、約14kDa〜16kDaの分子量を有する2つの非グリコシル化ポリペプチドを生じる。骨原性タンパク質は、種々のグリコシル化パターンを有する形態、種々のN末端を有する形態、およびネイティブタンパク質の活性な短縮形態または変異形態を含み得る。上記のように、特に有用な配列としては、DPP(Drosophila由来)、Vg1(Xenopus由来)、Vgr−1(マウス由来)、OP−1タンパク質およびOP−2タンパク質(米国特許第5,011,691号およびOppermannら(本明細書中に参考として援用される)を参照のこと)、ならびにBMP−2、BMP−3、BMP−4(WO88/00205、米国特許第5,013,649号およびWO91/18098(本明細書中に参考として援用される))、BMP−5およびBMP−6(WO90/11366、PCT/US90/01630(本明細書中に参考として援用される))、BMP−8およびBMP−9と呼ばれるタンパク質の、C末端の96アミノ酸配列または102アミノ酸配列を含む配列が挙げられる。
【0077】
本発明の好ましい形態形成タンパク質および骨原性タンパク質は、以下からなる群から選択される少なくとも1つのポリペプチドを含む:OP−1(BMP−7)、OP−2、OP−3、COP−1、COP−3、COP−4、COP−5、COP−7、COP−16、BMP−2、BMP−3、BMP−3b、BMP−4、BMP−5、BMP−6、BMP−9、BMP−10、BMP−11、BMP−12、BMP−13、BMP−14、BMP−15、BMP−16、BMP−17、BMP−18、GDF−1、GDF−2、GDF−3、GDF−5、GDF−6、GDF−7、GDF−8、GDF−9、GDF−10、GDF−11、GDF−12、MP121、ドーサリン−1(dorsalin−1)、DPP、Vg−1、Vgr−1、60Aタンパク質、NODAL、UNIVIN、SCREW、ADMP、NEURAL、TGF−β、ならびにこれらのアミノ酸配列改変体およびアミノ酸配列ホモログ(これらの種ホモログを含む)。好ましくは、形態形成タンパク質は、以下からなる群から選択される少なくとも1つのポリペプチドを含む:OP−1(BMP−7)、BMP−2、BMP−4、BMP−5およびBMP−6;より好ましくは、OP−1(BMP−7)およびBMP−2;ならびに、最も好ましくは、OP−1(BMP−7)。
【0078】
これらの配列ならびにこれらの化学特性および物理特性を開示する刊行物としては、以下が挙げられる:
【0079】
【化1】
。上記の刊行物は、参考として本明細書中に援用される。別の実施形態において、有用なタンパク質は、生物学的に活性な生合成構築物を含み、これには、新規の生合成形態形成タンパク質および2つ以上の公知のモルフォゲン由来の配列を用いて設計されたおよびキメラタンパク質を含む。
【0080】
本発明の別の実施形態において、形態形成タンパク質は、組織形成を誘導するためにMPSFと協調して使用するために合成的に調製され得る。合成的に調製される形態形成タンパク質は、ネイティブであり得るか、または非ネイティブタンパク質(すなわち、別の天然で見出されないタンパク質)であり得る。
【0081】
非ネイティブの骨原性タンパク質は、一連のコンセンサスDNA配列を用いて合成される(米国特許第5,324,819号(本明細書中に参考として援用される))。これらのコンセンサス配列は、天然の骨原性産物から得られた部分アミノ酸配列のデータ、および推定または実証された発達機能を有することが文献中に報告されている他の遺伝子との観察されるそれらの相同性に基づいて設計された。
【0082】
いくつかの生合成コンセンサス配列(コンセンサス骨原性タンパク質または「COP」と呼ばれる)が、原核生物中で融合タンパク質として発現された。精製された融合タンパク質は、切断され得、再び折り畳まれ得、少なくとも1つのMPSF(必要に応じて、マトリクスまたはデバイス中で)と組み合わされ得、確立された動物モデルに移植され得、そして骨誘導活性および/または軟骨誘導活性を有することが示され得る。現在好ましい合成骨原性タンパク質は、COP−5(配列番号2)および/またはCOP−7(配列番号3)と示される2つの合成アミノ酸配列を含む。
【0083】
Oppermannら(米国特許第5,011,691号および同第5,324,819号(これらは、本明細書中に参考として援用される)は、以下:
【0084】
【化2】
に示されるようなCOP−5およびCOP−7のアミノ酸配列を記載する。
【0085】
これらのアミノ酸配列において、ダッシュ(−)は、関連タンパク質中の比較され得る配列を単に並べるためにつなぎとして使用される。アライメントしたアミノ酸配列間の差異を強調する。
【0086】
これらのBMPファミリーのメンバーおよび他のBMPファミリーのメンバーのDNA配列およびアミノ酸配列は、公開されており、そして新規に同定されたタンパク質がこのBMPファミリーに属するか否かを決定するために当業者によって使用され得る。新規BMP関連遺伝子産物は、少なくとも1つの形成活性を保有するという類似性によって予想され、このようにしてBMPとして分類される。
【0087】
本発明の1つの好ましい実施形態において、形態形成タンパク質は、ダイマー種を生成するためにジスルフィド結合されるサブユニット対を含み、ここで、このサブユニットの少なくとも1つが、BMPタンパク質ファミリーに属する組換えペプチドを含む。本発明の別の好ましい実施形態において、形態形成タンパク質は、非共有結合的な相互作用を介して形成されるダイマー種を生成するサブユニットの対を含み、ここで、このサブユニットの少なくとも1つが、BMPタンパク質ファミリーに属する組換えペプチドを含む。非共有結合的な相互作用としては、ファンデルワールス力、水素結合、疎水性相互作用および静電気相互作用が挙げられる。ダイマー種は、ホモダイマーであってもヘテロダイマーであってもよく、そして細胞増殖および/または組織形成を誘導し得る。
【0088】
特定の好ましい実施形態において、本明細書中において有用な骨形成タンパク質としては、そのアミノ酸配列が、上記の天然に存在するタンパク質から選択される参照形態形成タンパク質と、少なくとも70%のアミノ酸配列の相同性または「類似性」、および好ましくは80%の相同性または類似性を共有する配列を含む、骨形成タンパク質である。好ましくは、参照タンパク質は、ヒトOP−1であり、その参照配列は、ヒトOP−1の骨原性的に活性な形態中に存在するC末端の7システインドメイン(配列番号1の残基330〜431)である。特定の実施形態において、参照モルフォゲンポリペプチドに対して機能的に等価であると推測されるポリペプチドは、Alignプログラム(DNAstar,Inc.)のようなコンピュータープログラムによって簡便に実行されるNeedlemanら(前出)の方法を用いて、それらと共にアライメントされる。上記のように、候補配列中の内部ギャップおよびアミノ酸挿入は、規定された関係を計算するために無視され、慣習的に、候補配列と参照配列との間のアミノ酸配列相同性またはアミノ酸配列同一性のレベルとして表現される。「アミノ酸配列相同性」は、アミノ酸配列同一性およびアミノ酸配列類似性の両方を含むことが、本明細書中で理解される。相同配列は、同一なアミノ酸残基および/または類似のアミノ酸残基を共有し、ここで、類似の残基が、アライメントされた参照配列中の対応するアミノ酸残基の代わりの保存的置換であるか、またはアライメントされた参照配列中の対応するアミノ酸残基の「点変異を許容する」。従って、参照配列と70%のアミノ酸相同性を共有する候補ポリペプチド配列は、アライメントされた残基の任意の70%が、参照配列中の対応する残基と同一であるか、または参照配列中の対応する残基の保存的置換である。目下好ましい実施形態において、参照配列は、OP−1である。従って、本明細書中において有用な骨形成タンパク質としては、天然に存在するか生合成的に産生される(例えば、「ムテイン」または「変異タンパク質」を含む)かにかかわらず、好ましい参照配列の対立遺伝子改変体、系統発生対応物および他の改変体、ならびに一般的な形態形成タンパク質ファミリーの新規メンバー(上記に示され、そして同定されるものを含む)が挙げられる。特定の特に好ましい形態形成ポリペプチドは、ヒトOP−1の好ましい参照配列と少なくとも60%のアミノ酸同一性を共有し、なおより好ましくはそれらと少なくとも65%のアミノ酸同一性を共有する。
【0089】
別の実施形態において、有用な骨原性タンパク質としては、本明細書中に規定されるように、保存された7システインドメインを共有し、そしてC末端活性ドメイン内で少なくとも70%のアミノ酸配列相同性(類似性)を共有する骨原性タンパク質が挙げられる。なお別の実施形態において、本発明の骨原性タンパク質は、本明細書中に規定される一般配列(generic sequence)(OPX(配列番号4)、および本発明の一般配列7(配列番号5)および8(配列番号6)、または一般配列9(配列番号7)および10(配列番号8)を含む)のうちの任意の1つを有する、骨原性的に活性なタンパク質として規定され得る。
【0090】
本発明において有用な骨形成ポリペプチドのファミリー、およびそれらのメンバーは、一般アミノ酸配列によって規定され得る。例えば、一般配列7(配列番号5)および一般配列8(配列番号6)は、それぞれ、97アミノ酸配列および102アミノ酸配列であり、そして現在までに同定された好ましいタンパク質ファミリーのメンバー(少なくともOP−1、OP−2、OP−3、CBMP−2A、CBMP−2B、BMP−3、60A、DPP、Vgl、BMP−5、BMP−6、Vgr−1、およびGDF−1を含む)間で共有される相同性を適応する。これらのタンパク質についてのアミノ酸配列は、上記に要約されるように、本明細書中および/または当該分野に記載される。一般配列としては、6システイン骨格および7システイン骨格によって規定される(それぞれ、一般配列7および一般配列8)C末端ドメイン中のそれらの配列によって共有されるアミノ酸同一性、ならびにこれらの配列内の可変位置に対する代替の残基の両方を含む。一般配列は、適切なシステイン骨格を提供し、ここで、分子間ジスルフィド結合または分子内ジスルフィド結合が形成され得、そして折り畳まれたタンパク質の三次構造におそらく影響を与える特定の重要なアミノ酸を含む。さらに、この一般配列は、36位(一般配列7)および41位(一般配列8)にさらなるシステインを許容し、それによって形態形成的に活性な配列のOP−2、OP−3を含む。
【0091】
【化3】
ここで、各Xaaは、以下のように規定される1つ以上の特定されたアミノ酸の群から選択される:「res.」は、「残基」を意味し、そして、
【0092】
【化4】
である。
【0093】
一般配列8(配列番号6)は、一般配列7の全てを含み、さらに、そのN末端に以下の配列(配列番号9)を含む。
【0094】
一般配列8(配列番号6)は、一般配列7のすべてを含み、そしてさらにそのN末端に以下の配列(配列番号9):
配列番号9
【0095】
【化5】
を含む。
【0096】
従って、残基7で始まって、一般配列8中の各「Xaa」は、一般配列7に関して規定された特定のアミノ酸であり、一般配列7について記載される各残基番号は、一般配列8において5ずれることが特徴である。従って、一般配列7における「res.2のXaa=(TyrまたはLys)」は、一般配列8におけるres.7のXaaを指す。一般配列8において、res.2のXaa=(Lys、Arg、AlaまたはGln)であり;res.3のXaa=(Lys、ArgまたはMet)であり;res.4のXaa=(His、ArgまたはGln)であり;そしてres.5のXaa=(Glu、Ser、His、Gly、Arg、Pro、Thr、またはTyr)である。
【0097】
別の実施形態において、有用な骨原性タンパク質としては、以下にように規定される、一般配列9および10により規定されるタンパク質が挙げられる。
【0098】
詳細には、一般配列9および10は、以下のタンパク質の複合アミノ酸配列である:ヒトOP−1、ヒトOP−2、ヒトOP−3、ヒトBMP−2、ヒトBMP−3、ヒトBMP−4、ヒトBMP−5、ヒトBMP−6、ヒトBMP−8、ヒトBMP−9、ヒトBMP 10、ヒトBMP−11、Drosophila 60A、Xenopus Vg−1、ウニUNIVIN、ヒトCDMP−1(マウスGDF−5)、ヒトCDMP−2(マウスGDF−6、ヒトBMP−13)、ヒトCDMP−3(マウスGDF−7、ヒトBMP−12)、マウスGDF−3、ヒトGDF−1、マウスGDF−1、ニワトリDORSALIN、dpp、Drosophila SCREW、マウスNODAL、マウスGDF−8、ヒトGDF−8、マウスGDF−9、マウスGDF−10、ヒトGDF−11、マウスGDF−11、ヒトBMP−15およびラットBMP3b。一般配列7と同様に、一般配列9は、C末端の6システイン骨格を収容する97アミノ鎖配列であり、一般配列8と同様に、一般配列10は、7システイン骨格を収容する102アミノ酸配列である。
【0099】
一般配列9
【0100】
【化6】
ここで、各Xaaは、以下のように規定される1つ以上の特定のアミノ酸の群から独立して選択される:「res.」は、「残基」を意味し、そしてres.1のXaa=(Phe、LeuまたはGlu)であり;res.2のXaa=(Tyr、Phe、His、Arg、Thr、Lys、Gln、ValまたはGlu)であり;res.3のXaa=(Val、Ile、LeuまたはAsp)であり;res.4のXaa=(Ser、Asp、Glu、AsnまたはPhe)であり;res.5のXaa=(PheまたはGlu)であり;res.6のXaa=(Arg、Gln、Lys、Ser、Glu、AlaまたはAsn)であり;res.7のXaa(Asp、Glu、Leu、AlaまたはGln)であり;res.8のXaa=(Leu、Val、Met、IleまたはPhe)であり;res.9のXaa=(Gly、HisまたはLys)であり;res.10のXaa=(TrpまたはMet)であり;res.11のXaa=(Gln、Leu、His、Glu、Asn、Asp、SerまたはGly)であり;res.12のXaa=(Asp、Asn、Ser、Lys、Arg、GluまたはHis)であり;res.13のXaa=(TrpまたはSer)であり;res.14のXaa=(IleまたはVal)であり;res.15のXaa=(IleまたはVal)であり;res.16のXaa=(Ala、Ser、TyrまたはTrp)であり;res.18のXaa=(Glu、Lys、Gln、Met、Pro、Leu、Arg、HisまたはLys)であり;res.19のXaa=(Gly、Glu、Asp、Lys、Ser、Gln、ArgまたはPhe)であり;res.20のXaa=(TyrまたはPhe)であり;res.21のXaa=(Ala、Ser、Gly、Met、Gln、His、Glu、Asp、Leu、Asn、LysまたはThr)であり;res.22のXaa=(AlaまたはPro)であり;res.23のXaa=(Tyr、Phe、Asn、AlaまたはArg)であり;res.24のXaa=(Tyr、His、Glu、PheまたはArg)であり;res.26のXaa=(Glu、Asp、Ala、Ser、Tyr、His、Lys、Arg、GlnまたはGly)であり;res.28のXaa=(Glu、Asp、Leu、Val、Lys、Gly、Thr、AlaまたはGln)であり;res.30のXaa=(Ala、Ser、Ile、Asn、Pro、Glu、Asp、Phe、GlnまたはLeu)であり;res.31のXaa=(Phe、Tyr、Leu、Asn、GlyまたはArg)であり;res.32のXaa=(Pro、Ser、AlaまたはVal)であり;res.33のXaa=(Leu、Met、Glu、PheまたはVal)であり;res.34のXaa =(Asn、Asp、Thr、Gly、Ala、Arg、LeuまたはPro)であり;res.35のXaa=(Ser、Ala、Glu、Asp、Thr、Leu、Lys、GlnまたはHis)であり;res.36のXaa=(Tyr、His、Cys、Ile、Arg、Asp、Asn、Lys、Ser、GluまたはGly)であり;res.37のXaa=(Met、Leu、Phe、Val、GlyまたはTyr)であり;res.38のXaa=(Asn、Glu、Thr、Pro、Lys、His、Gly、Met、ValまたはArg)であり;res.39のXaa=(Ala、Ser、Gly、ProまたはPhe)であり;res.40のXaa=(Thr、Ser、Leu、Pro、HisまたはMet)であり;res.41のXaa=(Asn、Lys、Val、ThrまたはGln)であり;res.42のXaa=(His、TyrまたはLys)であり;res.43のXaa=(Ala、Thr、LeuまたはTyr)であり;res.44のXaa=(Ile、Thr、Val、Phe、Tyr、MetまたはPro)であり;res.45のXaa=(Val、Leu、Met、IleまたはHis)であり;res.46のXaa=(Gln、ArgまたはThr)であり;res.47のXaa=(Thr、Ser、Ala、AsnまたはHis)であり;res.48のXaa=(Leu、AsnまたはIle)であり;res.49のXaa=(Val、Met、Leu、ProまたはIle)であり;res.50のXaa=(His、Asn、Arg、Lys、TyrまたはGln)であり;res.51のXaa=(Phe、Leu、Ser、Asn、Met、Ala、Arg、Glu、GlyまたはGln)であり;res.52のXaa=(Ile、Met、Leu、Val、Lys、Gln、AlaまたはTyr)であり;res.53のXaa=(Asn、Phe、Lys、Glu、Asp、Ala、Gln、Gly、LeuまたはVal)であり;res.54のXaa=(Pro、Asn、Ser、ValまたはAsp)であり;res.55のXaa=(Glu、Asp、Asn、Lys、Arg、Ser、Gly、Thr、Gln、ProまたはHis)であり;res.56のXaa=(Thr、His、Tyr、Ala、Ile、Lys、Asp、Ser、GlyまたはArg)であり;res.57のXaa=(Val、Ile、Thr、Ala、LeuまたはSer)であり;res.58のXaa=(Pro、Gly、Ser、AspまたはAla)であり;res.59のXaa=(Lys、Leu、Pro、Ala、Ser、Glu、ArgまたはGly)であり;res.60のXaa=(Pro、Ala、Val、ThrまたはSer)であり;res.61のXaa=(Cys、ValまたはSer)であり;res.63のXaa=(Ala、ValまたはThr)であり;res.65のXaa=(Thr、Ala、Glu、Val、Gly、AspまたはTyr)であり;res.66のXaa(Gln、Lys、Glu、ArgまたはVal)であり;res.67のXaa=(Leu、Met、ThrまたはTyr)であり;res.68のXaa=(Asn、Ser、Gly、Thr、Asp、Glu、LysまたはVal)であり;res.69のXaa=(Ala、Pro、GlyまたはSer)であり;res.70のXaa=(Ile、Thr、LeuまたはVal)であり;res.71のXaa=(Ser、Pro、Ala、Thr、AsnまたはGly)であり;res.72のXaa=(Val、Ile、LeuまたはMet)であり;res.74のXaa=(Tyr、Phe、Arg、Thr、TyrまたはMet)であり;res.75のXaa=(Phe、Tyr、His、Leu、Ile、Lys、GlnまたはVal)であり;res.76のXaa=(Asp、Leu、AsnまたはGlu)であり;res.77のXaa=(Asp、Ser、Arg、Asn、Glu、Ala、Lys、GlyまたはPro)であり;res.78のXaa=(Ser、Asn、Asp、Tyr、Ala、Gly、Gln、Met、Glu、AsnまたはLys)であり;res.79のXaa=(Ser、Asn、Glu、Asp、Val、Lys、Gly、GlnまたはArg)であり;res.80のXaa=(Asn、Lys、Thr、Pro、Val、Ile、Arg、SerまたはGln)であり;res.81のXaa=(Val、Ile、ThrまたはAla)であり;res.82のXaa=(Ile、Asn、Val、Leu、Tyr、AspまたはAla)であり;res.83のXaa=(Leu、Tyr、LysまたはIle)であり;res.84のXaa=(Lys、Arg、Asn、Tyr、Phe、Thr、GluまたはGly)であり;res.85のXaa=(Lys、Arg、His、Gln、Asn、GluまたはVal)であり;res.86のXaa=(Tyr、His、GluまたはIle)であり;res.87のXaa=(Arg、Glu、Gln、ProまたはLys)であり;res.88のXaa=(Asn、Asp、Ala、Glu、GlyまたはLys)であり;res.89のXaa=(MetまたはAla)であり;res.90のXaa=(Val、Ile、Ala、Thr、SerまたはLys)であり;res.91のXaa=(ValまたはAla)であり;res.92のXaa=(Arg、Lys、Gln、Asp、Glu、Val、Ala、SerまたはThr)であり;res.93のXaa=(Ala、Ser、Glu、Gly、ArgまたはThr)であり;res.95のXaa=(Gly、AlaまたはThr)であり;res.97のXaa=(His、Arg、Gly、LeuまたはSer)である。さらに、rBMP3bおよびmGDF−10のres.53の後にIleが存在し;GDF−1のres.54の後にTが存在し;BMP3のres.54の後にVが存在し;BMP−8およびDorsalinのres.78の後にGが存在し;hGDF−1のres.37の後にPro、Gly、Gly、Proが存在する。
【0101】
一般配列10(配列番号8)は、一般配列9(配列番号7)のすべてを含み、そしてさらに、そのN末端に以下の配列(配列番号9)
配列番号9
【0102】
【化7】
を含む。
【0103】
従って、残基6で始まって、一般配列10における各「Xaa」は、一般配列9に関して規定される特定のアミノ酸であり、一般配列9について記載される各残基番号は、一般配列10において5だけずれることが特徴である。従って、一般配列9における「res.1のXaa=(Tyr、Phe、His、Arg、Thr、Lys、Gln、ValまたはGlu)」は、一般配列10におけるres.6のXaaを指す。一般配列10において、res.2のXaa=(Lys、Arg、Gln、Ser、His、Glu、AlaまたはCys)であり;res.3のXaa=(Lys、Arg、Met、Lys、Thr、Leu、TyrまたはAla)であり;res.4のXaa=(His、Gln、Arg、Lys、Thr、Leu、Val、ProまたはTyr)であり;そしてres.5のXaa=(Gln、Thr、His、Arg、Pro、Ser、Ala、Gln、Asn、Tyr、Lys、AspまたはLeu)である。
【0104】
上記のように、本発明において有用な特定の現在好ましい骨形成ポリペプチド配列は、hOP−1の好ましい参照配列を規定するアミノ酸配列と、60%を超える同一性、好ましくは65%を超える同一性を有する。これらの特に好ましい配列としては、OP−1タンパク質およびOP−2タンパク質の、対立遺伝子改変体および系統発生対応物改変体(Drosophila 60Aタンパク質を含む)が挙げられる。従って、特定の特に好ましい実施形態において、有用な形態形成タンパク質としては、本明細書中で「OPX」と呼ばれる一般アミノ酸配列(配列番号4)内のポリペプチド鎖の対を含む活性タンパク質が挙げられ、この一般アミノ酸配列は、7システイン骨格を規定し、そしてOP−1およびOP−2の、いくつかの同定された改変体間のホモログを収容する。本明細書中に記載される場合、所定の位置の各Xaaは、マウスもしくはヒトのOP−1もしくはOP−2のC末端配列中の対応する位置に存在する残基から、独立して選択される。
【0105】
【化8】
ここで、res.2のXaa=(LysまたはArg)であり;res.3のXaa=(LysまたはArg)であり;res.11のXaa=(ArgまたはGln)であり;res.16のXaa=(GlnまたはLeu)であり;res.19のXaa=(IleまたはVal)であり;res.23のXaa=(GluまたはGln)であり;res.26のXaa=(AlaまたはSer)であり;res.35のXaa=(AlaまたはSer)であり;res.39のXaa=(AsnまたはAsp)であり;res.41のXaa=(TyrまたはCys)であり;res.50のXaa=(ValまたはLeu)であり;res.52のXaa=(SerまたはThr)であり;res.56のXaa=(PheまたはLeu)であり;res.57のXaa=(IleまたはMet)であり;res.58のXaa=(AsnまたはLys)であり;res.60のXaa=(Glu、AspまたはAsn)であり;res.61のXaa=(Thr、AlaまたはVal)であり;res.65のXaa=(ProまたはAla)であり;res.71のXaa=(GlnまたはLys)であり;res.73のXaa=(AsnまたはSer)であり;res.75のXaa=(IleまたはThr)であり;res.80のXaa=(PheまたはTyr)であり;res.82のXaa=(AspまたはSer)であり;res.84のXaa=(SerまたはAsn)であり;res.89のXaa=(LysまたはArg)であり;res.91のXaa=(TyrまたはHis)であり;そしてres.97のXaa=(ArgまたはLys)である。
【0106】
なお別の好ましい実施形態において、有用な骨原性活性タンパク質は、低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、または高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で、参照モルホゲン配列をコードするDNAまたはRNAにハイブリダイズする核酸によりコードされる配列を含むアミノ酸を含む、ポリペプチド鎖を有し、この参照モルホゲン配列は、例えば、OP−1、OP−2、BMP−2、BMP−4、BMP−5、BMP−6、60A、GDF−3 GDF−6、GDF−7などの保存された7つのシステインドメインを規定するC末端配列である。本明細書中で使用される場合、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、37℃で一晩、40%ホルムアルデヒド、5× SSPE、5×デンハート溶液、および0.1% SDS中での、公知技術に従うハイブリダイゼーション、ならびに50℃での0.1× SSPE、0.1% SDS中での洗浄として、規定される。標準的ストリンジェント条件は、市販の標準的分子クローニングの教科書中に十分に特徴付けられている。例えば、Molecular Cloning A Laboratory Manual、第2版、Sambrook、FritschおよびManiatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press:1989);DNA Cloning、第I巻および第II巻(D.N.Glover編、1985);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編、1984):Nucleic Acid Hybridization(B.D.HamesおよびS.J.Higgins編.1984);ならびにB.Perbal、A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)(これらの開示は、本明細書中で参考として援用される)を参照のこと。
【0107】
上記のように、本発明において有用なタンパク質は、一般的に、上記のポリペプチドのフォールディングされた対を含む、ダイマータンパク質である。そのような形態形成タンパク質は、還元された場合に不活性であるが、酸化ホモダイマーとして活性であり、本発明の他のものと組み合わせて酸化された場合に、ヘテロダイマーを生じる。従って、形態形成活性タンパク質中の形態形成ポリペプチドのフォールディングされた対のメンバーは、上記の特定のポリペプチドのいずれかから独立して選択され得る。
【0108】
本発明の材料および方法において有用な骨形成タンパク質としては、上記のポリペプチド鎖のいずれかを含むタンパク質(天然に存在する供給源から単離されたか、組換えDNA技術もしくは他の合成技術により生成されたかに、関わらない)が挙げられ、そしてこれらのタンパク質の対立遺伝子改変体および系統発生対応物改変体、ならびにそれらのムテイン、ならびに種々の短縮構築物および融合構築物が挙げられる。欠失変異体または付加変異体もまた、活性であると想定され、そのような変異体としては、保存的C末端6システインドメインまたは7システインドメインを変更し得る変異体であって、但し、その変更が、フォールディングされた構造においてこれらのシステインの関係を機能的には破壊しない、変異体が挙げられる。従って、そのような活性形態は、本明細書中に開示される特に記載された構築物の等価物であると見なされる。それらのタンパク質としては、種々のグリコシル化パターンを有する形態、種々のN末端を有する形態、アミノ酸配列相同性の領域を有するあるファミリーの関連タンパク質、および宿主細胞において組換えDNAの発現により生成されたネイティブタンパク質もしくは生合成タンパク質の活性短縮形態もしくは活性変異形態が挙げられ得る。
【0109】
本明細書中に企図される骨形成タンパク質は、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞において、インタクトなcDNAもしくは短縮型cDNAまたは合成DNAから発現され得、そして精製され得、切断され得、リフォールディングされ得、そして形態形成活性組成物を形成するように二量体化され得る。現在好ましい宿主細胞としては、限定はしないが、原核生物(E.coliを含む)または真核生物(酵母細胞または哺乳動物細胞(例えば、CHO細胞、COS細胞もしくはBSC細胞)を含む)が、挙げられる。当業者は、他の宿主細胞が都合良く使用され得ることを理解する。本発明の実施において有用な骨形成タンパク質の詳細な説明(その骨形成タンパク質の生成方法、使用方法、および骨原性活性について試験する方法を含む)が、多数の刊行物(米国特許第5,266,683号および同第5,011,691号を含む)(それらの開示は、本明細書中に参考として援用される)ならびに本明細書中にて引用される刊行物のいずれか(それらの開示は、本明細書中に参考として援用される)に開示されている。
【0110】
従って、本開示および当該分野において利用可能な知識を考慮すると、遺伝子工学の当業者は、種々の異なる生物学的種のcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーから、適切なアミノ酸配列をコードする遺伝子を単離し得るかまたはオリゴヌクレオチドからDNAを構築し得、その後、その遺伝子またはDNAを、種々の型の宿主細胞(原核生物および真核生物の両方を含む)において発現させて、哺乳動物における軟骨性骨形成を刺激可能である大量の活性タンパク質を生成し得る。
【0111】
(形態形成タンパク質刺激因子(MPSF))
本発明に従う形態形成タンパク質刺激因子(MPSF)は、形態形成タンパク質が前駆細胞からの組織形成を誘導する能力を刺激可能である因子である。このMPSFは、この形態形成タンパク質による組織誘導に対して付加的効果を有し得る。好ましくは、このMPSFは、この形態形成タンパク質による組織誘導に対して相乗効果を有し得る。
【0112】
本発明の形態形成タンパク質により増殖および/または分化するように誘導される前駆細胞は、好ましくは、哺乳動物細胞である。前駆細胞としては、哺乳動物の軟骨芽細胞、筋芽細胞、骨芽細胞、神経芽細胞、および血管組織前駆細胞、それらの発生初期前駆体すべて、ならびにそれらから発生する細胞すべて(例えば、軟骨芽細胞、プレ軟骨芽細胞、および軟骨細胞)が、挙げられる。しかし、形態形成タンパク質は、進化の間に高度に保存されており、非哺乳動物前駆細胞もまた、同じ種または交差種の形態形成タンパク質およびMPSFの組み合わせによって刺激される可能性がある。従って、有害な免疫学的反応を引き起こすことなくヒト中に異種細胞を移植するための計画が利用可能になった場合は、本明細書中に示される手順に従って形態形成タンパク質およびMPSFによって刺激される非哺乳動物前駆細胞が、ヒトにおける組織再生および組織修復のために有用である。
【0113】
1つ以上のMPSFが、誘導されることが所望される組織型、および形態形成タンパク質およびMPSFが投与される部位に従って、1つ以上の形成タンパク質とともに使用するために選択される。形態形成タンパク質/MPSFの組み合わせの特定の選択およびそれらが組み合わされる相対濃度は、本明細書中に記載される手順を使用して、選択された処置部位で誘導される組織型を最適にするために系統的に変化され得る。
【0114】
本発明の好ましい形態形成タンパク質刺激因子(MPSF)は、ホルモン、サイトカイン、および増殖因子からなる群より選択される。骨形成タンパク質とともに骨形成および/または軟骨形成を誘導するために最も好ましいMPSFは、インスリン様増殖因子I(IGF−1)、エストラジオール、線維芽細胞増殖因子(FGF)、成長ホルモン(GH)、成長および分化因子(GDF)、ヒドロコルチゾン(HC)、インスリン、プロゲステロン、副甲状腺ホルモン(PTH)、ビタミンD(1,25−(OH)2D3)、レチノイン酸およびインターロイキン(特に、IL−6)からなる群より選択される、少なくとも1つの化合物を含む。
【0115】
本発明の別の好ましい実施形態において、このMPSFは、別のMPSFの生物活性を増加可能である、化合物または因子を含む。MPSFの生物活性を増加させる因子としては、例えば、そのMPSFの合成、半減期、他の生体分子(例えば、結合タンパク質およびレセプター)との反応性またはバイアベイラビリティを増加させる、因子が挙げられる。これらの因子は、ホルモン、増殖因子、ペプチド、サイトカイン、キャリア分子(例えば、タンパク質または脂質)、またはこのMPSFの発現もしくは安定性を増加させる他の因子を包含し得る。
【0116】
例えば、選択されたMPSFがIGF−Iである場合、IGF−Iの生物活性を増加させる薬剤としては、GH、PTH、ビタミンDおよびcAMPの誘導物質が挙げられ、これらは本発明に従うMPSFとして機能し得る。さらに、ほぼ全ての循環中のIGF−Iおよびほぼ全ての細胞外空間は、IGF−Iの生物活性を増加または阻害し得る、高い親和性で結合するIGFBPと呼ばれるタンパク質の群により結合される(例えば、JonesおよびClemmons、Endocrine Reviews、16、第3〜34頁(1995))。従って、IGFBPのレベルを変化させ、その結果生物活性なIGF−I濃度を限界まで増加させる、IGFBPおよび薬剤もまた、本発明に従ってMPSFとして機能する。
【0117】
IGF−I生物活性を増加させるこれらの薬剤または他の薬剤は、初期のMPSFとして単独で使用されるか、または1つ以上の薬剤が、IGF−Iと組み合わせて、付加的なMPSFとして使用されて、形態形成タンパク質の組織誘導活性を刺激し得る。軟骨および骨の形成のための少なくとも2つのMPSFを含む、1つのこのような好ましい組み合わせは、骨形成タンパク質のOP−1、IGF−IおよびPTHである。
【0118】
好ましくは、このMPSFは、哺乳動物において、形態形成タンパク質の組織誘導活性を相乗的に刺激し得る量で存在する。哺乳動物に投与される場合に、最適に組織形成を誘導する、形態形成タンパク質およびMPSFの相対濃度は、本明細書中に記載した手順を使用して、当業者によって経験的に決定され得る。
【0119】
(移植デバイス)
本発明はまた、骨の形成、再生および修復を促進するための移植デバイスにも関する。この移植デバイスは、本発明の多孔性β−TCP材料、および必要に応じて少なくとも1つの生物活性剤を含む。
【0120】
多孔性β−TCP材料を含む移植デバイスは、遊走性の前駆体細胞を集合させるための一時的な足場および基層として、そしてそれら細胞のその後の固着および増殖のための基点として役立つ。
【0121】
好ましい実施形態において、移植デバイスは、多孔性β−TCPマトリクスおよび生物活性剤を含み、この生物活性剤はマトリクス中で分散または吸収される。生物活性剤としては、骨形成タンパク質、増殖因子(例えば、EGF、PDGF、IGF、FGF、TGF−αおよびTGF−β)、サイトカイン、MPSF、ホルモン、ペプチド、脂質、栄養剤および治療的組成物(抗生物質および化学治療剤を含む)、インスリン、化学誘引物質、化学走化性因子、酵素、酵素阻害剤が挙げられ得るが、これらに限定されないことが想定される。また、ビタミン、細胞骨格物質、自家移植片、同種移植片、軟骨断片、生細胞(例えば、軟骨細胞、骨髄細胞、間葉幹細胞)、組織移植片、免疫抑制剤のような生物活性剤が、多孔性β−TCPに添加され得ることが想定される。
【0122】
多孔性β−TCPマトリクスは、生物活性剤に徐放性送達システムおよび支持システムを提供し、この生物活性剤は、マトリクス材料が徐々に吸収されるので、移植部位で長期に渡って放出される。好ましい実施形態において、生物活性剤は生分解性剤中にカプセル充填される。生分解性剤の吸収および生物活性剤の徐放は、徐放性の放出システムを提供する。生物活性剤の送達の用量および速度は、多孔性マトリクスの性質、生分解性剤の性質、および生分解性剤中にカプセル充填される生物活性剤、多孔性マトリクスおよび生分解性剤間の結合相互作用の性質に基づいて、制御され得る。好ましい実施形態において、この生物活性剤は、骨形成タンパク質、またはBMPをコードする核酸分子である。最も好ましい実施形態において、そのBMPはOP−1である。
【0123】
好ましい実施形態において、生物活性剤はBMPである。より好ましい実施形態において、そのBMPはOP−1である。多孔性β−TCPマトリクスは、BMPおよびMPSFを非特異的なタンパク質分解から保護し得、そして組織成長の間に前駆体細胞の誘導に関係する細胞応答の各々の段階を調節し得る。
【0124】
研究により、マトリクスおよび形態形成タンパク質を組み合わせる方法論が、組織誘導を上手く達成することに役割を果たすことが示されている。特定の組み合わせおよび特定の組織細胞型に関する、形態形成タンパク質対MPSFの最適な割合は、当業者に経験的に決定され得る。より多くの量は、広範な移植について使用され得る。マトリクス中にBMPおよびMPSFを処方するために使用される手順は、タンパク質およびマトリクスの両方の物理的状態および化学的状態に対して感受性である。
【0125】
多孔性β−TCPを用いた好ましい骨原性デバイスにおいて、骨原性タンパク質は、マトリクスから出て移植部位中へと拡散して、そして細胞の流入および流出を可能とする。原性タンパク質は前駆体細胞が分化および増殖することを誘導する。前駆体細胞は、マトリクス中へと遊走し得、そして分化した細胞は多孔性マトリクスから出て移植部位中へと移動し得る。骨マトリクス/原性タンパク質の移植片の境界面におけるその後の細胞反応としては、以下が挙げられる:移植されたマトリクスとのフィブリンおよびフィブロネクチンの結合、間葉細胞の遊走および増殖、前駆体細胞の軟骨芽細胞への分化、軟骨形成、軟骨の石灰化、血管侵入、骨形成、再造形、および骨髄分化。多孔性β−TCP材料を有する好ましい骨原性デバイスが、様々な整体外科手順、歯周手順および再構築手順において、骨形成に適用され得る。
【0126】
移植デバイスはまた、生物活性剤および/または多孔性β−TCP材料との混合物において、結合剤も含み得る。この結合剤を添加して成形可能なパテを形成し、このパテは、欠損部位に適合させて、そして新生組織の形態をとるように造形され得る。成形可能なパテの組成物が、周囲の組織または寸断された(masticated)筋肉によって場所が保持され得る。組織欠損にまたがり、そして新生組織の所望される形態をとるように、マトリクスを造形することが好ましい。例えば、非接合型欠損についての骨修復の場合、非接合部にまたがる範囲を使用することが望ましい。ラットの研究により、新生骨は、本質的に移植されたデバイスの範囲を有するように形成されることが示される。従って、この材料は、皮下移植または筋肉内移植に対して使用され得る。骨形成の進行において、この材料は生体に徐々に吸収されて、そして移植片の形状で、または移植片に非常に近い形状で、骨に置き換えられる。
【0127】
(プロテーゼデバイス)
本発明の多孔性β−TCP材料が、プロテーゼデバイスにおいて使用され得ることもまた、企図される。プロテーゼデバイスは、哺乳動物の標的組織に隣接して移植され得る、表面領域、および表面領域上に配置される組成物を含む。プロテーゼデバイスは、処置される哺乳動物における、整体外科的な欠損、損傷または奇形を補修することに有用である。好ましくは、哺乳動物はヒト患者である。プロテーゼデバイスは、金属、セラミックまたはポリマーの複合体材料を含む材料から作製され得る。好ましいプロテーゼデバイスは、Co−Cr−Mo合金、チタン合金およびステンレス金属から選択される、負荷を受けるコアを含む。好ましいプロテーゼデバイスは、股関節部デバイス、融合ケージ(fusion cage)および顎顔面デバイスからなる群より選択される。
【0128】
この組成物は、本発明のβ−TCP材料および、必要に応じて、多孔性β−TCP中に分散した生物活性剤または結合剤からなる群から選択される1つ以上の薬剤を含む。好ましい実施形態において、生物活性剤は生分解性剤でカプセル充填される。好ましい実施形態において、生物活性剤は、BMP(より好ましくはOP−1である)またはBMPをコードする核酸である。骨原性タンパク質に覆われたプロテーゼデバイスは、人工器官と存在する骨との間の結合強度を増強させ得る(Ruegerら、米国特許第5,344,654号、本明細書中で参考として援用される)。この組成物は、合成により構築された骨材料のための(例えば、人工股関節部、疾患の骨の置換え、欠損の補正または歯の固着のための)コーティングとして作用する。この組成物は、増強された組織成長を移植片の表面中へと促進させるのに十分な量で、移植片の表面上に配置される。増強された組織成長を促進するために十分な組成物の量は、Ruegerら、米国特許第5,344,654号(本明細書中で参考として援用される)において記載されるバイオアッセイを使用して、当業者により経験的に決定され得る。好ましくは、動物研究を実施して、ヒト患者において同様のプロテーゼデバイスを使用する前に、組成物の成分の濃度を最適化する。
【0129】
別の好ましい実施形態において、組成物は、腰、膝、肘および他の関節において全関節形成の臨床手順に適用され、ここで、疾患のまたは損傷した生来の関節を、義装関節で置き換える。例えば、全股関節形成において、寛骨臼杯(acetabular cup)は、生来の寛骨臼を置換するために、骨盤の寛骨臼窩(acetabular socket)において、この組成物が挿入される。この杯は、組成物により位置が保持され、そして固定ネジにより締め付けられる。一般的に、空洞または窩は、寛骨臼杯の外側表面に適合する。この組成物はまた、全関節更新外科手術にも適用されて、関節プロテーゼデバイスと骨との間の結合を強化する。
【0130】
なお別の好ましい実施形態において、この組成物は椎骨形成(vertebroplasty)と呼ばれる臨床手順に適用される。この組成物を椎骨体の内部へと注入する。この方法を骨粗鬆症の処置に使用して、骨密度を増加させる。
【0131】
好ましい実施形態において、プロテーゼデバイスは、融合ケージ、合わせ釘、および本発明の組成物を含むための体内融合のような、ポケットまたはチャンバーを有する他のデバイスからなる群から選択される。好ましくは、椎体間融合デバイスは、チタン、PEEK(ポリ(エーテルエーテルケトン))および同種移植片からなる群から選択される材料から生産される。頚部、胸部および腰部の脊椎における椎体間融合は、前方または後方からのアプローチを介して施行される。あるいは、本発明の組成物は、椎体間融合を達成するために関連椎体間デバイスを用いずに使用され得る。
【0132】
脊椎の融合ケージを、損傷した脊椎の椎間板の除去後に残る椎骨内空間中に設置して、局所的動作を排除してそして椎骨の椎骨質融合に関係する。米国特許第5,015,247号(本明細書中で参考として援用される)において記載されるように、この融合ケージは円柱状の中空のメンバーの形状であり、融合される2つの隣接した椎骨間の空間よりも大きな外径を有する。円柱状の中空の移植片中の内部空間は、本発明の組成物で満たされ得る。この円柱状の移植片はまた、ネジ山の外側を含み、隣接の椎骨において形成された穿刺孔中にネジ込み挿入(threaded insertion)を可能とする。あるいは、いくつかの融合移植片は、椎間板内の空間中に嵌入されるよう設計されている。米国特許第6,146,420号(本明細書中で参考として援用される)において記載されるように、この融合デバイスは、不可欠な中央成分を有する、向かい合った末端部分を含む。この中央成分は、ずっと小さな直径を有し、そのため融合デバイスは中央成分の周囲に環状のくぼみを形成する。本発明の組成物は、向かい合った末端部分の間の環状のくぼみ中に配置され得る。
【0133】
好ましい実施形態において、プロテーゼデバイスは、骨および椎間板靱帯の(discoligamentous)不安定性を補修するために使用され得る。本発明の組成物は、椎骨内の領域に適用されて、その結果、優れた融合を生じ得、そして結果として1回の背部のアプローチを介して損傷した運動セグメントの最終的な安定化を達成し得る。この適用は、胸腰の脊椎(thoracolumbar spine)の骨折のための2回目の手術(この手術は、現在では、しばしば必要とされるが付加的に高い危険性を伴う)を受ける必要性を除き得る。また、この方法は、自己海綿骨移植と関連される問題を回避し、そして高い罹患率の自己海綿骨移植の関連される危険性を回避し得る。Ruegerら、Orthopade、27、第72〜79頁(1998)を参照のこと。
【0134】
別の好ましい実施形態において、プロテーゼデバイスは顎顔面デバイスである。顎顔面デバイスは、癌の外科手術、事故、先天的な奇形に起因する、顔面の欠損を外観上修正するために適用される。咀嚼器官の欠陥を回復するためには、最低限の骨重量を有する患者は、最初に本発明の組成物を用いて処置されて外科手術部位を充填および増加させる。顎顔面の固着システムおよび伸延システムを、米国特許第5,899,940号(本明細書中で参考として援用される)において例示されるように適用して、存在する骨質を増加させ得る。顎顔面の骨移植部位に対して、組織片および合成膜を保存するために、固定デバイス(例えば、標準的なネジ山のついた骨ネジおよび単純なピンポイント(pin point)びょうまたは自動固定式かつネジ山式の骨びょうネジデバイス(米国特許第5,971,985号、本明細書中で参考として援用される))を使用する。一旦その部位が治癒すると、2回目の外科手術を実施して、適切な長さの骨内部の(endosseous)歯の移植片を挿入し、そして咀嚼機能を回復する。
【0135】
本発明はまた、本発明の移植可能なプロテーゼデバイスの、哺乳動物の標的組織中へのインビボ組み込みを促進する方法を提供し、以下の工程を含む:a)プロテーゼデバイスの表面上に、多孔性β−TCP材料、必要に応じて、少なくとも1つの生物活性剤または結合剤を含む組成物を提供する工程、ならびにb)このデバイスを、標的組織およびプロテーゼデバイスの表面が、標的組織とそのデバイスとの間の組織成長を可能とする十分な時間の間に、少なくとも部分的に接触した状態で維持される位置にて、哺乳動物に移植する工程。
【0136】
(骨形成の誘導および送達の方法)
本発明はまた、哺乳動物において骨形成を誘導する方法を提供する。好ましくは、その哺乳動物はヒトの患者である。この方法は、哺乳動物の欠損部位に、本発明の多孔性β−TCPを含む組成物を移植する工程を包含する。好ましい実施形態において、その組成物はさらに結合剤および/または生物活性剤を含み得る。その欠損は軟骨内欠損、骨軟骨欠損または分節欠損であり得る。この方法は、非接合性骨折;骨空洞;腫瘍切除;新たな骨折(粉砕または非粉砕);頭蓋、顎顔面および顔面の奇形(例えば、顔面骨の再構築、特に、眼窩底再構築における奇形)、歯槽堤または歯槽湾曲部(alveolar sinus)の増強、歯周部欠損および歯抜去ソケット;頭蓋形成、おとがい形成、顎増強、口蓋再構築、および他の大規模な骨の再構築;椎骨形成(vertebroplasty)、頚部、胸部および腰部の脊椎における椎体間融合、ならびに胸部および腰部の脊椎における後方側面融合(posteriolateral fusion);骨再生に関する骨髄炎において;四肢融合、足根関節融合、全体的な股関節部、膝および関節の融合または関節形成;腱および/または靭帯の組織欠損の修正(例えば、前方、後方、側方および内側の膝靭帯)、膝蓋骨およびアキレス腱、など、ならびに癌、関節炎(変形性関節炎を含む)に起因する、それらの欠損、ならびに骨軟骨炎(osteochondritis dessican)のような、他の骨変性障害、に適用されるが、これらに限定されない。この方法は、骨増強、骨補てつ、硬組織移植、骨の足場、固定システム(例えば、ネジ、縫合糸、縫合留め具、ステープル(staple)、外科手術のびょう、クリップ、プレートおよびネジ)において、使用され得る。
【0137】
本発明はまた、骨形成を必要とする部位に生物活性剤を送達する方法を提供し、この方法は、哺乳動物の欠損部位に多孔性β−TCPおよび生物活性剤を移植する工程を含む。生物活性剤を送達する方法は、さらに結合剤を含む。好ましい実施形態において、この生物活性剤は生分解性剤でカプセル充填される。好ましい実施形態において、この生物活性剤は、骨形成タンパク質ファミリーに属する。別の好ましい実施形態において、生物活性剤は、BMPをコードする配列を含む核酸分子である。好ましくは、この核酸はキャリアにトラップされる。なお別の実施形態において、生物活性剤は、BMPをコードする核酸でトランスフェクトされた、骨細胞または細胞である。別の好ましい実施形態において、この生物活性剤の送達は、徐放性放出である。好ましくは、生分解性剤は、生体適合性かつ非免疫原性のポリマーであり、より好ましくは、PLGAである。生物活性剤は、好ましくはOP−1である。生物活性剤の放出速度は、PLGAの分子量を変化させることにより、制御され得る。PLGAの分解は、水分がセメントマトリクスに浸透して長いポリマー鎖を加水分解して短い水溶性フラグメントにする場合に、開始する。この結果、PLGAの物理的特性を損なわずにPLGAの分子量の減少が生じる。次第に、このポリマーはさらに浸食されて、そのポリマーの崩壊へと導き、それによって生物活性剤を放出する。例えば、10kD〜30kDのPLGAの場合、OP−1についての放出速度は1週間〜6週間である。
【0138】
本発明はまた、軟骨形成に必要とされる部位に生物活性剤を送達する方法を記載し、この方法は哺乳動物の欠損部位に生物活性剤および生分解性剤を含む組成物を移植する工程を包含し、ここで生物活性剤は生分解性剤中にカプセル充填される。好ましくは、生物活性剤はOP−1であり、生分解性剤はPLGAである。
【実施例】
【0139】
(実施例1:リン酸三カルシウムの調製)
石灰(酸化カルシウム水和物)のスラリーを調製して、そしてスラリーを一定に攪拌して、希釈したリン酸をそのスラリーに滴下する。酸化カルシウム対リン酸のモル比率は、3:2である。その生成物の特徴を、X線回折により評価して、そして必要な場合、その比率に調整を施す。生じたスラリーを噴霧乾燥により回収する。スラリーをフィルター濾過により回収する場合、乾燥したケーキをアモルファスTCPの微細な粉末まで粉砕する。好ましくは、アモルファスTCPの粒子径は10μmよりも小さい大きさである。
【0140】
(実施例2:β−TCP顆粒の調製)
TCP粉末を、ポリスチレンビーズ(NUNC A/S−Denmark)(0〜160μmビーズ)と混合した。10% ポリビニルピロリドン(PVP)顆粒化溶液を、溶液が透明になるまで、ビーカーまたはフラスコ中にPVP C−30(Plasdone C−30,ISP technologies ロット番号TX60810)を、水を攪拌しながら少量ずつ添加することによって調製した。約37mlの10% PVP溶液を、5mlずつTCP混合物に添加して、脆い塊を形成した。表1に例示するように、混合物を、異なる割合の細孔形成ビーズおよびTCPにより調製した。
【0141】
【表1】
この脆い塊を、振動運動下で500μm未満、500〜1000μm、または1000〜1700μm篩に通過させて、対応する粒子サイズ範囲を有する湿潤顆粒を生成した。この篩を通した材料を、105℃にて2〜3時間、真空下で乾燥させた。
【0142】
次いで、乾燥させた顆粒を、燃焼サイクル(burn off cycle)に供して、細孔形成材料を蒸発/炭化処理(carbonize)し、引き続き、1150℃にて焼結させた。18時間かけて温度を39℃から300℃に上昇させ、1時間にわたり300℃に保持し、18時間かけて700℃に上昇させ、2時間にわたり700℃に保持し、6時間かけて1150℃に上昇させ、6時間にわたり1150℃に保持し、6時間かけて、ゆっくりと39℃まで冷却した。焼結サイクルの後、得られた材料を、X線回折により多孔性結晶β−TCPであることを確認した。
【0143】
37.5% w/w,500〜1000μmの焼結した顆粒を、再度篩に通して、結合剤(カルボキシメチルセルロースナトリウム)と混合して、成形可能なパテを形成した。このパテ混合物を、異なる割合のβ−TCPおよびCMCにより形成した。β−TCPおよびCMCの全ての組み合わせは、適切な接着特性を有するパテを生じ、過剰な水中で壊れなかった。このパテの粘着性は、CMCの割合が増大するにつれて増した。β−TCP/CMCが1:0.4(w/w)のパテは、取り扱いに関する最良の特性を示した。種々のサンプルのレオロジー特性を決定した。
【0144】
(実施例3:骨誘導のためのラットモデルバイオアッセイ)
このアッセイは、エーテル麻酔下でのレシピエントラットの皮下部位におけるサンプルの移植からなる。雄性Long−Evansラット(28〜32日齢)を使用し得る。無菌条件下で胸郭領域の皮膚に垂直切開(1cm)を作製し、ポケットを、鈍的剥離(blunt dissection)により調製した。約25mgの試験サンプルを、ポケットの深くに移植し、この剥離を、金属皮膚クリップを使用して閉じる。移植日を、実験の1日目とした。移植物を、その後の異なる時間(すなわち、12日、18日)にて除去した。従属栄養(heterotrophic)部位により、垂直向性部位の使用から生じる、あり得る不明確性を有さない骨誘導の研究が可能になる。
【0145】
骨の成長を、移植物のカルシウム含有量により生化学的に決定する。カルシウム含有量は、移植物中に形成された骨の量に比例する。従って、骨の形成は、ラットにおける移植物のカルシウム含有量を決定することにより計算され、「骨形成単位」として表す。ここで、1骨形成単位は、移植物の最大骨形成活性の1/2に必要なタンパク質の量である。インタクトな鉱物質除去されたラット骨マトリクスにより示される骨誘導は、このアッセイにおける比較目的のために、最大骨分化活性ととみなされる。
【0146】
(軟骨内骨形成の間の細胞事象)
首尾よい移植物は、タンパク質誘導性軟骨内骨発生の段階を通じて、制御された発達を示す。この段階は、以下を含む:(1)多形核白血球による一過性の浸潤;(2)間葉細胞移動および増殖;(3)軟骨細胞の出現;(4)軟骨マトリクス形成;(5)軟骨カルシウム沈着(calcification);(6)血管侵襲、骨芽細胞の出現、および新たな骨の形成;(7)破骨細胞の出現、骨の再構築および移植したマトリクスの分解;ならびに(8)小骨における造血性骨髄分化。ラットにおける時間経過は、添加されるOP−1の量を増大することにより加速され得る。1以上のMPSFの漸増量もまたこの時間経過を加速し得ることがあり得る。新たな骨の形状は、移植したマトリクスの形と同じになる。
【0147】
(組織学的評価)
移植物における骨形成の程度を決定するためには、組織学的切片化および染色が好ましい。移植物を、Bouins溶液中で固定し、パラフィン中に包埋し、そして6〜8μm切片に切断する。トルイジンブルーまたはヘマトキシリン/エオシンでの染色により、軟骨内骨の最終的な発生が明らかに示される。12日目の移植物は、通常、移植物が新たに誘導された骨を含むか否かを決定するに十分である。
【0148】
(生物学的マーカー)
アルカリホスファターゼ(AP)活性を、骨原性についてのマーカーとして使用し得る。この酵素活性を、移植物のホモジナイゼーション後に分光光度計により決定し得る。活性は、インビボで9〜10日にピークに達し、その後ゆっくりと減少する。組織学により骨発生を示さない移植物は、これらのアッセイ条件下では、アルカリホスファターゼ活性がほとんどないか、まったくない。このアッセイは、定量およびラットから移植物が除去された後に迅速に骨形成の予測を得るために有用である。あるいは、骨形成の量は、移植物のカルシウム含有量を測定することにより決定され得る。
【0149】
軟骨内骨または他の型の組織形成と相関する遺伝子発現パターンもまた、ノーザンブロット分析のような、当業者に公知の手順を使用してmRNAレベルを定量することによりモニターされ得る。このような発生的遺伝子発現マーカーを使用して、骨形成タンパク質/MPSF処置の後に、組織分化経路を介した発達を決定し得る。これらのマーカーとしては、骨芽細胞関連マトリクスタンパク質(例えば、プロコラーゲンα2(I)、プロコラーゲンα1(I)、プロコラーゲンα1(III)、オステオネクチン、オステオポンチン、ビグリカン、および骨再生に関してのアルカリホスファターゼ(例えば、Suvaら、J.Bone Miner.Res.,8,pp.379−88(1993);Benayahuら,J.Cell.Biochem.,56,pp.62−73(1994)を参照のこと))が挙げられる。
【0150】
(実施例4:骨修復のヒツジモデルバイオアッセイ)
骨格が成熟した雌性ヒツジを、この研究に含めた。3つの欠損を、各動物の左脛骨および右脛骨の両方について近位骨幹端の領域にドリルで作製した。欠損は、直径6mmであり、少なくとも10mmの深さであった。この欠損のサイズは、全ての試験動物で一貫していた。この欠損を、骨間線維脂肪骨髄の構造を維持するように作製した。この骨髄は、移植物材料間で障壁として働き、試験マトリクス材料の骨間の混合を防止する。表2に例示されるように、β−TCPパテI、β−TCPパテII、β−TCPパテIII、β−TCPパテIVおよびコラーゲンを、OP−1ありまたはなしで欠損部位にて試験した。OP−1は、β−TCP処方物中に直接添加したかまたはPLGA中にカプセル化したかのいずれかであった。表3は、OP−1がPLGA中にカプセル化される処方物の例を示す。各動物における6つの欠損部位のうち、試験物質を含まない1つの欠損部分を、コントロールとして使用した。
【0151】
3〜4インチの切開を、近位頸骨骨幹端に作製した。皮膚および下にある筋肉を切開して、骨膜を露出した。この骨膜に切込みを入れ、可能であれば、外科的な閉鎖のために、インタクトなままにした。3つの横断孔を骨幹端に作製した。第1の最も上にあるものは、頸骨の関節表面の約2cm下に作製した。欠損を、骨の長軸と合わせた線を形成するように作製した。移植物は、中心間を測定して、1.6cmの間隔を空けた。
【0152】
処置して4週間後および8週間後に材料を採取した。動物を、75〜100mg/kg IVのペントバルビタールで安楽死させた。近位頸骨を採取し、切断して、最適の組織固定を可能にした。標本を、10%中性緩衝化ホルマリン中で固定した。標本を、実現可能であれば、1つの標本中に全ての移植物部位を捕捉するように切断した。固定の後、標本を脱石灰化し、プラスチック中に包埋し、Exackt技術を使用して長手軸方向に切片を作製し、組織学的解釈のために適切な切片厚に挽いた。
【0153】
放射線写真評価(図9〜16,27および28)および組織学的評価(図1〜8)を、全ての移植部位に対して術後4週間および8週間に行った。3つの欠損全てを同時に画像化し、側方から円筒状欠損を見るために、前後の放射線写真を撮影した。定性的組織学的説明により、新たな骨形成、残りの移植物材料および病理学的応答の全ての証拠が同定された。各標本についての画像を記録し、骨形成、急性炎症および慢性炎症ならびに残りのマトリクスについてのスコアを示した。
【0154】
標本の取り扱い特性および止血特性を、移植のときに記録した。材料は、パテまたは顆粒形態から半固体円筒状の形態およびコンシステンシーの範囲であった。
【0155】
【表2】
【0156】
【表3】
(処方物取り扱い)
Lyophil 1およびLyophil 2(プラシーボ)を、2.5mlの再構成培地を1バイアルのLyophil(全ての成分を、使用時まで2〜8℃にて凍結保存した)に添加し、均一な(透明〜濁っている)ゲルが形成されるまで2分間にわたり穏やかに培地を振盪することにより再構成した。0.4mlの再構成したLyophilゲルを、多孔性β−TCPマトリクスにゆっくりと注意しながら添加した。細いスパチュラを利用して、多孔性β−TCPマトリクスをゲルと混合して、パテ様材料を形成した。
【0157】
0.3%(w/w)OP−1を使用してカプセル化したPLGAミクロスフィア(粒子サイズ75〜150μm,Alkermes,Inc.)を、多孔性β−TCPマトリクスと混合した。
【0158】
パテ材料を、直ぐに移植した。移植材料を、滅菌紙の折りたたんだ小片を使用して配置した。この紙を、試験材料で満たし、その部位において材料を連続して詰め込みながら、欠損へと試験材料を注ぎ込むために使用した。配置前の取り扱い特性および欠損部位における取り扱い特性を記録した。
【0159】
β−TCPパテI処方物、β−TCPパテII処方物、β−TCPパテIII処方物、β−TCPパテIV処方物を、顆粒状乾燥粉末として注いだ。ビヒクル溶液と一旦あわせると、これらのパテは、乾燥した脆い顆粒状の外観を有した。これらの処方物は、Lyophil溶液の全てを吸収した。これらの処方物を、スパチュラを使用して移植した。一旦移植部位に入れると、これらの材料は、血液と十分に混ざった。
【0160】
コラーゲン処方物を綿毛状の粉末として注いだ。これらが一旦ビヒクル溶液と混合されると、ざらざらとしたパテ状の外観を有した。この処方物は、移植部位中にシリンジを使用して容易に配置され得る。この移植部位は、血液と十分に混ざった。
【0161】
(組織学的結果)
近位頸骨切片は、3つの欠損を含んだ。これらの欠損は、厚みのある大きな切片にされた。その結果、この3つの欠損全てが、1つの切片に含められた。厚みのある切片の観察、臨床的アッセイ、およびこの切片のfaxitron X線に基づくと、この切片は、サンプルの代表であると考えられた。この方向により、欠損の上に重なる骨膜反応および試験材料に対する骨髄内応答の評価が可能になった。標本を、4週間および8週間の外植片から評価した(図1〜8)。1つの頸骨切片内の3つの欠損全ては、プラシーボまたはOP−1溶液のいずれかを受容した。プラシーボおよびOP−1インプラントのこの分離により、移植物材料の活性または不活性な生物学的性質の決定が容易になった。
【0162】
(OP−1およびプラシーボ移植物材料の4週間の評価)
4週間にて、β−TCPパテI(89A)は、全ての部位中に存在した(図3の中央部位および図2の遠位部位)。概して、このマトリクスは、有意に再吸収されず、活発な再吸収を受けることもなかった。OP−1で処置した部位は、いくらかの新たな骨形成を生じたが、顕著な骨形成は生じなかった(図3中央部位)。プラシーボで処置した部位は、皮質のレベルで骨形成を有した(図2遠位部位)。
【0163】
β−TCPパテII(89B)は、4週間で有意な量にてすべての部位に存在した(図3遠位部位および図1近位部位)。マトリクス再吸収の有意な証拠はなかった。OP−1処理した部位は、目立って皮質レベルおよび骨膜レベルで少量の新たな骨形成を生じた(図3遠位部位)。試験した4つのβ−TCPパテ処方物のうち、β−TCPパテIIは、他の3つの処方物より大きな炎症を生じた。異物巨細胞(FBGC)は、この炎症と関連して報告された。
【0164】
β−TCPパテIII(89C)は、4週間で、処置した6つの部位全てに有意な量にて存在した(図1中央部位および図4近位部位)。OP−1処置は、残りのマトリクス容積を顕著には変化させなかった。皮質レベルでの骨形成が、OP−1処置標本において存在し(図4近位部位)、プラシーボ処置した部位においてはあまり共通しなかった(図1中央部位)。OP−1処置とは無関係に、β−TCPマトリクスに応答した炎症は、ほとんどまたは全く観察されなかった。
【0165】
β−TCPパテIV(89F)は、4週間にて、処置した6つの部位全てに有意な量にて存在した(図1遠位部位および図4中央部位)。残りのマトリクス容積に対する効果は、OP−1処置により明らかではなかった。OP−1処置部位は、明らかな皮質および膜応答を伴うマトリクス全体を通じたより大きな骨形成を生じた(図4中央部位)。OP−1処置とは無関係に、β−TCPマトリクスに応答した炎症はほとんどまたは全く観察されなかった。
【0166】
(OP−1およびプラシーボで処置した移植物材料についての8週間の評価)
β−TCPパテI(89A)は、8週間で全ての部位に存在した(図7近位部位および図6遠位部位)。OP−1処置移植物は、概して、強い骨誘導応答の証拠を示した(図7近位部位)。2つのOP−1処置部位において、β−TCPマトリクスは、有意に分解されたようであった。OP−1で処置した部位は、骨髄腔内のマトリクスへの中程度の骨浸潤を伴って、皮質レベルで顕著な新たな骨形成活性を生じた。プラシーボ処置部位は、皮質のレベルにてあまり骨形成を生じなかった(図6遠位部位)。
【0167】
β−TCPパテII(89B)は、8週間で、有意な量にて全ての部位に存在した(図5近位部位および図7中央部位)。マトリクス再吸収の有意な証拠は存在しなかった。OP−1処置部位は、目立って、皮質および骨膜レベルならびに欠損部位における閉鎖にて少量の新たな骨形成を生じた(図7中央部位)。プラシーボ処置材料は、皮質レベルおよび皮質欠損のカルシウム粒子ブロック閉鎖にてあまり骨形成を生じなかった(図5近位部位)。この材料に応答して以前に認められた炎症は、明らかではなかった。
【0168】
β−TCPパテIII(89C)は、8週間で、処置した6つ全ての部位に有意な量にて存在した(図5中央部位および図7遠位部位)。OP−1処置は、残りのマトリクス容積を顕著に変化させなかった。皮質レベルにおける骨形成および顕著な骨膜応答は、OP−1処置標本において明らかであった(図7遠位部位)。OP−1処置とは無関係に、β−TCPマトリクスに応答した炎症は、ほとんどまたは全く観察されなかった。
【0169】
β−TCP パテ IV(89F)は、8週目に処理した6つの部位全てにおいて有意な量で存在した(図5、遠位部位、および、図8、近位部位)。いくつかの部位では、残りのマトリクスが他の部位よりも少なかった。一般に、OP−1処理は、残りのマトリクスの量に対して明らかな効果を有さなかった。OP−1処理した部位は、明らかな皮質応答および骨膜応答を有するより多い骨形成を、マトリクス全体にわたって生じた(図8、近位部位)。OP−1処理非依存的にβ−TCPマトリクスに反応する炎症は、ほとんど観察されないか、全く観察されなかった。
【0170】
(上記の結果の結論)
FBGC応答と結びついた急性炎症および慢性炎症を示したコラーゲンマトリクスと比較して、4回の多孔性β−TCP処方は、4週目および8週目に、炎症をほとんど生じないか、全く生じなかった。多孔性β−TCP材料におけるOP−1処理は、皮質レベルでの顕著な骨形成、および骨欠損閉鎖をしばしば生じる反応性の骨膜応答を一貫して示した。大きな顆粒(1〜2mm)β−TCP パテ IV処方によって、骨はマトリクスにより深く内殖し得るようであるが、小さな顆粒β−TCP パテにおいて観察されたものと比較してより大きな顆粒間空間が存在した。
【0171】
(パラフィン組織学研究)
粒子内および粒子周囲における骨形成に対する、インプラント材料の粒子サイズおよび多孔度の効果を評価するために、ヒツジモデルバイオアッセイからの組織を、パラフィン切片、ならびにヘマトキシリンおよびエオシンの染色を使用して評価した。
【0172】
近位部位、中位部位および遠位部位におけるインプラント部位を4匹の動物(138、299、297および295)から単離するために、脛骨標本を切片化した。これらの外移植片を、脱石灰し、パラフィンに包埋し、切片化して、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
【0173】
切片を、光学顕微鏡を使用して観察し、粒子サイズおよび多孔度の効果について判断した。骨形成において層状化した標本について、皮質レベルからの応答は、強固かつ深く、そしてこの応答は、髄質区画において適度であった。この層状化に起因して、骨内膜皮質から2〜3mmの深さのレベルまで伸長するレベルを評価した。
【0174】
4つのセラミック処方物の各々を、細孔における骨形成、および粒子をまたぐ骨架橋について評価した。隣接するストロマから粒子内に完全に単離された細孔を計数することによって、細孔における骨形成を評価した。明るくかつ概して丸い細孔を、計数した。細孔を計数する場合、骨を有したものと有さなかったものとの比を生成した。これを、細孔占有率(pore−fill)比と記す。
【0175】
その視野を走査することによって、細孔の計数を行った。少数の細孔を有する材料において、その視野を走査した場合に、その多数を計数した(図25)。多くの細孔を有する材料において、領域を計数し、そして新たな領域を観察し、次いで計数した(図26)。この領域の平均または総数を、比で示した。
【0176】
粒子間を架橋する骨を、0〜2とスコア付けした。隣接する粒子を骨が架橋しない場合、スコア0を粒子に付与した。少数の粒子の対が一貫して架橋を示した場合、スコア1を付与した。多くの粒子が生き生きした(vital)骨小柱によって連結された場合、スコア2を付与した。
【0177】
表4および5は、4週目でのプラシーボおよびOP−1についての細孔占有率比および骨架橋スコアを示す(図17〜20)。表6および7は、8週目でのプラシーボおよびOP−1についての細孔占有率比および骨架橋スコアを示す(図21〜24)。骨架橋は、β−TCP パテが37.5%(w/w)の細孔形成剤で作製されておりかつ0.5〜1mmのより小さな顆粒サイズを有することを、より表した(図4〜7)。細孔占有率比によると、25%(w/w)および37.5%(w/w)の細孔形成剤で作製されているβ−TCP パテが、概して等しかった。12.5%(w/w)の細孔形成剤で作製されているβ−TCPは、より低い孔占有率比を有した(図4〜7)。細孔占有率比は、粒子当たりより多くの細孔を有するより大きなサイズの粒子(1〜2mm)に起因して、89F処方物において、一貫してより高かった。小さな粒子(0.5〜1mm)と比較して、大きな粒子を架橋するためにより多くの骨が必要とされた事実に起因して、より大きな粒子において骨架橋はほとんど存在しなかった。
【0178】
【表4】
注釈:切片297R−Dは、動物297の右側(R)、遠位部位(D)由来である。切片297L−Pは、動物297の左側(L)、近位部位(P)由来である。切片297L−Mは、動物297の左側(L)、中央部位(M)由来である。切片297L−Dは、動物297の左側(L)、遠位部位(D)由来である。
【0179】
【表5】
注釈:切片295L−Mは、動物295の左側(L)、中央部位(M)由来である。切片295L−Dは、動物295の左側(L)、遠位部位(D)由来である。切片295R−Pは、動物295の右側(R)、近位部位(P)由来である。切片295R−Mは、動物295の右側(R)、中央部位(M)由来である。
【0180】
【表6】
注釈:切片299R−Dは、動物299の右側(R)、遠位部位(D)由来である。切片299L−Pは、動物299の左側(L)、近位部位(P)由来である。切片299L−Mは、動物299の左側(L)、中央部位(M)由来である。切片299L−Dは、動物299の左側(L)、遠位部位(D)由来である。
【0181】
【表7】
注釈:切片138L−Pは、動物138の左側(L)、近位部位(P)由来である。切片138L−Mは、動物138の左側(L)、中央部位(M)由来である。切片138L−Dは、動物138の左側(L)、遠位部位(D)由来である。切片138R−Pは、動物138の右側(R)、近位部位(P)由来である。
【0182】
(パラフィン組織学研究の結論)
β−TCP処方物について、細孔における骨形成は、空隙率が増加するにつれてより明らかとなる。細孔における骨形成は、37.5%の細孔形成物で作製される材料と比較して、12.5%の細孔形成物で作製される材料においてはほとんどなかった。骨形成は、より大きな粒子(1〜2mm)においてより明らかであるが、これらの大きさの粒子において骨架橋はほとんど観察されなかった。
【0183】
コラーゲン処方物は、骨形成を生じず、顕著な病原性応答を生じた。さらに、これらの処方物は、顕著なFBGCRおよび慢性線維性炎症(fibroinflammatory)応答を生じた。
【0184】
(実施例5:骨修復についてのネコモデルバイオアッセイ)
大腿骨切り術欠損(femoral osteotomy defect)を、外科的に調製する。さらなる介入なしに、シミュレートした骨折欠損は、一貫して非合併に進行する。作製した骨欠損へ移植した骨原性組成物およびデバイスの効果を、以下の研究プロトコルによって評価する。
【0185】
簡単には、手順は、以下のとおりである:16匹の成体ネコ(各々体重は10lbs.未満)は、側方外科アプローチを介して右大腿にて1cm骨欠損の一側性の調製物を受ける。他の実験において、2cmの骨欠損を作製し得る。大腿を、8穴プレートの側方配置によって即座に内部固定して、欠損の正確な寸法を保護する。異なる4つの型の材料を、外科的に作製したネコ大腿欠損に移植し得る:I群は、試験材料なしのネガティブコントロール群である;II群は、生物学的に活性な多孔性β−TCPで移植される;III群は、多孔性β−TCPおよび骨原性タンパク質で移植される;そして、IV群は、多孔性β−TCP、骨原性タンパク質およびMPSFで移植される。
【0186】
全ての動物を、術後にケージ内で適宜移動させる。全てのネコに、骨を標識するためにテトラサイクリン(皮下的に(SQ)25mg/kg、4週にわたって各週)を注射する。
【0187】
大腿および骨切り術部位の正確な前後野(anterio−posterior view)を一貫して生成するように設計されたクッション性のX線ジグ内に配置した、軽く麻酔した動物を、標準化したX線で撮影することによって、インビボでの放射性形態計測研究を、手術の4週後、8週後、12週後および16週後に即座に行った。全てのX線を、同一様式で正確に、各動物上の同一位で正確に、行う。骨修復を、無作為な点での分析による鉱化作用の関数として計算する。切除した骨の最終標本のX線撮影研究を、屠殺後の2つの平面で行う。
【0188】
切除した試験大腿および正常大腿を、骨デンシトメトリーによって即座に研究し得るか、または生理食塩水に浸した2層のタオルで包み、シールしたプラスチックバッグ中に配置し、さらなる研究まで−20℃で保存した。特別に設計した、Instron試験機械に連結した鋼製の4点曲げのジグで、欠損まで負荷をかけて、骨強度、硬度、吸収エネルギーおよび欠損までの変形を定量することによって、骨修復強度、欠損までの負荷(load−to−failure)および欠損までの労働(work−to−failure)を、試験する。試験大腿および正常大腿の研究は、ポンドで骨強度(負荷)を、そしてジュールで欠損までの労働を得る。正常大腿は、96(+/−12)ポンドの強度を示す。骨原性デバイスを移植した大腿の強度は、(「くびれた(hourglass)」形状の骨欠損修復に起因して)骨折の部位での表面領域について補正されるべきである。この補正によって、結果は、正常骨強度と蜜に相関するはずである。
【0189】
生物メカニカル試験に続いて、骨を、欠損部位で2つの縦断切片に即座にスライスし、秤量し、そして容量を測定する。蛍光染色取り込み評価を用いる標準的な石灰化した骨の組織形態学のために、2分の1を固定し、そして、脱石灰化したヘマトキシリン/エオシン染色組織学調製のために、2分の1を固定する。
【0190】
骨修復由来部位の切片化した標本を、0.15Mの冷NaCl、3mMのNaHCO3(pH9.0)中で、Spex Freezerミルによってホモジナイズする。次いで、上清のアルカリホスファターゼ活性、および沈殿物の酸可溶性画分の総カルシウム含量を測定する。
【0191】
(実施例6:骨修復についてのウサギモデルバイオアッセイ)
このアッセイは、Oppermannら、米国特許第5,354,557号に詳細に記載される。Cookら、J.of Bone and Joint Surgery,76−A、827〜38頁(1994)もまた参照のこと(これらは、本明細書中に参考として援用される)。1.5cmの尺骨非合併欠損を、X線で示された骨端閉鎖を有する、成熟した(10lbs未満)New Zealand Whiteウサギに作製する。この実験は、以下のような群当たり少なくとも8羽のウサギへのデバイスの移植を含み得る:I群 試験材料なしのネガティブコントロール移植;II群 多孔性β−TCPでの移植;III群 多孔性β−TCPおよび骨形成性タンパク質での移植;IV群 多孔性β−TCP、骨原性タンパク質およびMPSFの組み合わせでの移植。尺骨欠損を、各群のウサギにおいて8週の研究の全過程について追跡する。
【0192】
別の実験において、1.5cmの尺骨欠損の骨髄腔を、MPSFの存在下または非存在下での多孔性β−TCP中の活性化した骨原性タンパク質でパックする。骨を、介在様式で同種移植する。ネガティブコントロール尺骨は、8週目まで治癒されず、古典的な「象牙」の外観を示す。明瞭なコントラストにおいて、骨原性タンパク質/MPSF処理したインプラントは、4週目までX線撮影では「現れず」、6〜8週目までに再鉱化の開始する。これらの同種移植片は、8週目までに穏やかな増殖性骨形成を伴って両端で治癒する。この型のデバイスは、同種移植片修復を促進させるように働く。
【0193】
MPSFの存在下で骨原性タンパク質で処理したインプラントは、促進された修復を示し得るか、またはより低濃度の骨原性タンパク質の使用と同速度で機能し得る。上記するように、ウサギモデルをまた使用して、特定の骨原性タンパク質/MPSF組み合わせが局所骨形成を誘導し得る効率を試験し得、そしてその条件を最適化し得る。
【0194】
(実施例7:骨修復についてのイヌ尺骨欠損バイオアッセイ)
このアッセイを、Cookら、Clinical Orthopaedics and Related Research、301、302〜112頁(1994)(本明細書中に参考として援用される)に記載されるように本質的に行う。簡単には、尺骨セグメント化欠損モデルを使用して、35〜45kgの雄成犬における骨治癒を評価する。500mgの多孔性β−TCPを含む実験用コンポジットを、漸増濃度の、1つ以上の推定のMPSFの非存在下または存在下で、OP−1の量を変化させながら再構成する。任意の骨形成性タンパク質を、このアッセイにおいてOP−1の代わりに使用し得る。欠損部位での移植を行い、1つのキャリアコントロールならびにOP−1およびOP−1/MPSF組合わせの一連の実験を試験する。移植12週後にコンポジットを受けた動物の尺骨にて、機械的な試験を行う。術後12週または16週のいずれかで動物を屠殺するまで、毎週、前肢のX線撮影を得る。欠損部位および隣接する正常骨からの組織学的切片を分析する。
【0195】
1つ以上のMPSFの存在によって、イヌにおける骨修復速度が上昇し得る。1つ以上のMPSFの存在によってまた、同様または同一の結果を達成するために、コンポジット当たり低減した濃度の骨原性タンパク質を使用し得る。
【0196】
(実施例8:骨修復についてのサルの尺骨欠損および脛骨欠損バイオアッセイ)
この骨治癒アッセイを、Cookら、J.Bone and Joint Surgery、77A、734〜50頁(1995)(本明細書中に参考として援用される)に記載されるように、アフリカミドリザルにおいて本質的に行う。簡単には、2.0cm骨骨膜欠損を、尺骨体の中央に作製し、そして漸増濃度の、1つ以上の推定のMPSFの非存在下または存在下で、OP−1を含む多孔性β−TCP材料を含むインプラントで埋める。漸増濃度の、1つ以上の推定のMPSFの非存在下または存在下で、OP−1の量を変化させながら、多孔性β−TCP材料を含む実験用コンポジットを再構成し、そして脛骨の骨幹に作製した2.0cm 骨骨膜欠損を埋めるために使用する。任意の骨原性タンパク質を、このアッセイにおいてOP−1の代わりに使用し得る。欠損部位での移植を行い、1つのキャリアコントロールならびにOP−1およびOP−1/MPSF組合わせの一連の実験を試験する。コンポジットを受けた動物の尺骨および脛骨にて、機械的な試験を行う。欠損部位および隣接する正常骨からのX線撮影および組織学的切片を、Cockらに記載されるように分析する。
【0197】
1つ以上のMPSFの存在によって、サルにおける骨修復速度が上昇し得る。1つ以上のMPSFの存在によってまた、同様または同一の結果を達成するために、コンポジット当たり低減した濃度の骨原性タンパク質を使用し得る。
【0198】
(実施例9:ヤギモデルでの骨折治癒バイオアッセイ)
ヒツジでのこの骨折治癒アッセイを、本質的にBlokhiusら,Biomaterials,22,725−730頁(2001)(これは、本明細書中で参考として援用される)に記載されたようにして実施する。骨幹中部の閉鎖骨折(closed midshaft fraction)を、特注の三点屈曲デバイスを用いて、成体雌性ヤギの左脛骨に作製した。この骨折は、その脛骨の外側に配置された外固定装置で安定化される。3つの異なる型の物質を、注射を介してこのヤギの欠損部に移植する;第I群は、試験物質を有さないネガティブコントロール群である;第II群は、生物学的に活性な多孔性β−TCPを移植される;第III群は、多孔性β−TCPおよび骨形成性タンパク質を移植される;ならびに第IV群は、多孔性β−TCPおよびPLGA中にカプセル化された骨形成性タンパク質を移植される。試験物質を、骨折した隙間に配置する。機械的試験(四点非破壊性屈曲試験)を、2週間目および4週間目に、混合物を受容した動物において実施する。この機械的試験後、この骨折した隙間の前側、後側、側面、および内側の切片を切り出し、X線写真撮影および組織学的切断を実施する。
【0199】
(実施例10:ヒツジ腰椎の不安定な運動セグメントの融合アッセイ)
このアッセイは、骨および椎間板靭帯(discoligamentous)の不安定性の治癒を研究する。脊椎の運動セグメントは、一方が他方の上に横たわる2つの椎体、および椎間板から構成される、機能的単位である。
【0200】
1試験群は、12個体のヒツジからなる。2つのコントロール群(各々12個体のヒツジ)を使用する。全身麻酔の導入後、腰椎下部に外科手術領域を作製し、そしてこの動物をうつ伏せ位置に置く。腰椎下部の棘突起上に約12cm長の皮膚切開を作製する。皮下組織および筋膜の横切開(transsection)後、後部の筋肉を脇に移動させる。
【0201】
挿管麻酔を、1.5mlのキシラジン(Rompun(登録商標))の筋内注射によって適用する。さらなる投薬を、必要に応じて投与し得る。鎮静は、耳静脈への穿刺後に、静脈内留置カテーテルを配置することを必要とする。麻酔を、このカテーテルを通して、体重1kgあたり3〜5mgのチオペンタール(Trapanal(登録商標))を与えることによって導入する。気管内挿管後、この動物に、酸素(30%)、亜酸化窒素(笑気)およびイソフルラン(Isofluran(登録商標))を用いて通気する。外科手術全体を通して、0.2〜0.4mgの投薬量を有する鎮痛性のクエン酸二水素フェンタニール(Fentanyl(登録商標))を投与する。同時に、体重1kgあたり0.5mgの投薬量でアトラクリウムベシラート(atracurium besilate)(Atracurium(登録商標))を投与することによって、弛緩を達成する。
【0202】
腰椎体L4〜L6の椎弓根(pedicle)を完全に露出させた後、椎弓根L4およびL6の両側への器械使用を行う。これは、椎弓根において見出される直径に依存して、直径5mmまたは6mmの椎弓根スクリューを使用することによって実施される。その後、上方運動セグメントL4/L5の椎間板の両側の椎弓根横断的(transpedicular)除去を、椎弓根観察(pediculoscopic)制御下で、L5椎弓根に対して行う。罹患した椎体の終板は、剥ぎ取られる。
【0203】
試験サンプルの身体間(inter−corporal)および身体内適用を、試験群の全12個体のヒツジにおいて、椎弓根横断カニューレを介して行う。この試験サンプルは、種々の濃度の多孔性β−TCP、骨形成性タンパク質、またはPLGA中にカプセル化された骨形成性タンパク質を含む。12個体のヒツジからなる第1のコントロール群では、多孔性β−TCPのみを適用する。第2のコントロール群では、本発明の組成物の代わりに、自己の海綿質(spongiosa)を投与する。
【0204】
最後に、内固定を完全に導入する。内固定の型ならびに必要な器械使用および外科手術手順は標準化されており、そして当業者に周知である。ドレーンを配置し、そして創傷を、筋膜および浅在筋膜についての吸収性縫合糸ならびに皮膚ステープルを使用して閉鎖する。
【0205】
外科手術手順全体を行う間に、X線画像増幅器が、術中透視のために利用可能である。これは、上記工程を遂行する間に正確に方向を見極めることを容易にする。
【0206】
自己の海綿質を投与された12個体のヒツジの収集を、麻酔下で、以下のようにして行う:左腸骨稜皮膚および筋膜に、長軸方向に約8cm長の切開を作製することによって、切込みを入れる。殿部の筋肉を骨膜下で移動させ、そして骨切り術後に、海綿質移植片を腸骨稜から収集する。出血の制御およびドレーンの配置を、層における創傷の閉鎖に際して行う。この収集手順は標準化されており、そして当業者に公知である。
【0207】
(臨床的観察)
神経学的試験を毎日実施して、動物の歩行および術後に生じ得る神経学的欠損を評価する。手術による創傷を毎日、綿密に調べる。体重を、手術前および安楽死時に測定する。
【0208】
(X線分析)
評価する前に、腰椎を完全に新たに切開し、そして内固定を注意深く取り除く。手術した脊椎セグメントの前後方向および単純な横方向でのX線写真を、0週間目および8週間目に、ミリアンペア、キロボルトおよび秒数について一貫した条件下で取得して、融合評価を助ける。融合状態を、Lenkeら,J.Spinal Disord,5,433−442頁(1992)(本明細書中で参考として援用される)に記載された段階評価系を使用して評価する。この系によると、Aは、大きく固い柱状の両側性の融合塊を示し(明らかに固い);Bは、小さな対側性の融合塊を有する、大きく固い片側性の融合塊を示し(おそらく固い);Cは、見かけ上亀裂を有する、薄い両側性の融合塊を示し(おそらく固くない);そしてDは、移植片の両側性の吸収または明らかな両側性の偽関節を有する融合塊を示す(明らかに固くない)。
【0209】
さらに、コンピューター処理した断層撮影走査を実施して、横断面および矢状面再構成において、融合塊を評価する。各融合塊について、一貫した倍率およびX線条件下で、2ミリメートルの切片間隔および引き続いて矢状面における再構成を使用することによって、約40の連続的なコンピューター処理した断層撮影走査を作製する。
【0210】
(生体力学的試験)
各群の4つの検体を、生体力学的に評価する。X線分析後、靱帯および骨の構造を維持しつつ、注意深くすべての筋肉を取り出す。脊椎を−20℃で凍結させる。これらの各検体について、運動セグメントL4/L5の上部椎骨の上半分および下部椎骨の下半分を、ポリメチルメタクリレート(Technovit 3040;Heraeus Kulzer GmbH,Wehrheim/Ts,Germany)中に包埋する。次いで、各検体を固定し、そして非破壊性試験様式で、脊椎テスター(spine tester)において前負荷なしで試験する。交互の順序での屈曲/伸長、軸の右回転/左回転、および右側/左側の屈曲モーメントを、脊椎テスターのジンバルに組み込まれたステッパー電動機によって、1.7度/秒の一定速度で連続的に適用する。2回のプレサイクルを適用して、粘弾性応答における粘着性成分の影響を最少にし、そしてデータを、3サイクル目に収集する。運動、中立域および2つの剛性のパラメーターの範囲を、得られた負荷−変形曲線から決定する。
【0211】
(組織学/組織形態計測)
各群の8つの検体を、術後の2週間後、4週間後、または8週間後に組織学的に評価する。X線分析後、脊椎を10%ホルマリン溶液中で固定する。各々の検体の横断面を得て、骨の融合、細胞性反応、生体適合性、およびセメントの形成/分解の徴候を評価する。手術部位での融合塊の質的な組織学的評価を、巨細胞、炎症細胞、または移植された物質がカプセル化され得る箇所での繊維性応答の存在について下す。さらに、小柱状の融合塊において見出される類骨、および海綿質の量を評価する。組織形態計測的な変量(例えば、類骨の割合、類骨の厚さ、骨表面1mmあたりの骨芽細胞の数、および骨表面1mmあたりの破骨細胞の数)を決定する。
【0212】
(蛍光色素標識)
8個体の動物を、手術後2週間目に体重1kgあたり90mgのキシレノールオレンジ、手術後4週間目に体重1kgあたり10mgのカルセイングリーン(Calcein green)、および手術後6週間目に体重1kgあたり25mgのドキシサイクリンハイクラートイエロー(doxycyclinhyclate yellow)の静脈内適用に供する。このレジメンは、RahnおよびPerrenによって公表された方法に従う。例えば、Rahnら,Stain Technology,46,125−129頁(1971);Rahnら,Akt Traumatol,10,109−115頁(1980)を参照のこと。次いで、蛍光色素の逐次分析を、定性的評価および定量的な動的評価のために、検体においてUV光の下での蛍光顕微鏡検査法によって実施する。
【0213】
(実施例11:イヌにおける骨軟骨性欠損の修復)
合計12個体の成体雄性イヌを利用する。肋軟骨下の骨を貫通する、両側性の骨軟骨性欠損(直径5.0mmおよび深さ6mm)を、各々の内側大腿顆(medial femoral condyle)の中心負荷支点領域に作製する。6個体の動物において、右側の欠損は、PLGAにカプセル化された高用量のOP−1を受ける。すべての動物の左肢は、コラーゲンマトリクス+CMCを受け、コントロールとして機能する。残りの6個体のイヌは、右側でPLGAにカプセル化された低用量のOP−1を受け、そして左側でコントロールを受ける。この動物を、移植後16週間目に屠殺する。屠殺に際して、遠位大腿をひとまとめにして回収し、そして欠損部位を、Moranら,J.Bone Joint Surg.74B,659−667頁(1992)(本明細書中で参考として援用される)のスキームに基づいて、組織学的にそして全体的に評価する。
【0214】
標準的な無菌技術を使用して、イソフルラン(isofluorane)ガス麻酔下で外科手術を実施し、そしてこの動物を、心電図および心拍数モニターによってモニターする。前外科的な薬物を、麻酔誘導の約20〜30分前に投与する。前外科的な薬物は、酒石酸ブトルファノール(0.05mg/体重1kg)からなる。麻酔を、ペントタールナトリウム(sodium pentothal)(17.5mg/体重1kg)の静脈内注射によって投与する。誘導後、気管内チューブを配置し、そしてイソフルランの吸入によって麻酔を維持する。約4cm長の内側傍膝蓋骨の切開(medial parapatellar incision)を作製することによって外科手術を実施する。膝蓋骨を側方に引っ込めて、大腿顆を露出させる。右側の内側顆において、軟骨層を通って伸長して肋軟骨下の骨を6mmの深さまで貫通する5.0mm直径の欠損を、特別に設計または改変された5.0mmのドリルビットを用いて作製する。生理食塩水で多量に洗浄して骨砕片および溢流した骨髄細胞を取り除いた後で、PLGAにカプセル化された適切な濃度のOP−1を、ブラントプローブ(blunt probe)を用いてかまたは手によって、注意深く各欠損部位に充填する。十分な量のOP−1を欠損内に配置し、その結果、その欠損部位は、交連している表面(articulating surface)で平らになる。移植された物質を保護しつつ、その結合部を洗浄して、その欠損部内に配置されていない任意の移植片を取り除く。次いで、結合部カプセルおよび軟組織を、再吸収可能な縫合糸を用いて、層において細密に閉鎖する。この手順を、コントロールの配置を有する対側で繰り返す。
【0215】
酒石酸ブトルファノール(0.05mg/体重1kg)を、必要に応じて、皮下投与する。動物に、外科手術後4日間にわたって抗生物質を筋内投与し、そして外科手術後すぐに、慣用的な前後方向のX線を撮ることにより、適切な外科的配置を保証する。動物が体重負荷に耐え得るようになるまで、この動物を3×4フィートの回復ケージ内で飼育する。次いで、動物を走行に移し、そして無制限に運動させる。
【0216】
後肢のX線を、術前、術後すぐ、および16週間目(屠殺時)に得る。術前のX線写真を使用して、以前から存在する異常はないことを保証し、そして骨格成熟を確証付ける。術後のX線写真を使用して、欠損の配置を評価する。屠殺時のX線写真を使用して、肋軟骨下の骨および交連している表面の治癒率および回復率を評価する。X線写真を、評価する日より前の1週間以内に得る。
【0217】
適切な時点で、静脈内でのバルビツレートの過剰投薬を使用して、動物を屠殺する。遠位大腿を直ちにひとまとめにして収集し、そして生理食塩水を浸漬したタオルに保存し、その動物の番号、右または左の明示、および他のあらゆる必要な識別子を記したプラスチックバッグ内に入れる。欠損部位の強力な写真を撮り、そして注意深く標識を付ける。屠殺する前に、静脈血を、示差的な細胞を用いた慣用的な血球算定のために採血する。軟組織を、欠損部位から細密に切開して取り出す。大腿の近位端を取り出す。すべての検体を、全体的な段階評価および写真撮影のすぐ後で、組織学的評価のために調製する。水冷したダイヤモンド鋸で、各欠損部位を切り離す。
【0218】
欠損部位および修復組織の全体的な外観を、Moranら(前出)の研究に基づいて段階評価する。点数を、関節内の接着、関節表面の修復、軟骨の侵食および外観の存在に従って割り当てる。
【0219】
個々の検体を、4%パラホルムアルデヒド溶液に浸漬することによって固定し、そして脱灰した組織学的処理のために調製する。3つのレベルから3つの切片を、各ブロックから切り出した。レベル1および3は、欠損の周界に最も近い。レベル2は、欠損の中心に位置付けられる。各レベルからの3つの切片を、トルイジンブルーおよびサフラニンOおよびファストグリーンで染色し得る。切片を、Moranら(前出)のスキームに基づいて段階評価する。この分析は、修復組織の性質、構造的特徴および細胞変化に基づいて、点数を割り当てる。記述統計を、全体的および組織学的パラメーターについて算出する。
【0220】
本発明者らは、本発明の多数の実施形態を記載したが、本発明者らによる基本的な構成を改変して、本発明の生成物およびプロセスを利用する他の実施形態を提供し得ることは明らかである。従って、本発明の範囲は、例として提示された特定の実施形態によってではなく、添付の特許請求の範囲によって規定されるべきであることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【0221】
【図1】図1は、プラシーボを用いた4週間での動物番号297L(左脛骨)の組織画像を示す。一番上から下まで、これらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれβ−TCPパテ89B、β−TCPパテ89C、β−TCPパテ89Fを含む。
【図2】図2は、プラシーボを用いた4週間での動物番号297R(右脛骨)の組織画像を示す。一番上から下まで、これらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれコントロール、コラーゲン48C、β−TCPパテ89Aを含む。
【図3】図3は、OP−1を用いた4週間での動物番号295L(左脛骨)の組織画像を示す。一番上から下まで、これらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれコラーゲン48C、β−TCPパテ89A、β−TCPパテ89Bを含む。
【図4】図4は、OP−1を用いた4週間での動物番号295R(右脛骨)の組織画像を示す。一番上から下まで、これらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれβ−TCPパテ89C、β−TCPパテ89F、コントロールを含む。
【図5】図5は、プラシーボを用いた8週間での動物番号299L(左脛骨)の組織画像を示す。一番上から下まで、これらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれβ−TCPパテ89B、β−TCPパテ89C、β−TCPパテ89Fを含む。
【図6】図6は、プラシーボを用いた8週間での動物番号299R(右脛骨)の組織画像を示す。一番上から下まで、これらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれコントロール、コラーゲン48C、β−TCPパテ89Aを含む。
【図7】図7は、OP−1を用いた8週間での動物番号138L(左脛骨)の組織画像を示す。一番上から下まで、これらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれβ−TCPパテ89A、β−TCPパテ89B、β−TCPパテ89Cを含む。
【図8】図8は、OP−1を用いた8週間での動物番号138R(右脛骨)の組織画像を示す。一番上から下まで、これらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれβ−TCPパテ89F、コントロール、コラーゲン48Cを含む。
【図9】図9は、プラシーボを用いた4週間での動物番号297L(左脛骨)のX線写真画像を示す。右から、これらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれβ−TCPパテ89B、β−TCPパテ89C、β−TCPパテ89Fを含む。
【図10】図10は、プラシーボを用いた4週間での動物番号297R(右脛骨)のX線写真画像を示す。左から、これらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれコントロール、コラーゲン48C、β−TCPパテ89Aを含む。
【図11】図11は、OP−1を用いた4週間での動物番号295L(左脛骨)のX線写真画像を示す。左から、これらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれコラーゲン48C、β−TCPパテ89A、β−TCPパテ89Bを含む。
【図12】図12は、OP−1を用いた4週間での動物番号295R(右脛骨)のX線写真画像を示す。左から、これらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれβ−TCPパテ89C、β−TCPパテ89F、コントロールを含む。
【図13】図13は、プラシーボを用いた8週間での動物番号299L(左脛骨)のX線写真画像を示す。右から、これらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれβ−TCPパテ89B、β−TCPパテ89C、β−TCPパテ89Fを含む。
【図14】図14は、プラシーボを用いた8週間での動物番号299R(右脛骨)のX線写真画像を示す。左から、これらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれコントロール、コラーゲン48C、β−TCPパテ89Aを含む。
【図15】図15は、OP−1を用いた8週間での動物番号138L(左脛骨)のX線写真画像を示す。右から、これらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれβ−TCPパテ89A、β−TCPパテ89B、β−TCPパテ89Cを含む。
【図16】図16は、OP−1を用いた8週間での動物番号138R(右脛骨)のX線写真画像を示す。左から、これらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれβ−TCPパテ89F、コントロール、コラーゲン48Cを含む。
【図17】図17は、プラシーボを用いた4週間での動物番号297L(左脛骨)のパラフィン走査画像を示す。一番上から、これらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれβ−TCPパテ89B、β−TCPパテ89C、β−TCPパテ89Fを含む。
【図18】図18は、プラシーボを用いた4週間での動物番号297R(右脛骨)のパラフィン走査画像を示す。一番上から、これらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれコントロール、コラーゲン48C、β−TCPパテ89Aを含む。
【図19】図19は、OP−1を用いた4週間での動物番号295L(左脛骨)のパラフィン走査画像を示す。一番上から、これらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれコラーゲン48C、β−TCPパテ89A、β−TCPパテ89Bを含む。
【図20】図20は、OP−1を用いた4週間での動物番号295R(右脛骨)のパラフィン走査画像を示す。一番上から、これらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれβ−TCPパテ89C、β−TCPパテ89F、コントロールを含む。
【図21】図21は、プラシーボを用いた8週間での動物番号299L(左脛骨)のパラフィン走査画像を示す。一番上から、これらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれβ−TCPパテ89B、β−TCPパテ89C、β−TCPパテ89Fを含む。
【図22】図22は、プラシーボを用いた8週間での動物番号299R(右脛骨)のパラフィン走査画像を示す。一番上から、これらの部位は、中位および遠位であり、それぞれコラーゲン48C、β−TCPパテ89Aを含む。
【図23】図23は、OP−1を用いた8週間での動物番号138L(左脛骨)のパラフィン走査画像を示す。一番上から、これらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれβ−TCPパテ89A、β−TCPパテ89B、β−TCPパテ89Cを含む。
【図24】図24は、OP−1を用いた8週間での動物番号138R(右脛骨)のパラフィン走査画像を示す。一番上から、これらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれβ−TCPパテ89F、コントロール、コラーゲン48Cを含む。
【図25】図25は、骨増殖を有する5つの細孔の1つを示す切片295Lの中位部位を示し、ここでEPは空の細孔であり、そしてFPは充填された細孔である。
【図26】図26は、骨増殖を有する7つまたは8つの細孔を示す切片299Lの遠位部位を示し、ここでEPは空の細孔であり、そしてFPは充填された細孔である。
【図27】図27は、PLGAでカプセル化されたOP−1を用いた4週間での動物番号5333L(左脛骨)のX線写真画像を示す。左からの、これらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれコントロール、処方物5および処方物4を含む。
【図28】図28は、PLGAでカプセル化されたOP−1を用いた8週間での動物番号5333L(左脛骨)のX線写真画像を示す。左からこれらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれコントロール、処方物4および処方物5を含む。
Claims (85)
- 複数の細孔を含むβ−リン酸三カルシウムの多孔性本体を備える、多孔性β−TCPであって、該細孔は、20〜500μmの細孔直径サイズを有する、単一の別個の空隙である、多孔性β−TCP。
- 複数の細孔を含むβ−リン酸三カルシウムの多孔性本体を備える、多孔性β−TCPであって、該細孔は、410〜460μmの細孔直径サイズを有する、単一の別個の空隙である、多孔性β−TCP。
- 複数の細孔を含むβ−リン酸三カルシウムの多孔性本体を備える、多孔性β−TCPであって、該細孔は、40〜190μmの細孔直径サイズを有する、単一の別個の空隙である、多孔性β−TCP。
- 複数の細孔を含むβ−リン酸三カルシウムの多孔性本体を備える、多孔性β−TCPであって、該細孔は、20〜95μmの細孔直径サイズを有する、単一の別個の空隙である、多孔性β−TCP。
- 複数の細孔を含むβ−リン酸三カルシウムの多孔性本体を備える、多孔性β−TCPであって、該細孔は、50〜125μmの細孔直径サイズを有する、単一の別個の空隙である、多孔性β−TCP。
- 前記β−リン酸三カルシウムが焼結されている、請求項1〜5のいずれか1項に記載の多孔性β−TCP。
- 前記β−TCPが顆粒であり、そして0.1〜2mmの粒子サイズを有する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の多孔性β−TCP。
- 前記β−TCPが顆粒であり、そして0.5〜1.7mmの粒子サイズを有する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の多孔性β−TCP。
- 前記β−TCPが顆粒であり、そして1〜1.7mmの粒子サイズを有する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の多孔性β−TCP。
- 前記β−TCPが顆粒であり、そして0.5〜1.0mmの粒子サイズを有する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の多孔性β−TCP。
- 全孔隙率が5〜80%の範囲である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の多孔性β−TCP。
- 全孔隙率が40〜80%の範囲である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の多孔性β−TCP。
- 全孔隙率が65〜75%の範囲である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の多孔性β−TCP。
- 全孔隙率が70%である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の多孔性β−TCP。
- 生物活性剤をさらに含有する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の多孔性β−TCP。
- 前記生物活性剤が、骨形成タンパク質である、請求項15に記載の多孔性β−TCP。
- 前記骨形成タンパク質が、OP−1、OP−2、OP−3、COP−1、COP−3、COP−4、COP−5、COP−7、COP−16、BMP−2、BMP−3、BMP−3b、BMP−4、BMP−5、BMP−6、BMP−9、BMP−10、BMP−11、BMP−12、BMP−13、BMP−14、BMP−15、BMP−16、BMP−17、BMP−18、GDF−1、GDF−2、GDF−3、GDF−5、GDF−6、GDF−7、GDF−8、GDF−9、GDF−10、GDF−11、GDF−12、MP121、ドルサリン−1、DPP、Vg−1、Vgr−1、60Aタンパク質、NODAL、UNIVIN、SCREW、ADMP、NEURAL、TGF−β、および骨原性活性を有するこれらの保存的アミノ酸配列改変体からなる群より選択される、請求項16に記載の多孔性β−TCP。
- 前記生物活性剤が、ヒトOP−1のC末端アミノ酸102〜106と少なくとも70%の相同性を有するアミノ酸配列を含む骨原性タンパク質である、請求項15に記載の多孔性β−TCP。
- 形態形成タンパク質刺激因子をさらに含有する、請求項16に記載の多孔性β−TCP。
- 前記形態形成タンパク質刺激因子が、インスリン様増殖因子I(IGF−I)、エストラジオール、線維芽細胞増殖因子(FGF)、成長ホルモン(GH)、成長および分化因子(GDF)、ヒドロコルチゾン(HC)、インスリン、プロゲステロン、副甲状腺ホルモン(PTH)、ビタミンD、レチン酸およびIL−6からなる群より選択される、請求項19に記載の多孔性β−TCP。
- 前記生物活性剤が、骨形成タンパク質をコードする配列を含む核酸分子である、請求項15に記載の多孔性β−TCP。
- 前記生物活性剤が、生分解性剤中にカプセル化されている、請求項15に記載の多孔性β−TCP。
- 前記生分解性剤が、エチレンビニルアセテート、天然コラーゲンおよび合成コラーゲン、ポリ(グラキサノン)、ポリ(ホスファゼン)、ポリグラクチン、ポリグラクチン酸、ポリアルドン酸、ポリアクリル酸、ポリアルカノエート、ポリオルトエステル、ポリ(L−ラクチド)(PLLA)、ポリ(D,L−ラクチド)(PDLLA)、ポリグリコリド(PGA)、ポリ(ラクチド−co−グリコリド)(PLGA)、ポリ(ζ−カプロラクトン)、ポリ(トリメチレンカーボネート)、ポリ(p−ジオキサノン)、ポリ(ζ−カプロラクトン−co−グリコリド)、ポリ(グリコリド−co−トリメチレンカーボネート)、ポリ(D,L−ラクチド−co−トリメチレンカーボネート)、ポリアリーレート、ポリヒドロキシブチレート(PHB)、ポリ無水物、ポリ(無水物−co−イミド)およびこれらのコポリマー、アミノ酸のポリマー、ポリエチレン−co−フマレート、1種以上のα−ヒドロキシカルボン酸モノマーのポリマー、生体活性ガラス組成物、これらの混合物ならびにこれらの誘導体および修飾物からなる群より選択される、請求項22に記載の多孔性β−TCP。
- 前記PLGAが、5kD〜500kDの分子量を有する、請求項23に記載の多孔性β−TCP。
- 前記PLGAが、10kD〜30kDの分子量を有する、請求項23に記載の多孔性β−TCP。
- 前記生物活性剤が、同種移植片または自己移植片である、請求項15に記載の多孔性β−TCP。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の多孔性β−TCPおよび結合剤を含有する、成形可能なパテ組成物。
- 前記結合剤が、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、ゼラチン、コラーゲン、ペプチド、ムチン、コンドロイチン硫酸、キトサン、ポロキサマー、グリコサミノグリカン、多糖類、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸およびポリグリコール酸のコポリマー、ポリヒドロキシ酪酸、ポリリンゴ酸、ポリグルタミン酸、ポリラクトン、マンニトール、白色鉱油、マンニトール/デキストランの組み合わせ、マンニトール/白色鉱油の組み合わせ、ゴマ油、フィブリン膠、およびこれらの混合物からなる群より選択される、請求項27に記載の成形可能なパテ組成物。
- 前記フィブリン膠が、ヒトフィブリノーゲンおよびトロンビンの混合物である、請求項28に記載の成形可能なパテ組成物。
- 生物活性剤をさらに含有する、請求項27に記載の成形可能なパテ組成物。
- キットであって、以下:
a)請求項1〜5のいずれか1項に記載の多孔性β−TCP;および
b)生物活性剤、
を備える、キット。 - 前記生物活性剤が、骨形成タンパク質である、請求項31に記載のキット。
- 前記骨形成タンパク質が、OP−1、OP−2、OP−3、COP−1、COP−3、COP−4、COP−5、COP−7、COP−16、BMP−2、BMP−3、BMP−3b、BMP−4、BMP−5、BMP−6、BMP−9、BMP−10、BMP−11、BMP−12、BMP−13、BMP−14、BMP−15、BMP−16、BMP−17、BMP−18、GDF−1、GDF−2、GDF−3、GDF−5、GDF−6、GDF−7、GDF−8、GDF−9、GDF−10、GDF−11、GDF−12、MP121、ドルサリン−1、DPP、Vg−1、Vgr−1、60Aタンパク質、NODAL、UNIVIN、SCREW、ADMP、NEURAL、TGF−β、および骨原性活性を有するこれらの保存的アミノ酸配列改変体からなる群より選択される、請求項32に記載のキット。
- 前記生物活性剤が、ヒトOP−1のC末端アミノ酸102〜106と少なくとも70%の相同性を有するアミノ酸配列を含む骨原性タンパク質である、請求項31に記載のキット。
- 形態形成タンパク質刺激因子をさらに備える、請求項32に記載のキット。
- 前記形態形成タンパク質刺激因子が、インスリン様増殖因子I(IGF−I)、エストラジオール、線維芽細胞増殖因子(FGF)、成長ホルモン(GH)、成長および分化因子(GDF)、ヒドロコルチゾン(HC)、インスリン、プロゲステロン、副甲状腺ホルモン(PTH)、ビタミンD、レチン酸およびIL−6からなる群より選択される、請求項35に記載のキット。
- キットであって、以下:
a)請求項1〜5のいずれか1項に記載の、多孔性β−TCP;および
b)結合剤、
を備える、キット。 - 前記結合剤が、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、ゼラチン、コラーゲン、ペプチド、ムチン、コンドロイチン硫酸、キトサン、ポロキサマー、グリコサミノグリカン、多糖類、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸およびポリグリコール酸のコポリマー、ポリヒドロキシ酪酸、ポリリンゴ酸、ポリグルタミン酸、ポリラクトン、マンニトール、白色鉱油、マンニトール/デキストランの組み合わせ、マンニトール/白色鉱油の組み合わせ、ゴマ油、フィブリン膠、およびこれらの混合物からなる群より選択される、請求項37に記載のキット。
- 前記フィブリン膠が、ヒトフィブリノーゲンおよびトロンビンの混合物である、請求項38に記載のキット。
- 移植可能なプロテーゼデバイスであって、以下:
a)標的組織に隣接して移植可能な表面領域を有する、プロテーゼ移植物;および
b)該表面領域の上に配置された、請求項1〜5のいずれか1項に記載の多孔性β−TCP。 - 前記多孔性β−TCP内に分散された生物活性剤をさらに備える、請求項40に記載のプロテーゼデバイス。
- 前記生物活性剤が、骨形成タンパク質である、請求項41に記載のプロテーゼデバイス。
- 前記骨形成タンパク質が、OP−1、OP−2、OP−3、COP−1、COP−3、COP−4、COP−5、COP−7、COP−16、BMP−2、BMP−3、BMP−3b、BMP−4、BMP−5、BMP−6、BMP−9、BMP−10、BMP−11、BMP−12、BMP−13、BMP−14、BMP−15、BMP−16、BMP−17、BMP−18、GDF−1、GDF−2、GDF−3、GDF−5、GDF−6、GDF−7、GDF−8、GDF−9、GDF−10、GDF−11、GDF−12、MP121、ドルサリン−1、DPP、Vg−1、Vgr−1、60Aタンパク質、NODAL、UNIVIN、SCREW、ADMP、NEURAL、TGF−β、および骨原性活性を有するこれらの保存的アミノ酸配列改変体からなる群より選択される、請求項42に記載のプロテーゼデバイス。
- 前記生物活性剤が、ヒトOP−1のC末端アミノ酸102〜106と少なくとも70%の相同性を有するアミノ酸配列を含む骨原性タンパク質である、請求項41に記載のプロテーゼデバイス。
- 形態形成タンパク質刺激因子をさらに含有する、請求項42に記載のプロテーゼデバイス。
- 前記形態形成タンパク質刺激因子が、インスリン様増殖因子I(IGF−I)、エストラジオール、線維芽細胞増殖因子(FGF)、成長ホルモン(GH)、成長および分化因子(GDF)、ヒドロコルチゾン(HC)、インスリン、プロゲステロン、副甲状腺ホルモン(PTH)、ビタミンD、レチン酸およびIL−6からなる群より選択される、請求項45に記載のプロテーゼデバイス。
- 前記生物活性剤が、骨形成タンパク質をコードする配列を含む核酸分子である、請求項41に記載のプロテーゼデバイス。
- 前記生物活性剤が、生分解性剤中にカプセル化されている、請求項41に記載のプロテーゼデバイス。
- 前記生分解性剤が、エチレンビニルアセテート、天然コラーゲンおよび合成コラーゲン、ポリ(グラキサノン)、ポリ(ホスファゼン)、ポリグラクチン、ポリグラクチン酸、ポリアルドン酸、ポリアクリル酸、ポリアルカノエート、ポリオルトエステル、ポリ(L−ラクチド)(PLLA)、ポリ(D,L−ラクチド)(PDLLA)、ポリグリコリド(PGA)、ポリ(ラクチド−co−グリコリド)(PLGA)、ポリ(ζ−カプロラクトン)、ポリ(トリメチレンカーボネート)、ポリ(p−ジオキサノン)、ポリ(ζ−カプロラクトン−co−グリコリド)、ポリ(グリコリド−co−トリメチレンカーボネート)、ポリ(D,L−ラクチド−co−トリメチレンカーボネート)、ポリアリーレート、ポリヒドロキシブチレート(PHB)、ポリ無水物、ポリ(無水物−co−イミド)およびこれらのコポリマー、アミノ酸のポリマー、ポリエチレン−co−フマレート、1種以上のα−ヒドロキシカルボン酸モノマーのポリマー、生体活性ガラス組成物、これらの混合物ならびにこれらの誘導体および修飾物からなる群より選択される、請求項48に記載のプロテーゼデバイス。
- 前記PLGAが、5kD〜500kDの分子量を有する、請求項49に記載のプロテーゼデバイス。
- 前記PLGAが、10kD〜30kDの分子量を有する、請求項49に記載のプロテーゼデバイス。
- 前記デバイスが、股関節部デバイス、融合ケージ、および顎顔面デバイスからなる群より選択される、請求項40に記載のプロテーゼデバイス。
- 結合剤をさらに含む、請求項40に記載のプロテーゼデバイス。
- 前記結合剤が、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、ゼラチン、コラーゲン、ペプチド、ムチン、コンドロイチン硫酸、キトサン、ポロキサマー、グリコサミノグリカン、多糖類、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸およびポリグリコール酸のコポリマー、ポリヒドロキシ酪酸、ポリリンゴ酸、ポリグルタミン酸、ポリラクトン、マンニトール、白色鉱油、マンニトール/デキストランの組み合わせ、マンニトール/白色鉱油の組み合わせ、ゴマ油、フィブリン膠、およびこれらの混合物からなる群より選択される、請求項53に記載のプロテーゼデバイス。
- 前記フィブリン膠が、ヒトフィブリノーゲンおよびトロンビンの混合物である、請求項54に記載のプロテーゼデバイス。
- 多孔性β−TCP顆粒を製造する方法であって、以下:
(a)TCP粉末を細孔形成剤と混合する工程;
(b)顆粒化溶液を添加して、脆い塊を形成する工程;
(c)該脆い塊を篩に通して、顆粒を形成する工程;および
(d)該顆粒を焼結して多孔性β−TCPを形成する工程、
を包含する、方法。 - 多孔性β−TCP顆粒を製造する方法であって、以下:
(a)TCP粉末を細孔形成剤と混合する工程であって、該細孔形成剤の割合が、37.5重量%である、工程;
(b)顆粒化溶液を添加して、脆い塊を形成する工程;
(c)該脆い塊を篩に通して、顆粒を形成する工程;および
(d)該顆粒を焼結して多孔性β−TCPを形成する工程、
を包含する、方法。 - 多孔性β−TCP顆粒を製造する方法であって、以下:
(a)TCP粉末を細孔形成剤と混合する工程;
(b)顆粒化溶液を添加して、脆い塊を形成する工程;
(c)該脆い塊を篩に通して、顆粒を形成する工程であって、該篩が、500〜1000μmまたは1000〜1700μmの範囲の大きさである、工程;および
(d)該顆粒を焼結して多孔性β−TCPを形成する工程、
を包含する、方法。 - 多孔性β−TCP顆粒を製造する方法であって、以下:
(a)TCP粉末を細孔形成剤と混合する工程;
(b)顆粒化溶液を添加して、脆い塊を形成する工程;
(c)該脆い塊を篩に通して、顆粒を形成する工程;
(d)該顆粒を700〜800℃で気化させる工程;および
(e)該顆粒を焼結して多孔性β−TCPを形成する工程、
を包含する、方法。 - 多孔性β−TCP顆粒を製造する方法であって、以下:
(a)TCP粉末を細孔形成剤と混合する工程;
(b)顆粒化溶液を添加して、脆い塊を形成する工程;
(c)該脆い塊を篩に通して、顆粒を形成する工程;および
(d)該顆粒を、1000〜1200℃で焼結し、次いでゆっくりと冷却して、多孔性β−TCPを形成する工程、
を包含する、方法。 - 前記細孔形成剤が、ポリアクリレートのプレポリマー、ポリメタクリレート、ポリメチルメタクリレート、メチルアクリレートおよびメチルメタクリレートのコポリマー、ポリスチレン、ポリエチレングリコール、結晶性セルロース、繊維状セルロース、ポリウレタン、ポリエチレン、ナイロン樹脂およびアクリル樹脂からなる群より選択される、請求項56〜60のいずれか1項に記載の方法。
- 前記顆粒化溶液が、ポリビニルピロリドン、デンプン、ゼラチン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド、ヒドロキシエチルセルロース、ポリビニルブチラールおよび酢酸酪酸セルロースからなる群より選択される化合物を含む、請求項56〜60のいずれか1項に記載の方法。
- 前記多孔性β−TCPが、形成後に再度篩分けされる、請求項56〜60のいずれか1項に記載の方法。
- リン酸三カルシウム粉末および細孔形成剤を含有する組成物であって、該細孔形成剤が、20〜500μmの直径を有する、組成物。
- リン酸三カルシウム粉末および細孔形成剤を含有する組成物であって、該細孔形成剤が、410〜460μmの直径を有する、組成物。
- リン酸三カルシウム粉末および細孔形成剤を含有する組成物であって、該細孔形成剤が、40〜190μmの直径を有する、組成物。
- リン酸三カルシウム粉末および細孔形成剤を含有する組成物であって、該細孔形成剤が、20〜95μmの直径を有する、組成物。
- リン酸三カルシウム粉末および細孔形成剤を含有する組成物であって、該細孔形成剤が、50〜125μmの直径を有する、組成物。
- 前記細孔形成剤の割合が、30〜40重量%である、請求項64〜68のいずれか1項に記載の組成物。
- 哺乳動物において骨形成を誘導する方法であって、該哺乳動物の欠損部位に、請求項1〜5のいずれか1項に記載の多孔性β−TCPを含有する組成物を移植する工程を包含する、方法。
- 前記組成物が、生物活性剤をさらに含有する、請求項70に記載の方法。
- 前記生物活性剤が、骨形成タンパク質である、請求項71に記載の方法。
- 前記組成物が、結合剤をさらに含有する、請求項70に記載の方法。
- 骨形成を必要とする部位において、生物活性剤を送達する方法であって、哺乳動物の欠損部位において、請求項1〜5のいずれか1項に記載の多孔性β−TCPおよび生物活性剤を含有する組成物を移植する工程を包含する、方法。
- 前記生物活性剤が、骨形成タンパク質である、請求項74に記載の方法。
- 前記生物活性剤が、生分解性剤中にカプセル化されている、請求項74に記載の方法。
- 前記生物活性剤の送達が、徐放性である、請求項76に記載の方法。
- 前記生物活性剤が、骨形成タンパク質をコードする配列を含む核酸分子である、請求項74に記載の方法。
- 軟骨形成を必要とする部位において、生物活性剤を送達する方法であって、哺乳動物の欠損部位において、生物活性剤および生分解性剤を含有する組成物を移植する工程を包含し、該生分解性剤は、20〜500μmの粒子サイズを有し、該生物活性剤は、該生分解性剤中にカプセル化されている、方法。
- 生分解性剤中にカプセル化された生物活性剤を含有する組成物であって、該生分解性剤が、20〜500μmの粒子サイズを有する、組成物。
- 生分解性剤中にカプセル化された生物活性剤を含有する組成物であって、該生分解性剤が、20〜140μmの粒子サイズを有する、組成物。
- 生分解性剤中にカプセル化された生物活性剤を含有する組成物であって、該生分解性剤が、75〜140μmの粒子サイズを有する、組成物。
- 前記生分解性剤が、エチレンビニルアセテート、天然コラーゲンおよび合成コラーゲン、ポリ(グラキサノン)、ポリ(ホスファゼン)、ポリグラクチン、ポリグラクチン酸、ポリアルドン酸、ポリアクリル酸、ポリアルカノエート、ポリオルトエステル、ポリ(L−ラクチド)(PLLA)、ポリ(D,L−ラクチド)(PDLLA)、ポリグリコリド(PGA)、ポリ(ラクチド−co−グリコリド)(PLGA)、ポリ(ζ−カプロラクトン)、ポリ(トリメチレンカーボネート)、ポリ(p−ジオキサノン)、ポリ(ζ−カプロラクトン−co−グリコリド)、ポリ(グリコリド−co−トリメチレンカーボネート)、ポリ(D,L−ラクチド−co−トリメチレンカーボネート)、ポリアリーレート、ポリヒドロキシブチレート(PHB)、ポリ無水物、ポリ(無水物−co−イミド)およびこれらのコポリマー、アミノ酸のポリマー、ポリエチレン−co−フマレート、1種以上のα−ヒドロキシカルボン酸モノマーのポリマー、生体活性ガラス組成物、これらの混合物ならびにこれらの任意の誘導体および修飾物からなる群より選択される、請求項80〜82のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記PLGAが、5kD〜500kDの分子量を有する、請求項83に記載の組成物。
- 前記PLGAが、10kD〜30kDの分子量を有する、請求項83に記載の組成物。
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