TWI449546B - 應用於軟硬組織修復與再生之生醫材料 - Google Patents

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Description

應用於軟硬組織修復與再生之生醫材料
本發明係有關於一種生醫材料，特別是有關於一種長效釋放控制並可有效保護生物活性物質之生醫材料。
目前，牙(骨)缺損修復醫材主要以Cotton-Gauze-based(第一代)及例如β-磷酸三鈣(β-TCP)、羥基磷灰石(hydroxyapatite)、生物活性玻璃(bioactive glass)或膠原蛋白(collagen-based)等的第二代材料為主流，而現階段牙缺損修復產品的國際大廠(例如Nobel Biocare、Straumann、Biomet 3i、Zimmer Dental、Dentsply Friadent)已進入第三代材料的研發，開發具有抗菌、抗發炎及活性治療(active therapy)功能的產品，但，上述產品仍會有填補物逆流及牙骨再生不良的情況發生，因此，如何有效包覆生物活性物質及包覆材料如何產生有效骨細胞結合生成反應(osteoblast migration and binding)是目前臨床治療上眾所期待解決的問題。
儘管目前已有開發生醫載體內包含生長因子(growth factor,GF)的活性治療技術，例如：Medtronic infuse；吸附rhBMP-2蛋白的第一型牛膠原蛋白載體(bovine collagen carrier)(包括海綿狀膠原蛋白(collagen sponge)與顆粒狀膠原蛋白(collagen particles))，但，包覆效果不佳，臨床治療上無法確定海綿狀膠原蛋白實際吸附BMP-2(其價格非常昂貴：10μg/300US)的量，故實際使用量通常需高出理論用量，且海綿狀膠原蛋白吸附的BMP-2進入體內後極易在短時間內大量釋放，且保存期限(shelf life)太短。此外，生長因子(GF)本身即是一種蛋白質，在酸、鹼及有機溶劑的作用下皆易變性(denature)與降解(degradation)，在臨床使用上亦會快速流失。對此，許多市面上產品改以高濃度含量來避免流失，然，此種做法易造成諸多副作用。因此，開發一種適合且具生物相容性的包覆材料與傳輸材料是相當急迫性的研究。
本發明之一實施例，提供一種生醫材料，包括：一生物相容性材料；以及一載體，分佈於該生物相容性材料之表面，其中該生物相容性材料與該載體兩者均不帶電荷、其中一者帶電荷或兩者均帶電荷但為相異電性，其中該載體與該生物相容性材料之重量比介於1:100,000~1:100或1:10,000~1:1,000。本發明生醫材料可作為牙科、骨科、傷口癒合或醫學美容之用途及應用於各種軟硬組織之修復與再生。
本發明以不含電荷或含正/負電荷的奈米載體(nanocarrier)作為包覆生物活性物質的材料，可藉由調整載體本身的配方組成來提高生物活性物質的功效及包覆率，例如以磷脂醯膽鹼(PC)/維生素作為載體材料時，可進一步提高人類骨形成蛋白(BMP-2)所產生鹼性磷酸酵素(alkaline phosphatase,ALP)的活性。後續可利用正、負電荷吸引的方式，將載體吸附固定於生醫級材料(例如生物活性玻璃陶瓷(bioactive glass ceramic)、骨水泥(bone cement)等)的表面及孔隙內，或可使用造粒或壓錠等方式，使至少其一不帶電荷的生物相容性材料與奈米載體兩者相結合。本發明之生醫材料(本發明稱之為Agglomer)外層進一步包覆生醫級醫材原料(例如同時帶有正電荷與負電荷的多醣體、膠原蛋白)(此技術稱為層-層包覆(layer by layer coating))，以達成長效釋放控制並可有效保護生物活性物質。本發明Agglomer的尺寸大小可藉由上述作為核心結構的生醫級材料(例如生物活性玻璃陶瓷、骨水泥等)的大小加以控制，而Agglomer外層所包覆的厚度則可藉由組裝層數與組裝條件加以控制。本發明生醫材料所形成的微粒(microsphere)於臨床上易操作使用，可作為廣效、即時性的骨再生填充修補物，彌補現階段的產品缺陷，有利發展成新一代骨科(牙科)修復醫材產品。
本發明奈米載體包覆技術，配合生醫材料(即Agglomer)的技術開發可達到骨傳導(osteoconduction)與骨誘發(osteoinduction)之間的整合，使骨生長獲得支撐，符合生物力學需求，並進一步達到長效釋放控制、準確定量生物活性物質濃度以及避免生物活性物質變性(denature)等功效。
本發明製備奈米載體的過程中，以磷脂醯膽鹼(PC)為主的微脂粒(liposome)原料經減壓蒸餾後形成薄膜，再將例如富含血小板血漿(PRP)、人類骨形成蛋白(BMP-2)或欲包覆的生物活性物質，利用低溫超音波震盪進行包覆。可利用不同微脂粒配方組成調控載體帶電性及介面穩定性，以利後續與生醫材料(即Agglomer)的結合。
本發明以上述奈米載體(nanocarrier)、微粒(microsphere)並結合各種生醫材料作為骨科/牙科的修復材料。各種生醫材料包括生物活性玻璃陶瓷、骨水泥、膠原蛋白等。實際應用方式端視使用目的及用途而加以選擇。本發明以具備便利、簡易使用的壓錠技術為例作說明，但實際應用方式並不以此壓錠技術為限。首先，將各種生醫骨材(例如生物活性玻璃陶瓷、羥基磷灰石-磷酸三鈣(HATCP)、β-磷酸三鈣(β-TCP)、硫酸鈣(Ca2 SO4 )、明膠(gelatin)、聚乳酸-甘醇酸(PLGA)等)之粉體或顆粒結合包覆例如BMP-2等活性因子的奈米載體/微粒，接著，即直接、快速地以壓錠機壓錠製作骨材。此外，可使用不同形狀之模具以適切各部位需求，並可依據不同需求進行配方設計(例如加入黏合劑、崩散劑、潤滑劑或崩散抑制劑等)，以達緩釋、加強硬度等效果。壓錠技術之優點包括：1.可正確控制劑量，2.可依據配方設計控制藥物解離速率，3.易於大量生產，成本低廉，以及4.運輸保存及投藥方便。
為讓本發明之上述目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉一較佳實施例，作詳細說明如下：
根據本發明之一實施例，揭示一種生醫材料，如第1圖所示。生醫材料10包括一生物相容性材料12以及一載體14。載體14分佈於生物相容性材料12之表面。值得注意的是，生物相容性材料12與載體14可兩者均不帶電荷、其中一者帶電荷或兩者均帶電荷但為相異電性。載體14的電性可根據生物相容性材料12的電性加以調整，以使載體14與生物相容性材料12的電性相異。在一實施例中，可藉由官能基化調整原中性載體的電性為負電性或正電性。在一實施例中，載體14與生物相容性材料12的重量比大體介於1:100,000~1:100，亦可介於1:10,000~1:1,000。
在一實施例中，生物相容性材料12可為一多孔性生物相容性材料。在此實施例中，載體14可分佈於多孔性生物相容性材料12之表面或孔隙中，如第1圖所示，或包覆於多孔性生物相容性材料12中。生物相容性材料12可包括羥基磷灰石-磷酸三鈣(hydroxyapatite tricalcium phosphate,HATCP)、β-磷酸三鈣(β-tricalcium phosphate,β-TCP)、α-磷酸三鈣(α-tricalcium phosphate,α-TCP)、生物活性玻璃陶瓷(bioactive glass ceramic)、硫酸鈣、骨水泥(bone cement)、明膠(gelatin)、膠原蛋白(collagen)、聚乳酸-甘醇酸(poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)、聚己內酯多元醇(polycaprolactone,PCL)或彈性蛋白(elastin)。
載體14可由油脂所構成。構成載體14的油脂可包括例如雙亞麻仁酸磷脂醯膽鹼(dilinoleoyl phosphatidylcholine,DLPC)、二油酸磷酯醯膽鹼(dioleoyl phosphatidylcholine,DOPC)或二硬脂酸磷脂醯膽鹼(distearoyl phosphatidylcholine,DSPC)的磷脂醯膽鹼(phosphatidylcholine,PC)、例如二硬脂酸磷脂醯乙醇胺(distearoyl phosphatidylethanolamine,DSPE)或二油酸磷脂醯乙醇胺(dioleoyl phosphatidylethanolamine,DOPE)的磷脂醯乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)、1,2-二油氧基-3-三甲基氨基丙烷(1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium propane,DOTAP)、2,3-二油氧基丙基-三甲基氯化銨(2,3-dioleoyloxypropyl-trimethylammonium chloride,DOTMA)、例如二油酸磷脂酸(dioleoyl phosphatidic acid,DOPA)的磷脂酸(phosphatidic acid,PA)、磷脂質絲胺酸(phosphatidylserine,PS)、例如二油酸磷脂醯甘油(dioleoyl phosphatidylglycerol,DOPG)的磷脂醯甘油(phosphatidylglycerol,PG)、3β-[N-(N' ,N' -二甲基胺乙基)胺基甲醯基]膽固醇(3β-[N-(N',N'-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol,DC-CHOL)、雙十六烷基磷酸鹽(dihexadecyl phosphate,DHDP)或其衍生物。載體14中，油脂之重量份大體介於0.1~30，較佳介於1~15，均以載體14為100重量份。載體14可更包括維生素A、C、D、E、K、B1、B3、B6、B7、B12、葉酸(folate)、泛酸(pantothenic acid)或其衍生物等各種生理必須維生素，或是鉀、鈣、鐵、鎂、鋅、銅、錳、鉬、鎳、矽、鉻、磷、硫或氯等各種生理必須元素或礦物質。
生醫材料10可更包括一生物活性物質(未圖示)，包覆於載體14內。生物活性物質可包括各種生長因子(growth factor,GF)、蛋白質、胜肽、DNA、RNA、細胞激素(cytokines)、細胞外基質(extracellular matrix,ECM)、細胞附著分子(cell adhesion molecules,CAM)、富含血小板血漿(platelets rich plasma,PRP)、顆粒細胞(granulocytes)或幹細胞(stem cells)等。上述生物活性物質的尺寸大小大體介於2~10,000nm。
生醫材料10外部可更包覆有一多醣體層16，如第2圖所示。多醣體層16可同時具有正電荷與負電荷。在一實施例中，多醣體層16可由例如負電荷的海藻酸(alginate)與例如正電荷的幾丁聚醣(chitosan)所構成。在一實施例中，於多醣體層16外層，可更包覆有一膠原蛋白(collagen)層18，如第3圖所示。
生醫材料10可為一單一顆粒狀結構，其粒徑大體介於10~500μm。在一實施例中，上述呈顆粒狀結構的生醫材料10亦可藉由使用例如生物黏著劑的生物黏著技術使複數個顆粒狀結構彼此聚集黏著而形成一聚集體，該聚集體尺寸大小可大於50μm，或大於1,000μm。
生醫材料10與外層的多醣體層16及膠原蛋白(collagen)層18可進一步製備形成一膠囊20，如第4圖所示，例如一軟殼膠囊或一硬殼膠囊。圖中22所指為一抗微生物劑。
生醫材料10與外層的多醣體層16及膠原蛋白(collagen)層18所共同形成的微粒(microsphere)結構可廣泛應用於牙科、骨科、傷口癒合或醫學美容及應用於各種軟硬組織之修復與再生，例如應用於牙缺損(dental defects)、植牙傷口(extraction wounds)、牙科複合式傷口(combined wounds)、全身骨缺損(small or large bone defects)、顱顏整形外科(craniofacial plastic surgery)、醫療美容(health beauty)或組織修復(tissue repair)等醫療領域。
根據本發明之一實施例，揭示一種生醫材料之製備方法，仍請參閱第1圖。首先，提供一生物相容性材料12與一載體14。之後，混合生物相容性材料12與載體14。值得注意的是，當生物相容性材料12與載體14兩者均不帶電荷或其中一者帶電荷時，可藉由一造粒或壓錠製程，使生物相容性材料12與載體14結合，而當生物相容性材料12與載體14兩者均帶電荷但為相異電性時，則藉由生物相容性材料12與載體14之相異電性，使載體14吸附至生物相容性材料12之表面。
在一實施例中，生物相容性材料12可為一多孔性生物相容性材料。在此實施例中，當多孔性生物相容性材料12與載體14兩者均不帶電荷或其中一者帶電荷時，可藉由一造粒或壓錠製程，使多孔性生物相容性材料12與載體14結合，而當多孔性生物相容性材料12與載體14兩者均帶電荷但為相異電性時，則藉由多孔性生物相容性材料12與載體14之相異電性，使或體14吸附至多孔性生物相容性材料12之表面或孔隙中，如第1圖所示。生物相容性材料12可包括羥基磷灰石-磷酸三鈣(hydroxyapatite tricalcium phosphate,HATCP)、β-磷酸三鈣(β-tricalcium phosphate,β-TCP)、α-磷酸三鈣(α-tricalcium phosphate,α-TCP)、生物活性玻璃陶瓷(bioactive glass ceramic)、硫酸鈣、骨水泥(bone cement)、明膠(gelatin)、膠原蛋白(collagen)、聚乳酸-甘醇酸(poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)、聚己內酯多元醇(polycaprolactone,PCL)或彈性蛋白(elastin)。
載體14可由油脂所構成。構成載體14的油脂可包括例如雙亞麻仁酸磷脂醯膽鹼(dilinoleoyl phosphatidylcholine,DLPC)、二油酸磷酯醯膽鹼(dioleoyl phosphatidylcholine,DOPC)或二硬脂酸磷脂醯膽鹼(distearoyl phosphatidylcholine,DSPC)的磷脂醯膽鹼(phosphatidylcholine,PC)、例如二硬脂酸磷脂醯乙醇胺(distearoyl phosphatidylethanolamine,DSPE)或二油酸磷脂醯乙醇胺(dioleoyl phosphatidylethanolamine,DOPE)的磷脂醯乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)、1,2-二油氧基-3-三甲基氨基丙烷(1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium propane,DOTAP)、2,3-二油氧基丙基-三甲基氯化銨(2,3-dioleoyloxypropyl-trimethylammonium chloride,DOTMA)、例如二油酸磷脂酸(dioleoyl phosphatidic acid,DOPA)的磷脂酸(phosphatidic acid,PA)、磷脂質絲胺酸(phosphatidylserine,PS)、例如二油酸磷脂醯甘油(dioleoyl phosphatidylglycerol,DOPG)的磷脂醯甘油(phosphatidylglycerol,PG)、3β-[N-(N' ,N' -二甲基胺乙基)胺基甲醯基]膽固醇(3β-[N-(N',N'-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol,DC-CHOL)、雙十六烷基磷酸鹽(dihexadecyl phosphate,DHDP)或其衍生物。載體14中，油脂之重量份大體介於0.1~30，較佳介於1~15，均以載體14為100重量份。或體14可更包括維生素A、C、D、E、K、B1、B3、B6、B7、B12、葉酸(folate)、泛酸(pantothenic acid)或其衍生物等各種生理必須維生素，或是鉀、鈣、鐵、鎂、鋅、銅、錳、鉬、鎳、矽、鉻、磷、硫或氯等各種生理必須元素或礦物質。
本發明生醫材料之製備方法更包括包覆一生物活性物質(未圖示)於載體14內。載體14所包覆的生物活性物質可包括各種生長因子(growth factor,GF)、蛋白質、胜肽、DNA、RNA、細胞激素(cytokines)、細胞外基質(extracellular matrix,ECM)、細胞附著分子(cell adhesion molecules,CAM)、富含血小板血漿(platelets rich plasma,PRP)、顆粒細胞(granulocytes)或幹細胞(stem cells)等。上述生物活性物質的尺寸大小大體介於2~10,000nm。
在一實施例中，當生醫材料10保存於-70℃~26℃之環境時，生物活性物質之活性至少可維持35天。
於生醫材料10外部，可更包括形成一多醣體層16，如第2圖所示。多醣體層16可同時具有正電荷與負電荷。在一實施例中，多醣體層16可由例如負電荷的海藻酸(alginate)與例如正電荷的幾丁聚醣(chitosan)所構成。在一實施例中，於多醣體層16外層，可更包括形成一膠原蛋白(collagen)層18，如第3圖所示。
本發明以不含電荷或含正/負電荷的奈米載體(nanocarrier)作為包覆生物活性物質的材料，可藉由調整載體本身的配方組成來提高生物活性物質的功效及包覆率，例如以磷脂醯膽鹼(PC)/維生素作為載體材料時，可進一步提高人類骨形成蛋白(BMP-2)所產生鹼性磷酸酵素(alkaline phosphatase,ALP)的活性。後續可利用正、負電荷吸引的方式，將載體吸附固定於生醫級材料(例如生物活性玻璃陶瓷(bioactive glass ceramic)、骨水泥(bone cement)等)的表面及孔隙內，或可使用造粒或壓錠等方式，使至少其一不帶電荷的生物相容性材料與奈米載體兩者相結合。本發明之生醫材料(本發明稱之為Agglomer)外層進一步包覆生醫級醫材原料(例如同時帶有正電荷與負電荷的多醣體、膠原蛋白)(此技術稱為層-層包覆(layer by layer coating))，以達成長效釋放控制並可有效保護生物活性物質。本發明Agglomer的尺寸大小可藉由上述作為核心結構的生醫級材料(例如生物活性玻璃陶瓷、骨水泥等)的大小加以控制，而Agglomer外層所包覆的厚度則可藉由組裝層數與組裝條件加以控制。本發明生醫材料所形成的微粒(microsphere)於臨床上易操作使用，可作為廣效、即時性的骨再生填充修補物，彌補現階段的產品缺陷，有利發展成新一代骨科(牙科)修復醫材產品。
本發明奈米載體包覆技術，配合生醫材料(即Agglomer)的技術開發可達到骨傳導(osteoconduction)與骨誘發(osteoinduction)之間的整合，使骨生長獲得支撐，符合生物力學需求，並進一步達到長效釋放控制、準確定量生物活性物質濃度以及避免生物活性物質變性(denature)等功效。
本發明製備奈米載體的過程中，以磷脂醯膽鹼(PC)為主的微脂粒(liposome)原料經減壓蒸餾後形成薄膜，再將例如富含血小板血漿(PRP)、人類骨形成蛋白(BMP-2)或欲包覆的生物活性物質，利用低溫超音波震盪進行包覆。可利用不同微脂粒配方組成調控載體帶電性及介面穩定性，以利後續與生醫材料(即Agglomer)的結合。
本發明以上述奈米載體(nanocarrier)、微粒(microsphere)並結合各種生醫材料作為骨科/牙科的修復材料。各種生醫材料包括生物活性玻璃陶瓷、骨水泥、膠原蛋白等。實際應用方式端視使用目的及用途而加以選擇。本發明以具備便利、簡易使用的壓錠技術為例作說明，但實際應用方式並不以此壓錠技術為限。首先，將各種生醫骨材(例如生物活性玻璃陶瓷、羥基磷灰石-磷酸三鈣(HATCP)、β-磷酸三鈣(β-TCP)、硫酸鈣(Ca2 SO4 )、明膠(gelatin)、聚乳酸-甘醇酸(PLGA)等)之粉體或顆粒結合包覆例如BMP-2等活性因子的奈米載體/微粒，接著，即直接、快速地以壓錠機壓錠製作骨材。此外，可使用不同形狀之模具以適切各部位需求，並可依據不同需求進行配方設計(例如加入黏合劑、崩散劑、潤滑劑或崩散抑制劑等)，以達緩釋、加強硬度等效果。壓錠技術之優點包括：1.可正確控制劑量，2.可依據配方設計控制藥物解離速率，3.易於大量生產，成本低廉，以及4.運輸保存及投藥方便。
【實施例1】
本發明維生素A衍生物之合成
(1)　維生素A酯之製備
首先，將100mg維生素A醇溶於2ml三乙基胺。之後，加入等當量脂肪酸醯氯或脂肪酸酐於常溫避光下靜置。反應過程以薄層分析。待維生素A醇完全消失後，將反應液傾倒入水中並以乙酸乙酯萃取之。將乙酸乙酯分離並以無水硫酸鈉進行脫水、乾燥，再經減壓抽乾後，以管柱進行產物純化。
(2)　烷基維生素A酯之製備
首先，將350mg維生素A酸溶於20ml乙酸乙酯。之後，加入等當量碳酸鉀及2當量烷基碘化物加熱迴流2小時。將反應液冷卻加入水中並進行水洗三次。將乙酸乙酯分離並以無水硫酸鈉進行脫水、乾燥，再經減壓濃縮後，以管柱進行產物純化。
將維生素A或維生素A衍生物以混摻形成離子鍵結的方式或利用接枝技術導入奈米載體。
【實施例2】
本發明包覆生物活性物質(BMP-2)之奈米載體(磷脂醯膽鹼(PC)/膽固醇/維生素A)之製備
(1)　本實施例採用薄膜水合/超音波震盪法(thin-film hydration/sonication method)進行奈米載體對人類骨形成蛋白(human bone morphogenetic protein 2,BMP-2)的包覆。首先，將磷脂醯膽鹼(phosphatidylcholine,PC)為主的微脂粒(liposome)原料(其餘組成包含膽固醇、雙十六烷基磷酸鹽(DHDP)、1,2-二油氧基-3-三甲基氨基丙烷(DOTAP))進行減壓蒸餾以形成薄膜。之後，利用低溫(-10~4℃)超音波震盪，進行對人類骨形成蛋白(BMP-2)的包覆。包覆人類骨形成蛋白(BMP-2)後的奈米載體粒徑大約小於200nm。不同奈米載體的油脂重量比例組成如下表1所示。本實施例利用不同奈米載體的配方組成以調控奈米載體的帶電荷度與介面穩定性，以利後續與Agglomer的結合。
(2)　參考表1配方11的重量比例，進一步將磷脂醯膽鹼(phosphatidylcholine,PC)搭配其它油脂如磷脂酸(phosphatidic acid,PA)、磷脂醯乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)或1,2-二油氧基-3-三甲基氨基丙烷(1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium propane,DOTAP)與維生素A形成微脂粒來包覆生長因子，結果如表2所示，包覆人類骨形成蛋白(BMP-2)後的奈米載體粒徑大部分小於100nm。
【實施例3】
本發明包覆生物活性物質(BMP-2)之奈米載體(磷脂醯膽鹼(PC)/膽固醇)對鹼性磷酸酵素(ALP)活性之影響
C 2 C 12 細胞培養
C2 C12 細胞購自BCRC生物資源保存與研究中心，培養於5% CO2 細胞培養箱中，並冷凍保存於液態氮桶中。細胞培養及繼代使用DMEM(10% FBS及1%盤尼西林/鏈黴素(streptomycin))之培養基，當細胞培養至90%聚滿(confluence)時以1：10之稀釋比例繼代培養。
ALP測試方法
取C2 C12 細胞調整細胞濃度為4×104 cells/ml，於24-井細胞培養盤中置入0.5ml，放入5% CO2 細胞培養箱中靜置18小時，使細胞均勻貼附於細胞培養盤內。將貼附完成的細胞培養盤中的培養基更換成DMEM(2% FBS)，並加入實施例2表2編號4的樣品。BMP-2的包覆量由10μg/mL~100μg/mL。在細胞培養箱中靜置72小時，以PBS清洗細胞後，加入溶解緩衝液(lysis buffer)後，以離心取得上清液進行雙辛可寧酸(bicinchoninic acid,BCA)測定檢測蛋白質濃度，及使用對-硝基苯酚磷酸鹽(p-nitrophenyl palmitate,pNPP)基質測試ALP活性。
請參閱第5圖，結果顯示：經本實施例奈米載體(磷脂醯膽鹼(PC)/膽固醇)包覆後的人類骨形成蛋白(human bone morphogenetic protein 2,BMP-2)較未經奈米載體包覆的人類骨形成蛋白(BMP-2)可提升鹼性磷酸酵素(alkaline phosphatase,ALP)的活性大約1.5~1.7倍。
【實施例4】
本發明包覆生物活性物質(BMP-2)之奈米載體(磷脂醯膽鹼(PC)/膽固醇/維生素)對鹼性磷酸酵素(ALP)活性之影響
ALP測試方法
取C2 C12 細胞調整細胞濃度為4×104 cells/ml，於24-井細胞培養盤中置入0.5ml，放入5% CO2 細胞培養箱中靜置18小時，使細胞均勻貼附於細胞培養盤內。將貼附完成的細胞培養盤中的培養基更換成DMEM(2% FBS)，並加入實施例2表2編號3的樣品。其餘加入的奈米載體包覆不同維生素。在細胞培養箱中靜置72小時，以PBS清洗細胞後，加入溶解緩衝液(lysis buffer)後，以離心取得上清液進行雙辛可寧酸測定(BCA assay)檢測蛋白質濃度，及使用對-硝基苯酚磷酸鹽基質(pNPP substrate)測試ALP活性。
請參閱第6圖，結果顯示：經本實施例奈米載體(磷脂醯膽鹼(PC)/膽固醇/維生素A)包覆後的人類骨形成蛋白(human bone morphogenetic protein 2,BMP-2)較未經奈米載體包覆的人類骨形成蛋白(BMP-2)可大幅提升鹼性磷酸酵素(alkaline phosphatase,ALP)的活性大約3倍之多(由3.1提升至9.9)，且較未經奈米載體包覆的2倍(100μg/ml)人類骨形成蛋白(BMP-2)所產生的鹼性磷酸酵素(ALP)活性(5.1)還高。
【實施例5】
本發明包覆生物活性物質(BMP-2)之奈米載體(磷脂醯膽鹼(PC)/膽固醇/維生素A)對鹼性磷酸酵素(ALP)活性之影響
ALP測試方法
取C2 C12 細胞調整細胞濃度為4×104 cells/ml，於24-井細胞培養盤中置入0.5ml，放入5% CO2 細胞培養箱中靜置18小時，使細胞均勻貼附於細胞培養盤內。將貼附完成的細胞培養盤中的培養基更換成DMEM(2% FBS)，並加入實施例2表2編號3的樣品。樣品包覆不同劑量維生素A。在細胞培養箱中靜置72小時，以PBS清洗細胞後，加入溶解緩衝液(lysis buffer)後，以離心取得上清液進行雙辛可寧酸測定(BCA assay)檢測蛋白質濃度，及使用對-硝基苯酚磷酸鹽基質(pNPP substrate)測試ALP活性。
請參閱第7圖，結果顯示：經本實施例奈米載體(磷脂醯膽鹼(PC)/膽固醇/維生素A(高劑量0.26μmol/mL))包覆後的人類骨形成蛋白(human bone morphogenetic protein 2,BMP-2)較未經奈米載體包覆的人類骨形成蛋白(BMP-2)可大幅提升鹼性磷酸酵素(alkaline phosphatase,ALP)的活性大約19倍之多(由0.65提升至11.3)，且較未經奈米載體包覆的4倍(200μg/ml)人類骨形成蛋白(BMP-2)所產生的鹼性磷酸酵素(ALP)活性(1.7)還高。顯見，當提高奈米載體維生素A的劑量時，將使得鹼性磷酸酵素(ALP)的活性顯著攀升。
【實施例6】
本發明奈米載體(磷脂醯膽鹼(PC)/膽固醇)包覆之生物活性物質(PRP)其活性隨時間之變化
將實施例2表2編號2的負電奈米載體與編號4的正電奈米載體包覆PRP後(如包覆BMP-2的方法)，保存於4℃環境下，分別於8天與35天時取樣，利用ELISA kit分析TGF-β1、PDGF-AB含量，並比比較並觀察含量變化。
富含血小板血漿(platelets rich plasma,PRP)赋含多種活性生長因子，例如VEGF、PDGF、TGF-β、FGF等，屬於自體(autologous)濃縮血小板，可利用離心機分離純化濃縮獲得。
請參閱第8~9圖，第8圖為經本發明負電與正電奈米載體包覆的PRP，其TGF-β1含量隨時間的變化，第9圖為經本發明負電與正電奈米載體包覆的PRP，其PDGF-AB含量隨時間的變化。結果顯示：本實施例奈米載體(磷脂醯膽鹼(PC)/膽固醇)可有效保存富含血小板血漿(PRP)，使其活性於4℃環境下仍可維持至少35天，傳統血庫的血液細胞保存只有7天，通常使用時間約3~5天，過期即拋棄，而本發明建立了長效保存PRP的方法。
【實施例7】
本發明生醫材料(Agglomer)之製備
首先，將生醫玻璃(bioglass)、HATCP或硫酸鈣等生醫材料以不同mesh進行過篩，取100mesh~600mesh的生醫材料。之後，將上述100mesh~600mesh的生醫材料與實施例2表2編號1~4的奈米載體進行混摻。奈米載體與生醫材料混摻比例為1:20,000。
【實施例8】
本發明生物活性支架(幾丁聚醣/膠原蛋白)之製備
首先，將1%(w/w)的醋酸溶液配製成1%~2%的幾丁聚醣(chitosan)溶液。之後，將幾丁聚醣溶液與不同比例的膠原蛋白(collagen)溶液進行混合，以形成一混合液，此階段操作於4℃的反應槽內進行。接著，於上述混合液中加入戊二醛或桅子素(genipin)進行交聯反應。之後，將此混合液注入模具中，以慢速冷凍至-20℃達24小時凍乾。最後，以酒精清洗數次，再以水清洗後凍乾即完成本實施例生物活性支架(幾丁聚醣/膠原蛋白)之製作。
【實施例9】
本發明微粒(microsphere)之製備
首先，取50mg多孔性HATCP作為核心結構，將1ml實施例2表2所製備帶正電荷的奈米載體(nanocarrier)大量吸附於多孔生醫玻璃中，如實施例7混摻比例。之後，將此生醫材料塗佈1%~5%正電荷的幾丁聚醣(chitosan)，再塗佈1%~5%負電荷的海藻酸(alginate)，形成相斥電荷吸附的多醣體層(polysaccharide shell)。最後，再塗佈1%~5%膠原蛋白(collagen)或明膠(gelatin)，以完成本實施例多層微粒(microsphere)結構之製備。
【實施例10】
本發明生醫材料(Agglomer)之控制釋放
將實施例7所製備的Agglomer置於水溶性緩衝溶液中觀察其控制釋放情形。取樣時間分別為起始點、1小時、3小時、8小時、1天、2天、4天、8天、12天與14天。取樣後以ELISA進行分析，結果如第10圖所示。
結果顯示：Agglomer置於水溶液時，就會有部份釋放，至4天後開始有較明顯釋出。而於12天後開始大量釋放。此即表示Agglomer對BMP-2的釋放可達14天以上。理論值OD450 =1.48時，釋放率為100%。
【實施例11】
本 發 明生醫材料(Agglomer)對鹼性磷酸酵素(ALP)活性之影響
取C2 C12 細胞調整細胞濃度為4×104 cells/ml，於12-井細胞培養盤中置入1.0 ml，放入5% CO2 細胞培養箱中靜置18小時，使細胞均勻貼附於細胞培養盤內。將貼附完成的細胞培養盤中的培養基更換成DMEM(2% FBS)，放入8.0μm孔徑之transwell，將生醫材料(Agglomer)如實施例7樣品置放其中再加入培養基覆蓋樣品。在細胞培養箱中靜置72小時，以PBS清洗細胞後，加入溶解緩衝液(lysis buffer)後，以離心取得上清液進行雙辛可寧酸測定(BCA assay)檢測蛋白質濃度，及使用對-硝基苯酚磷酸鹽基質(pNPP substrate)測試ALP活性。
請參閱第11圖，結果顯示：含實施例5所製備奈米載體(磷脂醯膽鹼(PC)/膽固醇/維生素A(高劑量0.26μmol/mL))的Agglomer，其人類骨形成蛋白(human bone morphogenetic protein 2,BMP-2)較未經奈米載體包覆的人類骨形成蛋白(BMP-2)可提升鹼性磷酸酵素(alkaline phosphatase,ALP)的活性大約5倍之多(由1.00提升至5.40)。
【實施例12】
本發明生醫材料(Agglomer)之骨修復效果
將實施例2所製備帶正電荷的奈米載體與200μm大小帶負電的生醫玻璃(bioglass)進行混摻，以此Agglomer(如實施例7，但奈米載體與生醫材料混摻比例調整為1:7,000)進行動物實驗。以器具切除老鼠5mm*5mm大小的骨頭(如第12A圖所示)，觀察12週。進行測試的材料包括第一代修復材料，目的即是為驗證本發明奈米載體之功效。本實施例奈米載體結合帶負電且經FDA認可之生醫材料，與其它對照組比較骨修復之狀況。
12週後，利用X-Ray檢測修復情況，結果顯示：僅使用膠原蛋白(collagen)的對照組並無骨修復的情形(如第12B圖所示)，僅使用生醫玻璃(bioglass)的對照組略有看到骨修復(如第12C圖所示)，而加入奈米載體的組別(如第12E圖所示)則較其它組的修復來的好，尤其是裂隙連接(gap junction)的位置較含BMP-2(未包覆)的生醫玻璃組(如第12D圖所示)來的好。因此，可證實利用生醫玻璃/奈米載體的組裝對骨修復的效果確實較好。但，骨修復密度可能與含BMP-2(未包覆)的生醫玻璃組相差不多。因此，可改用Agglomer/奈米載體(磷脂醯膽鹼(PC)/維生素/BMP-2)，由於提高了BMP-2的功效與Agglomer的控制釋放效果，將有助於骨修復密度的提升以及更佳的骨整合(osseointegration)，並降低BMP-2的使用量。上述利用micro-CT影像分析，12週骨缺損癒合修復的結果如第13圖所示，含有BMP-2的組別，其骨體積(bone volume=BV/TV)增加最多，其中以奈米載體包覆生長因子(BMP-2)的組別最佳。
【實施例13】
本發明生醫材料(Agglomer)之壓錠
為實現本發明奈米載體(nanocarrier)、微粒(microsphere)可順利與各式生醫材料結合，並可依據需求設計配方加入不同賦形劑以達緩釋或增加硬度之效果，因此，本實施例將奈米載體與不同生醫骨材(主材料)(生醫玻璃(bioglass)、羥基磷灰石-磷酸三鈣(HATCP)、β-磷酸三鈣(β-TCP))及賦形劑(如黏合劑(例如纖維素、羧甲基纖維素(carboxymethyl cellulose)、甲基纖維素、海藻酸鈉(sodium alginate)、明膠(gelatin))、潤滑劑(例如硬脂酸鎂、二氧化矽))依不同比例均勻混合(各配方之組成比例如下表3所示)，進行壓錠。本發明所使用之生醫材料不以多孔性為限，如下表6之主材料為非多孔性β-磷酸三鈣。以下結果顯見本發明奈米載體可與生醫材料結合並包覆於其中。壓錠後之測試重量及硬度結果如下表4~6所示。
根據上述測試結果顯示：本發明奈米載體(nanocarrier)、微粒(microsphere)可順利與各式生醫材料結合，並可依據需求設計不同配方以控制硬度，必要時亦可加入崩散劑或抑制崩散劑等，以控制藥物釋出速率，甚至可搭配膜衣等表面改質技術，或是加入其他材料使用，以達保護與控制釋放之效果。
雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此項技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
10．．．生醫材料
12．．．多孔性生物相容性材料
14．．．載體
16．．．多醣體層
18．．．膠原蛋白層
20．．．膠囊
22．．．抗微生物劑
第1圖係根據本發明之一實施例，一種生醫材料；
第2圖係根據本發明之一實施例，一種生醫材料；
第3圖係根據本發明之一實施例，一種生醫材料；
第4圖係根據本發明之一實施例，一種生醫材料膠囊；
第5圖係根據本發明之一實施例，包覆生物活性物質(BMP-2)之奈米載體(磷脂醯膽鹼(PC)/膽固醇)對鹼性磷酸酵素(ALP)活性之影響；
第6圖係根據本發明之一實施例，包覆生物活性物質(BMP-2)之奈米載體(磷脂醯膽鹼(PC)/維生素)對鹼性磷酸酵素(ALP)活性之影響；
第7圖係根據本發明之一實施例，包覆生物活性物質(BMP-2)之奈米載體(磷脂醯膽鹼(PC)/維生素A)對鹼性磷酸酵素(ALP)活性之影響；
第8圖係根據本發明之一實施例，富含血小板血漿(PRP)中TGF-β1含量隨時間之變化；
第9圖係根據本發明之一實施例，富含血小板血漿(PRP)中PDGF-AB含量隨時間之變化；
第10圖係根據本發明之一實施例，生醫材料(Agglomer)之釋放控制曲線；
第11圖係根據本發明之一實施例，生醫材料(Agglomer)對鹼性磷酸酵素(ALP)活性之影響；
第12A~12E圖係根據本發明之一實施例，生醫材料(Agglomer)與其他對照組對骨修復之效果；
第13圖係根據本發明之一實施例，生醫材料(Agglomer)與其他對照組對骨體積增加之效果。
12．．．多孔性生物相容性材料
14．．．載體
16．．．多醣體層
18．．．膠原蛋白層

Claims (15)

  1. 一種生醫材料，包括：一生物相容性材料，該生物相容性材料包括羥基磷灰石-磷酸三鈣(hydroxyapatite tricalcium phosphate,HATCP)、β-磷酸三鈣(β-tricalcium phosphate,β-TCP)、α-磷酸三鈣(α-tricalcium phosphate,α-TCP)、生物活性玻璃陶瓷(bioactive glass ceramic)、硫酸鈣、骨水泥(bone cement)、明膠(gelatin)、膠原蛋白(collagen)、聚乳酸-甘醇酸(poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)、聚己內酯多元醇(polycaprolactone,PCL)或彈性蛋白(elastin)；以及一油脂載體，分佈於該生物相容性材料之表面，其中該生物相容性材料與該油脂載體兩者均不帶電荷、其中一者帶電荷或兩者均帶電荷但為相異電性，其中該油脂載體與該生物相容性材料之重量比介於1：100,000~1：100。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之生醫材料，其中該載體與該生物相容性材料之重量比介於1：10,000~1：1,000。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之生醫材料，其中該生物相容性材料為一多孔性生物相容性材料。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之生醫材料，其中該載體更包括分佈於該多孔性生物相容性材料之孔隙中或包覆於該多孔性生物相容性材料中。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之生醫材料，其中該油脂包括磷脂醯膽鹼(phosphatidylcholine,PC)、磷脂醯乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)、1,2-二油氧基-3-三甲基氨基丙烷(1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium propane, DOTAP)、2,3-二油氧基丙基-三甲基氯化銨(2,3-dioleoyloxypropyl-trimethylammonium chloride,DOTMA)、磷脂酸(phosphatidic acid,PA)、磷脂質絲胺酸(phosphatidylserine,PS)、磷脂醯甘油(phosphatidylglycerol,PG)、3β-[N-(N' ,N' -二甲基胺乙基)胺基甲醯基]膽固醇(3ß-[N-(N',N'-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol,DC-CHOL)、雙十六烷基磷酸鹽(dihexadecyl phosphate,DHDP)或其衍生物。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之生醫材料，其中該油脂之重量份介於0.1~30，以該載體為100重量份。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之生醫材料，其中該載體更包括維生素A、C、D、E、K、B1、B3、B6、B7、B12、葉酸(folate)、泛酸(pantothenic acid)或其衍生物。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之生醫材料，其中該載體更包括鉀、鈣、鐵、鎂、鋅、銅、錳、鉬、鎳、矽、鉻、磷、硫或氯。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之生醫材料，更包括一生物活性物質，包覆於該載體內。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之生醫材料，其中該生物活性物質包括生長因子、蛋白質、胜肽、DNA或RNA。
  11. 如申請專利範圍第9項所述之生醫材料，其中該生物活性物質包括細胞激素(cytokines)、細胞外基質(extracellular matrix,ECM)或細胞附著分子(cell adhesion molecules,CAM)。
  12. 如申請專利範圍第9項所述之生醫材料，其中該生物活性物質包括富含血小板血漿(platelets rich plasma,PRP)、顆粒細胞(granulocytes)或幹細胞(stem cells)。
  13. 如申請專利範圍第1項所述之生醫材料，更包括一多醣體層，包覆該生醫材料。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之生醫材料，其中該多醣體層具有正電荷與負電荷。
  15. 一種應用於軟硬組織修復與再生之生醫材料，包括：一生物相容性材料，該生物相容性材料包括羥基磷灰石-磷酸三鈣(hydroxyapatite tricalcium phosphate,HATCP)、β-磷酸三鈣(β-tricalcium phosphate,β-TCP)、α-磷酸三鈣(α-tricalcium phosphate,α-TCP)、生物活性玻璃陶瓷(bioactive glass ceramic)、硫酸鈣、骨水泥(bone cement)、明膠(gelatin)、膠原蛋白(collagen)、聚乳酸-甘醇酸(poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)、聚己內酯多元醇(polycaprolactone,PCL)或彈性蛋白(elastin)；以及一油脂載體，分佈於該生物相容性材料之表面，其中該生物相容性材料與該油脂載體兩者均不帶電荷、其中一者帶電荷或兩者均帶電荷但為相異電性，其中該油脂載體與該生物相容性材料之重量比介於1：100,000~1：100。
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