JP4703926B2 - 骨形成蛋白をデリバリーするためのヒアルロン酸の処方 - Google Patents

Description

【０００１】
発明の背景
本発明は、骨形成蛋白およびその医薬処方の分野に関する。より詳細には、本発明は、ヒアルロン酸誘導体および骨形成蛋白を含む注射可能な医薬処方に関する。さらに本発明は、ヒアルロン酸から多孔性の注射可能ゲルおよびペーストを処方する方法を提供する。
【０００２】
骨形成蛋白は、軟骨および／または骨の形成誘導の際に誘発または促進を行いうる蛋白である。近年、多くのかかる骨形成蛋白が単離され、特徴付けられており、いくつかのものは組み換え法により製造されている。例えば、いわゆる骨形態形成蛋白（ＢＭＰ）が、鉱物質除去された骨組織から単離されている（例えば、Uristの米国特許第４４５５２５６号参照）。多くのかかるＢＭＰ蛋白が組み換え法により製造されている（例えば、Wangらの米国特許第４８７７８６４号およびwangらの米国特許第５０１３５４９号参照）。形質転換成長因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）のファミリーが、骨の疾患の治療において潜在的に有用であると確認されている（例えば、Derynckらの欧州特許第１５４４３４号参照）。Ｖｇｒ−１と命名された蛋白は、骨形成細胞において高レベルで発現されることが見出されている（Lyons et al. (1989) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86, 4554-4558）。そして、ＯＰ−１、ＣＯＰ−５およびＣＯＰ−７と命名された蛋白は骨誘導活性を示すといわれている（Oppermannらの米国特許第５００１６９１号参照）。
【０００３】
骨形成蛋白を、骨形成の誘導が望まれる部位にデリバリーするように設計された種々の処方が開発されている。例えば、アクリル酸エステルポリマー（Uristの米国特許第４５２６９０９号）および乳酸ポリマー（Uristの米国特許第４５６３４８９号）のごときある種のポリマー性材料が用いられている。
【０００４】
ＯＰと命名された骨形成蛋白をデリバリーするための多孔性粒子の生分解性マトリックスがKuber A. Sampathの米国特許第５１０８７５３号に開示されている。
【０００５】
Brekkeらの米国特許第４１８６４４８号および第５１３３７５５号には、乳酸のポリマー（「ＯＰＬＡ」）から構成される非常に多孔性の生分解性材料の製造方法が記載されている。
【０００６】
Okadaらの米国特許第４６５２４４１、４７１１７８２、４９１７８９３および５０６１４９２号およびYamamotoらの米国特許第４９５４２９８号には、外側の油層中のポリマー壁物質により囲まれた内側の水性層中に封入されたポリペプチド性薬剤および薬剤保持物質を含む、長期放出マイクロカプセルが開示されている。
【０００７】
Yamazaki et al., Clin. Orthop. and Related Research, 234: 240-249 (1988)には、骨から精製された１ｍｇの骨形態形成蛋白および５ｍｇのParisのプラスターからなるインプラントの使用が開示されている。米国特許第４６４５５０３号にはヒドロキシアパタイトおよびParisのプラスターの混合物が骨インプラント材料として開示されている。
【０００８】
コラーゲンマトリックスもまた、骨形成蛋白のデリバリービヒクルとして使用されている（例えば、Jeffriesの米国特許第４３９４３７０号参照）。
【０００９】
発明の概要
本発明は、骨形成蛋白デリバリー用の注射可能処方を提供する。１の具体例において、組成物は骨形成蛋白およびヒアルロン酸エステルを含む。もう１つの具体例において、組成物はさらにリン酸三カルシウムを含む。本発明の注射可能処方は、移植可能デバイスの場合に必要な骨折観血的整復法を用いずに閉鎖骨折および他の骨格組織の修復を可能にする。
【００１０】
さらに本発明は、水和または溶媒付加によりヒアルロン酸ベンジルエステルの種々の不織パッドおよびスポンジを注射可能ゲルまたはペースト処方に変形することによって、骨形成蛋白用の担体として有用な注射可能ゲルまたはペーストを製造する方法を提供する。もう１つの具体例において、本発明は、変形された注射可能ゲルまたはペースト処方を含む組成物に関する。
【００１１】
本発明の方法および組成物は、とりわけ、軟骨および／または骨の形成を促進するために、あるいは組織ダメージおよび骨折を修復するために使用されうる骨誘導蛋白の処方の製造に有用である。さらに本発明は、軟骨および／または骨の修復および／または成長を必要とする患者の治療方法を提供する。
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明は、骨形成蛋白のデリバリーのための注射可能処方を提供する。組成物はヒアルロン酸エステルおよび骨形成蛋白の注射可能処方を含む。さらに本発明は、水和または溶媒付加によりヒアルロン酸ベンジルエステルの種々の不織パッドおよびスポンジを変形させて、インビボでの滞留時間が数日ないし数ヶ月となったゲルを得ることにより、ヒアルロン酸エステルおよび骨形成蛋白の注射可能な処方を製造する方法を提供する。ヒアルロン酸の全体的または部分的なエステルは米国特許第５３３６７６７号に記載されている。水性バッファーまたは有機溶媒（Ｎ−メチルピロリジノン、ジメチルスルホキシド等のごとき）を用いてHyaff固体の部分エステルをゲルに変形させ、有機溶媒を用いてHyaff固体の完全エステルをゲルに変形させる。他の具体例において、可溶化された担体に孔形成剤を導入して多孔性度を増大させてもよい。孔形成剤の添加は、インビボ注射後の孔形成剤の可溶化および担体の沈殿／相逆転によりインシトゥ（in situ）での孔形成を可能にし得る。多孔性度を増大させるのに適当な液体孔形成剤はポリエチレングリコールまたはＰＥＧ（体積対体積で１０〜９０％）ならびに固体孔形成剤（重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸、ショ糖等のごとき、孔形成剤：Hyaff重量比で１：１〜２１：１）を包含する。ゲル／ペーストは無機成分として、例えば０．１〜１００％（重量／体積）の範囲のＴＣＰ（リン酸三カルシウム）粒子を含むことができる。
【００１３】
孔形成剤の量、タイプおよびサイズを最適化して、孔形成剤の可溶化およびインシトゥにおける担体の沈殿／相逆転により孔形成剤および溶媒がインビボにおいて担体から抽出される場合に、細胞の内部増殖（ingrowth）に十分な空隙を残すようにする。
【００１４】
本発明により製造される注射可能担体とともに有用な骨形成蛋白は当業者によく知られており、上記のものを包含する。本発明に使用される好ましい骨形成蛋白は、米国特許第４８７７８６４号；米国特許第５０１３６４９号；ＷＯ９０／１１３６６（１９９０年１０月４日公開）；ＷＯ９１／１８０９８（１９９１年１１月２８日公開）；ＷＯ９３／００４３２（１９９３年１月７日公開）；米国出願第０８／２４７９０４および０８／２４７９０４号（両方とも１９９４年５月２０日出願）ならびに米国出願第０８／２１７７８０号（１９９４年３月２５日出願）においてＢＭＰ−１からＢＭＰ−１２として同定されているＢＭＰクラスの蛋白である。上記刊行物の開示を参照により本明細書に一体化させる。最も好ましいのはＢＭＰ−２であり、その完全長ｃＤＮＡ配列は’６４９特許に詳細に記載されている。もちろん、２種またはそれ以上のかかる蛋白の組み合わせを用いてもよい。なぜなら、かかる蛋白のフラグメントもまた骨形成活性を示すからである。かかる骨形成蛋白はホモダイマー種であることが知られているが、混合ヘテロダイマーとしても活性を示す。骨形成蛋白のヘテロダイマー形態を本発明の実施に使用してもよい。ＢＭＰヘテロダイマーはＷＯ９３／０９２２９に記載されており、参照によりその開示を本明細書に一体化させる。組み換え蛋白は天然に存在する単離蛋白よりも好ましい。本発明において有用な骨形成蛋白の量は、浸潤中の前駆細胞の骨形成活性増大を促進するに十分な量であり、治療すべき欠損のサイズおよび性質ならびに使用担体により左右されるであろう。
【００１５】
例えば腱、ダメージを受けた軟骨組織、靭帯、および／またはそれらの骨への結合組織中に処方を注射してもよい。骨のう胞、骨欠損、骨内部位およびおよび閉鎖骨折のごとき他の骨部位に注射可能処方を適用してもよい。
【００１６】
投与規則は治療すべき臨床的徴候ならびに種々の患者変数（例えば、体重、年齢、性別等）および臨床的所見（例えば、傷害の程度、傷害部位等）により決定されるであろう。一般的には、骨形成蛋白の用量は約０．１ないし４ｍｇ／ｍｌの範囲であろう。
【００１７】
注射可能骨形成蛋白処方を単一処方として病院に提供してもよく、あるいは処方を多成分キットとして提供してもよく、キット中において、例えば骨形成蛋白が１のバイアル中に提供され、注射可能ヒアルロン酸ペーストが別個に提供されてもよい。
【００１８】
本発明の組成物は、軟骨および／または骨の形成が望まれる傷害部位に治療上有効量の骨形成蛋白をデリバリーするものである。新鮮な偽関節骨折、脊椎固定、成形外科分野の骨欠損修復において；頭蓋／顎顔面再構成において；補てつ組み込みのために、特にヒドロキシアパタイト被覆補てつのごとき補てつインプラントの固定性を改善する表面コーティングとして；骨再生に関する骨髄炎において；ならびに歯槽隆起および歯周欠損および抜歯跡の補充のための歯科分野において、処方を自己由来の骨グラフトの代用品として使用してもよい。本発明の方法および処方は、骨粗しょう症の治療および／または予防、あるいは骨粗しょう症またはオステオペニアの骨の治療において有用でありうる。もう１つの具体例において、本発明の処方を伸延骨形成として知られるプロセスに使用してもよい。最小の感染を伴った骨髄炎の治療または骨修復に使用する場合、骨形成蛋白を多孔性微粒子および抗体と組み合わせて使用し、さらにアルギネート、セルロース性物質、特にカルボキシメチルセルロースのごとき蛋白隔離剤（sequestering agents）を添加し、水性グリセロールで希釈してもよい。本発明のデバイスに使用するのに好ましい抗生物質はバンコマイシンおよびゲンタマイシンを包含する。抗生物質はいすれの医薬上許容される形態であってもよく、例えば、バンコマイシンＨＣｌまたは硫酸ゲンタマイシンであってもよい。好ましくは、抗生物質は約０．１ｍｇ／ｍＬないし約１０．０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。医薬上許容される形態の処方の伝統的な調合物（すなわち、パイロジェン不含であるもの、適切なｐＨおよび等張性を有するもの、滅菌されているもの等）は当業者によく知られており、本発明の処方に適用可能である。
【００１９】
不溶性または部分的に可溶性の不織パッドまたはスポンジの水和または溶媒付加により製造される本発明のヒアルロン酸誘導体組成物を、他の薬剤、成長因子、ペプチド、蛋白、サイトカイン、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＤＮＡおよびポリマーと組み合わせて使用してもよい。これらの化合物を担体と混合することにより、これらの化合物を添加してもよい。あるいは、ポリマー担体に共有結合させることにより添加してもよい。ＢＭＰｓをコードするＤＮＡならびにＢＭＰ蛋白をコードする遺伝子でトランスダクションまたはトランスフェクションされた細胞とともにヒアルロン酸誘導体組成物を使用してもよい。
【００２０】
下記の実施例は本発明を説明するものであり、何ら限定するものではない。修飾、変更および小さな改良は本発明の範囲内にあると考えられ、また本発明の範囲内にある。
【００２１】
実施例１
注射可能ヒアルロン酸エステルの製造
出発物質であるHyaffヒアルロン酸（Fidia Advanced Biopolymers, Abano Terne, Italy）材料は不織パッド、フェルト、シート、粉末、スポンジ、および微粒子のごとき固体である。Hyaff材料は、種々のエステル部分（例えば、ベンジル、エチル、プロピルまたはヒドロコルチゾンもしくはメチルプレドニソロンのごとき大型分子等）ならびに種々のエステル化程度（すなわち、部分エステルまたは完全エステル）を示すヒアルロン酸のエステルである。Hyaffの部分エステルは５０〜９９％のエステル化パーセントの範囲により示され（例えば、Hyaff-11p65、Hyaff-11p80等）、完全エステルは１００％のヒアルロン酸エステルである（例えば、Hyaff-11）。データを支持する際に用いられるHyaffゲルの分類は下記のごとくであり、処方選択例をその後に記載する：
−Hyaff-11ゲル：有機溶媒を用いてHyaff-11不織パッドをゲルに変形させて１０％固体を得る。
−Hyaff-11／バイカーボネートゲル（bicarbonate gel）：Hyaff-11に対するバイカーボネートの割合を１５：１（ｗ／ｗ）として、Hyaff-11ゲルを孔形成剤としての重炭酸ナトリウムと混合する。
−Hyaff-11／ＰＥＧゲル：Hyaff-11ゲルを、３３〜５０％（ｖ／ｖ）の範囲の孔形成剤としてのポリエチレングリコール（２００ｍｗ）と混合する。
−Hyaff-11／ＴＣＰゲル：Hyaff-11ゲルを３０％ ｗ／ｖのＴＣＰと混合する。−Hyaff-11／バイカーボネート／ＴＣＰゲル：Hyaff-11／バイカーボネートゲルを３０％ ｗ／ｖのＴＣＰと混合する。
−Hyaff-11／ＰＥＧ／ＴＣＰゲル：Hyaff-11／ＰＥＧゲルを３０％ ｗ／ｖのＴＣＰと混合する。
−Hyaff-11p80ゲル：有機溶媒を用いてHyaff-11p80不織パッドをゲルに変形させて５％固体を得る。
−Hyaff-11p65ゲル：水性バッファーを用いてHyaff-11p65不織パッドをゲルに変形させて６〜１５％固体を得る。
−Hyaff-11p65／ＴＣＰゲル：Hyaff-11p65ゲルを３０％ ｗ／ｖのＴＣＰと混合する。
【００２２】
ｒｈＢＭＰ−２（最終濃度０．１ｍｇ／ｍＬ）を含有するグルタミン酸バッファー（ｐＨ４．５）でHyaff-11p65不織パッドを水和させて６％ないし１５％固体（ｗ／ｖ）を得て、完全に混合してペーストを得た。Hyaff-11p80およびHyaff-11不織パッドをＮ−メチル−ピロリジノン（ＮＭＰ）またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に可溶化させて１〜３０％（ｗ／ｖ）溶液を得た。次いで、これらの溶液をｒｈＢＭＰ−２含有バッファー（１０％ ｖ／ｖ，０．１ｍｇ／ｍＬ ｒｈＢＭＰ−２）または凍結乾燥ｒｈＢＭＰ−２（０．１ｍｇ／ｍＬ）のいずれかと混合し、次いで、種々の孔形成剤（ポリエチレングリコール、重炭酸ナトリウム、ショ糖、ＮａＣｌ、クエン酸）およびリン酸三カルシウム（ＴＣＰ）を添加した。固体孔形成剤およびＴＣＰの粒子サイズは＜６００μｍ、好ましくは＜２００μｍであった。ＰＥＧ（２００ｍｗ）のごとき液体孔形成剤を１０〜９０％（ｖ／ｖ）の割合で混合し、固体孔形成剤を担体に対して９：１〜２１：１（ｗ／ｗ）で混合した。ＴＣＰを０．１〜３０（ｗ／ｖ）で混合した。ＴＣＰ（４５〜１２５ミクロンの粒子サイズ）をｒｈＢＭＰ−２/Hyaff-11またはｒｈＢＭＰ−２/Hyaff-11p65ゲル中に３０％（ｗ／ｖ）で完全に混合した。別に、先ずｒｈＢＭＰ−２をＴＣＰ上に吸着させ、次いで、Hyaff-11またはHyaff-11p65ゲルと混合した。１８ｇ注射針による注射可能性に基づいて処方を選択した。走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）により微細構造を特徴づけた。
【００２３】
ＳＥＭにより、種々の孔構造および多孔性度が明らかとなった。Hyaff-11p65 ６％ゲルは１５％処方よりも長い繊維を示したが、両方とも高レベルの多孔性度を示した。Hyaff-11およびHyaff-11p80ゲルは最小の孔構造および多孔性度を示したが、孔形成剤を伴ったそれらの担体は高レベルの多孔性度を示した。注射可能な混合物を生じさせる孔形成剤および／または添加剤はＰＥＧ、重炭酸ナトリウムおよびＴＣＰであった。
【００２４】
実施例２
インビトロ放出キネティクス
Indogen法（Pierce）を用いてｒｈＢＭＰ−２を^１２５Ｉで放射標識し、１００μｌのHyaff-11p65ゲル、Hyaff-11p80ゲル、Hyaff-11ゲルおよびHyaff-11/PEG（ｎ＝４）中でデリバリーされた０．１ｍｇ／ｍｌのｒｈＢＭＰ−２に関するトレーサーとして使用した。^１２５Ｉ−ｒｈＢＭＰ−２をロードした試料（５００００ｃｐｍ／試料）を、シェーカーにて、１ｍｌのウシ胎児血清（Hyclone）中３７℃でインキュベーションし、ガンマカウンターを用いて担体の放射活性を１４日目まで測定した。各時点において新鮮血清に置き換えた。注射可能処方からの^１２５Ｉ−ｒｈＢＭＰ−２の放出を、Hyaff-11およびHyaff-11p80の移植可能スポンジおよびパッドからの放出と比較した。
【００２５】
インビトロでの放出の研究およびラット異所性研究（ectopic study）のために、誘導体化ヒアルロン酸の自己架橋性多糖形態であるＡＣＰゲルを用いる。インビトロでの放出を研究するために、２ｍｌのＡＣＰゲルを１．５３ｍｇのｒｈＢＭＰ−２ケーク（６１ｍｇのケーク重量あたり８ｍｇのｒｈＢＭＰ−２で０．２ｍｇの実際のｒｈＢＭＰ−２に相当）および^１２５Ｉ−ｒｈＢＭＰ−２（全部で１００ｍｌ，２０ｍＣｉ／２００ｍｌゲル）と混合し、１ｍｌのシリンジ中に吸い込んで約１０％ゲルの希釈物を得る。ラット異所性研究用のＡＣＰゲルはトレーサーを含まないが、ＭＲＦ−００９０６で希釈される。２２ゲージの注射針を用いて２００ｍｌの注射を行う。ｒｈＢＭＰ−２の最終濃度は２００ｍｌの注射につき約２０ｍＣｉであろう。ＡＣＰゲルは室温で注射されるであろう。
【００２６】
インビトロでの放出キネティクスは、Hyaff-11/PEGゲルにおいて２週間にわたり最大のｒｈＢＭＰ−２保持を示し、次いで、Hyaff-11p80ゲル、そしてHyaff-11ゲルにおいて保持されていた（図１）。Hyaff-11p65ゲルはｒｈＢＭＰ−２を最も早く放出した。Hyaff-11およびHyaff-11p80のスポンジおよびパッドはHyaff-11/PEGまたはHyaff-11p80ゲルよりもｒｈＢＭＰ−２を保持しなかったが、Hyaff-11p65よりは保持した。Hyaff-11ゲルへのＴＣＰの添加によりｒｈＢＭＰ−２保持が増大した。すべての担体における放出プロファイルは、ｒｈＢＭＰ−２の中程度ないし迅速なバースト放出、その後、ゆっくりとした持続性の放出を示した。Hyaff-11p65を除き、すべてのHyaff-１１およびHyaff-11p80ゲル処方はｒｈＢＭＰ−２を十分に（１４日後において＞５０％保持）保持した。
【００２７】
実施例３
ラット異所性研究
０．１ｍｇ／ｍｌのｒｈＢＭＰ−２を含有するHyaff-11をベースにしたゲル（２００μｌ／部位、ｎ＝６）を、生後３〜４週間のオスのLong Evansラットに皮下注射（腹側胸郭）または筋肉内注射（四頭筋）した。２週間後にラットを殺し、Goldnerのトリクローム染色を用いてエクスプラントにおける骨形成を組織学的に分析した。組織形態学的計測に基づいて骨スコア（０＝骨なし、５＝１００％骨）をつけた。エクスプラントのサイズおよび骨スコアを用いて全骨（total bone）（ｍｍ^３）を計算した。エクスプラントのラジオグラフも得た。
【００２８】
ｒｈＢＭＰ−２存在下におけるラットモデルにおいてHyaff-11をベースにしたゲルはすべて有意な異所性の骨を形成した（表１）が、ラジオグラフおよび組織学によれば担体のタイプにより骨形成の相違があった。種々の用量のｒｈＢＭＰ−２（０．１〜１．５ｍｌ／ｍＬ）においてHyaff-11p65は骨形成（および骨スコア）の用量依存的増加を示したが、エクスプラントサイズにおいては一致せず、全骨がより少なかった（０．１ｍｇ／ｍＬのｒｈＢＭＰ−２のデータを示す）。Hyaff-11p80エクスプラントは大きかったが低い骨スコアを有し、Hyaff-11は良好な骨スコアおよび全骨を示した。Hyaff-11/PEGおよびHyaff-11/重炭酸ナトリウムはラジオグラフ上、Hyaff-11およびHyaff-11p80と同等のラジオオパシティー（radioopacity）を示した。組織学的に、Hyaff-11およびHyaff-11p80担体は両方とも、それらの分解速度が小さいために残存マトリックスを示したが、Hyaff-11p65は２週間目までに完全に分解した。孔中に骨が形成され、それは無機質化作用を有する骨芽細胞ならびに軟骨中間体により示された。孔形成剤存在下または不存在下におけるHyaff-11ゲルへのＴＣＰの添加は、他のHyaffをベースとしたゲルの骨形成のラジオグラフィー上の証拠と同様の比較可能なラジオグラフィー上の証拠を示した。
【００２９】
【表１】

【００３０】
実施例４
インビボでの生体内分配（biodistribution）
ウサギ尺骨骨折モデルを用いて各担体中のｒｈＢＭＰ−２の保持をインビボで分析した。両側の０．５ｍｍの骨切り術による欠損を、Nwe Zealand シロウサギの尺骨に作成し、該欠損中に１５０μＬのｒｈＢＭＰ−２／担体を注射した。ゲルに４０μＣｉの^１２５Ｉ標識ｒｈＢＭＰ−２および０．６７ｍｇ／ｍｌの未標識ｒｈＢＭＰ−２をロードした。骨折部位に保持された放射活性量を、ガンマシンチグラフィーにより時間の関数として測定した。
【００３１】
ウサギ尺骨骨折モデルにおけるHyaff-11/PEGゲルに由来するｒｈＢＭＰ−２のインビボでの生体内分配は、吸収可能コラーゲンスポンジ（ＡＣＳ）およびバッファー担体（ＭＦＲ−８４２）よりも良好なｒｈＢＭＰ−２の保持を示した（図２）。７日後においてHyaff-11/PEGは約４０％のｒｈＢＭＰ−２を保持していた。Hyaff-11p65ゲルはHyaff-11/PEGよりもｒｈＢＭＰ−２を保持しないことが示されたが、比較可能な骨折カルスがラジオグラフィーにより示された。
【００３２】
実施例５
インビトロ放出キネティクス
Indogen法（Pierce）を用いてｒｈＢＭＰ−２を^１２５Ｉで放射標識し、１００μｌのHyaff-11ゲル±ＴＣＰおよびHyaff-11p65ゲル±ＴＣＰ（ｎ＝４）中でデリバリーされた０．１ｍｇ／ｍｌのｒｈＢＭＰ−２に関するトレーサーとして使用した。^１２５Ｉ−ｒｈＢＭＰ−２をロードした試料（５００００ｃｐｍ／試料）を、シェーカーにて、１ｍｌのウシ胎児血清（Hyclone）中３７℃でインキュベーションし、ガンマカウンターを用いて担体の放射活性を１４日目まで測定した。各時点において新鮮血清に置き換えた。
【００３３】
ＴＣＰの添加により、Hyaff-11およびHyaff-11p65ゲルの両方において２週間にわたるｒｈＢＭＰ−２の保持が増大した（図３）。Hyaff-11/TCPは最も多くのｒｈＢＭＰ−２を保持し、次いで、Hyaff-11、Hyaff-11p65/TCP、そしてHyaff-11p65の順であった。Hyaff-11は、その疎水性および不溶性により、Hyaff-11p65よりも多くのｒｈＢＭＰ−２を保持した。ＴＣＰ上へのｒｈＢＭＰ−２の前吸着はHyaff-11ゲル中のｒｈＢＭＰ−２保持を増加させ、Hyaff-11相中へのｒｈＢＭＰ−２の混合とは逆であった。ＴＣＰまたはHyaff-11p65相中へのｒｈＢＭＰ−２の前吸着または混合は同様なｒｈＢＭＰ−２保持を引き起こし、いずれもＴＣＰ無しのHyaff-11p65よりも多かった。
【００３４】
実施例６
インビボでの生体内分配および有効性
Hyaff-11/TCPおよびHyaff-11p65/TCP中のｒｈＢＭＰ−２の保持を、ウサギ尺骨骨折モデルを用いてインビボにおいて分析した。New Zealandシロウサギ（ｎ＝３／担体）において両側の０．５ｍｍの骨切り術により欠損を作成し、１５０μＬの担体またはバッファー（０．６７ｍｇ／ｍＬ ｒｈＢＭＰ−２）を欠損周囲に注射した。２０μＣｉの^１２５Ｉ−ｒｈＢＭＰ−２をトレーサーとして使用した。骨折部位の各担体中に残った放射活性量を、数週間にわたりガンマカシンチグラフィーにより測定し、インビボにおける経時的なｒｈＢＭＰ−２保持を計算した。４週間後に屠殺して、これらのウサギ（ｎ＝８）においてねじれ力生化学的試験により骨折修復効率を分析して、最大トルクを得た。対側肢を手術対照とした。
【００３５】
ウサギ尺骨骨折部位におけるｒｈＢＭＰ−２のインビボでの保持は、インビトロでの研究と同様のパターンを示した（図４）。Hyaff-11/TCPゲル（ＴＣＰ相に最初に吸着したｒｈＢＭＰ−２）は最大の保持（４週間後に４０％保持）を示し、次いで、Hyaff-11p65/TCPゲル（１４日目のｒｈＢＭＰ−２検出不能）そしてバッファー（７日目に検出不能）であった。ｒｈＢＭＰ−２は、Hyaff-11p65/TCPまたはHyaff-11p65ゲル中でデリバリーされた場合に骨折治癒を加速した。Hyaff-11p65/TCPおよびHyaff-11p65に関する最大トルク（Ｎ−ｍ）は、それらの対側手術対照よりも有意に大きかった（それぞれ、８５．６％および９６．９％）が、統計学的には互いに差がなかった（表１）。
【表２】

【００３６】
上記説明は本発明の現在好ましい具体例を詳述するものである。その実施に際して多くの修飾および変更が、これらの説明を考慮した当業者により行われると考えられる。それらの修飾は添付した特許請求の範囲中に包含されるものと確信する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、Hyaffゲル中の^１２５Ｉ−ｒｈＢＭＰ−２のインビトロでの放出キネティクスを示す。
【図２】 図２は、Hyaff-11/PEG、ＡＣＳ、およびバッファー中の^１２５Ｉ−ｒｈＢＭＰ−２のインビボにおける保持を示す。
【図３】 図３は、Hyaffゲル／ＴＣＰ中の^１２５Ｉ−ｒｈＢＭＰ−２のインビトロでの放出キネティクスを示す。
【図４】 図４は、^１２５Ｉ−ｒｈＢＭＰ−２のインビボでの生体内分配を示す。

Claims (23)

1. 骨形成蛋白をデリバリーするための注射可能な組成物であって、
   （ａ）ＯＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１およびＢＭＰ−１２からなる群より選択される骨形成蛋白；
   （ｂ）注射可能ヒアルロン酸ベンジルエステル；および
   （ｃ）ポリエチレングリコールまたは重炭酸ナトリウムから選択される孔形成剤を含み、医薬上許容される混合物を含む、注射可能な組成物。
2. さらにリン酸三カルシウムを含む請求項１の組成物。
3. 注射によって、骨形成蛋白およびヒアルロン酸ベンジルエステルが多孔性の沈殿を形成する請求項１の組成物。
4. 注射によって、孔形成剤がインシトゥでの可溶化により骨形成蛋白およびヒアルロン酸ベンジルエステルから抽出される請求項１の組成物。
5. 骨形成蛋白が、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１およびＢＭＰ−１２からなる群より選択されるものである請求項１の組成物。
6. 骨形成蛋白がＢＭＰ−２である請求項５の組成物。
7. 骨形成蛋白がＯＰ−１である請求項１の組成物。
8. 孔形成剤がポリエチレングリコールである請求項１の組成物。
9. ヒアルロン酸ベンジルエステルが有機溶媒中でゲルまたはペーストに変形されたものである請求項１の組成物。
10. ヒアルロン酸ベンジルエステルが水性バッファー中でゲルまたはペーストに変形されたものである請求項１の組成物。
11. ヒアルロン酸ベンジルエステルが１００％エステル化されたものである請求項１の組成物。
12. 孔形成剤がポリエチレングリコールである請求項１１の組成物。
13. ヒアルロン酸ベンジルエステルが有機溶媒中でゲルまたはペーストに変形されたものである請求項１１の組成物。
14. さらにリン酸三カルシウムを含む請求項１１の組成物。
15. 骨形成蛋白が、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１およびＢＭＰ−１２からなる群より選択されるものである請求項１１の組成物。
16. ヒアルロン酸ベンジルエステルが５０％〜９９％エステル化されたものである請求項１の組成物。
17. 孔形成剤がポリエチレングリコールである請求項１６の組成物。
18. ヒアルロン酸ベンジルエステルが有機溶媒中でゲルまたはペーストに変形されたものである請求項１６の組成物。
19. さらにリン酸三カルシウムを含む請求項１６の組成物。
20. 骨形成蛋白が、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１およびＢＭＰ−１２からなる群より選択されるものである請求項１６の組成物。
21. 骨形成蛋白をデリバリーするための注射可能な組成物であって、
    （ａ）ＢＭＰ−２；
    （ｂ）注射可能ヒアルロン酸ベンジルエステル；
    （ｃ）リン酸三カルシウム；および
    （ｄ）ポリエチレングリコールまたは重炭酸ナトリウムから選択される孔形成剤を含み、医薬上許容される混合物を含む、注射可能な組成物。
22. ヒアルロン酸ベンジルエステルとポリエチレングリコールまたは重炭酸ナトリウムから選択される孔形成剤とを含み、注射可能な骨形成蛋白用注射可能マトリックスを提供する、注射可能な組成物。
23. 不溶性または部分的に可溶性のヒアルロン酸ベンジルエステルの不織パッドまたはスポンジを水和または溶媒付加により変形させること、ＯＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１およびＢＭＰ−１２からなる群より選択される骨形成蛋白質を添加すること、およびポリエチレングリコールまたは重炭酸ナトリウムから選択される孔形成剤を添加することを含む、請求項１の組成物の製造方法。

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