CN108324994B - 珍珠粉人工骨的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及假体材料或假体被覆材料技术领域，尤其是珍珠粉人工骨及其制备方法，其原料组成包括纳米级珍珠粉、透明质酸钠、重组人骨形态发生蛋白‑2和浓度为1％的醋酸溶液；各原料之间的比例如下：纳米级珍珠粉与透明质酸钠之间的质量比为10:0.5～2；纳米级珍珠粉与重组人骨形态发生蛋白‑2之间的质量比200000:0.5～2。本方案解决了现有技术中骨修复材料不易塑形；且骨缺损处的愈合时间长，使用不方便的问题。

Description

珍珠粉人工骨的制备方法
技术领域
本发明涉及假体材料或假体被覆材料技术领域，具体涉及珍珠粉人工骨及其制备方法。
背景技术
骨缺损已成为全球的健康问题，随着人口老年化的增加，骨修复已经成为了一个重要的临床课题和社会需求。目前临床上常用的骨修复材料大致分为自体骨、异体骨和异种骨三种，自体骨修复效果好，但却有供区有限和二次创伤的缺点；异体骨或异种骨由于其骨诱导作用不足且可能引起交叉感染、免疫排斥反应，亦不是最理想的骨修复材料。例如：骨修复材料常用于植牙技术领域，但是长期缺失牙的患者几乎都要面临牙槽骨吸收而导致的骨量不足的问题；现有的骨修复材料大多为粉末状，粉末状的骨修复材料在放入到骨缺损处时，不易塑形，且容易散到其他地方，使用非常的不方便。
因此，提供一种易于塑形、缩短骨缺损处的愈合时间，并克服目前临床上使用的骨修复材料来源有限、价格昂贵、生物安全性能欠佳、作为粉剂不宜使用的缺点的骨修复材料，迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的在于提供珍珠粉人工骨，解决了现有技术中骨缺损处的愈合时间长的问题。珍珠粉人工骨的制备方法，解决了现有技术中骨修复材料不易塑形，使用不方便的问题。
为达到上述目的，本发明的基础方案一如下：
珍珠粉人工骨，其原料组成包括纳米级珍珠粉、透明质酸钠、重组人骨形态发生蛋白-2 和浓度为1％的醋酸溶液；各原料之间的比例如下：
纳米级珍珠粉与透明质酸钠之间的质量比为10:0.5～2；
纳米级珍珠粉与重组人骨形态发生蛋白-2之间的质量比200000:0.5～2。
本方案产生的有益效果是：
1、珍珠粉是一种由珍珠通过机械球磨法制备而来，其成分包含约为95％无机碳酸钙和不足5％有机基质，珍珠的来源相对广泛，价格比较低廉，且易于加工，理化性能和生物学特性与骨组织接近，因此在骨组织工程中具有应用前景。
纳米材料是指由处于一定尺度范围(1nm～100nm)内的纳米颗粒及其致密的聚集体，或由纳米微晶体所构成的具有表面效应、量子(小)尺寸效应和量子隧道效应等一系列特殊效应的材料。纳米级珍珠粉人工骨在刺激成骨细胞产生新生骨组织的同时，其多孔状空间结构利于新生骨组织爬行替代人工骨材料及新生血管的长入，为骨组织的长入和血管化提供足够的三维空间。与微米级珍珠层粉相比，纳米级珍珠层粉比表面积大，生物活性高，与体内微环境相互作用快；同时，纳米级多孔状间隙的晶体结构类似人体牙槽骨中松质骨的多孔状结构，在空间结构上与骨组织的松质骨近似，具有很好的组织相容性，在一定范围内可以适应牙槽骨中的应力变化，确保新生骨组织正常的生长和代谢。
在骨愈合的过程中，骨形态蛋白(Bone Morphogenetic Protein，BMP)对骨量及骨的发生和重建有多向的调节作用，能影响细胞的增殖、分化和细胞外基质的合成，其中，BMP-2 是骨折愈合过程中必不可少的转化生长因子。
重组人骨形态发生蛋白2(Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein-2，rhBMP-2) 是通过基因工程技术将骨形态蛋白2进行重组而得来。
采用浓度为1％的醋酸溶液来溶解重组人骨形态发生蛋白-2，不会破坏重组人骨形态发生蛋白-2的活性。
综上，珍珠粉人工骨是利用具有粘弹特性的透明质酸将其与纳米级珍珠粉混合后制备成具有塑形能力的珍珠粉人工骨(即，骨修复材料)，将其作为骨生长因子重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)的载体材料，使其可以自由塑形；同时也缩短骨缺损处的愈合时间。还克服了目前临床上使用的骨修复材料来源有限、价格昂贵、生物安全性能欠佳、作为粉剂使用不方便的缺点。
2、另外各原料之间的比例在上述范围内，在保证成骨性能的情况下，采用这个比例，能够达到较好的塑形的效果。
本发明的基础方案二如下：
珍珠粉人工骨的制备方法，包括以下步骤：
包括以下步骤：
步骤一、将重组人骨形态发生蛋白-2溶解于醋酸溶液中形成第一混合原料；
步骤二、将透明质酸钠溶解到步骤一中的第一混合原料中，以1800～2300rpm/min的速度搅拌3～6min，放置在10℃以下的条件中静置20～26h形成第二混合原料；
步骤三、将纳米级珍珠粉溶于步骤二中的第二混合原料中，以50～70rpm/min的速度搅拌2～4min，在10℃以下储存形成第三混合原料备用；
步骤四、步骤三中的第三混合原料在10℃以下的环境中静置一段时间，待其内部充分溶解及气泡逐渐浮出后，冷冻干燥形成珍珠粉人工骨。
本方案产生的有益效果是：
1、将重组人骨形态发生蛋白-2溶解于醋酸溶液中，而且纳米级珍珠粉与重组人骨形态发生蛋白-2之间的质量比200000:0.5～2；保证了重组人骨形态发生蛋白-2能够更好的溶解在醋酸溶液中。纳米级珍珠粉与透明质酸钠之间的质量比为10:0.5～2；将透明质酸钠溶解到步骤一中的第一混合原料中，并采用1800～2300rpm/min的速度搅拌3～6min，在保证其混合的均匀性能的同时，还能够加快制作的时间。将混合后的溶液放置在10℃以下静置，保证了重组人骨形态发生蛋白-2的活性；而且，在此环境下，达到各原料的混合效果，进一步保证了最后得到的珍珠粉人工骨(骨修复材料)的塑形性能。
2、步骤三中，搅拌的时候，以50～70rpm/min的速度搅拌2～4min；防止因转速太快，溶液产生大量热，而破坏珍珠粉有机质里面的活性；进而保证了后续得到的珍珠粉人工骨(骨修复材料)的塑形效果。
3、步骤四中，静置一段时间，主要是为了让第三混合原料中的各种成分在醋酸溶液中溶解的更加彻底，保证后续制作得到的珍珠粉人工骨(骨修复材料)的性能更佳。另外，步骤四中，冷冻干燥形成的珍珠粉人工骨(骨修复材料)塑形效果好，而且有一定的密实度；将其用作骨修复，可以随缺损的形状自由塑形。
优选方案一：作为对基础方案一的进一步优化，珍珠粉人工骨的密度为0.0052～0.013g/mm3。
此密度下的珍珠粉人工骨(骨修复材料)的柔软度、延展性与面团一致，具有较高的可塑性，将其放置在骨缺损处，进一步可以随缺损的形状自由塑形，保证其与缺损形态吻合，增加周围骨质贴合的效果，进一步缩短骨缺损处的愈合时间。
优选方案二：作为对基础方案二的进一步优化，步骤四中冷冻干燥的时间为1.5～4h。
进一步保证制作得到的珍珠粉人工骨骨修复材料的塑形能力，保证其形态能够更好的与缺损形态吻合。
优选方案三：作为对优选方案二的进一步优化，步骤四中冷冻干燥的时间为2h。
在此干燥时间下，进一步保证了珍珠粉人工骨的柔软度、延展性与面团一致，具有较高的可塑性。
优选方案四：作为对基础方案二的进一步优化，步骤四中冷冻干燥的时间大于4h。
在此干燥时间下，得到的硬度较大的珍珠粉人工骨，便于储存。
优选方案五：作为对优选方案四的进一步优化，还包括步骤五、将冷冻干燥得到的珍珠粉人工骨制作成粉末储存；使用时，采用生理盐水调和形成密度为0.0052～0.013g/mm3的珍珠粉人工骨。
将珍珠粉人工骨制作成粉末状，更易于储存；在使用的时候，再采用生理盐水进行调和形成密度为0.0052～0.013g/mm3的柔软度、延展性与面团一致的珍珠粉人工骨；非常的方便。
附图说明
图1是本发明珍珠粉人工骨及其制备方法的实施例术后1个月CBCT检测对比图；
图2是本发明珍珠粉人工骨及其制备方法的实施例术后2个月CBCT检测对比图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细的说明，其中以实施例1为详细说明，其余的实施例以及对比例的数据均见表1和表2：
实施例1
准备制作仪器：纳米陶瓷磨砂分散机(KLLN-1，深圳市科力纳米工程设备有限公司)， Thinky搅拌机(GR-8，深圳日新基贸有限公司)，实验室纯水超纯水系统(Millipore0409，美国)，电子天平(XPE05，METTLER TOLEDO，瑞士)，真空冷冻干燥机(LGJ-10，北京松源化兴科技发展有限公司)。
珍珠粉人工骨，其原料组成包括纳米级珍珠粉(海南京润珍珠生物技术股份有限公司)、透明质酸钠(H107141，Aladdin)、重组人骨形态发生蛋白-2(ab50099，Abcam)和浓度为 1％的醋酸溶液(分析纯，Aladdin)。各原料之间的比例如下：
纳米级珍珠粉与透明质酸钠之间的质量(单位均为g)比为10:0.5～2。
纳米级珍珠粉与重组人骨形态发生蛋白-2之间的质量(单位均为g)比为200000:0.5～ 2。
纳米级珍珠粉的质量(单位为g)与醋酸溶液的体积(单位为ml)比值为1:3～2:3。进一步保证了原料在醋酸溶液中的溶解效果；同时也使得冷冻干燥的时间更为优化。由于醋酸溶液量的多少，会影响后续冷冻干燥的时间，当其比例控制在上述范围的时候，不仅使得冷冻干燥的时间适宜，还使得得到的珍珠粉人工骨(骨修复材料)的塑形效果更好。
表1
Figure BDA0001641424630000051
以下以实施例1的参数进行制备(其他实施例和对比例的数据见表2)，包括以下步骤：
步骤一、将40ug重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)溶解于20ml1％醋酸溶液中形成第一混合原料。
步骤二、将0.8g透明质酸钠溶解到步骤一中的第一混合原料中，在搅拌机中以2000rpm/min的速度搅拌5min，放置在4℃的条件中静置24h形成第二混合原料。此处温度条件，能够更好的保证各原料的活性；另外，静置24h达到充分溶解混合的效果。
步骤三、将8g纳米级珍珠粉溶于步骤二中的第二混合原料中；以60rpm/min的速度手动搅拌3min，保证原料在混合时，产生的热量少；在4℃的条件下储存形成第三混合原料备用。
步骤四、步骤三中的第三混合原料在4℃的环境中静置一天(24小时)，保证各原料能够更好的溶解在醋酸溶液中，待其内部气泡逐渐浮出后，置于真空冷冻干燥机(LGJ-10，北京松源化兴科技发展有限公司)中冷冻干燥2h形成珍珠粉人工骨(骨修复材料)，且珍珠粉人工骨的密度控制在0.0052～0.013g/mm3的范围内。塑形效果好，且有一定的密实度。然后将骨修复材料低温下Co60射线消毒处理，然后置于4℃环境下储存备用，保证骨修复材料中重组人骨形态发生蛋白-2的活性以及珍珠粉人工骨的塑形型，同时也便于珍珠粉人工骨(骨修复材料)的随时取用。
表2
Figure BDA0001641424630000061
Figure BDA0001641424630000071
实施例2～实施例3的珍珠粉人工骨的制备方法均与实施例1相同，只是在数据上按照表1和表2中的数据进行修改替换即可。
实施例4
样本具体取值见表1，其与实施例1的区别在于，主要是在冷冻干燥时间上有所不同，且制作方法上增加了步骤五；具体如下：
步骤五、由于步骤四中冷冻干燥的时间长，因此得到的珍珠粉人工骨相比于实施例1硬；将冷冻干燥得到的珍珠粉人工骨制作成粉末储存；使用时，采用生理盐水调和形成密度为 0.0052～0.013g/mm3的珍珠粉人工骨，然后放置在骨缺损处使用。
对比例1
见表1，直接采用8g纳米级珍珠粉的珍珠粉作为骨修复材料。
对比例2
见表1，为空白对照组(即，试验的时候，不植入任何材料)。
对比例3
本对比例与实施例1的制作步骤相同，数据见表1和表2，主要区别在于，制作得到的珍珠粉人工骨的密度小于0.0052g/mm3。
对比例4
本对比例与实施例1的制作步骤相同，数据见表1和表2，主要区别在于，制作得到的珍珠粉人工骨的密度大于0.013g/mm3。
对比例5
见表1和表2，本对比例与实施例1的区别在于，仅采用了纳米珍珠粉/透明质酸组/醋酸溶液，三种原料。由于原料少了，因此，制作方法与实施例1也有不同，具体为：
步骤一、将0.8g透明质酸钠(H107141，Aladdin)溶解到20ml1％的醋酸溶液中，形成第一混合原料。
步骤二、将步骤一中的第一混合原料在Thinky搅拌机(GR-8，深圳)中以2000rpm/min 的速度搅拌5min，在4℃条件下静置24h，形成第二混合原料。
步骤三、将8g纳米级珍珠粉溶于上述第二混合原料中，以60rpm/min的速度手动搅拌 3min，4℃条件下储存形成第三混合原料备用；
步骤四、步骤三是在4℃条件下储存静置一天后形成第三混合原料；然后置于真空冷冻干燥机(LGJ-10，北京松源化兴科技发展有限公司)中冷冻干燥2h，低温下Co60射线消毒， 4℃条件下储存备用。
实施例1～对比例4制作得到的珍珠粉人工骨的密度见表3：
表3
Figure BDA0001641424630000081
实验一：
现将实施例1制作得到的骨修复材料、对比例1的纳米级珍珠粉和对比例2分别作如下试验，具体如下：
兔股骨远端骨缺损模型的建立：
准备试验用新西兰大白兔，6-10月龄，雄性，体重(2.5-3.0)kg。单笼饲养，自由进食进水，每日定时冲洗排泄物，并定期清洗及消毒笼具、食盒；室内温度保持20-26℃。
选用健康新西兰大白兔24只，随机分为A、B、C、D 4个组(A组为实施例1中的纳米珍珠粉/rhBNMP-2/透明质酸组/醋酸溶液；B组为对比例5中纳米珍珠粉/透明质酸组/醋酸溶液；C组为对比例1中的纳米珍珠粉组；D组为对比例2中的空白组)。每只动物左右腿按分组均植入预先制备的人工骨修复材料，空白组不植入任何材料。
观察时间为1月和2月。通过CBCT检查各组在各时间段的材料降解情况、骨组织愈合情况及骨修复作用。观察明确珍珠粉人工骨的成骨效果以及比较纳米级珍珠粉/rhBMP-2/透明质酸/醋酸溶液、纳米级珍珠粉和空白组在兔股骨远端骨缺损的成骨效果的差异。
实验兔术前8小时禁食，测量并记录其体重。均选双侧股骨干骺端为手术部位，侧卧位，按0.2mL/kg体重肌肉注射速眠新Ⅱ注射液及水合氯醛水溶液(0.1g/ml)以3.5L/kg体重经腹腔缓慢推注进行麻醉。待其角膜反射消失后，常规术区消毒，铺巾。自膝关节外侧向上可扪及一近似平台状结构，即兔股骨外上髁，将兔后腿膝关节稍屈曲，皮肤稍绷紧，避开皮下血管，斜形切开皮肤、皮下组织及筋膜,皮肤切口长约3.0cm，暴露股骨外上髁，将附于其上肌键及骨膜剥离，可见股骨干与股骨髁移行处有一明显干骺线。用直径7mm去骨环钻垂直钻入深度约10mm，小心取出皮质骨及松质骨。术中注意用4℃生理盐水降温，牙周探针检测缺损深度。若制备骨缺损形态不标准，使用手动挖匙细微修整。按分组植入骨组织替代材料，轻压实，分层缝合伤口并包扎，术后各实验兔分别予120万单位肌肉注射预防感染。
本实验研究所选择的兔是骨折愈合和骨缺损修复研究的常用备选动物。目前实验兔繁殖、饲养以及麻醉、解剖等技术都已比较成熟，且其性格温顺，价格相对低廉，来源广泛，生物信息已充分掌握，手术耐受能力及抗感染能力相对较强，适用于大样本动物模型研究，又能很好模拟人类的骨折和骨缺损的修复，因此是骨缺损实验研究的最佳选择之一。兔股骨远端干骺端作为目标实验区域主要是因为该部位大部分为松质骨，有足够的空间制作骨缺损模型，而且已有研究通过此区域作为骨缺损部位，均取得良好效果。
一般观察：
实验兔术后1h均自然苏醒，能活动。但术后前2d精神萎靡，饮食及活动均减少，行动时稍跛行，伤口周围软组织轻度肿胀，2-3d肿胀自行消退。2d后精神、饮食及大小便均恢复正常。7d后，行动自如，伤口愈合良好。材料植入部位未观察到动物机体的明显排斥反应。术后除1只兔子死于麻药过量外，其他兔子均存活至实验观察时间。
放射学观察结果显示：
术后1个月：
见图1，可见A组缺损区材料的阻射影像与周围正常骨组织界限较清楚，缺损区可见较多的材料未降解，且未降解材料的灰度值高于周围正常骨组织；
B组缺损区材料的阻射影像与周围正常骨组织界限较清楚，缺损区可见较多的材料未降解，且未降解材料的灰度值高于周围正常骨组织；
C组可见较多材料降解，骨缺损处灰度值较周围骨有所减低，边缘较模糊，且有部分材料游离至缺损外；
D组空白组可见正常组织边缘有少量组织生成，其灰度值较正常组织稍低。
图1为造模后1个月CBCT检测对比图，其中a1-a3为A组，分别为造模前、造模后、处死前，下同；b1-b3为B组，c1-c3为C组，d1-d3为D组。
造模在此处的意思就是制备骨缺损，造模前是没有骨缺损的，也就是正常、未经处理的实验兔；造模后就是做了骨缺损处理的实验兔；处死前就是我们在做骨缺损处理后的1个月观察成骨效果前拍摄CBCT。
术后2个月：
见图2，三组均可见缺损区面积较1个月时有所减小；A、B、C组材料几乎全部降解，且三组的灰度值均较同组1个月时低；其中，A组骨缺损内有骨小梁形成；其余组未见明显骨小梁形成。
图2为造模后2个月CBCT检测(a1-a3为A组，分别为造模前、造模后、处死前，下同；c1-c3为C组，d1-d3为D组)。
造模在此处的意思就是制备骨缺损，造模前是没有骨缺损的，也就是正常、未经处理的实验兔；造模后就是做了骨缺损处理的实验兔；处死前就是我们在做骨缺损处理后的2个月观察成骨效果前拍摄CBCT。
实验研究表明，实施例1中的纳米级珍珠粉、重组人骨形态发生蛋白-2、透明质酸和醋酸溶液复合而成的珍珠粉人工骨具有促成骨作用，且塑形效果好，能缩短骨缺损的愈合时间，有利于骨缺损区新骨形成。且，实施例1制作得到的珍珠粉人工骨的成骨能力在重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)的协同下，效果要优于单纯的珍珠粉以及未添加重组人骨形态发生蛋白-2的组。另外，由于珍珠粉人工骨具有塑形能力，在使用过程中较单纯的珍珠粉更为方便。
因此，珍珠粉人工骨利用透明质酸的黏弹特性将其与珍珠粉、重组人骨形态发生蛋白-2 和醋酸溶液混合后，制备成具有塑形能力的骨缺损替代材料，可以随缺损的形状自由塑形，克服了目前临床上使用的人工骨材料作为粉剂不方便使用的缺点。
试验二：
将实施例1、对比例3和对比例4制作得到的珍珠粉人工骨做出如下实验：
准备试验用新西兰大白兔，6-10月龄，雄性，体重(2.5-3.0)kg。单笼饲养，自由进食进水，每日定时冲洗排泄物，并定期清洗及消毒笼具、食盒；室内温度保持20-26℃。
选用健康新西兰大白兔3只，每只动物左右腿按分组均植入预先制备的人工骨修复材料， 2周后，将动物体内该处骨头取出，观察各三个骨头处植入的骨修复材料与骨头之间的贴合效果；发现实施例1相比于对比例3和对比例4，实施例1中的骨修复材料与骨头贴合更加紧密，且其随着骨缺损处塑形效果更好。
对比例3中珍珠粉人工骨的密度小于0.0052g/mm3，观察到其贴合效果较差，材料容易从缺损部位溢出。
对比例4中珍珠粉人工骨的密度大于0.013g/mm3，观察到，珍珠粉人工骨过硬与骨缺损处的内壁及人工骨之间有缝隙，贴合效果不好。
以上的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims (4)

1.珍珠粉人工骨的制备方法，其特征在于，其原料组成包括纳米级珍珠粉、透明质酸钠、重组人骨形态发生蛋白-2和浓度为1%的醋酸溶液；各原料之间的比例如下：
纳米级珍珠粉与透明质酸钠之间的质量比为10:0.5～2；
纳米级珍珠粉与重组人骨形态发生蛋白-2之间的质量比200000:0.5～2；
珍珠粉人工骨的制备方法为：包括以下步骤：
步骤一、将重组人骨形态发生蛋白-2溶解于醋酸溶液中形成第一混合原料；
步骤二、将透明质酸钠溶解到步骤一中的第一混合原料中，以1800～2300rpm/min的速度搅拌3～6min，放置在10℃以下的条件中静置20～26h形成第二混合原料；
步骤三、将纳米级珍珠粉溶于步骤二中的第二混合原料中，以50～70rpm/min的速度搅拌2～4min，在10℃以下储存形成第三混合原料备用；
步骤四、步骤三中的第三混合原料在10℃ 以下的环境中静置一段时间，待其内部充分溶解及气泡逐渐浮出后，冷冻干燥形成珍珠粉人工骨；
步骤五、将冷冻干燥得到的珍珠粉人工骨制作成粉末储存；使用时，采用生理盐水调和形成密度为0.0052～0.013g/mm3的珍珠粉人工骨。
2.根据权利要求1所述的珍珠粉人工骨的制备方法，其特征在于：步骤四中冷冻干燥的时间为1.5～4h。
3.根据权利要求2所述的珍珠粉人工骨的制备方法，其特征在于：步骤四中冷冻干燥的时间为2h。
4.根据权利要求1所述的珍珠粉人工骨的制备方法，其特征在于：步骤四中冷冻干燥的时间大于4h。
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