JP6476120B2 - 治療的使用のための架橋ヒアルロン酸及びハイドロキシアパタイトに基づく注入用無菌水性製剤 - Google Patents

Description

本発明は、凝集性粒子系の粘弾性ゲルとして治療目的で使用される、即時使用可能な吸収性の無菌注入用水性製剤であって、ｉ）１％〜４％（質量／体積）の濃度の架橋ヒアルロン酸又はその塩の１種であって、行われる架橋が前記凝集性構造を有する架橋ヒアルロン酸ゲルを取得することを可能とする、架橋ヒアルロン酸又はその塩の１種と、ｉｉ）１０％〜７０％（質量／体積）の濃度のハイドロキシアパタイトであって、６５０μｍ以下の平均サイズを有する粒子形態である、ハイドロキシアパタイトと、を含有し、前記無菌注入用水性製剤が１Ｈｚの周波数におけるＴａｎδが０．６０以下となるような粘弾特性を有する、無菌注入用水性製剤に関する。

本発明の内容
本発明は、ヒト又は動物の手術の分野、特に、整形外科手術、歯科又は顎顔面の手術、ＥＮＴ（耳鼻咽喉）手術、泌尿器科又は婦人科の手術、及び消化器手術に関する。

長期間又は短期間の容積の充填及び／又は回復、及び／又は生体材料を置換する手術のために多くの生体材料が開発されてきた。

これらの生体材料の中でも、整形外科手術で使用される金属材料製の人工股関節等の非吸収性の解決策、又は例えば、心臓手術で使用される生体吸収性ポリマーステント等の吸収性の解決策がある。

標的化された生体材料の充填材を軟組織又は硬組織における様々な治療用途に使用することができる。例えば、
顎顔面手術：セラミック材料製のボールを使用した摘出後の眼窩の再構築（reconstruction：再建）、
歯科手術：歯周ポケットを充填するためのセラミック材料の適用による歯周炎の治療、
泌尿器手術：コラーゲン系製品等の充填材の尿道内注入による尿失禁又は膀胱尿管逆流の治療、
消化器手術：シリコーン系製品等の充填製品の注入による便失禁の治療、
ＥＮＴ手術：例えば、カルボマー系製品等の充填製品の注入による発声を改善するための声帯の治療、
整形外科手術：多孔質セラミック系骨代用材の使用による骨欠損の治療、
が挙げられる。

一般に、移植された標的化充填製品は、
軟組織の場合、主に、これらの組織における長期の充填／増加をもたらすことにより、
硬組織の場合、主に、これらの組織の構築／再生を補助することにより、
所望の組織を治療することができると言える。

いわゆる吸収性の標的化充填生体材料のうち、ハイドロキシアパタイト粒子を含有する製品が例として言及され得る。

ハイドロキシアパタイトは、骨のミネラル相の組成と非常に類似する化学的組成を有する。その生物学的特性及びその生体適合性は、ハイドロキシアパタイトを優れた骨代用製品とする。上記代用材による骨のコロニー化は、上記材料の多孔質特徴、特に孔サイズ及
び分布、並びにマクロ細孔間の相互接続（数及びサイズ）に大いに依存する。上記相互接続は、細胞の通過及び孔間の血液循環を可能とすることで、代用材内での骨形成を促進するトンネルである。

ハイドロキシアパタイトは、体内におけるその生体適合性が高く、その吸収が遅いことから、以下のような種々の形態のもとで非常に異なる組織に、及び様々な用途で投与される。

ハイドロキシアパタイト系セメント。これらのセメントは、手術室において外科医によって調製され（数分の調製の間、展性のある材料）、その後、治療領域に投与される（上記材料がｉｎ ｓｉｔｕで硬化する）。ハイドロキシアパタイト系セメントは、経時的な骨の新たな形成のための場所（room）を残す、良好な骨結合及び生体吸収性のため骨代用材として使用される。

カルボキシメチルセルロース等のポリマーを含有し得るハイドロキシアパタイト系溶液又はゲル。これらの製品は、例えば、歯科手術において歯槽欠損を充填するため若しくは尿失禁を治療するため、又は更には、嚢腫若しくは良性腫瘍の掻爬術後の整形外科手術における充填材として、様々な分野で使用され得る。

ハイドロキシアパタイト系製品は、例えば、人工股関節置換の充填材として、又は顎顔面の修復では歯科インプラントの補完材として使用される、整形外科で使用されるブロック、粉末及び顆粒の形態で利用可能であり、急速な骨結合を有している。

ハイドロキシアパタイト系製品の中には、即時使用できず、外科医による事前調製を必要とするものが多く存在する（ハイドロキシアパタイトセメントの場合、治療する領域上又はその中に留置する前に指定時間内に粉末と溶液との予備混合を必要とし、ｉｎ ｓｉｔｕでセメントを硬化することを必要とする）。他の製品は、治療する領域上又はその中に移植する前に外科医により調製される必要がある（適切な形状に「切断」される固体材料）。ハイドロキシアパタイト粒子の移行に関連する問題もまた報告されている。これらの問題は、合併症及び／又は製品の性能喪失を招く可能性がある。例えば、ハイドロキシアパタイト粒子の移行は、生体組織における充填効果の喪失をもたらし、潜在的に副作用を引き起こす可能性がある。実際、ハイドロキシアパタイト粒子は、主に、生体材料にかかる機械的応力によって、治療領域から幾分離れた或る特定の領域で濃縮される可能性がある。望ましくない領域での粒子の存在又は過剰に高い粒子濃度は、多かれ少なかれ重度の合併症をもたらす可能性がある。

ヒアルロン酸（ＨＡ）は、多くの製品、特に充填材として使用される製品において見出される別の吸収性生体材料である。ヒアルロン酸は、多くの治療領域及び審美領域でその天然形態（化学的に修飾されていない）又は架橋形態で使用される。

架橋ヒアルロン酸は、数か月の期間に亘ってしわを充填するため、又は身体の種々の領域の容積を回復するために皮膚又は皮下に注入される分野である皮膚審美用途においてよく知られている。架橋ヒアルロン酸は注入後の副作用がほとんどなく、長期に亘って合併症が非常に稀である利点を有する。一方、注入が十分に適用されなかった場合、施術者には、ヒアルロニダーゼ（ＨＡ特異的酵素）溶液を注入することによって治療を修正する機会がある。この溶液は、以前に注入された架橋ＨＡ系製品を分解する。架橋ＨＡ注入液が徐々に消失することから（上記ポリマーの組織への経時的な吸収）、治療の有効性を維持するためには、定期的、典型的には６か月毎〜１２か月毎に注入を繰り返さなければならない。しかしながら、非架橋ヒアルロン酸は、皮膚における滞留時間が短く（１週間未満の半減期）、ラジカル、酵素、熱、及び機械的な分解等の様々な因子によりｉｎ ｖｉｖ
ｏで分解される。上述の因子によるヒアルロン酸分解の速度を遅らせることによってその半減期を著しく増加することができるのが架橋であり、そのようにして約１２か月もの間継続する効果的な審美治療を可能とする。

架橋又は非架橋のヒアルロン酸は、
整形外科、ヒアルロン酸を骨関節炎に冒された関節における関節内補充療法として投与して、疼痛を軽減し、治療される患者の運動性を増加するため、
眼科では、眼内空間を形成するため、また眼組織を保護するための白内障手術中の粘弾性溶液として、若しくは緑内障手術の領域における排液用インプラントとして、
泌尿器科では、尿失禁若しくは便失禁を治療するための充填材として、又は、
顎顔面手術において、眼球摘出術後の眼窩を再構築するため、
等の治療領域で使用される。

経時的な性能が増強されたヒアルロン酸に基づく治療を開発するための徹底的な科学研究が世界中で行われている。目標は、注入された製品の高レベルの安全性を維持しながら、可能な限り長期に亘って最適な充填効果を維持するため生体組織においてそれほど急速には分解されることのない製品を得ることである。さらに、ヒアルロン酸は多くの利点を有し、様々な医学的用途に最適な生体材料となっている。しかしながら、ヒアルロン酸は、残念なことに、ハイドロキシアパタイト等の生体材料と異なり、骨再構築のための骨接合術の分野で強い効果を付与する特性がない。

このような状況より、移植した製品の移行に関連する合併症を生じることなく治療目的で注入されるのに適した、投与が容易で、極めて優れた機械的特性を有し、長期に亘る効果をもたらす、即時使用可能な生体適合性の製剤を施術者に提供することが重要である。

本発明の要約
本発明は、凝集性粒子系の粘弾性ゲルの形態の治療目的で即時使用可能な無菌注入用生体吸収性水性製剤であって、ｉ）１％〜４％（質量／体積）の濃度の架橋ヒアルロン酸又はその塩の１種であって、行われる前記架橋が前記凝集性構造を有する架橋ヒアルロン酸を含有するゲルを取得することを可能とする、架橋ヒアルロン酸又はその塩の１種と、ｉｉ）１０％〜７０％（質量／体積）の濃度のハイドロキシアパタイトであって、６５０μｍ以下の平均サイズを有する粒子形態である、ハイドロキシアパタイトと、を含有し、前記無菌注入用水性製剤が１Ｈｚの周波数におけるＴａｎδが０．６０以下となるような粘弾特性を有する、無菌注入用生体吸収性水性製剤に関する。

別の目標によれば、本発明は、無菌注入用水性製剤を作製する方法であって、ａ）二官能性又は多官能性の分子を用いて前記バイオポリマーの鎖間に共有結合を形成することにより、行われる架橋が前記凝集性構造を有する架橋ヒアルロン酸を含有するゲルを取得することを可能にする、少なくとも１重量％〜４重量％の架橋ヒアルロン酸又はその塩を含む第１混合物の調製工程と、ｂ）前記第１混合物の精製工程と、ｃ）次いで、前記架橋ヒアルロン酸系ゲル中に均質に分散させることによる、１０％〜７０％（質量／体積）の濃度のハイドロキシアパタイトの添加工程と、ｄ）このようにして得られた前記ゲルを、即時使用可能な形態にする工程と、ｅ）前記製品の湿熱による滅菌工程と、からなる、無菌注入用水性製剤を作製する方法に関する。

また、別の目標によれば、本発明は、好ましくは上述の製剤の入ったシリンジの形態で供給されるキットに関する。

実施例２に記載される試験によるゲルＢ’、ゲルＸ、並びにＣＭＣ系製剤及びハイドロキシアパタイトの比較写真を示す図である。

発明の詳細な説明
以下に記載される本発明は、治療目的で使用され、粘弾性、充填及び長期性能の特殊な特性、また或る特定の場合には、周囲の生体組織の吸収を積極的に促進する能力を有する、新たな即時使用可能な無菌注入用水性生体吸収性製剤の提供の目的を果たす。この製剤は、凝集性粒子系の粘弾性ゲルの形態であり、
ｉ）１％〜４％（質量／体積）の濃度の架橋ヒアルロン酸又はその塩の１種であって、行われる架橋が上記凝集性構造を有する架橋ヒアルロン酸を有するゲルを取得することを可能とする、架橋ヒアルロン酸又はその塩の１種と、
ｉｉ）１０％〜７０％（質量／体積）の濃度のハイドロキシアパタイトであって、６５０μｍ以下の平均サイズを有する粒子形態である、ハイドロキシアパタイトと、
を含有し、
上記無菌注入用水性製剤が１Ｈｚの周波数におけるＴａｎδが０．６０以下となるような粘弾特性を有することを特徴とする。

本発明の新たな製剤は生体吸収性である。上記製剤は、多かれ少なかれ長期に亘って生体適合性であり、生体組織によって吸収可能な生体材料を含む。多くの用途において、特に整形外科の骨再構築の分野では、上記製剤は周辺の生体組織の再成長を促進する役割を果たすことができる。骨再構築用途の場合では、本発明による製剤は吸収されて経時的に新たに形成される骨のための場所を残す。

全く意外な方法で、この製剤が、架橋ヒアルロン酸とハイドロキシアパタイト粒子との相乗作用により、本発明の状況下で、長期に亘る容積の充填及び／又は回復、及び／又は生体材料の置換に対して優れた能力を有することが見出された。

機械的な観点から、ハイドロキシアパタイト粒子（固体性能：実質的な弾性及び無視できるほどの粘性）は、ゲルの弾性を大きく増し、治療される欠損領域を修復するために組織に対して著しい力／圧力を誘導することによって容積を生じる能力を増大する。

架橋ヒアルロン酸は、粘弾特性、すなわち、弾性のみならず粘性を提供し、軟組織の粘弾性に近いゲル粘稠度（consistency）を有することを可能にして、非常に高い弾性とハイドロキシアパタイト粒子によって提供される粘性の欠如とを釣り合わせる。これは、組織に対してより傷害性でなく（注入後の炎症に対する強い制限）、注入に際してより痛みの少ないより一層均質に組織へと融合する製品を得ることを可能とする。

さらに、架橋ヒアルロン酸は、本発明の状況下で、凝集性の架橋ヒアルロン酸（架橋ヒアルロン酸は低い吸収速度を有する）によって提供される強い凝集性により、ゲル中に保持されるハイドロキシアパタイト粒子の移行をかなり減少することを可能とする。この移行に対する強い制限は、
ボリュマイズ（volumatrice：容積を生じる）能力を有する長期ゲルの改善、
注入部位にハイドロキシアパタイト粒子が留まるのを可能とすることにより副作用の軽減、
を可能とする。

ヒアルロン酸は、グルクロン酸塩及びＮ−アセチルグルコサミンの二糖単位の反復で構
成される多糖である。ヒアルロン酸は、ヒト及び動物の結合組織、上皮組織、及び神経組織の間に広く分布する。ヒアルロン酸は、細胞外マトリクスの主な構成成分の１つである。ヒアルロン酸は、細胞の増殖及び遊走に大きく寄与する。ヒアルロン酸は、主に、眼房水、滑液、皮膚、及び臍帯に高濃度で見出される。

本発明による好ましいヒアルロン酸塩としては、陽イオンを伴うヒアルロン酸塩、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、又はマンガンの塩等の一価又は二価の塩が挙げられる。ナトリウム塩が特に好ましい。

本発明によれば、ヒアルロン酸又はその塩は架橋形態である。この架橋は、二官能性又は多官能性の分子を用いる上記バイオポリマーの鎖間の共有結合の形成により得られ、行われる架橋が、単相性構造としても知られる、いわゆる凝集性構造を有する架橋ヒアルロン酸系ゲルの取得を可能とする。

本発明の非限定的な例では、架橋ヒアルロン酸は、ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）と接触するように置かれたヒアルロン酸ナトリウムの繊維から作製されてゲルネットワークを形成する。

架橋ヒアルロン酸系ゲルの凝集特性は、本発明の重要かつ必要な特殊性である。上記ゲルは、二相性ゲルとも呼ばれる非凝集特性を有するゲル（ハイドロキシアパタイト粒子を保持できないため移行を抑制できない架橋ヒアルロン酸ゲル）のように、水に導入された場合に急速に崩壊することがない。実施例２は、凝集性ゲルと非凝集性ゲルとのこの相違を指摘する。

本発明は、概して、１％〜４％（質量／体積）、好ましくは１％〜３％（質量／体積）の濃度の架橋ヒアルロン酸又はその塩を含む。特に好ましい変形形態によれば、架橋ヒアルロン酸又はその塩の濃度は、１．５％〜２．５％（質量／体積）である。代替的には、架橋ヒアルロン酸又はその塩の濃度は、１．５％〜３％（質量／体積）、又は１％〜２．５％（質量／体積）であってもよい。

有利には、本発明による水性製剤は、好ましくは２．５×１０^５Ｄａ〜４×１０^６Ｄａの分子量のヒアルロン酸又はその塩を含む。特に好ましい変形形態によれば、この分子量は１×１０^６Ｄａ〜３×１０^６Ｄａである。代替的には、上記分子量は１×１０^６Ｄａ〜２．５×１０^６Ｄａ、又は２．５×１０^５Ｄａ〜３×１０^６Ｄａである。

ハイドロキシアパタイトは、式Ｃａ５（ＰＯ４）３（ＯＨ）を有し、通常はその結晶構造の格子が２つの分子を含有するという事実を強調するためにＣａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２と記載されるホスフェートファミリーのミネラル種である。ハイドロキシアパタイトは、同じ六方晶系の構造を有する同形化合物である、結晶学的アパタイトファミリーに属する。この化合物は、様々な医学専門領域において長年生体材料として使用されてきた。

本発明は、概して、１０％〜７０％（質量／体積）、好ましくは２０％〜６０％（質量／体積）、好ましくは３０％〜５０％（質量／体積）の濃度のハイドロキシアパタイト粒子を含み、ハイドロキシアパタイトの平均粒子サイズは６５０μｍ以下、好ましくは２００μｍ以下、８０μｍ以下、又は５００ｎｍ以下である。

本発明による製剤の粘性特性及び弾性特性は、１Ｈｚの周波数における比［粘性率Ｇ’’／弾性率Ｇ’］に対応するパラメーターＴａｎデルタ、すなわちＴａｎδが０．６０以下、好ましくは０．５８以下である場合に最適であることが観察された。実際、本発明に
よる製剤の弾性特性は、その粘性に比べて、ハイドロキシアパタイト粒子の沈降を抑制するのに十分大きくなければならないことが示された。そのため、０．６０を超えると、ハイドロキシアパタイト粒子は、経時的に沈殿しやすいことが観察された。この沈降は、不均質性のハイドロキシアパタイト粒子のベースを有する製剤の取得に関与する。この製剤は、一方では針を通す製剤の注入行為に不十分であり（針の詰まりによる）、もう一方では、注入区域における上記製剤の安全性及び性能に不十分である（例えば、生体材料にかかる機械的応力により治療される領域から幾分離れた或る特定の領域でのハイドロキシアパタイト粒子の濃縮によって誘導される硬組織の領域の形成に起因する。望ましくない領域における粒子の存在又は過剰に高い粒子濃度は、多かれ少なかれ重度の合併症を引き起こす可能性がある）。

概して、弾性（Ｇ’）、及び粘性と弾性との比（Ｔａｎデルタ＝Ｇ’’／Ｇ’）は、プレート形状４０ｍｍ、作動エアギャップ１０００マイクロメートル、及び分析温度２５℃のレオメーターを使用して、０．０１Ｈｚ〜１００Ｈｚの周波数掃引を行うことにより計測される。

実施例２に示されるように、本発明による製剤の凝集性は主な要素であるが、
容器中での経時的なハイドロキシアパタイト粒子の沈降を回避するために、並びに
注入中及び／又は注入部位で製品が２相（ハイドロキシアパタイト粒子及び架橋ヒアルロン酸ゲル）に分離して、治療部位で不均質性を生じることを回避するために、
適した粘弾特性も必要である。

本発明の別の目標は、従来技術の製剤と比較してより良好な経時的な寿命を与えることである。治療される領域における上記充填材の改善された寿命は、架橋ヒアルロン酸の長期に亘って注入部位でハイドロキシアパタイト粒子を保持する能力、及びハイドロキシアパタイト粒子の長期に亘る優れた機械的／流動的な（rheologiques：レオロジカルな）特性を与える能力により達成される。臨床上の寿命の増加は数か月になる場合がある。

また、Ｘ線不透過性であるハイドロキシアパタイト粒子の存在は、注入中及び／又はその後にＸ線撮影を介して施術者によってハイドロキシアパタイト粒子を容易に位置決定できるため、上記ゲルに利点を付与することに留意するのも重要である。

施術者が注入を修正するため、また上記製品を構成する架橋ヒアルロン酸を分解するためにヒアルロニダーゼ溶液を注入する機会もまた、本発明に対して利点を付与する。しかしながら、この注入はハイドロキシアパタイト粒子の吸収を加速せず、そのため、組織内での上記製品の完全な分解は起こらない。

よって、本発明は、例えば、
眼窩を再構築する顎顔面手術における、
歯周炎を治療する歯科手術における、
尿道内注射による尿失禁又は膀胱尿管逆流を治療する泌尿器手術における、
便失禁を治療する消化器手術における、
発声を改善するために声帯を治療するＥＮＴ手術における、
骨欠損を治療する整形外科手術における、
等の容積の充填及び／又は回復、及び／又は生体組織の置換及び／又は再生に使用される、上述の製剤からなるものである。

本発明による製剤は、概してそのまま使用されるが、少なくとも１つの他の添加剤（上述のもの以外）及び／又は少なくとも１つの有効成分の添加が除外されるわけでない。

したがって、上記製剤は、１又は複数のセラミック材料を更に含んでもよい。これらの材料は、一般に、リン酸三カルシウム、炭酸カルシウム、及び硫酸カルシウム、又はこれらのセラミック材料のうちの幾つかの組合せからなる群から選択される。

本発明による製剤は、「骨形成タンパク質」（ＢＭＰ）のファミリー及び／又は「形質転換成長因子ｂ」（ＴＧＦ−β）のファミリーの成長因子等の１又は複数の成長因子を更に含んでもよい。ＴＧＦ β成長因子の大きなファミリーでは、形態形成成長因子（ＢＭＰ）は骨形成に対して特異的な効果を有する。ＢＭＰは骨形成を誘導することが可能であり、ＢＭＰは骨誘導性生体材料である。ＢＭＰは、骨格に微量で存在する（骨１ｋｇ当たり１μｇ）。分子生物学、特にクローニング技法の発展により、ｒｈＢＭＰ−２組換え形態で遺伝子操作により無制限の非常に純粋な量でこれらの因子を産生することが可能となった。

本発明による製剤は、リドカイン単独若しくはアドレナリンとの併用、プロカイン、エチドカイン単独若しくはアドレナリンとの併用、アルチカイン単独若しくはアドレナリンとの併用、メピバカイン、プラモカイン、キニソカイン、又はこれらの麻酔剤の１若しくは複数の塩からなる群から選択される１又は複数の麻酔剤を含んでもよい。特に好ましい変形形態によれば、選択される麻酔剤は、塩酸リドカインである。本発明による製剤中の麻酔剤の存在は、注入中及びその後の患者の慰安を改善するため重要性が高い。

本発明の別の特定の実施形態によれば、本発明の製剤は、ポリオールファミリーの抗酸化剤等の１又は複数の抗酸化剤を含んでもよい。上記抗酸化剤は、主にソルビトール、グリセロール、マンニトール、又はプロピレングリコールからなるポリオール群から選択することができる。

別の目標によれば、本発明は、無菌注入用水性製剤を作製する方法であって、ａ）二官能性又は多官能性の分子を用いて前記バイオポリマーの鎖間に共有結合を形成することにより、行われる架橋が前記凝集性構造を有する架橋ヒアルロン酸を含有するゲルを取得することを可能にする、少なくとも１重量％〜４重量％の架橋ヒアルロン酸又はその塩を含有する第１混合物の調製工程と、ｂ）前記第１混合物の精製工程と、ｃ）次いで前記架橋ヒアルロン酸系ゲル中に均質に分散させることによる、１０％〜７０％（質量／体積）の濃度のハイドロキシアパタイトの添加工程と、ｄ）このようにして得られた前記ゲルを、即時使用可能な形態にする工程と、ｅ）前記製品の湿熱による滅菌工程と、からなる、無菌注入用水性製剤を作製する方法に関する。

ステージｅ）による製剤の滅菌は湿熱により行われる。当業者であれば、上記製品の滅菌に適した熱滅菌サイクル（温度及び滅菌サイクルの期間）を選択するであろう。例えば、以下の湿熱滅菌サイクル、１３１℃で１分間、１３０℃で３分間、１２５℃で７分間、１２１℃で２０分間を使用することができる。

別の目標によれば、本発明は、好ましくは上述の製剤の入ったシリンジの形態で供給されるキットに関する。有利には、上記製剤は即時使用可能であり、施術者によって直接注入され得る。注入のタイプは、関係する部位及び／又は生体組織に依存する。本発明は、
眼窩を再構築する顎顔面手術における、
歯周炎を治療する歯科手術における、
尿道内注射による尿失禁又は膀胱尿管逆流を治療する泌尿器手術における、
便失禁を治療する消化器手術における、
発声を改善するために声帯を治療するＥＮＴ手術における、
骨欠損を治療する整形外科手術における、
を含む多くの治療用途に使用することができる。

また、本発明は、上述の製剤の入ったアンプル又はバイアル等のシリンジ以外の容器の形態のキットに関する。

ここで、以下の実施例１〜４により本発明を非限定的に説明する。

実施例１
いわゆる凝集性構造を有する架橋ヒアルロン酸系ゲルの調製
ステージ１：２．６ＭＤａの分子量を有するヒアルロン酸ナトリウム３．５ｇを１％水酸化ナトリウム（３０．５ｇ）に添加した。混合物を１時間３０分に亘ってホモジナイズした。４２０ｍｇのブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）を、ホモジナイズした混合物に添加し、密閉して５０℃の水浴に２時間置いた。その後、上記混合物を７．５ｇの１Ｎ ＨＣｌを添加することにより中和した。

上記ゲルを、中性ｐＨを有する等浸透圧（iso-osmolaire：等張）生理食塩溶液を用い、２４時間に亘って透析により精製し（再生セルロース、分離限界：分子量＝６０ｋＤａ）、ヒアルロン酸濃度２５ｍｇ／ｍｌ（２．５％）を得た。その後、従来の櫂型ミキサーで１時間３０分に亘ってホモジナイズした（＝ゲルＡ１／１２４ｇ）。

その後、上記ゲルを脱気して、２ｍｌ容のガラスシリンジに詰め、１３０℃で３分間蒸気滅菌することにより滅菌できた（＝ゲルＡ／いわゆる凝集性又は単相性の構造を有する粘弾性ゲル）。

ステージ２：本発明によるゲルの調製。１００ｇのゲルＡ１において、粒子が３０ミクロン〜５０ミクロンの平均サイズを有する、リン酸カルシウムハイドロキシアパタイトＣａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２を４２．９ｇ添加した。その後、上記ゲルを従来の櫂型ミキサーで１時間３０分に亘ってホモジナイズした（＝ゲルＢ１／１４２．９ｇ）。

その後、上記ゲルを脱気して、２ｍｌ容のガラスシリンジに詰め、１３０℃で３分間蒸気滅菌することにより滅菌できた（＝ゲルＢ）。

上記ゲルは、凝集性粒子ベースの粘弾性ゲルであった。実際、上記ゲルは、強い凝集性を有し（実施例２を参照されたい）、ハイドロキシアパタイト粒子を含有する粘弾性ゲルの形態であった（弾性特性Ｇ’及び粘性特性Ｇ’’を有していた；下記を参照されたい）。

ゲル中のヒアルロン酸の濃度は、１７．５ｍｇ／ｍｌ（１．７５％）（カルバゾールアッセイ、ヨーロッパ薬局方の方法）であった。さらに、上記ゲルのｐＨ（７．１５）及びモル浸透圧濃度（３１５ｍＯｓｍ／ｋｇ）は生理学的であった。

上記ゲルは針を通して容易に注入可能であった。２１Ｇの針を通してゲルを押し出すために２６．３Ｎの力が必要であり、押出速度１２．５ｍｍ／分と想定された。

ゲルＡ及びゲルＢを、機械的／流動的な観点から特性評価した。これらの特性評価を行うために使用したレオメーターは、プレート形状４０ｍｍ、作動エアギャップ１０００マイクロメートル、及び分析温度２５℃のＡＲ２０００（TA Instruments）であった。

弾性（Ｇ’）及び粘性と弾性との比（Ｔａｎデルタ＝Ｇ’’／Ｇ’）を、０．０１Ｈｚ〜１００Ｈｚの周波数掃引を行うことにより計測した。上記パラメーターの比較を１Ｈｚ
で行った。

製品Ｂの弾性は、製品Ａのものよりも著しく高いことがわかった。しかしながら、２つの製品Ａ及びＢのＴａｎデルタは比較的近く、ゲルＢは、ハイドロキシアパタイト粒子（高い弾性と無視できるほどの粘性とを有する）が存在するにも関わらず、著しい粘性特徴を保った。

試験されるゲルによって誘導された垂直力の計測を、作動エアギャップ１５００マイクロメートル及びゲル量１．４ｇについて、Ｐｅｌｔｉｅｒプレートと幾何学的形状との間で試料を圧迫することにより行った。

製品Ｂの弾性及びその誘導された垂直力は、製品Ａのものよりも著しく高いことがわかった。

このより高い弾性は、本発明によるゲルの強い凝集性と併せて、上記製品に組織内でより大きな容積を生じる能力を与えた。

実施例２
いわゆる凝集性架橋ＨＡ系ゲル構造の重要性の比較
実施例１に記載されるゲルＡ１（いわゆる凝集性又は単相性の構造を有する）を、中性ｐＨを有する等浸透圧生理食塩溶液により透析して（再生セルロース、分離限界：分子量＝６０ｋＤａ）、ヒアルロン酸濃度２０ｍｇ／ｍｌ（２％）を得た。

その後、カルシウムハイドロキシアパタイトを上記ゲルに添加して２００ｍｇ／ｍｌ（２０％）の濃度を得た後、スパチュラを使用して混合した（ゲル５ｇ当たり２分間）。

その後、得られたゲルをオートクレーブで１２１℃にて２０分間滅菌した（＝本発明によるゲルＢ’）。

いわゆる二相性又は非凝集性の構造を有し、ヒアルロン酸濃度が２０ｍｇ／ｍｌ（２％）である市販の架橋ヒアルロン酸系ゲルＲｅｓｔｙｌａｎｅ（商標）Ｐｅｒｌａｎｅ（商標）（ロット１１３６３−１）を、スパチュラで混合することにより（ゲル５ｇ当たり２分間）２００ｍｇ／ｍｌ（２０％）のカルシウムハイドロキシアパタイトを用いて濃縮した。

その後、得られたゲルをオートクレーブで１２１℃にて２０分間滅菌した（＝ゲルＸ）。

ゲルＡ１及びＲｅｓｔｙｌａｎｅ（商標）Ｐｅｒｌａｎｅ（商標）ゲルを以下の試験で比較した：
５ｍｌの精製水の入ったプラスチック製の３０ｍｌ容のボトルにおいて、１ｍｌのゲルＡ１をボトル１に導入し、１ｍｌのＲｅｓｔｙｌａｎｅ（商標）Ｐｅｒｌａｎｅ（商標）ゲルをボトル２に導入した。ボトルの閉鎖後、２つのボトルを手で５秒間混合した。

１０秒後、Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ（商標）Ｐｅｒｌａｎｅ（商標）ゲルは、水溶液中で多数の粒子の形態に完全に崩壊／分散したことが観察された。よって、Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ（商標）Ｐｅｒｌａｎｅ（商標）ゲルは、いわゆる非凝集性又は二相性の構造を有していた（上記ゲルが水溶液中に急速に分散する）。

ゲルＡ１は、水溶液中で「ゲルボール」形態のままであった。したがって、ゲルＡ１は、実際に凝集性又は単相の構造を有していた（ゲルは、水溶液内で急速に分散せず、Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ（商標）Ｐｅｒｌａｎｅ（商標）ゲルと異なり、強い凝集性を有する）。

本発明によるゲルＢ’及びゲルＸを以下の試験で比較した（図１を参照されたい）：５ｍｌの精製水の入ったプラスチック製の３０ｍｌ容のボトルにおいて、１ｍｌのＢ’を添ボトル１に導入し、１ｍｌのゲルＸをボトル２に導入した。ボトルの閉鎖後、２つのボトルを手で５秒間混合した。

１０秒後、Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ（商標）Ｐｅｒｌａｎｅ（商標）ゲルは、水溶液中で多数の粒子の形態に完全に崩壊／分散されることが観察された。ゲルＸは、非凝集性粒子に基づく粘弾性構造を有していた。ゲルＸは、本発明によるゲルの特徴に対応しなかった。審美的使用に関する医学的実施では、ゲルＸは注入部位において拡散／移行するであろう。

一方、ゲルＢ’は、水溶液中で「ゲルボール」形態のままであった。したがって、化粧用途における使用に対する医学的実施の状況において、注入部位における拡散／移行を抑制することにより、治療領域からの生体材料の移行がないため、注入されたゲルが長期に亘って組織中に容積を生じる能力を維持できることから、より良好な長期の製品性能を提供しながら、組織中のハイドロキシアパタイト粒子の移行に関連する合併症を回避する、凝集性粒子に基づく構造を有する。

実施例３
本発明によるゲルの粘弾性の重要性の比較
Ｃは、ＢＤＤＥ４２０ｍｇに代えて２００ｍｇを導入すること以外は、実施例１に記載されるのと同じプロトコル（工程１及び工程２）に従って調製されたゲルである。
Ｄは、ＢＤＤＥ４２０ｍｇに代えて２９０ｍｇを導入すること以外は、実施例１に記載されるのと同じプロトコル（工程１及び工程２）に従って調製されたゲルである。

ゲルＣを機械的／流動的な観点から特性評価した：
これらの流動的な特性評価を行うために使用したレオメーターは、プレート形状４０ｍｍ、作動エアギャップ１０００マイクロメートル、及び分析温度２５℃のＡＲ２０００（TA Instruments）であった。

０．０１Ｈｚ〜１００Ｈｚの周波数掃引を行うことにより、弾性と粘性との間の比（ＴａｎデルタＧ’’／Ｇ’）を計測した。

上記パラメーターの比較を１Ｈｚで行った。

ハイドロキシアパタイト粒子は、ゲルＣ中で経時的に沈殿し（遠心分離器に試料を通すことによって観察されるよく知られた現象）、この現象はゲルＤには観察されないことがわかった。

この沈降は、不均質な粒子に基づくハイドロキシアパタイト製品の取得を必然的に伴う。これは、針を通すゲルの注入行為（針の詰まりのため）、また、安全性及び注入区域における製剤の性能（いわゆる硬質領域の生成等の合併症の大きなリスク）の点で不十分である。

実施例２に示されるように、本発明によるゲルの凝集性は重要であるだけでなく、
容器中でハイドロキシアパタイト粒子の経時的な沈降を回避するため、
注入中及び／又は注入部位で２相（ハイドロキシアパタイトの粒子及び架橋ヒアルロン酸ゲル）に分離する製品を有することにより、治療領域で不均質性が生じるのを回避するため、
その粘弾特性を好適にする必要もある。

そのため、ゲルの弾性特性（その粘度に関する）は、上記粒子の沈降を抑制するために十分高くなければならない。

実施例４
本発明によるゲルと従来技術の溶液との比較
ａ）非架橋ＨＡ及びハイドロキシアパタイト系製剤
文献に記載されるように、ｉｎ ｖｉｖｏで非架橋ヒアルロン酸は１週間未満の半減期を有する。

その結果、非架橋ＨＡとハイドロキシアパタイトとからなる溶液は、非架橋ヒアルロン酸が非常に急速に吸収され、長期に亘ってハイドロキシアパタイト粒子の移行を抑制しないことから価値がない。

ｂ）水性ハイドロキシアパタイト製剤
水性ハイドロキシアパタイト溶液（Ｓ１）を調製した（中性ｐＨの等浸透圧生理食塩溶液中、３０マイクロメートル〜５０マイクロメートルの粒子サイズの３０％リン酸カルシウムハイドロキシアパタイト）。

５ｍｌの精製水の入ったプラスチック製の３０ｍｌ容のボトルにおいて、１ｍｌのＳ１溶液を添加した。上記ボトル中でハイドロキシアパタイト粒子の即時の分散が観察された。

本発明の製剤と異なり、Ｓ１溶液は長期に亘って注入部位でハイドロキシアパタイト粒子を保持することができなかった。

ｃ）ＣＭＣ及びハイドロキシアパタイト系製剤（図１を参照されたい）
水性カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）及びハイドロキシアパタイト（Ｓ３）の製
剤を調製した（中性ｐＨの等浸透圧生理食塩溶液中、３０マイクロメートル〜５０マイクロメートルの粒子サイズの３０％リン酸カルシウムハイドロキシアパタイト、及び２５００００Ｄａの２％ＣＭＣ）。

５ｍｌの精製水の入ったプラスチック製の３０ｍｌ容のボトルにおいて、１ｍｌのＳ３製剤を添加した。上記ボトルの閉鎖後、そのボトルを手で５秒間混合した。

１０秒後、Ｓ３製剤は、水溶液中に多数の粒子の形態に完全に崩壊／分散されたことが観察された。

本発明の製剤と異なり、Ｓ３溶液は長期に亘って注入部位でハイドロキシアパタイト粒子を保持することができなかった。

Claims (18)

1. 凝集性粒子系の粘弾性ゲルの形態の治療目的で使用される湿熱によって滅菌された無菌水性注入用製剤であって、
   ｉ）１％〜４％（質量／体積）の濃度の架橋ヒアルロン酸又はその塩の１種であって、前記架橋が、二官能性又は多官能性の分子を用いる前記ヒアルロン酸の鎖間の共有結合の形成により達成される、架橋ヒアルロン酸又はその塩の１種と、
   ｉｉ）１０％〜７０％（質量／体積）の濃度のハイドロキシアパタイトであって、５００ｎｍ以上８０μｍ以下の平均サイズを有する粒子形態である、ハイドロキシアパタイトと、
   を含有し、
   前記無菌注入用水性製剤は、プレート形状４０ｍｍ、作動エアギャップ１０００マイクロメートル、及び分析温度２５℃のレオメーターを使用して、０．０１Ｈｚ〜１００Ｈｚの周波数掃引を行うことにより計測された場合の１Ｈｚの周波数におけるＴａｎδが０．６０以下となるような粘弾特性を有する、無菌水性注入用製剤。
2. 前記ヒアルロン酸又はその塩の１種の分子量が２．５×１０５Ｄａ〜４×１０６Ｄａであることを特徴とする、請求項１に記載の無菌注入用水性製剤。
3. 前記架橋ヒアルロン酸又はその塩の１種の濃度が１％〜３％（質量／体積）であることを特徴とする、請求項１に記載の無菌注入用水性製剤。
4. 前記ハイドロキシアパタイトの濃度が２０％〜６０％（質量／体積）、好ましくは３０％〜５０％であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の無菌注入用水性製剤。
5. リン酸三カルシウム等の１又は複数のセラミック材料を更に含むことができることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の無菌注入用水性製剤。
6. 前記セラミック材料がリン酸三カルシウムであることを特徴とする、請求項５に記載の
   無菌注入用水性製剤。
7. １又は複数の麻酔剤を更に含むことができることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の無菌注入用水性製剤。
8. １又は複数の麻酔剤が、リドカイン単独若しくはアドレナリンとの併用、プロカイン、エチドカイン単独若しくはアドレナリンとの併用、アルチカイン単独若しくはエピネフリンとの併用、メピバカイン、プラモカイン、キニソカイン、又はこれらの麻酔剤の１若しくは複数の塩からなる群から選択されることを特徴とする、請求項７に記載の無菌注入用水性製剤。
9. 前記麻酔剤が塩酸リドカインであることを特徴とする、請求項８に記載の無菌注入用水性製剤。
10. １又は複数の抗酸化剤を更に含むことができることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の無菌注入用水性製剤。
11. １又は複数の抗酸化剤がポリオールファミリーから選択されることを特徴とする、請求項１０に記載の無菌注入用水性製剤。
12. 前記ポリオールがソルビトール、グリセロール、マンニトール、及びプロピレングリコールを含むことを特徴とする、請求項１０に記載の無菌注入用水性製剤。
13. 「骨形成タンパク質」（ＢＭＰ）及び／又は「形質転換成長因子β」（ＴＧＦ−β）のファミリーの成長因子等の１又は複数の成長因子を更に含むことを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の無菌注入用水性製剤。
14. 整形外科、歯科、顎顔面、ＥＮＴ、消化器科、泌尿器科、又は婦人科の手術に使用される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の無菌注入用水性製剤。
15. 容積の充填及び／又は回復、及び／又は生体組織の置換に使用される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の無菌注入用水性製剤。
16. 請求項１〜１５のいずれか一項に記載の無菌注入用水性製剤を含有するキット。
17. シリンジ、アンプル、又はボトルの形態である、請求項１６に記載のキット。
18. 無菌水性注入用製剤を作製する方法であって、
    ａ）二官能性又は多官能性の分子を用いてバイオポリマーの鎖間に共有結合を形成することにより調製する、少なくとも１重量％〜４重量％の架橋ヒアルロン酸又はその塩を含有する第１混合物の調製工程と、
    ｂ）前記第１混合物の精製工程と、
    ｃ）次いで、前記架橋ヒアルロン酸系ゲル中に均質に分散させることによる、１０％〜７０％（質量／体積）の濃度の、５００ｎｍ以上８０μｍ以下の平均サイズを有する粒子形態である前記ハイドロキシアパタイトの添加工程と、
    ｄ）このようにして得られた前記ゲルを、即時使用可能な形態にする工程と、
    ｅ）前記製品の湿熱による滅菌工程と、
    からなる、無菌水性注入用製剤を作製する方法。