ES2951549T3 - Métodos de fabricación de geles inyectables que comprenden ácido hialurónico reticulado e hidroxiapatita - Google Patents
Métodos de fabricación de geles inyectables que comprenden ácido hialurónico reticulado e hidroxiapatita Download PDFInfo
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Abstract
En el presente documento se proporcionan las composiciones y métodos de fabricación de geles inyectables de ácido hialurónico reticulado asociado en un grado variable con hidroxiapatita. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Métodos de fabricación de geles inyectables que comprenden ácido hialurónico reticulado e hidroxiapatita
Campo de la invención
La presente invención se refiere a métodos de fabricación de materiales compuestos que comprenden ácido hialurónico reticulado e hidroxiapatita.
Antecedentes
El ácido hialurónico es un componente común de las preparaciones cosméticas, y se usa en varios procedimientos cosméticos, especialmente en el relleno de arrugas. El ácido hialurónico natural tiene escasa estabilidad in vivo debido a una rápida degradación enzimática y a la hidrólisis y, en consecuencia, se han preparado diversas formas de ácido hialurónico químicamente modificadas (p. ej., formas reticuladas, formas modificadas iónicamente, formas esterificadas, etc.) para hacer frente a esta escasa estabilidad.
La hidroxiapatita tiene una composición química que es muy similar a la de la fase mineral del hueso. Sus propiedades biológicas y su biocompatibilidad la convierten en un excelente producto sustituto óseo. La colonización ósea por parte del sustituto generalmente depende, en gran medida, de las características porosas del material y, en particular, del tamaño y distribución de los poros, y la interconexión entre los macroporos (número y tamaño). Las interconexiones son túneles que permiten el paso de células y la circulación de sangre entre los poros y, por lo tanto, promueven la formación ósea dentro del sustituto. La hidroxiapatita cálcica (CaHAp) es una especie mineral de la familia del fosfato, que tiene la fórmula Ca5(PO4)3(OH), generalmente indicada como Ca10(PO4)6(OH)2 , para enfatizar el hecho de que la red de la estructura cristalina contiene dos moléculas. La hidroxiapatita pertenece a la familia cristalográfica de la apatita, que son compuestos isomórficos que tienen la misma estructura hexagonal. Este compuesto se ha usado como biomaterial durante muchos años en diversas especialidades médicas.
Actualmente, el ácido hialurónico o las versiones reticuladas del mismo, se usan en diversas formas de gel, por ejemplo, como productos de aumento de tejidos blandos, barreras de adhesión y similares.
Por ejemplo, la solicitud de patente PCT WO 2013/053457 divulga una composición de dos polímeros de ácido hialurónico de peso molecular diferente, reticulados en presencia de hidroxiapatita. La solicitud de patente PCT WO 2016/074794 enseña composiciones de relleno dérmico en forma de gel, que comprende ácido hialurónico (AH), carboximetilcelulosa (CMC) y, opcionalmente, micropartículas tales como hidroxiapatita cálcica (CaHAP). La solicitud de patente PCT WO 2016/025945 enseña un material compuesto que incluye un gel basado en ácido hialurónico, y una nanoestructura dispuesta dentro del gel. La publicación de solicitud de patente de EE. UU. US-2013096081 proporciona composiciones duraderas de relleno dérmico de hidrogel a base de ácido hialurónico, fácilmente inyectables, hechas con un agente de reticulación de diamina o multiamina, en presencia de un agente de acoplamiento de carbodiimida. La solicitud de patente coreana KR 20110137907 enseña una composición de relleno dérmico que se forma mediante adsorción o unión covalente de polímeros aniónicos, sobre la superficie de las perlas de cerámica, como perla de hidroxiapatita, perla de biovidrio, perla de carbonato de calcio, perla de dióxido de titanio, perla de sulfato de bario, perla de alúmina y perla de zirconia. La publicación de solicitud de patente de EE. UU. US-2010136070 divulga una composición reticulada de ácido hialurónico, derivados de ácido hialurónico, o mezclas de los mismos, ácido algínico, derivados de ácido hialurónico, o mezclas de los mismos, e iones de calcio. Además, las solicitudes de patente de EE. UU. US-20150257989 y US-2015238525 describen un gel de ácido hialurónico reticulado cohesivo rellenado con partículas de hidroxiapatita. La publicación de solicitud de patente de EE. UU. US-2011038938 enseña una composición inyectable autoconfigurable, que comprende: partículas de cemento capaces de experimentar una reacción de cementación cuando se ponen en contacto con un líquido de fraguado adecuado; y al menos un gel de polímero reticulable, en donde dicho gel polimérico es capaz de experimentar reticulación iónica en presencia de iones multivalentes.
Existe en la técnica una necesidad de proporcionar materiales compuestos de ácido hialurónico con propiedades deseadas mejoradas, tales como resistencia a la degradación controlada, enzimática o no enzimática, y/o comportamiento de hinchamiento espacial, y/o propiedades reológicas mejoradas, y/o estabilidad mecánica, y/o efectos secundarios reducidos, y/o biocompatibilidad, y/u osmolaridad controlada.
Resumen de la invención
Se proporcionan métodos de fabricación de composiciones de ácido hialurónico e hidroxiapatita, como se describe en la reivindicación 1.
Los presentes inventores han descubierto, inesperadamente, que la reticulación del ácido hialurónico y la adición de hidroxiapatita puede realizarse en múltiples etapas, p. ej., en al menos dos etapas. Según un método para producir el material compuesto de la invención, la hidroxiapatita se añade al ácido hialurónico en múltiples etapas, en dos etapas,
separadas o concomitantemente con una reticulación del ácido hialurónico, es decir, de manera escalonada. El material compuesto resultante incluye partículas de hidroxiapatita dispersas, p. ej., finamente dispersas dentro del gel reticulado, divididas entre diferentes regiones funcionales de la matriz de ácido hialurónico (AH) reticulado, como se define a continuación, y que tiene un grado variable de asociación a la matriz de AH, tal como, p. ej., hidroxiapatita fuertemente asociada a hidroxiapatita débilmente asociada, proporcionando, de ese modo, un material compuesto que tiene propiedades mejoradas. Sin pretender quedar limitado por ninguna teoría, se cree que, como resultado de un proceso de múltiples etapas según la invención, las partículas de hidroxiapatita que se añaden durante diferentes etapas de la reticulación del ácido hialurónico, poseen un grado diferente de asociación con la matriz de ácido hialurónico, permitiendo, de ese modo, una liberación gradual de las partículas de hidroxiapatita de la matriz.
El material compuesto puede incorporarse en una preparación cosmética, médica (incluyendo quirúrgica) o farmacéutica. La preparación generalmente está en forma de gel viscoelástico. La preparación puede comprender ácido hialurónico en concentraciones de aproximadamente 0,2 a 9 % p/p, inclusive. La preparación puede también comprender hidroxiapatita cálcica en concentraciones de aproximadamente 5 a 90 % en peso. La preparación puede también comprender material adicional, p. ej., fármacos, siendo ejemplos no limitativos anestésicos locales, p. ej., lidocaína u hormonas, factores de crecimiento, esteroides.
La presente invención proporcionada en la presente memoria es un proceso de fabricación de un producto de gel que comprende ácido hialurónico reticulado e hidroxiapatita, comprendiendo dicho proceso: combinar, en un medio acuoso, ácido hialurónico o una sal del mismo, un agente de reticulación, y realizar una reacción de reticulación en presencia de una primera parte de hidroxiapatita; completar la reacción de reticulación; e incorporar una segunda parte de hidroxiapatita en el gel así formado, en donde dicha incorporación comprende dispersar homogéneamente dicha segunda parte de hidroxiapatita en dicho gel de ácido hialurónico así formado.
La reticulación puede efectuarse aumentando el pH del medio. La finalización de la reacción se puede lograr dejando la mezcla de reacción en reposo y/o neutralizando dicha mezcla de reacción, p. ej., ajustando el pH a aproximadamente entre 6,0 y 7,8, p. ej., aproximadamente 7.
La concentración de hidroxiapatita en el gel puede ser superior al 25 por ciento en peso, preferiblemente superior al 45 por ciento en peso, y además preferiblemente entre el 50 y el 60 por ciento en peso.
La cantidad total de hidroxiapatita se divide de manera que la primera parte de hidroxiapatita que está presente en la mezcla de reacción de reticulación, sea de entre el 5 y el 90 por ciento en peso de la cantidad total de hidroxiapatita. Es decir, que la relación en peso entre la primera parte y la segunda parte esté entre 1:9 y 9:1. Preferiblemente, la primera parte de hidroxiapatita está entre el 5 y el 30 por ciento en peso de la cantidad total de hidroxiapatita. Es decir, la relación en peso entre la primera parte y la segunda parte es preferiblemente entre aproximadamente 1:7 y 1:3, especialmente, en algunas realizaciones, la parte predominante se añade en la segunda parte.
La hidroxiapatita cálcica empleada en el proceso puede tener un tamaño de partículas promedio de entre 25 y 45 micrómetros.
El agente de reticulación puede seleccionarse del grupo que consiste en 1,4-butanodiol diglicidil éter, poli-(etilenglicol) diglicidil éter, y etilenglicol diglicidil éter; preferiblemente 1,4-butanodiol diglicidil éter.
La concentración de dicho ácido hialurónico en dicho medio acuoso puede ser de entre 0,2 y 9 por ciento en peso, preferiblemente de entre 0,5-4 por ciento en peso.
La relación en peso entre ácido hialurónico y el agente de reticulación en el medio acuoso puede ser de entre 15:1 y 2:1.
El proceso puede también comprender introducir al gel una cantidad adicional de ácido hialurónico, es decir, ácido hialurónico no reticulado libre, después de completar la reacción de reticulación.
El gel resultante se puede desgasificar, p. ej., al vacío, llenar en un dispositivo de inyección adecuado, y esterilizar, para que sea adecuado para la inyección a un sujeto que lo necesite.
En una realización específica, el proceso de la invención comprende cargar un recipiente de reacción, con agua y ácido hialurónico o una sal del mismo, agitar para obtener una solución, añadir 1,4-butanodiol diglicidil éter, hidróxido de sodio, y una primera parte de hidroxiapatita cálcica, mantener a temperatura elevada durante un primer período, y a temperatura ambiente durante un segundo período, añadir una solución tampón de fosfato y un ácido acuoso, para lograr un gel con un pH casi neutro, e incorporar una segunda parte de hidroxiapatita cálcica en el gel, en donde la relación de peso entre la primera parte de hidroxiapatita cálcica y la segunda parte de hidroxiapatita cálcica es de entre 1:3 y 1:7, y la concentración total de hidroxiapatita cálcica es de entre el 50 y el 60 por ciento en peso.
La composición de gel inyectable comprende ácido hialurónico reticulado e hidroxiapatita, en donde la concentración de dicha hidroxiapatita es superior al 45 por ciento en peso del peso total del gel, preferiblemente entre el 50 y el 60 por ciento en peso del peso total del gel.
Alternativamente, la composición de gel inyectable comprende ácido hialurónico reticulado e hidroxiapatita, en donde la concentración de dicha hidroxiapatita es superior al 20 por ciento en peso del peso total del gel, p. ej., superior al 25 por ciento en peso, con mayor preferencia superior al 45 por ciento en peso, y aún más preferiblemente entre el 50 y el 60 por ciento en peso, y en donde una parte de dicha hidroxiapatita es inseparable de dicho gel después de la centrifugación durante 10 minutos con 735 g de fuerza, siendo dicha parte al menos aproximadamente la quinta parte de la cantidad total de hidroxiapatita, es decir, entre aproximadamente el 18 y el 35 por ciento en peso inseparable de dicho gel.
En el gel inyectable, las partículas de hidroxiapatita pueden tener un tamaño de partículas promedio de entre 25 y 45 micrómetros.
La concentración de dicho ácido hialurónico reticulado en la composición de gel inyectable puede ser de entre el 0,2 y el 9 por ciento en peso.
La unidad estructural que reticula el ácido hialurónico reticulado en el gel inyectable, corresponde al agente de reticulación que se usó en el proceso, p. ej., 1,4-butanodiol diglicidil éter, poli-(etilenglicol) diglicidil éter, o etilenglicol diglicidiléter. Por lo tanto, la unidad estructural corresponde a las formas convertidas de los agentes de reticulación.
El gel puede también comprender ácido hialurónico no reticulado.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 presenta un diagrama de flujo de un proceso para preparar un gel inyectable según una realización de la presente invención.
La Figura 2 presenta un diagrama de dispersión de rayos X de ángulo pequeño de diversos geles que comprenden solo o hidroxiapatita débilmente asociada, o fuertemente y débilmente asociada.
La Figura 3 muestra un dibujo esquemático que demuestra un aparato usado para medir la liberación a lo largo del tiempo de la hidroxiapatita cálcica de los geles.
Descripción detallada
A menos que el contexto indique claramente lo contrario, los términos “ preparación” , “ composición” , “ compuesto”, “ formulación” y similares, como se usan indistintamente en la presente memoria, deben considerarse como que se refieren a un producto de gel inyectable, de ácido hialurónico reticulado e hidroxiapatita, como se describe generalmente en la presente memoria.
Las expresiones “ fuertemente asociada” y “ débilmente asociada” , como se usan en la presente memoria en referencia a la hidroxiapatita en diferentes regiones (p. ej., “ regiones funcionales” ) del gel, deben considerarse como pertenecientes a regiones del gel de ácido hialurónico con diferente grado de asociación entre partículas de hidroxiapatita y el gel reticulado, alto y bajo, respectivamente. Por lo tanto, un material que se denomina “ fuertemente asociado” , o “ estrechamente asociado” , debe considerarse como una región de material en donde la hidroxiapatita está mejor asociada o más densamente colocalizada con el AH reticulado, por unidad de volumen del gel. Por el contrario, el material “ débilmente asociado” debe considerarse como una región de material en donde la hidroxiapatita está menos asociada o menos densamente colocalizada con el AH reticulado, por unidad de volumen del gel. Los términos y expresiones “ región” , “ región funcional” , “ fase” y similares, como se usan en referencia a las regiones de hidroxiapatita fuertemente y débilmente asociadas, deben considerarse como una fracción de gel de ácido hialurónico con un grado variable de asociación o colocalización con la hidroxiapatita. Se cree que las partículas de hidroxiapatita fuertemente asociadas no son fácilmente separables del gel, p. ej., por centrifugación. También se cree que la presencia de una fracción de hidroxiapatita fuertemente asociada puede impedir la separación de las partículas del gel más débilmente asociadas.
En el contexto de la presente invención, los términos y expresiones “ apatita” , “ hidroxiapatita” , “ hidroxiapatita cálcica” y similares, como se usan en la presente memoria, se refieren a un mineral de hidroxiapatita de una fórmula general Ca1ü(PO4)6(OH)2, de una calidad y pureza adecuadas para su uso/administración, p. ej., inyección, en seres humanos.
A veces, la hidroxiapatita puede sustituirse por otros minerales de fosfato de calcio. La expresión “ minerales de fosfato de calcio” se refiere a una familia de minerales que contienen iones calcio (Ca2+) junto con ortofosfatos (PO43"), metafosfatos o pirofosfatos (P2O74") y, ocasionalmente, iones hidrógeno o hidróxido. Los ejemplos no limitativos de minerales de fosfato de calcio que pueden usarse como alternativa a la hidroxiapatita, son alfa-fosfato tricálcico y beta-fosfato tricálcico. Otras partículas de material biocompatible también pueden ser adecuadas.
En algunas realizaciones, la hidroxiapatita puede estar parcialmente sustituida con minerales de fosfato de calcio, particularmente con alfa-fosfato tricálcico y/o beta-fosfato tricálcico, y/o una mezcla de los mismos. En las realizaciones, en donde la parte de hidroxiapatita está sustituida con minerales de fosfato de calcio, la parte puede variar de aproximadamente el 10 por ciento en peso a aproximadamente el 90 por ciento en peso, p. ej., entre 10-30, o 30-50, o 50-70, o entre 70-90, o entre 10-70, o 30-90, o 30-70 por ciento en peso. En estas realizaciones, la parte en peso expresada en porcentaje en peso es el porcentaje de la cantidad descrita en la presente memoria para la hidroxiapatita.
La hidroxiapatita está incrustada en las composiciones de la presente invención, ya que puede actuar como un material de relleno dérmico, y puede inducir la síntesis de colágeno. Los inventores han descubierto, además, que el grado de asociación de la hidroxiapatita a la matriz de AH, p. ej., la cantidad particular de hidroxiapatita fuertemente asociada e hidroxiapatita débilmente asociada, dentro de la matriz de AH, puede controlarse mediante el proceso de fabricación, p. ej., por las cantidades relativas de hidroxiapatita añadidas durante varias etapas del proceso de formación de la matriz de AH.
La hidroxiapatita puede estar presente en la preparación según la invención, generalmente en concentraciones entre el 5 y el 90 por ciento en peso, p. ej., entre el 5 y el 70 por ciento en peso, o entre el 20 y el 65 por ciento en peso, preferiblemente entre el 30 y el 60, o entre el 40 y el 70 por ciento en peso, del peso total del gel. En algunas realizaciones, la hidroxiapatita está en la concentración de entre el 50 y el 60 por ciento en peso. En realizaciones adicionales, la concentración de hidroxiapatita es superior al 25 por ciento en peso, p. ej., superior al 35, o superior al 45, o al 48, o al 51, al 53, o entre el 54 y el 57 por ciento en peso.
En algunas realizaciones, una parte de hidroxiapatita es inseparable de la preparación después de la centrifugación. Generalmente, la parte inseparable puede determinarse a una fuerza g de 2040 durante 5 minutos, o a una fuerza de 735 g durante 10 minutos. La parte inseparable puede ser al menos el 18 % en peso de la hidroxiapatita total, y puede ser al menos un quinto (p. ej., 20 % en peso), un cuarto (p. ej., 25 % en peso), p. ej., hasta aproximadamente un tercio (p. ej., 35 % en peso) de hidroxiapatita total. La centrifugación se puede realizar como se conoce generalmente en la técnica, p. ej., usando una centrífuga Eppendorf 5415C (dimensiones: [Ancho x Alto x Profundidad] 21,0 cm x 28,0 cm x 28,5 cm) con muestras de gel colocadas en tubos adecuados, p. ej., tubos Eppendorf de 2 ml. Con esta centrífuga, se logra una fuerza de 2040 g a 5000 rpm, y se logra una fuerza de 735 g a 3000 rpm.
La hidroxiapatita puede proporcionarse en forma de polvo, p. ej., como una pluralidad de partículas. El tamaño de partículas promedio puede ser inferior o igual a 650 um, preferiblemente inferior a aproximadamente 200 um, más preferiblemente inferior a aproximadamente 80 um, y también puede ser inferior a aproximadamente 500 nm. Además, preferiblemente, aproximadamente al menos el 75 % de las partículas de hidroxiapatita puede tener un tamaño entre 25 um y 500 um, o entre 25 um y 300 um, o entre 25 um y 200 um, o entre 25 um y 100 μm, preferiblemente entre 25 um y 45 um. Alternativa o adicionalmente, al menos el 75 % de las partículas de hidroxiapatita pueden estar entre 1 um y 100 um, o entre 5 um y 45 um, o entre 10 um y 45 um. Las expresiones “ tamaño de partículas promedio” , “ tamaño de partículas” , “ tamaño de partículas promedio en peso” y similares, como se usan indistintamente en la presente memoria en referencia a las partículas de hidroxiapatita cálcica, se refieren a un peso promedio de una distribución de tamaño de partículas de polvo, p. ej., hidroxiapatita cálcica; es decir, el valor promedio del tamaño de partículas en un volumen de polvo tomado por proporción en peso de cada fracción.
En el contexto de la presente invención, las expresiones “ ácido hialurónico” , “AH” o “ hialuronato” , se refieren indistintamente a un polisacárido lineal o a su sal, particularmente a un glicosaminoglicano no sulfatado, compuesto por unidades de disacárido repetidas, consistiendo cada unidad en ácido D-glucorónico y D-N-acetilglucosamina, a través de enlaces glucosídicos (3-1,4 y (3-1,3 alternos.
El ácido hialurónico puede representarse mediante la Fórmula 1 a continuación.
El ácido hialurónico o sus sales pueden proceder de una variedad de fuentes en una variedad de pesos moleculares y otras especificaciones. Generalmente, todas las fuentes de ácido hialurónico pueden ser útiles para los fines de la presente invención, incluidas fuentes bacterianas y aviares.
El peso molecular del ácido hialurónico puede usarse como una característica para describir el material. La expresión “ peso molecular” incluye tanto el peso molecular promedio en número, como el peso molecular promedio en peso, como se conoce para los polímeros. Los materiales de ácido hialurónico útiles pueden tener un peso molecular de aproximadamente 0,25 MDa (mega Dalton) a aproximadamente 4,0 MDa, p. ej., de aproximadamente 0,5 MDa a aproximadamente 4,0 MDa. Los intervalos útiles del peso molecular del AH incluyen de aproximadamente 0,6 MDa a aproximadamente 2,6 MDa, preferiblemente de aproximadamente 1,3 MDa a aproximadamente 2,0 MDa. Los intervalos útiles del peso molecular del AH también pueden incluir de aproximadamente 1,0 MDa a aproximadamente 3,0 MDa, de aproximadamente 1,0 MDa a aproximadamente 2,5 MDa, de aproximadamente 1,5 MDa a aproximadamente 2,0 MDa. Específicamente, se puede usar AH del peso molecular de aproximadamente 0,7 MDa, de aproximadamente 1,8 MDa, o de aproximadamente 2,7 MDa. En algunas realizaciones, el gel comprende AH que tiene un Pm de entre 0,1-5 MDa, entre 1 a 5 MDa, entre 0,1 a 2 MDa, entre 0,1 a 1 MDa, entre 1 y 4 MDa, entre 2 y 3,5 MDa, o entre 0,1 y 5 MDa.
El ácido hialurónico también se caracteriza con un valor de polidispersidad, indicativo de la variación de los pesos moleculares en el polímero. Si bien puede ser ventajoso usar un ácido hialurónico de baja polidispersidad, en aras de una repetibilidad mejorada de los procesos, puede ser económicamente inviable. Puede lograrse un compromiso razonable entre la anchura de la polidispersidad de pesos moleculares y el precio del material de partida, y los materiales de ácido hialurónico adecuados pueden tener una polidispersidad de aproximadamente 1,1 a 4,0, preferiblemente menos de 3,0, más preferiblemente menos de 2,0.
La concentración de ácido hialurónico reticulado en la composición puede variar de 0,2 por ciento en peso a 9 por ciento en peso. En algunas realizaciones, la concentración de ácido hialurónico es de entre 0,5 y 8, o de entre 0,8 y 7, o de entre 0,2 y 1, o de entre 0,5 y 1,5, o de entre 0,5 y 4, o de entre 3 y 6, o de entre 1 y 5 por ciento en peso. Generalmente, el ácido hialurónico reticulado en la composición es ácido hialurónico que se combinó con un agente de reticulación en condiciones de reticulación, como se describe en la presente memoria.
El ácido hialurónico puede estar al menos parcialmente reticulado. El término “ reticulado” , como se utiliza en la presente memoria, en referencia al ácido hialurónico, debe considerarse como una modificación química o física de dos o más cadenas poliméricas de ácido hialurónico, lo que da como resultado que las cadenas de ácido hialurónico se unan entre sí, preferiblemente se unan covalentemente. El proceso de reticulación puede incluir preferiblemente un agente de reticulación. De manera similar, un proceso de reacción intermolecular o intramolecular, sin un agente de reticulación, que da como resultado la formación de una lactona, un anhídrido, un éter o un éster, ya sea dentro de una sola cadena polimérica o entre dos o más cadenas. El término “ reticulado” también puede usarse en referencia al ácido hialurónico unido covalentemente a un agente de reticulación, o a un ácido hialurónico modificado covalentemente.
Además, el gel puede también comprender ácido hialurónico libre, es decir, ácido hialurónico no reticulado. Generalmente, el ácido hialurónico libre no está expuesto a condiciones de reticulación. En algunas realizaciones, los geles pueden comprender ácido hialurónico libre, y el ácido hialurónico libre puede estar presente en las concentraciones entre el 5 y el 95 por ciento en peso de ácido hialurónico total. Por lo tanto, la relación entre el AH reticulado y no reticulado puede ser de al menos 0,1:1, p. ej., al menos 0,5:1, o 1:1, o 2:1, o 5:1, o 10:1.
La expresión “ agente de reticulación” , como se usa en la presente memoria, se refiere a moléculas que contienen al menos dos grupos funcionales reactivos que crean enlaces covalentes entre dos o más moléculas de ácido hialurónico. Los agentes de reticulación pueden ser homo-bifuncionales (es decir, tienen dos extremos reactivos idénticos) o heterobifuncionales (es decir, tienen dos extremos reactivos diferentes). Los agentes de reticulación adecuados para su uso en la presente invención, generalmente comprenden grupos funcionales complementarios a los del ácido hialurónico, de manera que puedan formarse los enlaces cruzados. Preferiblemente, la reticulación no forma ácido hialurónico esterificado. Los ejemplos no limitativos de agentes de reticulación adecuados para la presente invención incluyen 1,4-butanodiol diglicidil éter (BDDE), 1,2,7,8-diepoxioctano (DEO), biscarbodiimida (BCDI), ácido adípico dihidrazida (ADH), suberato de bis(sulfosuccinimidilo) (BS3), hexametilendiamina (NMDA), 1-(2,3-epoxipropil)-2,3-epoxiciclohexano, agentes de reticulación multifuncionales, tales como pentaeritritol tetraglicidil éter (PETGE), o a base de PEG, tal como polietilen diglicidil éter (PEGDE), monoetilenglicol diglicidil éter (EGDE), o una combinación de los mismos. Preferiblemente, el agente de reticulación es BDDE.
Como se usa indistintamente en la presente memoria, las expresiones “ agente de reticulación a base de PEG” y similares, se refieren a derivados de polietilenglicol (PEG). El término “ PEG” se refiere a un compuesto de poliéter de polietilenglicol, con muchas aplicaciones, desde la fabricación industrial hasta la medicina. El PEG también se conoce como poli(óxido de etileno) (PEO) o polioxietileno (POE), dependiendo de su peso molecular. La estructura del PEG se expresa comúnmente como H-(O-CH2-CH2)n-OH. Los ejemplos no limitativos de derivados de PEG que pueden usarse como agentes de reticulación son epóxidos de PEG, tales como poli(etilenglicol) diglicidil éter, PEG-dihidrazida, PEG-dihaluros, diazida-PEG, diaminooxi-PEG, diamina-PEG, etc.
La expresión “ condiciones de reticulación” , como se usa en la presente memoria, se refiere a condiciones de reacción que permiten la formación de enlaces covalentes entre las cadenas de AH. Generalmente, las condiciones de reticulación afectan a la reacción de reticulación, y pueden incluir el ajuste de la mezcla a un pH y temperatura deseados, específicos para un agente de reticulación usado. Las condiciones de reticulación pueden incluir ajustar el pH de la mezcla a un pH superior a 12. Las condiciones de reticulación pueden incluir, además, exponer la mezcla a temperatura elevada, p. ej., a 45 °C, durante un primer período, p. ej., entre 1 y 5 horas, p. ej., 3 horas. Las condiciones de reticulación pueden incluir, además, exponer la mezcla a 25 °C durante un segundo período, p. ej., 15 horas. La temperatura de reticulación óptima y el pH pueden determinarse fácilmente, experimentalmente, mediante la prueba de las condiciones de reticulación para el Ah que son bien conocidas en la técnica para un agente de reticulación específico. A veces, las condiciones de reticulación pueden retirarse activamente para terminar la reacción de reticulación. La terminación de la reacción de reticulación puede incluir el ajuste de la mezcla a un pH y temperatura deseados, específicos para un agente de reticulación usado, p. ej., ajustando el pH de la mezcla a un pH de aproximadamente 7.
El grado de reticulación puede expresarse como un percentil de los grupos reactivos de AH que estaban ocupados al realizar el proceso de reticulación. El grado de reticulación puede ser importante para las propiedades fisicoquímicas de los geles resultantes, p. ej., la tasa de degradación y/o la resistividad a la degradación enzimática. El grado de modificación (MoD) definido por la relación entre los moles de agente de reticulación y los moles de dímero de AH, puede estar entre 1 %-40 %, 2 %-30 %, 3 %-20 %, 4 %-10 %, particularmente 6 %-10 %.
La reticulación de AH se puede lograr disolviendo/dispersando ácido hialurónico en un disolvente, preferiblemente agua, añadiendo el agente de reticulación y, preferiblemente, al menos un aditivo, p. ej., hidroxiapatita, y llevando la mezcla a condiciones de reticulación. Alternativamente, el agente de reticulación puede añadirse gradualmente a una mezcla de ácido hialurónico con aditivos opcionales, en condiciones de reticulación.
Los geles compuestos pueden comprender, además, material biológicamente activo, p. ej., fármacos. Los ejemplos no limitativos de fármacos adecuados para los geles compuestos incluyen anestésico local, p. ej. lidocaína, y también hormonas, factores de crecimiento y esteroides.
Los geles compuestos pueden formarse en una preparación farmacéutica, médica o cosmética. La preparación puede ser generalmente una formulación acuosa que comprende ácido hialurónico reticulado, o una sal del mismo, e hidroxiapatita cálcica, preferiblemente en forma de un gel inyectable, opcionalmente, un gel inyectable estéril. Más preferiblemente, la preparación es una preparación cosmética.
Al realizar el proceso según la invención, se puede añadir ácido hialurónico, o una sal del mismo, al agua, y mezclarse en un mezclador adecuado hasta la disolución. El agente de entrecruzamiento, p. ej., BDDE, puede añadirse al mezclador, y mezclarse hasta la disolución. Alternativamente, se puede añadir una solución de agente de reticulación a la solución de ácido hialurónico. La hidroxiapatita puede dispersarse en la mezcla de reacción, p. ej., usando un homogeneizador de rotor-estator.
La realización de una reacción de reticulación puede comprender aumentar el pH del medio. Esto se puede lograr añadiendo a la mezcla de reacción una cantidad suficiente de una base o una solución de una base, y mezclándola hasta que sea homogénea. La temperatura de la mezcla de reacción puede elevarse si es necesario. La realización de la reacción de reticulación para obtener un gel puede incluir neutralizar dicha mezcla de reacción, es decir, lograr un pH de aproximadamente entre 6,0 y 7,8, p. ej., aproximadamente 7, p. ej., añadiendo un ácido acuoso, o un tampón neutro o ácido, o permitiendo que la reacción proceda a una conversión esencialmente completa del agente de reticulación.
Preferiblemente, la formulación en gel comprende:
i) agua;
ii) ácido hialurónico reticulado, o una de sus sales, a una concentración entre 0,2 y 9 % en peso (p/p);
iii) hidroxiapatita, a una concentración entre 5 y 90 % en peso (p/p), como se describe en la presente memoria, dividida entre una primera parte y una segunda parte; y, opcionalmente,
iv) un fármaco, por ejemplo, un anestésico local, tal como lidocaína, hasta 1 % p/p.
La formulación puede también comprender agentes tamponadores y agentes de osmolaridad, p. ej., cloruro de sodio, sales fosfato y similares. Las sales fosfato pueden incluir sales monobásicas, dibásicas o tribásicas de ácido orto-fosfórico con sodio y/o potasio.
La concentración de ácido hialurónico en la formulación de gel puede variar de 0,2 a 9 % en peso, o de 1 a 6 % en peso, o de 1,5 a 5 % peso, o de 2,5 a 4,5 % en peso, o aproximadamente 4 % en peso. En algunas realizaciones, la concentración de ácido hialurónico está entre 0,5 y 8, o entre 0,8 y 7, o entre 0,5 y 1,5, o entre 0,5 y 1, o entre 3 y 6, o entre 1 y 5 % en peso. Preferiblemente, la concentración de ácido hialurónico está entre 0,5 y 4 % p/p.
Según una realización, las partículas de hidroxiapatita cálcica están presentes en la formulación a una concentración de entre 55 y 57 % en peso, p. ej., 55,7 % p/p.
Las partículas de hidroxiapatita pueden estar contenidas en la formulación en varias regiones, con un grado variable de asociación a la matriz de AH, p. ej., como hidroxiapatita fuertemente asociada, y como hidroxiapatita débilmente asociada, según el proceso de fabricación de las mismas. La hidroxiapatita fuertemente asociada puede obtenerse, p. ej., añadiendo una parte de hidroxiapatita a una solución que comprende ácido hialurónico reticulable, p. ej., ácido hialurónico libre, o un ácido hialurónico parcialmente reticulado, añadiendo un agente de reticulación, y exponiendo la mezcla a condiciones de reticulación. La hidroxiapatita débilmente asociada puede obtenerse, p. ej., introduciendo hidroxiapatita en un ácido hialurónico reticulado, y preferiblemente sometiendo la mezcla a homogeneización. Por lo tanto, la cantidad total de hidroxiapatita puede dividirse en una primera parte y una segunda parte.
La cantidad adecuada para la primera parte de hidroxiapatita (p. ej., “ hidroxiapatita fuertemente asociada” ) puede estar entre 1 y 20, preferiblemente entre 1 y 10 % en peso del peso total del producto terminado (después de sumar todos los ingredientes). La primera parte puede estar entre el 5 y el 90 por ciento en peso de la cantidad total de hidroxiapatita. En algunas realizaciones, la primera parte puede comprender entre 10 y 70 por ciento en peso, entre 20 y 60 por ciento en peso, entre 30 y 50 por ciento en peso.
La cantidad adecuada para la segunda parte de hidroxiapatita (p. ej., “ hidroxiapatita débilmente asociada” ) puede ser de 5 90 por ciento en peso de la cantidad total de hidroxiapatita. En algunas realizaciones, la segunda parte puede comprender entre 10 y 70 por ciento en peso, entre 20 y 60 por ciento en peso, entre 30 y 50 por ciento en peso.
En realizaciones ilustrativas, en donde la composición comprende el 30 % en peso de hidroxiapatita, la primera y segunda partes pueden tener una relación respectiva de 5:25, o 10:20, o 15:15, o 20:10. En realizaciones ilustrativas adicionales, en donde la composición comprende el 40 % en peso de hidroxiapatita, la primera y segunda partes pueden tener una relación respectiva de 5:35, o 10:30, o 15:25, o 20:20. En realizaciones ilustrativas adicionales, en donde la composición comprende el 55,7 % en peso de hidroxiapatita, la primera y segunda partes pueden tener una relación respectiva de 10:45,7, o 20:35,7. En realizaciones ilustrativas adicionales, en donde la composición comprende el 70% en peso de hidroxiapatita, la primera y segunda partes pueden tener una relación respectiva de 5:65, o 10:60, o 15:55, o 20:50.
El proceso de la invención puede llevarse a cabo mediante las siguientes etapas: a) preparación de una primera mezcla que comprende agua y al menos del 0,2 % al 9 % en peso de ácido hialurónico, o una sal del mismo, y un agente de reticulación; b) exponer la mezcla a condiciones de reticulación; c) añadir hidroxiapatita a una concentración de entre el 1 % en peso y el 20 % en peso, y exponer la mezcla a condiciones de reticulación, d) neutralizar la mezcla, e) añadir hidroxiapatita a una concentración de entre el 5 % en peso y el 70 % en peso, y dispersar homogéneamente en el gel de ácido hialurónico reticulado. Adicional o alternativamente, la primera parte de la hidroxiapatita puede añadirse a la mezcla de reacción en la etapa a). Además, la etapa de neutralización puede realizarse antes de la adición de una parte consecutiva de hidroxiapatita. Además, el método puede también comprender la adición de una parte adicional del mismo o de un diferente agente de reticulación, y posteriormente someter la mezcla a condiciones de reticulación. Por lo tanto, puede estar presente más de una etapa de neutralización, como se describe a continuación.
El pH y la osmolaridad de la formulación acuosa pueden ajustarse, además, a valores fisiológicos. La neutralización se puede llevar a cabo mediante la adición de soluciones acuosas que comprenden ácidos farmacéuticamente aceptables, agentes tamponadores, p. ej., sales fosfato, de entre 6 y 8 de pH, según el requerimiento del pH final.
De manera similar, el ajuste de osmolaridad se puede realizar añadiendo a la mezcla una solución de sales, p. ej., cloruro de sodio, fosfatos, como se describe en la presente memoria, y mezclando la formulación, para obtener un gel homogéneo.
En cualquier etapa del proceso de fabricación, la mezcla se puede probar para fines de garantía de calidad. Las pruebas estándar aplicables son conocidas por un experto técnicamente capacitado, e incluyen, p. ej., reometría, determinación de pH, cuantificación del agente de reticulación residual, microscopía, sedimentación por centrifugación, y otros.
La formulación lista puede molerse, p. ej., mediante extrusión, o en un mezclador de alto cizallamiento, para mejorar las propiedades de flujo antes del envasado. La molienda puede realizarse en presencia de componentes líquidos adicionales, p. ej., solución de ajuste de agua y/o neutralización y/u osmolaridad.
Los geles pueden ser fácilmente inyectables. En algunas realizaciones, los geles son inyectables a través de una aguja médica o cosmética regular, p. ej., una aguja de 25G/16 mm. El término “ inyectable” debe considerarse como que no se requiere una fuerza excesiva para inyectar el gel a través de una aguja a la velocidad de inyección común. La velocidad de inyección puede ser de 0,2 ml por minuto a 1,5 ml por minuto, preferiblemente entre 0,9 ml/min y 1,1 ml/min. La fuerza requerida para inyectar los geles puede variar según su composición respectiva, y la concentración de hidroxiapatita y ácido hialurónico, pero generalmente, cuando se extruye a través de la aguja 25G, la fuerza promedio requerida para forzar el gel de una jeringa estándar de 1 ml con 6,35 ± 0,1 mm de diámetro interior, es inferior a 40 Newton.
La formulación se puede llenar en jeringas y esterilizar, p. ej., en autoclave, o con irradiación gamma.
La formulación estéril puede usarse en una variedad de aplicaciones, p. ej., en el relleno de tejidos, tal como el relleno de arrugas o el relleno de injerto óseo.
La Figura 1 presenta un diagrama de flujo ilustrativo de un proceso según una realización de la presente invención. La preparación de la solución de ácido hialurónico, denominada “ Prep SOL AH” , se lleva a cabo disolviendo hialuronato de sodio (“ Na-HA” ) y butanodiol diglicidil éter (“ BDDE” ) en agua (“Agua” ), en un mezclador centrífugo (“ MCf” ), durante 15 30 minutos, a 300-2000 rpm. La preparación de la solución de reticulación (“ Prep SOL RETIC” ), se lleva a cabo mezclando hidróxido de sodio en agua (“Agua” ), en un mezclador centrífugo (“ MCf” ), durante 30-60 minutos, a 300 2000 rpm. La reticulación de ácido hialurónico (“ RETIC AH” ) se realiza combinando la solución de AH, la solución de reticulación y una primera parte de hidroxiapatita cálcica (“ CaHAp I” ), aproximadamente un 10% en peso, en un mezclador centrífugo (“ MCf” ), durante 15-30 minutos, a 300-2000 rpm. La solución de neutralización (“ Prep SOL Neutr” ) se prepara mezclando agua (“Agua” ), dihidrogenofosfato de potasio (“ KH2PO4” ), hidrogenofosfato disódico (“ Na2HPO4” ), y ácido clorhídrico (“ HCl” ), en un agitador superior (“Agit sup” ), durante 1-10 minutos. La mezcla de hidroxiapatita con ácido hialurónico reticulado (“AH RETIC CaHAp I” ) se mezcla con una solución neutralizante en un mezclador centrífugo (“ MCf” ), durante 10-120 minutos, a 300-2000 rpm, para proporcionar gel neutralizado (“ GEL Neut” ). Se añade hidroxiapatita adicional (“ CaHAp II” ) al gel, y se mezcla (“ MEZCLAR GEL” ), en un mezclador centrífugo (“ MCf” ) y/o en un mezclador planetario (“Thinky” ), durante 1-30 minutos, a 300-2000 rpm. El gel se desgasifica (“ DESG g E L ” ) a aproximadamente 20 mBar (presión absoluta), durante 30 minutos, a continuación, se muele (“ MOL” ), se envasa (“ ENVAS” ) en jeringas (“JERINGA” ) y, a continuación, se esteriliza (“ ESTERILIZ” ) mediante autoclave (“AUTOCL” ).
Ejemplos
Ejemplo 1-
Preparación del gel n.° 1- gel con hidroxiapatita fuertemente y débilmente asociada
Etapa 1: Preparación de un gel reticulado a base de ácido hialurónico e hidroxiapatita cálcica.
Se añadió hialuronato de sodio (AH) de peso molecular 1,3-2,0 MDa (calidad farmacéutica), 2,31 g, a 19,19 g de agua, se mezcló hasta disolución a temperatura ambiente, a 300 rpm, usando un mezclador centrífugo, fabricado por Collox, seguido de 0,23 g de 1,4-butanodiol diglicidil éter (BDDE) (suministrado por TCI), y la mezcla se mezcló adicionalmente durante 30 min a 300 rpm. Después de eso, se añadieron 3,98 g de solución de hidróxido de sodio (NaOH) 1M a la mezcla, lo que hace un peso total de 25,71 g, a un pH > 12. A continuación, la mezcla se homogeneizó durante 60 min a 300 rpm usando el mezclador centrífugo. A continuación, se añadieron a la mezcla 24,00 g de microesferas densas de hidroxiapatita cálcica Ca-i0(PO4)6(OH)2 (calidad médica), con un tamaño de partículas promedio de 25-45 micrómetros, , hasta un peso total de 49,71 g y, a continuación, se mezcló de nuevo durante 30 min a 300 rpm. A continuación, la mezcla se colocó en un horno ajustado a 45 °C, durante 3 horas y, a continuación, se colocó a 25 °C durante 15 horas adicionales.
Etapa 2: Preparación del volumen final.
La mezcla se neutralizó añadiendo 80,61 g de solución de neutralización a un pH 7. La composición de la solución de neutralización fue de 0,56 g de dihidrogenofosfato de potasio (KH2PO4) (calidad farmacéutica, suministrado por Merck), 0,56 g de hidrogenofosfato disódico (Na2HPO4) (calidad farmacéutica, suministrado por Merck), 76,66 g de agua para inyección, y 2,83 g de solución de ácido clorhídrico (HCl) 1M (calidad farmacéutica, suministrado por Merck). La mezcla se mezcló durante 1 hora a 300 rpm usando el mezclador centrífugo, hasta que se formó un gel homogéneo. Una segunda parte de hidroxiapatita cálcica, 109,68 g, se añadió a los 130,32 g de gel formado después de la neutralización, y la mezcla se homogeneizó adicionalmente durante 30 min a 300 rpm. El gel finalmente se desgasificó al vacío, sometiéndolo a 20 mbar de vacío durante 30 minutos, se llenó en jeringas de vidrio de 1,25 ml, y se esterilizó en una autoclave de vapor a 121 °C durante 20 minutos. Se formó un gel cohesivo y viscoelástico.
La concentración de ácido hialurónico en el gel (que no incluye las microesferas de hidroxiapatita cálcica incrustadas) fue de 20 mg/g (2 % p/p), su pH fue ~7,0, y su osmolalidad fue ~300 mOsm/kg. El gel tenía una concentración final del 55,7 % de hidroxiapatita cálcica, del 10% como hidroxiapatita fuertemente asociada y del 45,7% como hidroxiapatita débilmente asociada.
Prueba 1- Determinación de la inyectabilidad
La fuerza de extrusión (FE) se midió determinando la fuerza máxima requerida para inyectar el gel, pensando en una aguja de 25G/16 mm con un diámetro interno de 0,31 mm (fabricada por P i C , n.° de cat. 03.070250.300.800). Brevemente, el gel se insertó en jeringas BD de 1 ml, con un diámetro interior de 6,35 mm (±0,1), y se extrudió a través de la aguja a una velocidad de 1 ml/min. La fuerza se midió mediante un dispositivo de medición de fuerza de extrusión (preparado internamente), que usó un calibre de fuerza YISIDA DS-2, y el software de calibre de fuerza (ShangheDS2_Eng). La fuerza promedio de extrusión medida fue de 34 Newton.
Ejemplo 2- Comparativo, preparación del gel n.° 2, solo con hidroxiapatita débilmente asociada
Etapa 1: Preparación de un gel reticulado.
Se añadió 2,31 g de hialuronato de sodio (AH) de 1,3-2,0 MDa de peso molecular, a 19,19 g de agua, se mezcló hasta disolución a temperatura ambiente, a 300 rpm, usando un mezclador centrífugo, fabricado por Collox, seguido de 0,23 g de 1,4-butanodiol diglicidil éter (BDDE) (suministrado por TCI), y la mezcla se mezcló adicionalmente durante 30 min a 300 rpm. Después de eso, se añadieron 3,98 g de solución de hidróxido de sodio (NaOH) 1M a la mezcla, lo que hace un peso total de 25,71 g, a un pH > 12. A continuación, la mezcla se homogeneizó durante 90 min a 300 rpm usando el mezclador centrífugo. A continuación, la mezcla se colocó en un horno ajustado a 45 °C, durante 3 horas y, a continuación, se colocó a 25 °C durante 15 horas adicionales.
Etapa 2: Preparación del volumen final.
La mezcla se neutralizó añadiendo 80,61 g de solución de neutralización a un pH 7. La composición de la solución de neutralización fue de 0,56 g de dihidrogenofosfato de potasio (KH2 PO4) (calidad farmacéutica, suministrado por Merck), 0,56 g de hidrogenofosfato disódico (Na2HPO4) (calidad farmacéutica, suministrado por Merck), 76,66 g de agua para inyección, y 2,83 g de solución de ácido clorhídrico (HCl) 1M (calidad farmacéutica, suministrado por Merck). La mezcla se mezcló durante 60 min a 300 rpm, hasta que se formó un gel homogéneo. A continuación, se añadieron 133,68 g de microesferas densas de hidroxiapatita cálcica Ca-i0(PO4)6(OH)2 (calidad médica), con un tamaño de partículas promedio de 25-45 micrómetros, a 106,32 g de gel formado después de la neutralización, y la mezcla se homogeneizó adicionalmente durante 60 min a 300. El gel finalmente se desgasificó al vacío, sometiéndolo a 20 mbar de vacío durante 30 minutos, se llenó en jeringas de vidrio de 1,25 ml, y se esterilizó en una autoclave de vapor a 121 °C durante 20 minutos. Se formó un gel cohesivo y viscoelástico.
El gel tenía una concentración final del 55,7 % de hidroxiapatita cálcica, como hidroxiapatita débilmente asociada.
Ejemplo 3- Ensayo de la liberación de los geles
Se colocaron alícuotas de aproximadamente 1 g de los geles 1 y 2 del Ejemplo 1 y de la Preparación 1, respectivamente, en insertos de malla metálica (bolsillos) con un área total de 81 cm2, con alambres de aproximadamente 40 um y poros de aproximadamente 50 um. Los insertos se colocaron en tubos de centrífuga estándar de 50 ml, y se añadieron 30 ml de agua a cada tubo, de modo que aproximadamente 28,5 cm2 de la cavidad metálica estaba sumergida en agua. Las muestras se dejaron en intervalos de tiempo predeterminados, como se detalla en la Tabla 1 a continuación, cada muestra para un intervalo especificado. Durante el experimento, los geles absorben agua y liberan gradualmente las partículas de hidroxiapatita cálcica al agua. Una representación esquemática del sistema se muestra en la Figura 3.
El contenido de partículas de hidroxiapatita cálcica liberadas al agua en cada tubo, se probó y cuantificó gravimétricamente. Brevemente, se retiró la bolsa metálica y se centrifugó el tubo. A continuación, la mayor parte del agua se eliminó por decantación. El sedimento de partículas de hidroxiapatita cálcica se lavó con aproximadamente 7 ml de etanol, y se secó a 70 °C durante la noche. Los resultados se resumen en la Tabla 1.
Tabla 1
Puede verse fácilmente que se liberaron menos partículas de hidroxiapatita cálcica del gel n.° 1 en comparación con el gel n.° 2, en cada punto temporal, es decir, la cinética de liberación del gel n.° 1 es más lenta que la del gel n.° 2. Esto se debe a que la hidroxiapatita cálcica está fuertemente asociada con el gel reticulado en el gel n.° 1, a diferencia de las partículas del gel n.° 2, que solo estaban débilmente asociadas con el gel.
Ejemplo 4- Resistencia de la asociación de hidroxiapatita
Los geles se probaron colocando alícuotas, pesadas con precisión, de aproximadamente 1,25 g, en tubos Eppendorf de 2 ml, y se centrifugaron a una fuerza de 2040 g, usando una centrífuga Eppendorf 5415C (dimensiones: [Ancho x Alto x Profundidad] 21,0 cm x 28,0 cm x 28,5 cm) a 5000 rpm, durante 5 minutos, o con una fuerza de 735 g, a 3000 rpm durante 10 minutos.
Después de la centrifugación, se observaron dos fases, la fase inferior contenía las partículas de hidroxiapatita cálcica que se separaron del gel, y la fase superior contenía el resto de gel restante, con partículas que todavía estaban unidas al gel. Las dos fases se separaron. El gel en la fase superior se digirió usando hialuronidasa, se sedimentaron por centrifugación las partículas de hidroxiapatita cálcica, se lavaron con agua, y se secaron y cuantificaron como se describe en el Ejemplo 3. Las partículas de hidroxiapatita cálcica en la fase inferior, también se secaron y cuantificaron como en el Ejemplo 3.
Como el gel se había pesado antes de la centrifugación, se pudo calcular el porcentaje de CaHAp en cada fase. El porcentaje de hidroxiapatita cálcica se calculó mediante el uso de la fórmula: (peso seco de CaHAp en cada fase) / (cantidad total de gel) x 100 %.
Los resultados, para una centrifugación a 735 g, se presentan en la Tabla 2 a continuación. Las desviaciones menores de la carga teórica del 55,7 % de hidroxiapatita cálcica, podrían atribuirse a errores de pesaje.
Tabla 2
Ejemplo 5- Comparación entre un gel de la técnica anterior (solo hidroxiapatita débilmente asociada) y un gel con hidroxiapatita fuertemente y débilmente asociada
Se prepararon dos geles adicionales y se compararon sus características. El primer gel (gel n.° 3) se preparó como se describe en la solicitud de patente de EE. UU. publicada como US-20150257989, en la cual la CaHAp está débilmente asociada con el gel reticulado. El segundo gel (gel n.° 4) se preparó según el mismo procedimiento; sin embargo, se añadió hidroxiapatita cálcica en dos etapas discretas, como se describe en la presente solicitud, para crear una CaHAp fuertemente y débilmente asociada en el gel final. La concentración final de hidroxiapatita cálcica en ambos geles fue del 30 por ciento en peso.
Brevemente, el gel n.° 3 se preparó de la siguiente manera:
Etapa 1: Se añadieron 3,75 g de hialuronato de sodio, con un peso molecular de 1,3-2,0 MDa, a 30,5 g de NaOH al 1,0 % (0,25 M). La mezcla se dejó homogeneizar durante 90 min. A continuación, se añadieron 420 mg de 1,4-butanodiol diglicidil éter (BDDE) a la mezcla, que se homogeneizó durante 5 minutos, se cerró y se colocó en un horno a 50 °C durante 2 horas. El procedimiento se adaptó a continuación, manteniendo la mezcla durante 15 h adicionales a 25 °C, para obtener un gel procesable. Después, la mezcla se neutralizó añadiendo 7,5 g de HCl 1N. El gel se purificó durante 24 h mediante diálisis con un tampón de fosfato (KH2PO4:Na2HPO4, relación 1:1), para obtener la concentración final de ácido hialurónico de 25 mg/ml (2,5 %) y, a continuación, se homogeneizó durante 90 min. El peso del Gel después de la diálisis fue de 139,29 g.
Etapa 2: Se tomaron 100 g del gel preparado, y se mezclaron con 42,9 g de CaHAp (tamaño de partículas: 25-45 um) durante 90 min hasta la homogeneización. El gel homogeneizado se desgasificó, se llenó en jeringas de 1,25 ml, y se esterilizó en una autoclave de vapor a 130 °C durante 3 min.
El Gel n.° 4 se preparó según el siguiente procedimiento:
Etapa 1: Se añadieron 3,75 g de hialuronato de sodio, con un peso molecular de 1,3-2,0 MDa, a 30,5 g de NaOH al 1,0% (0,25 M). La mezcla se dejó homogeneizar durante 90 min. Después, se añadieron 420 mg de 1,4-butanodiol diglicidil éter (BDDE), y se mezclaron durante 5 min. Después de añadir la primera parte de hidroxiapatita cálcica, se añadieron 19,90 g (tamaño de partículas: 25-45 um) a la mezcla, y se homogeneizó durante 30 min, se cerró y se colocó en un horno a 50 °C durante 2 horas, seguido de 15 h adicionales a 25 °C. A continuación, la mezcla se neutralizó añadiendo 7,5 g de HCl 1N. El gel se purificó durante 24 h mediante diálisis con un tampón de fosfato (KH2 PO4 :Na2 HPO4 , relación 1:1), para obtener una concentración final de ácido hialurónico de 25 mg/ml (2,5 %) y, a continuación, se homogeneizó durante 90 min. El peso del gel después de la diálisis fue de 159,19 g.
Etapa 2: Se tomaron 114,29 g del gel preparado, y se mezclaron con una segunda parte de hidroxiapatita cálcica, 28,58 g (tamaño de partículas: 25-45 um) durante 90 min hasta la homogeneización. El gel homogeneizado se desgasificó, se llenó en jeringas de 1,25 ml, y se esterilizó en una autoclave de vapor a 130 °C durante 3 min.
Prueba 1: Resistencia de asociación
La prueba se realizó según el Ejemplo 3, a 2040 g de fuerza, usando una centrífuga Eppendorf 5415C durante 5 min a 5000 rpm. La separación completa entre el gel y el calcio, se observó en el gel n.° 3, mientras que solo se
observó una ligera diferencia en el gel n.° 4. Los resultados se proporcionan en la Tabla 3, más abajo. Las desviaciones menores de la carga teórica de hidroxiapatita cálcica 300 podrían atribuirse a errores de pesaje.
Tabla 3
Puede verse fácilmente que en el gel n.° 3 según la técnica anterior, que contenía hidroxiapatita cálcica solo como componente débilmente asociado, prácticamente toda la CaHAp (>99 %) se separó del gel. Sin embargo, en el gel n.° 4, al menos un tercio se retuvo en el gel. Sin estar limitado por una teoría, se cree que las partículas de CaHAp en el gel n.° 4 se unen más fuertemente al gel y, por lo tanto, tienen menos tendencia a separarse del mismo, en una cantidad incluso superior al 10 % que se añadió durante la etapa de reticulación.
Prueba 2: Liberación de hidroxiapatita cálcica a partir de los geles
La prueba se realizó generalmente según el Ejemplo 3, usándose aproximadamente ~1,5 g de gel.
Los resultados se presentan en la Tabla 4, más abajo. Se puede observar fácilmente que, incluso después de 6 y 14 días, se liberaba más CaHAp del gel n.° 3 que del gel n.° 4.
Sin pretender imponer ninguna teoría, se cree que debido a la mayor asociación que se produce entre las partículas y el gel reticulado en el gel n.° 4, la cinética de liberación de las partículas es más lenta. Por el contrario, el gel n.° 3 contenía solo las partículas que estaban asociadas más débilmente con el gel, lo que afectó a la velocidad de liberación de estas a partir del mismo.
Tabla 4
Ejemplo 6- Dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS)
Además, algunos de los geles se probaron mediante dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS).
Se obtuvieron patrones de dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS) de geles poliméricos, con una Saxplane Gesesha 300-XL. La radiación CuKa se generó mediante una fuente de Cu Genix 3D con una colimación integrada de monocromador, 3 orificios, y un detector Pilatus 300K bidimensional. La intensidad de dispersión I(q) se registró a intervalos de 0,012 < q < 0,6 A-1. Las mediciones se realizaron al vacío a temperatura ambiente.
Las probetas de gel se colocaron en celdas de muestra de acero inoxidable, con ventanas de entrada y salida hechas de mica. El análisis de datos se basó en el ajuste de la curva de dispersión mediante el software proporcionado por NIST (análisis NIST SANS, versión 6.32, en IGOR). Las curvas de dispersión se corrigieron para contar el tiempo de conteo y la absorción de la muestra. Las curvas de dispersión se presentan en la Figura 2.
Se examinaron tres geles, como se ha descrito anteriormente: geles n.° 1, 3 y 4. Los resultados de la SAXS indican que la matriz de AH en el gel en donde las partículas de hidroxiapatita cálcica están unidas más débilmente, es más voluminoso que el gel que comprende también algunas partículas de CaHAp fuertemente asociadas.
Ejemplo 7- Geles de baja concentración
Se prepararon geles adicionales que comprenden baja concentración de CaHAp fuertemente asociada y bajas concentraciones de AH. Además, se examinó el efecto de diferentes Pm de AH.
Los geles n.° 5 y 6 se prepararon según el procedimiento del Ejemplo 1.
Los geles se resumen en la Tabla 5 a continuación, donde se presenta la FE promedio para cada gel. Puede verse fácilmente que los geles probados se comportaron de manera relativamente similar en términos de valores de FE.
Tabla 5
Ejemplo 8- Gel doble reticulado con hidroxiapatita fuertemente asociada e hidroxiapatita débilmente asociada
Etapa 1: Preparación de un gel reticulado a base de ácido hialurónico.
Se añadieron 2,31 g de hialuronato de sodio (AH), de peso molecular 1,3-2,0 MDa (calidad farmacéutica), a 19,19 g de agua, se mezcló hasta disolución a temperatura ambiente, a 300 rpm, usando un mezclador centrífugo, fabricado por Collox, seguido de 0,12 g de 1,4-butanodiol diglicidil éter (BDDE) (suministrado por TCI), y la mezcla se mezcló adicionalmente durante 30 min a 300 rpm. Después de eso, se añadieron 3,98 g de una solución de hidróxido de sodio (NaOH) 1M a la mezcla, lo que hace un peso total de 25,60 g, a un pH > 12. A continuación, la mezcla se colocó en un horno ajustado a 45 °C, durante 3 horas, y después se colocó a 25 °C durante 15 horas adicionales.
Etapa 2: Preparación de gel doble reticulado con hidroxiapatita cálcica.
Se añadió una solución de ácido clorhídrico (HCl) 1M, aproximadamente 2,5-4 ml, llevando la mezcla a un pH ~4, seguido de una mezcla durante 15 min. Se añadió hidróxido de sodio (NaOH) 1M, aproximadamente 3-5 ml, llevando la mezcla a un pH 12, seguido de una mezcla durante 15 min a 300 rpm. Después de eso, se añadieron 0,11 g de 1,4-butanodiol diglicidil éter (BDDE) y 24,00 g de microesferas densas de hidroxiapatita cálcica Ca1ü(PO4)6(OH)2, con un tamaño de partículas promedio de 25-45 micrómetros (calidad médica), a la mezcla, y se mezclaron durante 15 min a 300 rpm.
A continuación, la mezcla se colocó en un horno ajustado a 45 °C, durante 3 horas y, a continuación, se colocó a 25 °C durante 15 horas adicionales.
Etapa 3: Preparación del volumen final.
La mezcla se neutralizó añadiendo 80,61 g de solución de neutralización a un pH 7. La composición de la solución de neutralización fue de 0,25 g de dihidrogenofosfato de potasio (KH2PO4) (calidad farmacéutica, suministrado por Merck), 0,87 g de hidrogenofosfato disódico (Na2HPO4) (calidad farmacéutica, suministrado por Merck), 76,43 g de agua para inyección, y 2,83 g de solución de ácido clorhídrico (HCl) 1M (calidad farmacéutica, suministrado por Merck). La mezcla se mezcló durante 1 hora a 300 rpm usando el mezclador centrífugo, hasta que se formó un gel homogéneo. Se añadió una segunda parte de hidroxiapatita cálcica, 109,68 g, a los 130,32 g de gel formado después de la neutralización, y la mezcla se homogeneizó adicionalmente durante 30 min a 300 rpm usando el mezclador centrífugo. El gel finalmente se desgasificó al vacío, sometiéndolo a 20 mbar de vacío durante 30 minutos, se llenó en jeringas de vidrio de 1,25 ml, y se esterilizó en una autoclave de vapor a 121 °C durante 20 minutos. Se formó un gel cohesivo y viscoelástico.
La concentración de ácido hialurónico en el gel (que no incluye las microesferas de hidroxiapatita cálcica incrustadas) es de 20 mg/g (2 % p/p), su pH es ~7,0, y su osmolalidad es de 300 mOsm/kg. El gel a granel se inyectó fácilmente a través de una aguja; se requirió una fuerza de 20 a 40 N para inyectar el gel a través de una aguja de pared regular de 25G/16 mm (fabricada por PIC), a una velocidad de 1 ml/min.
Ejemplo 9- Gel doble reticulado con hidroxiapatita fuertemente asociada e hidroxiapatita débilmente asociada, proceso alternativo
Etapa 1: Preparación de un gel reticulado a base de ácido hialurónico con hidroxiapatita cálcica.
Se añadieron 2,31 g de hialuronato de sodio (AH), de peso molecular 1,3-2,0 MDa (calidad farmacéutica), a 19,19 g de agua, se mezcló hasta disolución a temperatura ambiente, a 300 rpm, usando un mezclador centrífugo, fabricado por Collox, seguido de 0,12 g de 1,4-butanodiol diglicidil éter (BDDE) (suministrado por TCI). Después de eso, se añadieron 3,98 g de una solución de hidróxido de sodio (NaOH) 1M a la mezcla, lo que hace un peso total de 25,60 g, a un pH > 12. La mezcla se mezcló durante 15 minutos a 300 rpm usando el mezclador centrífugo. A continuación, la mezcla se colocó en un horno ajustado a 45 °C, durante 3 horas, y después se colocó a 25 °C durante 15 horas adicionales.
A continuación, se añadieron 0,11 g de 1,4-butanodiol diglicidil éter (BDDE) y 24,00 g de microesferas densas de hidroxiapatita cálcica Ca-10(PO4)6(OH)2 , con un tamaño de partículas promedio de 25-45 micrómetros (calidad médica), y se mezclaron durante 15 min a 300 rpm usando un mezclador centrífugo, fabricado por Collox.
A continuación, la mezcla se colocó en un horno ajustado a 45 °C, durante 3 horas, y a continuación se colocó a 25 °C durante 15 horas adicionales.
Etapa 2: Preparación del volumen final.
La mezcla se neutralizó añadiendo 80,61 g de solución de neutralización a un pH 7. La composición de la solución de neutralización fue de 0,25 g de dihidrogenofosfato de potasio (KH2PO4) (calidad farmacéutica, suministrado por Merck), 0,87 g de hidrogenofosfato disódico (Na2HPO4) (calidad farmacéutica, suministrado por Merck), 76,66 g de agua para inyección, y 2,83 g de solución de ácido clorhídrico (HCl) 1M (calidad farmacéutica, suministrado por Merck). La mezcla se mezcló durante 1 hora a 300 rpm usando el mezclador centrífugo, hasta que se formó un gel homogéneo. Se añadió una segunda parte de hidroxiapatita cálcica, 109,68 g, a los 130,32 g de gel formado después de la neutralización, y la mezcla se homogeneizó adicionalmente durante 30 min a 300 rpm. El gel finalmente se desgasificó al vacío, sometiéndolo a 20 mbar de vacío durante 30 minutos, se llenó en jeringas de vidrio de 1,25 ml, y se esterilizó en una autoclave de vapor a 121 °C durante 20 minutos. Se formó un gel cohesivo y viscoelástico.
La concentración de ácido hialurónico en el gel (que no incluye las microesferas de hidroxiapatita cálcica incrustadas) es de 20 mg/g (2 % p/p), su pH es ~7,0, y su osmolalidad es de 300 mOsm/kg. El gel a granel se inyectó fácilmente a través de una aguja; se requirió una fuerza de 20 a 40 N para inyectar el gel a través de una aguja de pared regular de 25G/16 mm (fabricada por PIC), a una velocidad de 1 ml/min.
Claims (13)
1. Un proceso de fabricación de un producto de gel que comprende ácido hialurónico reticulado e hidroxiapatita, comprendiendo dicho proceso:
combinar en un medio acuoso ácido hialurónico, o una sal del mismo, un agente de reticulación, y realizar una reacción de reticulación en presencia de una primera parte de hidroxiapatita; completar la reacción de reticulación; e
incorporar una segunda parte de hidroxiapatita en el gel así formado, en donde dicha incorporación comprende dispersar homogéneamente dicha segunda parte de hidroxiapatita en dicho gel de ácido hialurónico así formado.
2. El proceso según la reivindicación 1, en donde dicha realización de la reacción de reticulación comprende aumentar el pH del medio, y dicha finalización de la reacción de reticulación comprende dejar en reposo la mezcla de reacción y/o neutralizar dicha mezcla de reacción.
3. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha primera parte de hidroxiapatita es de entre el 5 y el 90 por ciento en peso de la cantidad total de hidroxiapatita.
4. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha primera parte de hidroxiapatita es de entre el 5 y el 30 por ciento en peso de la cantidad total de hidroxiapatita.
5. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el agente de reticulación es 1,4-butanodiol diglicidil éter.
6. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde una concentración de dicho ácido hialurónico en dicho medio acuoso, es de entre 0,2 y 9 por ciento en peso.
7. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde una relación de peso entre dicho ácido hialurónico y dicho agente de reticulación en dicho medio acuoso, es de entre 15:1 y 2:1.
8. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende, además, introducir una cantidad adicional de ácido hialurónico en el gel, después de terminar la reacción de reticulación.
9. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde una concentración de hidroxiapatita en dicho gel es superior al 25 por ciento en peso.
10. El proceso de la reivindicación 10, en donde una concentración de hidroxiapatita en dicho gel es de entre el 50 y el 60 por ciento en peso.
11. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha hidroxiapatita cálcica tiene un tamaño de partículas promedio de entre 25 y 45 micrómetros.
12. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende, además, al menos uno de desgasificar el gel y/o esterilizar el gel.
13. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende cargar un recipiente de reacción con agua y ácido hialurónico, o una sal del mismo, agitar para obtener una solución, añadir 1,4-butanodiol diglicidil éter, hidróxido de sodio, y una primera parte de hidroxiapatita cálcica, mantener a temperatura elevada durante un primer período, y a temperatura ambiente durante un segundo período, añadir solución tampón de fosfato y un ácido acuoso, para lograr un gel con un pH casi neutro, e incorporar una segunda parte de hidroxiapatita cálcica en el gel, en donde la relación de peso entre la primera parte de hidroxiapatita cálcica y la segunda parte de hidroxiapatita cálcica está entre 1:3 y 1:7, y la concentración total de hidroxiapatita cálcica es de entre el 50 y el 60 por ciento en peso.
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