CN109906073A - 包含交联透明质酸和羟基磷灰石的可注射凝胶及其制造方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了在不同程度上与羟基磷灰石缔合的交联透明质酸的可注射凝胶的组合物和制造方法。

Description

包含交联透明质酸和羟基磷灰石的可注射凝胶及其制造方法
技术领域
本发明涉及包含交联透明质酸和羟基磷灰石的复合材料、制造此类复合材料的方法及其在制备化妆品组合物、医疗组合物和药物组合物中的用途。
背景技术
透明质酸是化妆品制剂的常见组分，并且用于若干种美容手术，特别是用于填充皱纹。由于快速酶促降解和水解，天然透明质酸具有差的体内稳定性，并且因此已经制备了透明质酸的各种化学修饰形式(例如交联形式、离子改性形式、酯化形式等)以解决稳定性差的问题。
羟基磷灰石的化学组成与骨的矿物相的化学组成非常相似。其生物学特性和生物相容性使其成为优秀的骨替代产品。通过替代品的骨长入通常高度依赖于材料的多孔特征，并且特别高度依赖于孔径和分布、以及大孔之间的相互连接(数量和尺寸)。相互连接是隧道，其允许细胞通过和血液在孔之间循环，从而促进替代品内的骨形成。羟基磷灰石钙(CaHAp)是磷酸盐家族的矿物种类，具有式Ca5(PO4)3(OH)，通常写为Ca10(PO4)6(OH)2，以强调晶体结构的晶格包含两个分子的事实。羟基磷灰石属于结晶磷灰石家族，它们是具有相同六方结构的同构化合物。此化合物已在各种医学专业中多年用作生物材料。
目前，透明质酸或其交联形式以各种凝胶形式使用，例如作为软组织增强产品、粘附屏障等使用。
例如，PCT专利申请WO 2013/053457披露了在羟基磷灰石的存在下交联的两种不同分子量透明质酸聚合物的组合物。PCT专利申请WO 2016/074794传授了呈凝胶形式的皮肤填充剂组合物，该组合物包含透明质酸(HA)、羧甲基纤维素(CMC)和任选地微粒诸如羟基磷灰石钙(CaHAP)。PCT专利申请WO 2016/025945传授了一种复合材料，其包括基于透明质酸的凝胶和设置在该凝胶内的纳米结构。美国专利申请公开US 2013096081提供了在碳二亚胺偶联剂的存在下用二胺或多胺交联剂制成的高度可注射的持久的基于透明质酸的水凝胶皮肤填充剂组合物。韩国专利申请KR 20110137907传授了一种皮肤填充剂组合物，该组合物通过将阴离子聚合物吸附或共价键合在陶瓷珠的表面上形成，该陶瓷珠如羟基磷灰石珠、生物玻璃珠、碳酸钙珠、二氧化钛珠、硫酸钡珠、氧化铝珠、和氧化锆珠。美国专利申请公开US 2010136070披露了透明质酸、透明质酸衍生物或其混合物，藻酸、透明质酸衍生物或其混合物，和钙离子的交联组合物。另外，美国专利申请公开US 20150257989和US2015238525描述了填充有羟基磷灰石颗粒的粘性交联透明质酸凝胶。美国专利申请公开US2011038938传授了一种自固化可注射组合物，其包含：能够在与合适的固化液接触时进行粘固反应的粘固剂颗粒；和至少一种可交联聚合物凝胶，其中所述聚合物凝胶能够在多价离子的存在下进行离子交联。
本领域中需要提供具有改进的所需特性的透明质酸复合材料，该改进的所需特性例如是受控的抗降解性(酶促或非酶促的)和/或空间溶胀行为、和/或改进的流变特性、和/或机械稳定性、和/或减少的副作用、和/或生物相容性、和/或受控的渗透压。
发明内容
提供了复合材料，其制造方法，以及透明质酸和羟基磷灰石的化妆品组合物、医疗组合物或药物组合物，如下面进一步详细描述的。在一个方面，透明质酸以多个步骤交联。在另一方面，羟基磷灰石以多个步骤添加。任选地，既以多个步骤交联透明质酸，也以多个步骤添加羟基磷灰石。
诸位发明人意外地发现，透明质酸的交联和羟基磷灰石的添加可以多个步骤例如以至少两个步骤进行。根据用于生产本发明复合材料的方法，羟基磷灰石以多个阶段例如以至少两个阶段添加到透明质酸中，这些阶段被透明质酸的交联分隔或与其伴随，即，以逐步的方式。所得复合材料包含在交联凝胶中分散的(例如，精细分散的)羟基磷灰石颗粒，这些羟基磷灰石颗粒被分割在如下定义的交联透明质酸(HA)基质的不同功能区之间并且具有不同的与HA基质缔合程度，例如像紧密缔合羟基磷灰石和松散缔合羟基磷灰石，从而提供了具有改进特性的复合材料。不受理论束缚，据信作为根据本发明的多步骤方法的结果，在透明质酸交联的不同阶段期间添加的羟基磷灰石颗粒具有不同的与透明质酸基质缔合程度，从而允许羟基磷灰石颗粒从基质中逐渐释放。
该复合材料可以掺入到化妆品制剂、医疗(包括手术)制剂或药物制剂中。该制剂通常呈粘弹性凝胶的形式。该制剂可包含透明质酸，其浓度为约0.2％至9％w/w，包括端值。该制剂还可包含羟基磷灰石钙，其浓度为在约5％至90％wt之间。该制剂还可包含另外的材料，例如药物，非限制性例子是局部麻醉剂(例如，利多卡因)或激素、生长因子、类固醇。
在本发明的第一方面，本文提供了一种制造包含交联透明质酸和羟基磷灰石的凝胶产品的方法，所述方法包括：将透明质酸或其盐、交联剂在水性介质中合并，并且在第一部分羟基磷灰石的存在下进行交联反应；完成该交联反应；并且将第二部分羟基磷灰石掺入到如此形成的凝胶中。
该交联可通过增加该介质的pH来进行。该反应的完成可通过以下方式实现：允许反应混合物静置，和/或将所述反应混合物中和，例如，将pH调节至约6.0与7.8之间，例如，约7。
羟基磷灰石在该凝胶中的浓度可高于25重量％、优选高于45重量％、并且进一步优选在50重量％与60重量％之间。
划分羟基磷灰石的总量使得存在于交联反应混合物中的第一部分羟基磷灰石在羟基磷灰石总量的5重量％与90重量％之间。也就是，该第一部分与该第二部分之间的重量比在1:9与9:1之间。优选地，该第一部分羟基磷灰石在羟基磷灰石总量的5重量％与30重量％之间。也就是，该第一部分与该第二部分之间的重量比优选在约1:7与1:3之间，即，在一些实施方案中，主要部分在第二部分中添加。
在该方法中使用的羟基磷灰石钙的平均粒度可以在25微米与45微米之间。
该交联剂可选自1,4-丁二醇二缩水甘油醚、聚(乙二醇)二缩水甘油醚和乙二醇二缩水甘油醚；优选1,4-丁二醇二缩水甘油醚。
所述透明质酸在所述水性介质中的浓度可以在0.2重量％与9重量％之间、优选在0.5-4重量％之间。
该水性介质中透明质酸与交联剂之间的重量比可以在15:1与2:1之间。
该方法可以进一步包括在完成该交联反应后将另外量的透明质酸(即，游离的非交联透明质酸)引入到该凝胶中。
可将所得凝胶脱气(例如，在真空中)，填充到合适的注射装置中，并且灭菌以适合于注射给对其有需要的受试者。
在特定实施方案中，本发明的方法包括：向反应容器中装入水和透明质酸或其盐，搅拌以获得溶液，添加1,4-丁二醇二缩水甘油醚、氢氧化钠和第一部分羟基磷灰石钙，在高温下保持第一时间段并且在环境温度下保持第二时间段，添加磷酸盐缓冲溶液和水性酸以得到具有接近中性pH的凝胶，并且将第二部分羟基磷灰石钙掺入到该凝胶中，其中，该第一部分羟基磷灰石钙与该第二部分羟基磷灰石钙之间的重量比在1:3与1:7之间，并且羟基磷灰石钙的总浓度在50重量％与60重量％之间。
在本发明的另一个方面，本文提供了一种包含交联透明质酸和羟基磷灰石的可注射凝胶组合物，其中，所述羟基磷灰石的浓度高于该凝胶的总重量的45重量％、优选在该凝胶的总重量的50重量％与60重量％之间。
在本发明的其他方面，本文提供了一种包含交联透明质酸和羟基磷灰石的可注射凝胶组合物，其中，所述羟基磷灰石的浓度高于该凝胶的总重量的20％，例如，高于25重量％、更优选高于45重量％、并且再更优选在50重量％与60重量％之间，并且其中，所述羟基磷灰石的一部分在735g力下离心10分钟后与所述凝胶不可分离，所述部分是羟基磷灰石总量的至少约五分之一，例如，羟基磷灰石总量的约五分之一与三分之一之间，即，18重量％与35重量％之间与所述凝胶不可分离。
在该可注射凝胶中，羟基磷灰石颗粒的平均粒度可以在25微米与45微米之间。
所述交联透明质酸在该可注射凝胶组合物中的浓度可以在0.2重量％与9重量％之间。
将该可注射凝胶中的交联透明质酸交联的结构单元对应于在该方法中使用的交联剂，例如，1,4-丁二醇二缩水甘油醚、聚(乙二醇)二缩水甘油醚或乙二醇二缩水甘油醚。因此，该结构单元对应于该交联剂的转化形式。
该凝胶还可包含非交联透明质酸。
附图说明
图1呈现了根据本发明的实施方案的用于制备可注射凝胶的方法的流程图。
图2呈现了各种凝胶的小角度X射线散射图，这些凝胶仅包含松散缔合羟基磷灰石或者包含紧密缔合羟基磷灰石和松散缔合羟基磷灰石。
图3展现了示意图，该示意图展现了用于测量羟基磷灰石钙随时间从凝胶中的释放的设备。
具体实施方式
除非上下文另有明确规定，否则如在本文中可互换使用的术语“制剂”、“组合物”、“复合物”、“配制品”等应理解为是指交联透明质酸和羟基磷灰石的可注射凝胶产品，如本文总体上所述的。
如本文中关于凝胶的不同区域(例如“功能区”)中的羟基磷灰石所用的术语“紧密缔合”和“松散缔合”应当被解释为与透明质酸凝胶的其中羟基磷灰石颗粒与交联凝胶之间缔合程度不同(分别为高和低)的区域有关。因此，被称为“紧密缔合”或“亲密缔合”的材料应被解释为其中每体积单位凝胶中羟基磷灰石与交联HA较好地缔合或较致密地共定位的材料区域。相反，“松散缔合”材料应该被解释为其中每体积单位凝胶中羟基磷灰石与交联HA较小地缔合或较松散地共定位的材料区域。如关于紧密缔合羟基磷灰石区域和松散缔合羟基磷灰石区域所用的术语“区域”、“功能区”、“相”等应当被解释为其中与羟基磷灰石缔合程度或共定位程度不同的透明质酸凝胶的部分。据信，紧密缔合羟基磷灰石颗粒例如通过离心不易与凝胶分离。还据信，紧密缔合羟基磷灰石部分的存在可阻碍较松散缔合的颗粒与凝胶的分离。
在本发明的上下文中，如本文所用的术语“磷灰石”、“羟基磷灰石”、“羟基磷灰石钙”等是指通式为Ca10(PO4)6(OH)2的羟基磷灰石矿物质，其具有合适的质量和纯度以便在人体中使用/给予(例如注射)。
有时，羟基磷灰石可能被其他磷酸钙矿物质替代。术语“磷酸钙矿物质”是指含有钙离子(Ca2+)连同正磷酸根(PO4 3-)、偏磷酸根或焦磷酸根(P2O7 4-)和偶尔氢或氢氧根离子的矿物质家族。可用作羟基磷灰石的替代物的磷酸钙矿物质的非限制性例子是α-磷酸三钙和β-磷酸三钙。其他生物相容性材料颗粒也可以是合适的。
在一些实施方案中，羟基磷灰石可以部分或完全被磷酸钙矿物质取代，特别是用α-磷酸三钙和/或β-磷酸三钙、和/或其混合物取代。在其中羟基磷灰石部分被磷酸钙矿物质取代的实施方案中，该部分可以从约10重量％至约90重量％变化，例如在10-30重量％、或30-50重量％、或50-70重量％之间，或在70-90重量％之间，或在10-70重量％、或30-90重量％、或30-70重量％之间变化。在这些实施方案中，以重量％表示的重量部分是本文中针对羟基磷灰石所述的量的百分比。在一些实施方案中，羟基磷灰石完全被磷酸钙矿物质取代；在这些实施方案中，组合物中磷酸钙矿物质的量如本文中针对羟基磷灰石所述。
羟基磷灰石嵌入在本发明的组合物中，因为它可以充当皮肤填充材料并且可以诱导胶原蛋白合成。诸位发明人已进一步发现，羟基磷灰石与HA基质的缔合程度，例如，HA基质中的紧密缔合羟基磷灰石和松散缔合羟基磷灰石的具体量，可通过制造方法例如通过在HA基质形成过程的各个步骤期间添加的羟基磷灰石的相对量来控制。
羟基磷灰石可总体上以该凝胶的5％与90％wt之间例如在5重量％与70重量％之间、或在20重量％与65重量％之间、优选在30重量％与60重量％之间或在40重量％至70重量％之间的浓度存在于根据本发明的制剂中。在一些实施方案中，羟基磷灰石浓度在50重量％与60重量％之间。在其他实施方案中，羟基磷灰石浓度高于25重量％，例如，高于35重量％、或高于45重量％、或48重量％、或51重量％、53重量％、或在54重量％至57重量％之间。
在一些实施方案中，羟基磷灰石的一部分在离心后与制剂不可分离。通常，可以在2040g力下持续5分钟或者在735g力下持续10分钟来测定该不可分离部分。该不可分离部分可以是总羟基磷灰石的至少18重量％，并且可以是总羟基磷灰石的至少五分之一(例如，20％wt)、四分之一(例如，25％wt)，例如，高达约三分之一(例如，35％wt)。离心可以如本领域中通常已知的那样进行，例如，使用Eppendorf 5415C离心机(尺寸：(W×H×D)21.0cm×28.0cm×28.5cm)，其中凝胶样品被放置于合适的管中，例如，2-mL Eppendorf管。使用此离心机，在5000rpm下达到2040g力并且在3000rpm下达到735g力。
羟基磷灰石可以粉末形式(例如多个颗粒)提供。平均粒度可以小于或等于650μm，优选小于约200μm，进一步优选小于约80μm，并且还可以小于约500nm。进一步优选地，约至少75％的羟基磷灰石颗粒的尺寸可以在25μm与500μm之间、或在25μm与300μm之间、或在25μm与200μm之间、或在25μm与100μm之间、优选在25μm与45μm之间。可替代地或另外地，至少75％的羟基磷灰石颗粒可以在1μm与100μm之间、或在5μm与45μm之间、或在10μm与45μm之间。如本文中关于羟基磷灰石钙颗粒可互换使用的术语“平均粒度”、“粒度”、“重均粒度”等是指例如羟基磷灰石钙的粉末粒度分布的重均量；即，按照每个部分的重量比例取得的粉末体积中的颗粒尺寸的平均值。
在本发明的上下文中，术语“透明质酸”、“HA”或“透明质酸盐”可互换地指代由重复的二糖单元构成的线性多糖或其盐，特别是指非硫酸化糖胺聚糖，每个单元由以下组成：通过交替的β-1,4和β-1,3糖苷键相连的D-葡萄糖醛酸和D-N-乙酰葡糖胺。
透明质酸可以由下式1描绘。
透明质酸或其盐可以来自具有多种分子量和其他规格的多种来源。通常，透明质酸的所有来源(包括细菌和禽类来源)可用于本发明的目的。
透明质酸的分子量可以作为特征来描述材料的。术语“分子量”包括数均分子量和重均分子量，如针对聚合物所已知的。有用的透明质酸材料的分子量可以为约0.25MDa(兆道尔顿)至约4.0MDa，例如约0.5MDa至约4.0MDa。HA的分子量的有用范围包括约0.6MDa至约2.6MDa、优选约1.3MDa至约2.0MDa。HA的分子量的有用范围还可包括约1.0MDa至约3.0MDa、约1.0MDa至约2.5MDa、约1.5MDa至约2.0MDa。具体地，可以使用分子量为约0.7MDa、约1.8MDa或约2.7MDa的HA。在一些实施方案中，该凝胶包含HA，该HA的Mw为在0.1-5MDa之间、在1MDa至5MDa之间、在0.1MDa至2MDa之间、在0.1MDa至1MDa之间、在1MDa至4MDa之间、在2MDa至3.5MDa之间或在0.1MDa至5MDa之间。
透明质酸进一步以多分散性值表征，该多分散性值指示聚合物中分子量的变化。虽然为了改进方法的可重复性而使用低多分散性透明质酸可能是有利的，但在经济上可能是不可行的。可以实现分子量多分散性的宽度与起始材料的价格之间的合理折衷，并且合适的透明质酸材料可以具有约1.1至4.0、优选小于3.0、进一步优选小于2.0的多分散性。
交联透明质酸在该组合物中的浓度可以从0.2重量％至9重量％变化。在一些实施方案中，透明质酸的浓度在0.5重量％与8重量％之间、或在0.8重量％与7重量％之间、或在0.2重量％与1重量％之间、或在0.5重量％与1.5重量％之间、或在0.5重量％与4重量％之间、或在3重量％与6重量％之间、或在1重量％与5重量％之间。通常，该组合物中的交联透明质酸是在交联条件下与交联剂组合的透明质酸，如本文所述。
透明质酸可以至少部分地交联。如本文所用的关于透明质酸的术语“交联”应解释为透明质酸的两个或更多个聚合物链的化学或物理改性，其导致透明质酸链键合(优选共价键合)在一起。交联过程可以优选包括交联剂。类似地，在没有交联剂的情况下，在单个聚合物链内或在两个或更多个链之间产生内酯、酸酐、醚或酯形成的分子间或分子内反应的过程。关于共价连接至交联剂的透明质酸或共价改性的透明质酸，也可以使用术语“交联”。
另外，该凝胶还可包含游离透明质酸，即，非交联透明质酸。通常，游离透明质酸不暴露于交联条件。在一些实施方案中，该凝胶可包含游离透明质酸，并且该游离透明质酸可以总透明质酸的5重量％至95重量％的浓度存在。因此，交联HA与非交联HA的比率可以是至少0.1:1，例如至少0.5:1、或1:1、或2:1、或5:1、或10:1。
如本文所用的术语“交联剂”是指含有至少两个反应性官能团的分子，该反应性官能团在两个或更多个透明质酸分子之间产生共价键。交联剂可以是同双官能的(即具有两个相同的反应性末端)或异双官能的(即具有两个不同的反应性末端)。适用于本发明的交联剂通常包含与透明质酸的官能团互补的官能团，使得可形成交联。优选地，交联不形成酯化的透明质酸。适用于本发明的交联剂的非限制性例子包括1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、1,2,7,8-二环氧辛烷(DEO)、双碳二亚胺(BCDI)、己二酸二酰肼(ADH)、双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(BS3)、六亚甲基二胺(NMDA)、1-(2,3-环氧丙基)-2,3-环氧环己烷、多官能交联剂(如季戊四醇四缩水甘油醚(PETGE)、或基于PEG的如聚乙二醇二缩水甘油醚(PEGDE)、单乙二醇二缩水甘油醚(EGDE))、或其组合。优选地，该交联剂是BDDE。
如本文中可互换使用的，术语“基于PEG的交联剂”等是指聚乙二醇(PEG)衍生物。术语“PEG”是指聚乙二醇聚醚化合物，其具有从工业制造到医药的许多应用。PEG也称为聚环氧乙烷(PEO)或聚氧乙烯(POE)，这取决于其分子量。PEG的结构通常表示为H-(O-CH2-CH2)n-OH。可用作交联剂的PEG衍生物的非限制性例子是PEG环氧化物，例如聚(乙二醇)二缩水甘油醚、PEG-二酰肼、PEG-二卤化物、二叠氮化物-PEG、二氨基氧基-PEG、二胺-PEG等。
如本文所用的通用术语“交联条件”是指允许在HA链之间形成共价键的反应条件。通常，交联条件实现交联反应，并且可以包括将混合物调节至所需的pH和温度，所需的pH和温度对于所用的交联剂是特定的。交联条件可包括将混合物的pH调节至高于12的pH。交联条件还可包括将混合物暴露于高温，例如45℃，持续第一时间段，例如，在1小时与5小时之间，例如，3小时。交联条件还可包括将混合物暴露于25℃持续第二时间段，例如，15小时。通过测试本领域中对于特定交联剂熟知的针对HA的交联条件，可以容易地通过实验确定最佳的交联温度和pH。有时，可以主动撤出交联条件，以终止交联反应。交联反应的终止可包括将混合物调节至所需的pH和温度，所需的pH和温度对于所用的交联剂是特定的，例如，将混合物的pH调节至约7的pH。
交联度可以表示为在交联过程完成后HA的被占据的反应性基团的百分位数。交联度对于所得凝胶的物理化学特性可能是重要的，该物理化学特性例如是酶促降解的降解速率和/或电阻率。如由交联剂摩尔数与HA二聚体摩尔数的比率所定义的改性度(MoD)可以在1％-40％、2％-30％、3％-20％、4％-10％、特别是6％-10％之间。
HA的交联可以通过以下方式实现：将透明质酸溶解/分散在溶剂(优选水)中，添加交联剂和优选地至少一种添加剂，例如，羟基磷灰石，并且将混合物置于交联条件。可替代地，可以在交联条件下将交联剂逐渐添加至透明质酸与任选添加剂的混合物中。
复合凝胶还可以包含生物活性材料，例如，药物。适用于复合凝胶的药物的非限制性例子包括局部麻醉剂(例如利多卡因)以及还有激素、生长因子和类固醇。
本发明的复合凝胶可以形成药物制剂、医疗制剂或化妆品制剂。该制剂通常可以是包含交联透明质酸或其盐和羟基磷灰石钙的水性配制品，优选呈可注射凝胶的形式，任选地呈无菌可注射凝胶的形式。进一步优选地，该制剂是化妆品制剂。
在进行根据本发明的方法时，可以将透明质酸或其盐添加到水中并且在合适的混合器中混合直至溶解。可以将交联剂例如BDDE添加到该混合器中，并且混合直至溶解。可替代地，可以将交联剂溶液添加到透明质酸溶液中。可以例如使用转子-定子均化器将羟基磷灰石分散在反应混合物中。
进行交联可包括增加介质的pH。这可通过以下方式实现：向反应混合物中添加足量的碱或碱溶液，并且混合直至均匀。如果需要，可以升高反应混合物的温度。完成交联反应以获得凝胶可以包括：将所述反应混合物例如通过添加水性酸或中性或酸性缓冲剂中和，即，达到约6.0与7.8之间例如约7的pH，或者使反应进行到交联剂基本上完全转化。
优选地，凝胶配制品包含：
i)水；
ii)交联透明质酸、或其盐之一，浓度在0.2％wt与9％wt(w/w)之间；
iii)羟基磷灰石，浓度在5％wt与90％wt(w/w)之间，如本文所述，分割在第一部分与第二部分之间；以及任选地
iv)药物，例如局部麻醉剂(例如利多卡因)，高达1％w/w。
配制品还可包含缓冲剂和渗透压剂，例如氯化钠、磷酸盐等。磷酸盐可包括正磷酸与钠和/或钾的一元、二元或三元盐。
透明质酸在凝胶配制品中的浓度的范围可以为0.2％wt至9％wt、或1％wt至6％wt、或1.5％wt至5％wt、或2.5wt％至4.5wt％、或约4％wt。在一些实施方案中，透明质酸的浓度在0.5重量％与8重量％之间、或在0.8重量％与7重量％之间、或在0.5重量％与1.5重量％之间、或在0.5重量％与1重量％之间、或在3重量％与6重量％之间、或在1重量％与5重量％之间。优选地，透明质酸浓度在0.5％与4％w/w之间。
根据一个实施方案，羟基磷灰石钙颗粒以55重量％与57重量％之间例如55.7％w/w的浓度存在于配制品中。
根据其制造方法，羟基磷灰石颗粒可以在其中与HA基质的缔合程度不同的各种区域中(例如，作为紧密缔合羟基磷灰石以及作为松散缔合羟基磷灰石)而包含于配制品中。紧密缔合羟基磷灰石可通过以下方式获得：例如，将一部分羟基磷灰石添加到包含可交联透明质酸例如游离透明质酸或部分交联透明质酸的溶液中，添加交联剂，并且将混合物暴露于交联条件。松散缔合羟基磷灰石可通过以下方式获得：例如，将羟基磷灰石引入到交联透明质酸中，并且优选使混合物经受均化。因此可将羟基磷灰石的总量分割成第一部分和第二部分。
第一部分羟基磷灰石(例如“紧密缔合羟基磷灰石”)的合适量可以是成品总重量(在汇总所有成分之后)的1％与20％之间、优选1％与10％wt之间。该第一部分可在羟基磷灰石总量的5重量％与90重量％之间。在一些实施方案中，该第一部分可包括10重量％与70重量％之间、20重量％与60重量％之间、30重量％至50重量％之间。
第二部分羟基磷灰石(例如“松散缔合羟基磷灰石”)的合适量可以是羟基磷灰石总量的5-90重量％。在一些实施方案中，该第二部分可包括10重量％与70重量％之间、20重量％与60重量％之间、30重量％至50重量％之间。
在其中组合物包含30％wt的羟基磷灰石的示例性实施方案中，第一部分和第二部分的各自比率可以是5:25、或10:20、或15:15、或20:10。在其中组合物包含40％wt的羟基磷灰石的其他示例性实施方案中，第一部分和第二部分的各自比率可以是5:35、或10:30、或15:25、或20:20。在其中组合物包含55.7％wt的羟基磷灰石的其他示例性实施方案中，第一部分和第二部分的各自比率可以是10:45.7、或20:35.7。在其中组合物包含70％wt的羟基磷灰石的其他示例性实施方案中，第一部分和第二部分的各自比率可以是5:65、或10:60、或15:55、或20:50。
本发明的方法可以通过以下步骤进行：a)制备包含水和至少0.2％至9％重量的透明质酸或其盐、和交联剂的第一混合物；b)将混合物暴露于交联条件；c)添加浓度在1％wt至20％wt之间的羟基磷灰石并且使混合物暴露于交联条件；d)中和混合物；c)添加浓度为5％wt至70％wt之间的羟基磷灰石，并且将其均匀分散于交联透明质酸凝胶中。另外或可替代地，可以在步骤a)中将第一部分羟基磷灰石添加到反应混合物中。另外，中和步骤可在添加连续部分的羟基磷灰石之前进行。此外，该方法还可包括添加另外部分的相同或不同的交联剂，并且随后使混合物经受交联条件。因此，可存在多于一个中和步骤，如下所述。
可以进一步将水性配制品的pH和渗透压调节至生理值。可以根据最终pH的要求，通过添加包含pH在6与8之间的药学上可接受的酸、缓冲剂(例如，磷酸盐)的水溶液来进行中和。
类似地，可以通过以下方式来进行渗透压调节：向混合物中添加盐(例如氯化钠、如本文所述磷酸盐)溶液，并且混合配制品以获得均匀凝胶。
在制造方法的任何步骤中，出于质量保证目的，可以测试混合物。适用的标准测试是技术人员已知的，并且包括例如流变测定法、pH测定、残留交联剂定量、显微术、离心沉降等。
在包装之前，可以例如通过挤出或通过高剪切混合器将制备好的配制品研磨，以改进流动特性。可以在另外的液体成分(例如水和/或中和和/或渗透压调节溶液)存在下进行研磨。
该凝胶可以是可容易注射的。在一些实施方案中，该凝胶是通过普通医用或美容用针例如25G/16-mm针可注射的。术语“可注射的”应该被解释为通过针以常用注射速率注射凝胶不需要过大的力。注射速率可以是0.2mL/分钟至1.5mL/分钟、优选在0.9mL/min与1.1mL/min之间。注射凝胶所需的力可根据它们各自的组成和羟基磷灰石和透明质酸的浓度而变化，但通常当通过25G针挤出时，迫使凝胶从内径为6.35±0.1mm的标准1-mL注射器中出来所需的平均力小于40牛顿。
可以将配制品填充到注射器中并且例如通过高压灭菌或通过γ辐射灭菌。
该无菌配制品可用于多种应用，例如，组织填充，诸如皱纹填充或骨移植填充。
图1呈现了根据本发明实施方案的方法的示例性流程图。通过以下方式进行透明质酸溶液制备，称为“HA SOL Prep”：在离心混合器(“CfM”)中以300-2000rpm持续15-30分钟将透明质酸钠(“Na-HA”)和丁二醇二缩水甘油醚(“BDDE”)溶解于水(“Wtr”)中。通过以下方式进行交联溶液制备，称为(“XL SOL Prep”)：在离心混合器(“CfM”)中以300-2000rpm持续30-60分钟将氢氧化钠在水(“Wtr”)中。通过以下方式进行透明质酸交联(“HA XL”)：在离心混合器(“CfM”)中以300-2000rpm持续15-30分钟将HA溶液、交联溶液和第一部分羟基磷灰石(“CaHAp I”)(约10％wt)合并。通过以下方式制备中和溶液(“Neutr SOL prep”)：将水(“Wtr”)、磷酸二氢钾(“KH2PO4”)、磷酸氢二钠(“Na2HPO4”)和盐酸(“HCl”)在顶置式搅拌器(“OhS”)中混合1-10分钟。将羟基磷灰石与交联透明质酸(“HA XL+CaHAp I”)的混合物与中和溶液在离心混合器(“CfM”)中以300-2000rpm混合10-120分钟以提供中和凝胶(“NeutGL”)。将另外的羟基磷灰石(“CaHAp II”)添加到凝胶中并且在离心混合器(“CfM”)和/或行星式混合器(“Thinky”)中以300-2000rpm混合(“MX GL”)1-30分钟。将凝胶在约20毫巴(绝对压力)下脱气(“DGS GL”)30分钟，然后研磨(“MLNG”)，包装(“PKGN”)于注射器(“SYRNG”)中，并且然后通过高压灭菌(“AUTOCLV”)进行灭菌(“STRLZ”)。
实施例
实施例1-
制备凝胶#1-具有紧密缔合羟基磷灰石和松散缔合羟基磷灰石的凝胶
步骤1：制备基于透明质酸和羟基磷灰石钙的交联凝胶。
将2.31g分子量为1.3-2.0MDa(制药级)的透明质酸钠(HA)添加到19.19g水中，在室温下使用由Collomix制造的离心混合器以300rpm混合至溶解，接着添加0.23g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)(由TCI提供)，并且将混合物在300rpm下进一步混合30min。之后，将3.98g 1M氢氧化钠(NaOH)溶液添加到混合物中，得到25.71g的总重量，pH>12。然后使用离心混合器以300rpm将混合物均化60min。然后，将24.00g平均粒度为25-45微米的羟基磷灰石钙Ca10(PO4)6(OH)2致密微球(医用级)添加到混合物中，得到49.71g总重量，并且然后在300rpm下再次混合30min。然后将混合物在设定为45℃的烘箱中放置3小时，然后在25℃下再放置15小时。
步骤2：制备最终本体。
通过添加80.61g中和溶液将混合物中和至pH 7。中和溶液的组成为0.56g磷酸二氢钾(KH2PO4)(药物级，由Merck提供)、0.56g磷酸氢二钠(Na2HPO4)(药物级，由Merck提供)、76.66g注射用水和2.83g 1M盐酸(HCl)溶液(药物级，由Merck提供)。使用离心混合器以300rpm将混合物混合1小时，直至形成均匀凝胶。将109.68g第二部分羟基磷灰石钙添加到130.32g中和后形成的凝胶中，并且以300rpm将混合物进一步均化30min。最后通过使凝胶经受20毫巴真空持续30分钟将其在真空中脱气，填充到1.25mL玻璃注射器中，并且在蒸汽高压灭菌器中在121℃下灭菌持续20分钟。形成粘性和粘弹性凝胶。
凝胶中的透明质酸浓度(不包括嵌入的羟基磷灰石钙微球)为20mg/g(2％w/w)，其pH为约7.0并且其渗透压为约300mOsm/kg。该凝胶具有最终55.7％的羟基磷灰石钙浓度，10％为紧密缔合羟基磷灰石并且45.7％为松散缔合羟基磷灰石。
测试1-可注射性测定
通过测定经由内径为0.31mm的25G/16mm针(由PIC制造，目录号03.070250.300.800)注射凝胶所需的最大力来测量挤出力(EF)。简言之，将凝胶插入到内径为6.35mm(±0.1)的1-mL BD注射器中，并且经由该针以1mL/min的速率挤出。通过使用YISIDA DS-2测力计的挤压力测量装置(内部制备)和测力计软件(ShanheDS2_Eng)测量该力。测量的平均挤压力为34牛顿。
实施例2-比较，制备凝胶#2，仅具有松散缔合羟基磷灰石
步骤1：制备交联凝胶。
将2.31g分子量为1.3-2.0MDa的透明质酸钠(HA)添加到19.19g水中，在室温下使用由Collomix制造的离心混合器以300rpm混合至溶解，接着添加0.23g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)(由TCI提供)，并且将混合物以300rpm进一步混合30min。之后，将3.98g 1M氢氧化钠(NaOH)溶液添加到混合物中，得到25.71g的总重量，pH>12。然后使用离心混合器以300rpm将混合物均化90min。然后将混合物在设定为45℃的烘箱中放置3小时，然后在25℃下再放置15小时。
步骤2：制备最终本体。
通过添加80.61g中和溶液将混合物中和至pH 7。中和溶液的组成为0.56g磷酸二氢钾(KH2PO4)(药物级，由Merck提供)、0.56g磷酸氢二钠(Na2HPO4)(药物级，由Merck提供)、76.66g注射用水和2.83g 1M盐酸(HCl)溶液(药物级，由Merck提供)。以300rpm将混合物混合60min，直至形成均匀凝胶。将133.68g平均粒度为25-45微米的羟基磷灰石钙Ca10(PO4)6(OH)2致密微球(医用级)添加到106.32g中和后形成的凝胶中，并且以300将混合物进一步均化60min。最后通过使凝胶经受20毫巴真空持续30分钟将其在真空中脱气，填充到1.25mL玻璃注射器中，并且在蒸汽高压灭菌器中在121℃下灭菌持续20分钟。形成粘性和粘弹性凝胶。
该凝胶具有最终55.7％的羟基磷灰石钙浓度，该羟基磷灰石钙为松散缔合羟基磷灰石。
实施例3-测试从凝胶中的释放
分别将约1g等份的实施例1和制备1的凝胶1和2分别放置于具有大约40μm的线和大约50μm的孔的总面积为81cm2的金属网插入物(袋)中。将插入物放置于标准50-mL离心管中，并且向每个管中添加30mL水，使得其中金属袋的约28.5cm2浸没在水中。将样品静置预定的时间间隔，如下表1中详述，每个样品有指定的间隔。在实验过程中，凝胶吸收水并且逐渐将羟基磷灰石钙颗粒释放到水中。体系的示意性图示在图3中示出。
测试每个管中释放到水中的羟基磷灰石钙颗粒的含量，并且通过重量分析进行定量。简言之，移除金属袋并且将管离心。然后，通过倾析除去大部分水。将羟基磷灰石钙颗粒沉淀物用约7ml乙醇洗涤并且在70℃下干燥过夜。结果汇总于表1中。
表1
可容易看出，在每个时间点与凝胶#2相比，从凝胶#1释放的羟基磷灰石钙颗粒较少，即，从凝胶#1中的释放动力学慢于从凝胶#2中的释放动力学。这是因为在凝胶#1中羟基磷灰石钙与交联凝胶紧密缔合，与凝胶#2中仅与凝胶松散缔合的颗粒不同。
实施例4-羟基磷灰石的缔合强度
通过以下方式测试凝胶：将精确称重的约1.25g等份放置于2-mL Eppendorf管中并且使用Eppendorf 5415C离心机(尺寸：(W×H×D)21.0cm×28.0cm×28.5cm)以5000rpm在2040g力下离心5分钟或以3000rpm在735g力下10分钟。
离心后，观察到两个相，下部相含有从凝胶中分离出的羟基磷灰石钙颗粒，并且上部相含有剩余凝胶部分，该剩余凝胶部分具有仍附着在凝胶上的颗粒。将这两个相分离。使用透明质酸酶将上部相中的凝胶消化，将羟基磷灰石钙颗粒通过离心沉淀，用水洗涤并且干燥并且如实施例3中所述进行定量。还将下部相中的羟基磷灰石钙颗粒干燥并且如实施例3中那样进行定量。
当凝胶在离心前被称重时，可计算出每相中的CaHAp的百分比。通过使用下式计算羟基磷灰石钙的百分比：(每相中的CaHAp干重)/(凝胶总量)×100％。
对于735g离心，结果呈现于下表2中。与理论的55.7％羟基磷灰石钙负载量的微小偏差可归因于称重误差。
表2
实施例5-现有技术凝胶(仅松散缔合羟基磷灰石)与具有紧密缔合羟基磷灰石和松散 缔合羟基磷灰石二者的凝胶之间的比较
制备另外两种凝胶并且比较它们的特征。如作为US 20150257989公开的美国专利申请中所述制备第一凝胶(凝胶#3)，其中CaHAp是与交联凝胶松散缔合的。第二凝胶(凝胶#4)根据相同的程序制备；然而，如本申请中所述，以两个离散的步骤添加羟基磷灰石钙，以在最终凝胶中产生紧密缔合CaHAp和松散缔合CaHAp。这两种凝胶中羟基磷灰石钙的最终浓度为30重量％。
简言之，凝胶#3制备如下：
步骤1：将3.75g分子量为1.3-2.0MDa的透明质酸钠添加到30.5g的1.0％(0.25M)NaOH中。将混合物均化90min。然后，向混合物中添加420mg 1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)，将其均化5分钟，封闭并且放置于烘箱中于50℃下持续2小时。然后通过在25℃下将混合物保持另外15小时将该程序调整以获得可用的凝胶。之后通过添加7.5g 1N HCl将混合物中和。
通过用磷酸盐缓冲液(KH2PO4:Na2HPO4，比率1:1)透析来将凝胶纯化24h以获得25mg/ml(2.5％)的最终透明质酸浓度，并且然后将其均化90min。透析后的凝胶重量为139.29g。
步骤2：取100g制备的凝胶并且将其与42.9g CaHAp(粒度-25-45μm)混合90min直至均化。将均化的凝胶脱气，填充到1.25ml注射器中，并且通过蒸汽高压灭菌器在130℃下灭菌持续3min。
凝胶#4根据以下程序制备：
步骤1：将3.75g分子量为1.3-2.0MDa的透明质酸钠添加到30.5g的1.0％(0.25M)NaOH中。将混合物均化90min。然后添加420mg 1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)并且混合5min。之后，向混合物中添加19.90g(粒度-25-45μm)第一部分羟基磷灰石钙并且将其均化30min，封闭并且放置于烘箱中于50℃下持续2小时，接着于25℃下另外15h。然后通过添加7.5g 1NHCl将混合物中和。
通过用磷酸盐缓冲液(KH2PO4:Na2HPO4，比率1:1)透析来将凝胶纯化24h以获得25mg/ml(2.5％)的最终透明质酸浓度，并且然后将其均化90min。透析后的凝胶重量为159.19g。
步骤2：取114.29g制备的凝胶并且将其与28.58g(粒度-25-45μm)第二部分羟基磷灰石钙混合90min直至均化。将均化的凝胶脱气，填充到1.25ml注射器中，并且通过蒸汽高压灭菌器在130℃下灭菌持续3min。
测试1：缔合强度
根据实施例3，使用Eppendorf 5415C离心机以5000rpm在2040g力下离心5min进行测试。在凝胶#3中观察到凝胶与钙之间完全分离，而在凝胶#4中仅观察到细微差异。结果呈现于下表3中。与理论的30％羟基磷灰石钙负载量的微小偏差可归因于称重误差。
表3
可容易看出，在仅含有作为松散缔合组分的羟基磷灰石钙的根据现有技术的凝胶#3中，几乎全部CaHAp(>99％)与凝胶分离。然而，在凝胶#4中，至少三分之一保留在凝胶中。不受理论的束缚，据信凝胶#4中的CaHAp颗粒更强地附着在凝胶上并且因此更不容易与它分离，其量甚至超过交联阶段期间添加的那10％。
测试2：羟基磷灰石钙从凝胶中的释放
通常根据实施例3进行测试，其中使用约1.5g凝胶。
结果呈现于下表4中。可容易看出，即使在6天和14天后，从凝胶#3中释放的CaHAp多于从凝胶#4中释放的CaHAp。
不受理论束缚，据信由于凝胶#4中颗粒与交联凝胶之间发生较高的缔合，因此颗粒的释放动力学较慢。相反，凝胶#3仅含有与凝胶较松散缔合的颗粒，这影响了它们从其中的释放速率。
表4
实施例6-小角度X射线散射(SAXS)
另外，将这些凝胶中的一些通过小角度X射线散射(SAXS)进行测试。
使用SAXSLAB GANESHA 300-XL获得聚合物凝胶的小角度X射线散射(SAXS)图。由带有集成单色器、3针孔准直和二维Pilatus 300K检测器的Genix 3D Cu源产生CuKα辐射。以的间隔记录散射强度I(q)。在环境温度下在真空下进行测量。
将凝胶试样放置于不锈钢样品池中，该样品池具有由云母制成的入射窗和出射窗。基于通过由NIST(NIST SANS分析版本6.32，IGOR)提供的软件拟合散射曲线进行数据分析。修正散射曲线的计数时间和样品吸收。该散射曲线呈现于图2中。
检查三种凝胶，如上所述：凝胶##1、3和4。SAXS结果表明，其中羟基磷灰石钙颗粒较松散地附着的凝胶中的HA基质比还包含一些紧密缔合CaHAp颗粒的凝胶更大量。
实施例7-低浓度凝胶
制备包含低浓度紧密缔合CaHAp和低浓度HA的其他凝胶。另外，检查了不同Mw的HA的效果。
根据实施例1的程序制备凝胶##5和6。
这些凝胶汇总于下表5中，其中呈现了每种凝胶的平均EF。可容易看出，测试凝胶在EF值方面表现相对类似。
表5
实施例8-具有紧密缔合羟基磷灰石和松散缔合羟基磷灰石的双交联凝胶
步骤1：制备基于透明质酸的交联凝胶。
将2.31g分子量为1.3-2.0MDa(制药级)的透明质酸钠(HA)添加到19.19g水中，在室温下使用由Collomix制造的离心混合器以300rpm混合至溶解，接着添加0.12g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)(由TCI提供)，并且将混合物在300rpm下进一步混合30min。之后，将3.98g 1M氢氧化钠(NaOH)溶液添加到混合物中，得到25.60g的总重量，pH>12。然后将混合物在设定为45℃的烘箱中放置3小时，然后在25℃下再放置15小时。
步骤2：制备具有羟基磷灰石钙的双交联凝胶。
添加约2.5-4mL 1M盐酸(HCl)溶液，使混合物达到pH约4，接着混合15min。添加约3-5mL1M氢氧化钠(NaOH)，使混合物达到pH 12，接着以300rpm混合15min。之后，向混合物中添加0.11g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)和24.00g平均粒度为25-45微米的羟基磷灰石钙Ca10(PO4)6(OH)2致密微球(医用级)，并且以300rpm混合15min。
然后将混合物在设定为45℃的烘箱中放置3小时，然后在25℃下再放置15小时。
步骤3：制备最终本体。
通过添加80.61g中和溶液将混合物中和至pH 7。中和溶液的组成为0.25g磷酸二氢钾(KH2PO4)(药物级，由Merck提供)、0.87g磷酸氢二钠(Na2HPO4)(药物级，由Merck提供)、76.43g注射用水和2.83g 1M盐酸(HCl)溶液(药物级，由Merck提供)。使用离心混合器以300rpm将混合物混合1小时，直至形成均匀凝胶。将109.68g第二部分羟基磷灰石钙添加到130.32g中和后形成的凝胶中，并且使用离心混合器以300rpm将混合物进一步均化30min。最后通过使凝胶经受20毫巴真空持续30分钟将其在真空中脱气，填充到1.25mL玻璃注射器中，并且在蒸汽高压灭菌器中在121℃下灭菌持续20分钟。形成粘性和粘弹性凝胶。
凝胶中的透明质酸浓度(不包括嵌入的羟基磷灰石钙微球)为20mg/g(2％w/w)，其pH为约7.0并且其渗透压为300mOsm/kg。该本体凝胶通过针可容易注射：通过25G/16mm普通壁针(由PIC制造)以1mL/min的速率注射凝胶需要20N至40N的力。
实施例9-具有紧密缔合羟基磷灰石和松散缔合羟基磷灰石的双交联凝胶，替代方法
步骤1：制备具有羟基磷灰石钙的基于透明质酸的交联凝胶。
将2.31g分子量为1.3-2.0MDa(制药级)的透明质酸钠(HA)添加到19.19g水中，在室温下使用由Collomix制造的离心混合器以300rpm混合至溶解，接着添加0.12g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)(由TCI提供)。此后，将3.98g 1M氢氧化钠(NaOH)溶液添加到混合物中，得到总重量为25.60g，pH>12。使用离心混合器将混合物以300rpm混合15分钟。然后将混合物在设定为45℃的烘箱中放置3小时，然后在25℃下再放置15小时。
然后添加另外0.11g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)和24.00g平均粒度为25-45微米的羟基磷灰石钙Ca10(PO4)6(OH)2致密微球(医用级)，并且使用由Collomix制造的离心混合器以300rpm混合15min。
然后将混合物在设定为45℃的烘箱中放置3小时，然后在25℃下再放置15小时。
步骤2：制备最终本体。
通过添加80.61g中和溶液将混合物中和至pH 7。中和溶液的组成为0.25g磷酸二氢钾(KH2PO4)(药物级，由Merck提供)、0.87g磷酸氢二钠(Na2HPO4)(药物级，由Merck提供)、76.66g注射用水和2.83g 1M盐酸(HCl)溶液(药物级，由Merck提供)。使用离心混合器以300rpm将混合物混合1小时，直至形成均匀凝胶。将109.68g第二部分羟基磷灰石钙添加到130.32g中和后形成的凝胶中，并且以300rpm将混合物进一步均化30min。最后通过使凝胶经受20毫巴真空持续30分钟将其在真空中脱气，填充到1.25mL玻璃注射器中，并且在蒸汽高压灭菌器中在121℃下灭菌持续20分钟。形成粘性和粘弹性凝胶。
凝胶中的透明质酸浓度(不包括嵌入的羟基磷灰石钙微球)为20mg/g(2％w/w)，其pH为约7.0并且其渗透压为300mOsm/kg。该本体凝胶通过针可容易注射：通过25G/16mm普通壁针(由PIC制造)以1mL/min的速率注射凝胶需要20N至40N的力。

Claims (26)

1.一种制造包含交联透明质酸和羟基磷灰石的凝胶产品的方法，所述方法包括：
将透明质酸或其盐、交联剂在水性介质中合并，并且在第一部分羟基磷灰石的存在下进行交联反应；
完成该交联反应；并且
将第二部分羟基磷灰石掺入到如此形成的凝胶中。
2.根据权利要求1的方法，其中，所述进行交联反应包括提高该介质的pH，并且所述完成该交联反应包括允许反应混合物静置、和/或将所述反应混合物中和。
3.前述权利要求中任一项的方法，其中，所述第一部分羟基磷灰石在羟基磷灰石总量的5重量％与90重量％之间。
4.前述权利要求中任一项的方法，其中，所述第一部分羟基磷灰石在羟基磷灰石总量的5重量％与30重量％之间。
5.前述权利要求中任一项的方法，其中，所述交联剂选自1,4-丁二醇二缩水甘油醚、聚(乙二醇)二缩水甘油醚和乙二醇二缩水甘油醚。
6.权利要求5的方法，其中，所述交联剂是1,4-丁二醇二缩水甘油醚。
7.前述权利要求中任一项的方法，其中，所述透明质酸在所述水性介质中的浓度在0.2重量％与9重量％之间。
8.权利要求7的方法，其中，所述透明质酸在所述水性介质中的浓度在0.5-4之间。
9.前述权利要求中任一项的方法，其中，所述水性介质中所述透明质酸与所述交联剂之间的重量比在15:1与2:1之间。
10.前述权利要求中任一项的方法，还包括在终止该交联反应后将另外量的透明质酸引入到该凝胶中。
11.前述权利要求中任一项的方法，其中，羟基磷灰石在所述凝胶中的浓度高于25重量％。
12.权利要求11的方法，其中，羟基磷灰石在所述凝胶中的浓度高于45重量％。
13.权利要求12的方法，其中，羟基磷灰石在所述凝胶中的浓度在50重量％
与60重量％之间。
14.前述权利要求中任一项的方法，其中，所述羟基磷灰石钙的平均粒度在25微米与45微米之间。
15.前述权利要求中任一项的方法，其还包括将该凝胶脱气和/或将该凝胶灭菌中的至少一者。
16.前述权利要求中任一项的方法，其包括向反应容器中装入水和透明质酸或其盐，搅拌以获得溶液，添加1,4-丁二醇二缩水甘油醚、氢氧化钠和第一部分羟基磷灰石钙，在高温下保持第一时间段并且在环境温度下保持第二时间段，添加磷酸盐缓冲溶液和水性酸以得到具有接近中性pH的凝胶，并且将第二部分羟基磷灰石钙掺入到该凝胶中，其中该第一部分羟基磷灰石钙与该第二部分羟基磷灰石钙之间的重量比在1:3与1:7之间，并且羟基磷灰石钙的总浓度在50重量％与60重量％之间。
17.一种包含交联透明质酸和羟基磷灰石的可注射凝胶组合物，其中，所述羟基磷灰石的浓度高于该凝胶的总重量的45重量％。
18.权利要求17的可注射凝胶，其中，所述羟基磷灰石的浓度在该凝胶的总重量的50重量％与60重量％之间。
19.一种包含交联透明质酸和羟基磷灰石的可注射凝胶组合物，其中，所述羟基磷灰石的浓度高于该凝胶的总重量的20重量％，并且其中，所述羟基磷灰石的一部分在735g力下离心10分钟后与所述凝胶不可分离，所述部分是羟基磷灰石总量的至少约五分之一。
20.权利要求19的凝胶组合物，其中，所述羟基磷灰石的浓度高于该凝胶的总重量的25重量％。
21.权利要求20的凝胶组合物，其中，所述羟基磷灰石的浓度高于该凝胶的总重量的45重量％。
22.权利要求21的凝胶组合物，其中，所述羟基磷灰石的浓度在该凝胶的总重量的50重量％与60重量％之间。
23.权利要求19-22中任一项的凝胶组合物，其中，所述交联透明质酸的浓度在0.2重量％与9重量％之间。
24.权利要求19-23中任一项的凝胶组合物，其中，所述交联透明质酸与对应于1,4-丁二醇二缩水甘油醚、聚(乙二醇)二缩水甘油醚或乙二醇二缩水甘油醚的结构单元交联。
25.权利要求19-24中任一项的凝胶组合物，还包含非交联透明质酸。
26.权利要求19-25中任一项的凝胶组合物，其中，所述羟基磷灰石的平均粒度在25微米与45微米之间。
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