CN111498822A - 一种功能性的纤维化杂化凝胶及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种功能性的纤维化杂化凝胶的制备方法及其应用，解决目前硬骨修复支架材料中羟基磷灰石在基体相中容易大块团聚，导致组织修复不均匀的问题。本发明的制备方法为：通过表面官能团修饰将表面带有氨基的羟基磷灰石与带有羧基的亲水性天然材料或合成聚合物通过酰胺化反应，制得表面改性的羟基磷灰石颗粒。本发明设计科学，操作简便，有生物相容性，骨诱导以及生物矿化能力，是一种理想的骨修复支架材料。

Description

一种功能性的纤维化杂化凝胶及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，具体涉及杂化纤维凝胶制备方法及其应用。
技术背景
天然骨是胶原蛋白与纳米羟基磷灰石的天然复合材料。羟基磷灰石晶体分布在胶原蛋白纤维上，约占骨重量的60% ~ 70%。虽然天然骨组织受到外界破坏有能力重建，但在自愈合失败的情况下，如骨折不愈合，就需要借助外界生物活性材料，诸如合成羟基磷灰石和含有羟基磷灰石的聚合物复合材料。理想情况下，这些材料应具有与骨骼相似的结构性能特征，具有生物相容性、生物降解性和生物活性，并且应该易于获得、制备简单。但是目前，由羟基磷灰石颗粒与聚合物复合制备骨修复支架时，存在着增强相与基体相不相容，界面结合处结强度差，纳米晶体固有的高表面能有利于团聚，从而导致力学性能较差。目前很多研究都集中在通过对羟基磷灰石表面修饰来克服这一问题。所采用的方法包括表面活性剂和聚电解质的吸附，使粒子具有静电和空间稳定性。但目前各种改性方法的综合效果都并不十分理想，因此，提供一种改性羟基磷灰石，具有良好的生物相容性，并且降解稳定，能与有机纤维支架良好结合且分散均匀，成为了本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
针对以上技术问题，本发明提供了一种巯基化改性羟基磷灰石并构建杂化纤维凝胶支架的制备方法，成功解决了现有技术中传统骨修复支架中羟基磷灰石大块团聚，组织修复不均匀等问题。
本发明包含以下技术方案：
一种巯基化改性羟基磷灰石，包括氨基化的羟基磷灰石和巯基化的天然化合物或合成化合物，所述天然化合物或合成化合物具有羧基官能团或可被修饰成羧基的官能团，所述氨基化的羟基磷灰石通过氨基与所述巯基化的天然化合物或合成化合物中带有的羧基发生酰胺反应化学结合。通过将巯基修饰过的化合物与氨基修饰过的羟基磷灰石反应，可以成功得到表面带有巯基的改性羟基磷灰石颗粒，将其与带有巯基的有机物相复合可以实现羟基磷灰石在基体中良好的分散，同时二硫键相互作用还有望增强支架内部两相界面的结合，从而提高支架的整体力学强度以及组织修复效果。
作为可选方式，在上述巯基化改性羟基磷灰石中，所述氨基化的羟基磷灰石为硅烷偶联剂改性而成的羟基磷灰石。进一步的，所述氨基化的羟基磷灰石表面硅烷偶联剂的质量百分比为2%~12%。更进一步的，所述硅烷偶联剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷。
作为可选方式，在上述巯基化改性羟基磷灰石中，所述氨基化的羟基磷灰石为3-氨丙基三乙氧基硅烷与正硅酸乙酯联合改性而成的羟基磷灰石。3-氨丙基三乙氧基硅烷作为一种硅烷偶联剂，其一端的三个乙氧基可与羟基磷灰石表面修饰过的聚硅醇网络结构结合，另一端暴露出的氨基可与带有羧基的天然生物材料或合成高分子反应，达到羟基磷灰石表面亲疏水改性。
作为可选方式，在上述巯基化改性羟基磷灰石中，所述天然化合物或合成化合物为透明质酸、羧甲基壳聚糖、明胶、胶原、海藻酸钠、硫酸软骨素、聚碳酸酯、聚胱胺酸中的任意一种或几种。
作为可选方式，在上述巯基化改性羟基磷灰石中，所述天然化合物或合成化合物为透明质酸。透明质酸作为一种细胞外基质，有一定的生物相容性，以及良好的亲水性，支链上的活性羧基还可以与其他化合物反应，从而赋予其各种活性官能团。
作为可选方式，在上述巯基化改性羟基磷灰石中，氨基化的羟基磷灰石和巯基化的天然化合物或合成化合物的用量质量比为1:1~1:5。
作为可选方式，在上述巯基化改性羟基磷灰石中，所述氨基化的羟基磷灰石结构式具体为：
Figure 720730DEST_PATH_IMAGE001
。
作为可选方式，在上述巯基化改性羟基磷灰石中，所述巯基化的天然化合物或合成化合物具体为巯基化透明质酸，其结构式如下：
Figure 128578DEST_PATH_IMAGE002
。
本发明还提供了一种所述巯基化改性羟基磷灰石的制备方法，即将氨基改性的羟基磷灰石与同时带有羧基与巯基的天然化合物或合成化合物通过发生酰胺反应化学结合，制得所述巯基化改性羟基磷灰石。利用表面氨基与天然化合物或合成高分子中带有的活性羧基反应，实现羟基磷灰石表面改性，其制备流程示意图如图21所示。
作为可选方式，在上述巯基化改性羟基磷灰石的制备方法中，具体步骤如下：
（1）制备氨基化羟基磷灰石；
（2）制备巯基化的天然化合物或合成化合物；
（3）酰胺化反应：将氨基化羟基磷灰石与巯基化的天然化合物或合成化合物混合均匀反应，使巯基化的天然化合物或合成化合物自身带有的羧基与羟基磷灰石表面的氨基发生酰胺化反应。
作为可选方式，在上述巯基化改性羟基磷灰石的制备方法中，所述步骤（1）通过两步化学接枝将羟基磷灰石表面赋予氨基。
作为可选方式，在上述巯基化改性羟基磷灰石的制备方法中，步骤（1）所述氨基化羟基磷灰石的制备方法具体为：先将正硅酸乙酯在乙醇/水体系中酸性条件下水解，再将其加入分散有纳米羟基磷灰石的乙醇/水溶液中，随后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷；反应10h-12h，用乙醇和去离子水各清洗三次改性后的羟基磷灰石，得到氨基化羟基磷灰石。
作为可选方式，在上述巯基化改性羟基磷灰石的制备方法中，所述氨基化羟基磷灰石的反应pH值为10。
作为可选方式，在上述巯基化改性羟基磷灰石的制备方法中，正硅酸乙酯与3-氨丙基三乙氧基硅烷的体积比为：1:1~1:2。
作为可选方式，在上述巯基化改性羟基磷灰石的制备方法中，正硅酸乙酯水解pH为2~3。
作为可选方式，在上述巯基化改性羟基磷灰石的制备方法中，其中的乙醇和水的体积比为1~2:9，正硅酸乙酯水解pH为1~2，水解时间为30min~1h，正硅酸乙酯与3-氨丙基三乙氧基硅烷以及羟基磷灰石浆料的体积比为1:1~2:5~6。
作为可选方式，在上述巯基化改性羟基磷灰石的制备方法中，步骤（2）所述巯基化的天然化合物或合成化合物的制备方法具体为：将透明质酸溶解于2-(N-吗啉)乙磺酸（MES）缓冲溶液中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化1~2h，反应pH为4.75~5，随后加入半胱胺盐酸盐在冰浴条件下反应3~10h，透析，得到巯基化透明质酸。
作为可选方式，在上述巯基化改性羟基磷灰石的制备方法中，所述透明质酸与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺以及半胱胺盐酸盐的摩尔比为1:4~5:2:4~5。透明质酸的分子量为0.01 MDa~3.0 MDa；透析袋的规格为cut off MW=8000~13000；所述MES缓冲液的浓度为0.01~1mol/L。
进一步地，所述巯基化透明质酸的反应pH为4.75~5，巯基取代率为12%~70%
作为可选方式，在上述巯基化改性羟基磷灰石的制备方法中，步骤（2）所述巯基化的天然化合物或合成化合物的制备方法具体为：将N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐加入透明质酸钠溶液中，pH为4.75~5，反应1.5~2h后，加入半胱胺盐酸盐，pH为4.75~5；反应3~10h；透析，得到巯基化透明质酸，其中透明质酸与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺以及半胱胺盐酸盐的摩尔比为1:4~5:2:4~5。
作为可选方式，在上述巯基化改性羟基磷灰石的制备方法中，所述步骤（3）中在冰浴条件下进行酰胺化反应。
作为可选方式，在上述巯基化改性羟基磷灰石的制备方法中，步骤（3）所述巯基化透明质酸改性羟基磷灰石的制备方法为：将N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐加入到巯基化透明质酸溶液中，pH为4.75~5，反应1.5~2h后，加入氨基化羟基磷灰石，pH为5~6；反应3~10h，用去离子水反复清洗改性羟基磷灰石3次，得到改性的羟基磷灰石。
作为可选方式，在上述巯基化改性羟基磷灰石的制备方法中，所述透明质酸与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺以及半胱胺盐酸盐的摩尔比为1:4~5:2:4~5，透明质酸与氨基化羟基磷灰石的质量比为1：1~3。
本发明还提供了一种功能性的纤维化杂化凝胶，由本发明所述的巯基化改性羟基磷灰石和巯基化的天然化合物或合成化合物混合形成，所述巯基化改性羟基磷灰石与巯基化的天然化合物或合成化合物之间通过二硫键相互作用。所述凝胶能够增强骨诱导以及生物矿化性能。
作为可选方式，在上述纤维化凝胶中，所述纤维化凝胶中还包括胶原。骨骼有机物中有70%~86%为胶原，由于具有良好的生物活性以及丰富的RGD序列，将胶原与上述凝胶支架相复合可以更好地调控细胞行为，促进细胞生长，所制备的凝胶支架有望成为一种良好的骨修复材料。
作为可选方式，在上述纤维化凝胶中，所述纤维化凝胶中还包括细胞。
本发明还提供了一种上述增强骨诱导以及生物矿化性能的纤维化凝胶的制备方法，其特征在于，将巯基化改性的羟基磷灰石均匀地分散在去离子水中，随后将巯基化的天然化合物或合成化合物在上述去离子水中混合均匀后，调节pH至中性条件进行凝胶化反应。
本发明还提供了一种上述巯基化改性羟基磷灰石的应用，其特征在于，用作骨修复支架增强相或用于制备药物载体或组织工程三维细胞支架。
一种组织工程三维细胞支架，由巯基化改性羟基磷灰石、胶原、巯基化的天然化合物或合成化合物于细胞混合形成水凝胶。
一种上述组织工程三维细胞支架的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）将巯基化改性羟基磷灰石、胶原、巯基化的天然化合物或合成化合物三者按比例称重并灭菌；
（2）将巯基化改性羟基磷灰石均匀地分散在无菌的去离子水中，随后加入巯基化的天然化合物或合成化合物，胶原通过加入0.25摩尔的醋酸溶解，将三者混合均匀，然后加入细胞悬浮液混匀，调节pH值至7.0~8.0。
（3）将调节pH值后的混合溶液立即注射至生物体内的待修复部位形成水凝胶，得到组织工程三维支架，或者将混合溶液注入模具中，静置成胶，而后将所得水凝胶从模具中取出并浸没于培养基中，置于培养箱中在34~38℃、3%~5%的CO2的条件下培养至少1天，得到组织工程三维细胞支架，培养期间定期更换培养基。
作为可选方式，在上述组织工程三维细胞支架的制备方法中，所述步骤（1）中，巯基化改性羟基磷灰石、胶原、巯基化的天然化合物或合成化合物三者质量比为1~10:1~10:1~10。
作为可选方式，在上述组织工程三维细胞支架的制备方法中，所述步骤（2）中，巯基化改性羟基磷灰石的含量为1~20mg/mL，胶原与巯基化的天然化合物或合成化合物的含量分别为1~15mg/mL。
作为可选方式，在上述组织工程三维细胞支架的制备方法中，所述步骤（2）中，细胞悬液的加入量为：按照5×105~5×106cells/mL的比例向基于天然材料透明质酸/胶原的可注射纤维化水凝胶混合液中加入细胞悬液。
作为可选方式，在上述组织工程三维细胞支架的制备方法中，所述步骤（3）中，培养基是在α-MEM基础培养基的基础上加入青霉素和链霉素混合液、抗坏血酸以及胎牛血清得到，α-MEM培养基中青霉素和链霉素混合液的浓度为0.8%~1.2%，抗坏血酸的浓度为0.15%~0.25%，胎牛血清的浓度为8%~12%。
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
本发明的有益效果：
1. 本发明所述纤维化凝胶设计科学，操作简便，实现了羟基磷灰石在水相介质中的均匀分散，同时，由改性羟基磷灰石，巯基化透明质酸，胶原组成的高度交联的纤维化凝胶还可增强骨诱导性能以及生物矿化能力，是一种理想的骨修复支架材料。
2. 本发明所述巯基化改性羟基磷灰石，以羟基磷灰石浆料为原材料，进行功能化改性，由正硅酸乙酯联合3-氨丙基三乙氧基硅烷对羟基磷灰石表面接枝氨基，随后将其与巯基化透明质酸反应得到最终改性产物。透明质酸作为细胞外基质的主要成分之一，具有良好的生物相容性并且可降解，有良好的亲水性。在羟基磷灰石表面化学接枝一层巯基化透明质酸，可以实现羟基磷灰石在基体相中的均匀分散，并且与基体相有望实现二硫键相互作用，以提高二者界面结合能力。将其应用在骨修复支架材料中，例如和巯基修饰过的明胶，透明质酸，胶原。壳聚糖以及海藻酸钠等材料复合，可以实现增强相与基体相之间的有效结合，提高支架整体力学性能的同时，更有望提高组织修复的均匀性。
附图说明：
图1为实施例1中四种改性羟基磷灰石以及纯羟基磷灰石的XPS谱图。
图2为实施例1中四种改性羟基磷灰石的XPS N1s高分辨谱图。
图3为实施例1中四种改性羟基磷灰石以及纯羟基磷灰石的热重分析结果。
图4为实施例1中e产物与纯羟基磷灰石600cm-1~1600cm-1波段的红外谱图。
图5为实施例1中e产物与纯羟基磷灰石2400cm-1~3650cm-1波段的红外谱图。
图6为实施例1中四种改性羟基磷灰石以及纯羟基磷灰石的XRD谱图。
图7为实施例2中巯基化透明质酸与透明质酸的核磁氢谱。
图8为实施例3中两种改性羟基磷灰石以及纯羟基磷灰石的XPS C谱。
图9为实施例3中巯基化透明质酸改性羟基磷灰石的XPS C1s高分辨谱图。
图10为实施例3中两种改性羟基磷灰石与纯羟基磷灰石的热重分析结果。
图11为实施例3中巯基化透明质酸改性羟基磷灰石与纯羟基磷灰石的红外谱图。
图12为实施例3中两种改性羟基磷灰石与纯羟基磷灰石的XRD谱图。
图13为实施例3中两种改性羟基磷灰石与纯羟基磷灰石在去离子水中分散的大体观。途中从左至右依次为纯羟基磷灰石、硅烷偶联剂改性后的羟基磷灰石、巯基化透明质酸改性后的羟基磷灰石。
图14为实施例3中两种改性羟基磷灰石与纯羟基磷灰石的扫描电镜观察结果。
图15、16、17分别为实施例3中两种改性羟基磷灰石与纯羟基磷灰石的粒径分析结果。
图18为实施例3中两种改性羟基磷灰石与纯羟基磷灰石的Zeta电位分析结果。
图19为实施例7中纤维化凝胶的扫描电镜观察结果。
图20为实施例8中纤维化凝胶体内矿化结果。
图21为本发明所述巯基化改性羟基磷灰石的制备流程示意图。
具体实施方式：
以下通过实施例对本发明提供的功能性的纤维化杂化凝胶的制备方法及其应用作进一步说明。有必要指出，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员根据上述发明内容，对本发明做出一些非本质的改进和调整进行具体实施，仍属于发明保护的范围。
本发明实施例中透析所用的透析袋的规格为cut off MW=8000~13000。
实施例1
本实施例公开了三种氨基化羟基磷灰石制备方法，具体步骤如下：
（1）将12ml的羟基磷灰石浆料分散在100ml的乙醇/水溶剂中，加入2ml的3-氨丙基三乙氧基硅烷，pH控制在10左右，反应10~12h，随后用乙醇和去离子水各清洗三次，得到改性羟基磷灰石，这里我们记为b产物，其中乙醇和水的体积比为1:9~2~9。
（2）将2g的羟基磷灰石粉体加入到100ml无水甲苯中，其中含有2ml的3-氨丙基三乙氧基硅烷，在氮气环境下，120℃油浴反应10~12h,随后用三氯甲烷和乙醇各清洗改性后的羟基磷灰石三次，这里我们记为c产物。
（3）先将1.2ml的正硅酸乙酯在乙醇/水体系中酸性条件下水解，再将其加入含有12ml纳米羟基磷灰石浆料的100ml乙醇/水溶液中，随后加入2ml的3-氨丙基三乙氧基硅烷；反应10h-12h，用乙醇和去离子水各清洗三次改性后的羟基磷灰石，这里我们记为d产物。其中乙醇和水的体积比为1:9~2~9，正硅酸乙酯水解pH为1~2，水解时间为30min~1h
（4）将c产物在60~70℃保存2h，得到的产物我们记为e产物。
本实施例中a、b、d、e组所用的羟基磷灰石浆料固含量为1g/6ml，c组羟基磷灰石为羟基磷灰石微球颗粒（d≤25μm），a组为对照组纯羟基磷灰石。
如附图1所示，本实施例制得的四种改性羟基磷灰石N，Si，C元素均有出峰，证明硅烷偶联剂3-氨丙基三乙氧基硅烷成功的接枝在羟基磷灰石表面，另外纯羟基磷灰石的XPS谱图中也有C元素出峰是因为在合成羟基磷灰石时，环境中的CO2掺杂在其中所致。
本实施例制得的四种不同改性羟基磷灰石及纯羟基磷灰石元素含量如表1所示：
表1
Figure DEST_PATH_IMAGE005
从表1中可以看出，改性后的羟基磷灰石C元素含量均有所提高，其中N、Si、C元素含量最高的组为e产物，N/Ca比例也由0.23提高到0.63，表明第四种方法对羟基磷灰石表面修饰氨基最有效。
对b、c、d、e产物进行N 1s高分辨率XPS谱图分析，结果如附图2所示，图中四组改性羟基磷灰石中N元素都以两种形式存在，即：氨基形态（399.2±0.2ev 半波宽1.67ev）以及质子化氨基形态（401.1±0.2ev 半波宽1.95ev）,其中b产物较c、d、e产物质子化氨基含量更高，其具体含量如表2所示。
表2
Figure 995382DEST_PATH_IMAGE006
由表2所知四种改性羟基磷灰石中第四种改性方法，即e产物氨基的含量最高，是总氮含量的76.82%左右，表明采用第四种改性方法，羟基磷灰石表面的氨基更多，反应效果更好。
对b、c、d、e产物进行热重分析，结果如附图3所示，其中e产物的失重率最高，这与羟基磷灰石表面接枝的硅烷偶联剂的含量有关，表明e产物是四种改性产物中接枝量最高的，其具体含量如表3所示。
表3
Sample 质量保留分数（%） 总接枝质量分数（%）
（a）HAP 93.09 0
（b）HAP-A alcohol/water 91.91 1.18
（c）HAP-A anhydrous toluene 91.60 1.49
（d）HAP-T-A 85.74 7.35
（e）HAP-T-A 2h curing 81.30 11.79
对纯羟基磷灰石以及e改性产物进行红外分析，结果如附图4、5所示，其中我们将纯羟基磷灰石的红外谱图标记为a，e改性产物的红外谱图标记为b。由图可知，b谱线相较于a谱线在780cm-1、1377cm-1处出峰，分别代表了硅烷偶联剂上的C-H、C-N的特征峰，在2400-3600cm-1波段，b谱线相较于a谱线多了2875cm-1和2935cm-1的C-H的特征峰，表明改性羟基磷灰石e产物成功化学接枝上了硅烷偶联剂。
对四种改性羟基磷灰石进行X射线衍射分析，结果如附图6所示，四种改性羟基磷灰石以及改性原料纯羟基磷灰石浆料的XRD谱图与羟基磷灰石的标准卡片PDF#09-0432的出峰位置相一致，表明改性前后没有改变羟基磷灰石的晶体结构。
实施例2
本实施例公开了巯基化透明质酸的制备方法，具体步骤如下：
将分子量为0.01 MDa~3.0 MDa的透明质酸钠溶解于0.01~1mol/l的MES溶液中，加入N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），充分溶解，然后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（EDC•HCl），充分溶解，用0.1~1mol/L的NaOH溶液和0.1~1mol/L的HCl溶液调节混合液的pH值至4.75~5.0，在冰浴条件下反应1.5~2h。随后加入半胱胺盐酸盐在冰浴条件下反应3~10h，透析，得到巯基化透明质酸；其中，透明质酸与1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺以及半胱胺盐酸盐的摩尔比为1:4~5:2:4~5。透析袋的规格为cut offMW=8000~13000。
巯基化透明质酸的核磁谱图如附图7所示，其中巯基化透明质酸相较于透明质酸核磁图谱来说，在2.82化学位移处出现新峰，表明巯基成功接枝在了透明质酸上。接枝率在12%~70%。
实施例3
本实施例中制备巯基化透明质酸修饰羟基磷灰石的制备方法，具体步骤如下：
将制备好的巯基化透明质酸溶解于0.01~1mol/l的MES溶液中，加入N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），充分溶解，然后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（EDC•HCl），充分溶解，用0.1~1mol/L的NaOH溶液和0.1~1mol/L的HCl溶液调节混合液的pH值至4.75~5.0，在冰浴条件下反应1.5~2h，加入氨基化羟基磷灰石，pH为5~6；反应3~10h，用去离子水反复清洗改性羟基磷灰石3次，烘干得到巯基化透明质酸修饰的羟基磷灰石。其中巯基化透明质酸与N-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐以及半胱胺盐酸盐的摩尔比为1:4~5:2:4~5，透明质酸与氨基化羟基磷灰石的质量比为1:1~3。
图8为两种改性羟基磷灰石以及纯羟基磷灰石的C 1s高分辨率XPS图谱，其中a为纯羟基磷灰石，b为HAP-T-A 2h curing 即实施例1中所述的e产物，c为经巯基化透明质酸改性后的羟基磷灰石，由图可知巯基化透明质酸改性后的羟基磷灰石在288.5ev左右出有峰，证明有COOH形式或C=O形式的C元素存在。
图9为巯基化透明质酸改性后的羟基磷灰石关于XPS C1s的高分辨图谱拟合后的结果，由图可知，改性后的羟基磷灰石的C元素有C-C, C-H, C-Si (284.8ev),C-N(286.1ev),COO-,CO32-(288.5ev)几种存在形式，表明了巯基化透明质酸接枝在羟基磷灰石表面。
图10为两种改性羟基磷灰石以及纯羟基磷灰石的热重分析结果，其中a为纯羟基磷灰石，b为HAP-T-A 2h curing 即实施例1中所述的e产物，c为经巯基化透明质酸改性后的羟基磷灰石，由图可知，经巯基化透明质酸改性过的羟基磷灰石失重率最高约为77.8%，相较于实施例1中的e产物来说，失重率增加了3.5%。说明巯基化透明质酸的接枝量大概在3.5%（w/w）
图11为两种改性羟基磷灰石以及纯羟基磷灰石的红外分析结果，其中a为纯羟基磷灰石，b为HAP-T-A 2h curing 即实施例1中所述的e产物，c为经巯基化透明质酸改性后的羟基磷灰石，由图可知，c谱线于1150cm-1处出现特征峰，对应着巯基化透明质酸支链上的CH2OH官能团，另外1665cm-1、1550cm-1、1412cm-1三处出现的特征峰，对应着酰胺I带，酰胺II带，酰胺III带，表明巯基化透明质酸成功的化学接枝在羟基磷灰石表面。
图12为两种改性羟基磷灰石以及纯羟基磷灰石的X射线衍射分析结果，由图可知，两种改性羟基磷灰石的谱图结果与标准卡片的出峰位置相符合，对其改性没有改变其晶体结构。
实施例4
取相同质量的纯羟基磷灰石浆料、HAP-T-A 2h curing 即实施例1中的e产物以及巯基化透明质酸改性后的羟基磷灰石分别分散在相同体积的去离子水中，分别观察1min、5min、10min、30min、1h、2h、3h、4h的沉降情况，其大体观如图13所示，其中纯羟基磷灰石浆料、HAP-T-A 2h curing 即实施例1中的e产物以及巯基化透明质酸改性后的羟基磷灰石分散体分别为左、中、右三个瓶子，由图可知经巯基化透明质酸改性后的羟基磷灰石能够更好的分散在水溶液体系内，几乎在1h左右才会出现白色沉淀。
实施例5
将纯羟基磷灰石浆料、HAP-T-A 2h curing 即实施例1中的e产物以及巯基化透明质酸改性后的羟基磷灰石三者分别分散在去离子水中滴在硅片上在扫描电镜下的结果如图14所示，纯羟基磷灰石浆料中纳米颗粒的粒径大约为长75nm直径为25nm的短棒，随着正硅酸乙酯以及3-氨丙基三乙氧基硅烷对羟基磷灰石的改性，纳米颗粒的尺寸逐渐增大，巯基化透明质酸改性后的羟基磷灰石的粒径相较未改性的羟基磷灰石，粒径明显增大，且团聚现象明显减轻，证明经过巯基化透明质酸修饰的羟基磷灰石颗粒分散性得到了明显的提高。
实施例6
将纯羟基磷灰石浆料、HAP-T-A 2h curing 即实施例1中的e产物以及巯基化透明质酸改性后的羟基磷灰石三者分别分散在去离子水中用马尔文激光粒度仪测粒径以及Zeta电位，其结果如图15、16、17、18所示。由图可知纯羟基磷灰石浆料粒子平均直径约为531nm，HAP-T-A 2h curing 即实施例1中的e产物粒子平均直径约为718nm，巯基化透明质酸改性后的羟基磷灰石粒子平均直径约为846nm，三者的多分散系数分别为0.36、0.27、0.19。Zeta电位分别为-5.12、-9.33、-19。Zeta电位的降低是由于羟基磷灰石表面化学环境改变，正硅酸乙酯，3-氨丙基三乙氧基硅烷增加了其表面的Si-OH密度，巯基化透明质酸本身带负电荷导致羟基磷灰石表面Zeta电位下降。
实施例7
将巯基化透明质酸修饰过的羟基磷灰石，胶原，巯基化透明质酸三者按照质量比为2:1:1的比例称重并灭菌，将巯基化透明质酸修饰过的羟基磷灰石均匀地分散在去离子水中，随后加入巯基化透明质酸固体，胶原通过加入0.25摩尔的醋酸溶解，将三者混合均匀，其中巯基化透明质酸修饰过的羟基磷灰石的含量为15mg/ml, 胶原和巯基化透明质酸的含量分别为7.5mg/ml，调节pH值至7.4，最后，将水凝胶通过注射器注入模具中成型。冷冻干燥后将支架在扫描电镜下观察微观形貌，其结果如图19所示，羟基磷灰石良好的分散在基体相（巯基化透明质酸以及胶原）组成的纤维网络结构中，网络孔隙结构明显，有利于营养物质的输送以及细胞的生长。
实施例8
将巯基化透明质酸修饰过的羟基磷灰石，胶原，巯基化透明质酸三者按照质量比为2:1:1的比例称重并灭菌，将巯基化透明质酸修饰过的羟基磷灰石均匀地分散在去离子水中，随后加入巯基化透明质酸固体，胶原通过加入0.25摩尔的醋酸溶解，将三者混合均匀，其中巯基化透明质酸修饰过的羟基磷灰石的含量为15mg/ml, 胶原和巯基化透明质酸的含量分别为7.5mg/ml，加入2×106cells/mL的细胞悬浮液，调节pH值至7.4，在体外37℃条件下成胶半小时后，植入到裸鼠背部皮下，培养1个月后，将组织凝胶块取出通过Micro-CT检测组织支架在体内的矿化结果。其结果如图20所示，纤维化凝胶在体内可以实现大量且均匀的矿化，同时表明支架具有足够的骨诱导潜能。是一种理想的骨修复组织工程支架。
综上所述，本发明的巯基化透明质酸改性羟基磷灰石的方法设计科学，操作简便，实现了羟基磷灰石在水相介质中的均匀分散。此外，本发明所制备的纤维化凝胶有良好的生物相容性，还可增强骨诱导性能以及生物矿化能力，是一种理想的骨修复支架材料。
实施例9
参照实施例1-8中所述方法，其不同之处仅在于分别将透明质酸替换为羧甲基壳聚糖、明胶、胶原、海藻酸钠、硫酸软骨素、聚碳酸酯，成功制得一系列巯基化改性羟基磷灰石以及对应的骨修复组织工程支架，所得组织工程支架在体内均可以实现大量且均匀的矿化，同时表明支架具有足够的骨诱导潜能。
实施例10
参照实施例1-8中所述方法，其不同之处仅在于分别将透明质酸替换为聚胱胺酸，由于聚胱胺酸中本身还有巯基，故在对应的制备方法中省去步骤（2）制备巯基化的天然化合物或合成化合物相关步骤，成功制得对应的巯基化改性羟基磷灰石以及对应的骨修复组织工程支架，所得组织工程支架在体内可以实现大量且均匀的矿化，同时表明支架具有足够的骨诱导潜能。
上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护范围，但凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种巯基化改性羟基磷灰石，其特征在于，包括氨基化的羟基磷灰石和巯基化的天然化合物或合成化合物，所述天然化合物或合成化合物具有羧基官能团或可被修饰成羧基的官能团，所述氨基化的羟基磷灰石通过氨基与所述巯基化的天然化合物或合成化合物中带有的羧基发生酰胺反应化学结合。
2.根据权利要求1所述的巯基化改性羟基磷灰石，其特征在于，所述天然化合物或合成化合物为透明质酸、羧甲基壳聚糖、明胶、胶原、海藻酸钠、硫酸软骨素、聚碳酸酯、聚胱胺酸中的任意一种或几种。
3.根据权利要求1所述的巯基化改性羟基磷灰石，其特征在于，所述氨基化的羟基磷灰石结构式具体为：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。
4.根据权利要求1所述的巯基化改性羟基磷灰石，其特征在于，所述巯基化的天然化合物或合成化合物具体为巯基化透明质酸，其结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
。
5.根据权利要求1所述的巯基化改性羟基磷灰石的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）制备氨基化羟基磷灰石；
（2）制备巯基化的天然化合物或合成化合物；
（3）酰胺化反应：将氨基化羟基磷灰石与巯基化的天然化合物或合成化合物混合均匀反应，使巯基化的天然化合物或合成化合物自身带有的羧基与羟基磷灰石表面的氨基发生酰胺化反应。
6.一种功能性的纤维化杂化凝胶，其特征在于，由权利要求1所述的巯基化改性羟基磷灰石和巯基化的天然化合物或合成化合物混合形成，所述巯基化改性羟基磷灰石与巯基化的天然化合物或合成化合物之间通过二硫键相互作用。
7.根据权利要求6所述的纤维化杂化凝胶，其特征在于，所述纤维化凝胶中还包括胶原。
8.根据权利要求6所述的纤维化杂化凝胶，其特征在于，所述纤维化凝胶中还包括细胞。
9.一种如权利要求6所述的纤维化杂化凝胶的制备方法，其特征在于，将巯基化改性的羟基磷灰石均匀地分散在去离子水中，随后将巯基化的天然化合物或合成化合物在上述去离子水中混合均匀后，调节pH至中性条件进行凝胶化反应。
10.一种如权利要求1所述的巯基化改性羟基磷灰石的应用，其特征在于，用作骨修复支架增强相或用于制备药物载体或组织工程三维细胞支架。
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