CN105412983A - 一种纳米羟基磷灰石表面接枝rgd肽的制备方法与应用 - Google Patents

一种纳米羟基磷灰石表面接枝rgd肽的制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种纳米羟基磷灰石表面接枝RGD肽的制备方法与应用，主要包括一下步骤：1）利用硅烷偶联剂将-NH2修饰到纳米羟基磷灰石的表面；2）利用二醛基化合物将表面氨基化的纳米羟基磷灰石进行醛基化；3）利用RGD肽分子上的-NH2与醛基化的纳米羟基磷灰石反应，将RGD接枝在纳米羟基磷灰石的表面。本发明制备过程较为简单，条件温和，成本较低，且接枝效率较高，应用前景较为广阔。

Description

一种纳米羟基磷灰石表面接枝RGD肽的制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种纳米羟基磷灰石表面接枝RGD肽的制备方法与应用，属于生物医用材料技术领域。
背景技术
近年来，我国因疾病或者创伤引起的骨不连、骨缺损等，达到了数百万例，这些骨不连和骨缺损的治疗均需要使用骨植入材料。目前，临床上应用最多的还是自体骨、异体骨以及骨植入材料。自体骨具有良好的骨传导性和成骨能力，且由于是自体骨，不存在传染病的风险，是目前骨缺损移植的金标准。但是自体骨也存在着一定的缺陷，如：会造成取骨部位的畸形，增加了患者的创伤面和痛苦。异体骨不存在增加患者创伤面的问题，但是由于异体骨与患者本身的骨会存在免疫排斥反应，与患者本身的骨存在相容性的问题，会影响骨缺损的修复效果，且骨缺损移植一般会暴露骨髓，若异体骨中存在某种未知疾病，会使患者患上疾病，增加了患者的手术风险。此外异体骨的来源较为有限，且成本较高，在临床上应用也受到了限制。因此，目前来说，应用较多的还是以骨移植材料为主，以为骨移植材料相对于自体骨和异体骨来说，原料广泛，成本较低，与患者不会产生免疫排斥反应。纳米羟基磷灰石（HA）就是目前临床上应用较多的骨移植材料，HA是人体骨骼和牙齿的主要的无机成分，与骨组织具有良好的生物相容性，骨传导性，是公认的骨修复材料。但是羟基磷灰石与其他的骨移植材料都存在这一个共性的问题，那就是这些材料住具有骨引导活性，而缺乏骨诱导活性，因而在临床上不能获得令人满意的治疗效果。
精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）短肽是最小的氨基酸序列，能与整合素蛋白进行特异性的结合，从而有效的促进细胞在材料上的粘附，从而会影响细胞的增殖、分化等行为，提高材料的生物活性。因此，将RGD肽接枝到纳米羟基磷灰石上面能够有效的改善纳米羟基磷灰石的生物活性和骨诱导活性。本发明所有反应均在常温下进行，反应条件较为简单，可适用于大规模的生产，应用前景广阔。
发明内容
本发明的目的在于提供一种纳米羟基磷灰石表面接枝RGD肽的制备方法与应用。该制备方法得到的纳米羟基磷灰石接枝RGD改善了纳米羟基磷灰石骨诱导活性差的问题，提高了纳米羟基磷灰石的生物活性。该方法工艺简单，操作方便，反应周期短，且得到的材料具有良好的细胞和组织相容性，特别适用于组织工程和骨缺损修复方面的应用。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种纳米羟基磷灰石表面接枝RGD肽的制备方法，步骤如下：
（1）硅烷偶联剂在乙醇水溶液中充分水解0.5~2h，加入纳米羟基磷灰石反应6-8h，反应完成后离心回收固体物质，真空干燥后进行研磨、过筛，得到表面修饰了-NH2的纳米羟基磷灰石；
（2）将表面修饰了-NH2的纳米羟基磷灰石与浓度为0.1mol/L的二醛水溶液混合均匀，反应8-10h，反应完成后离心回收固体物质，真空干燥后研磨过筛，得到表面醛基化的纳米羟基磷灰石；
（3）配制浓度为0.1mol/L的RGD肽的水溶液，将表面醛基化的纳米羟基磷灰石加入到RGD肽的稀溶液中，反应4-6h，将反应后的产物离心、去离子水洗涤，然后冷冻干燥，研磨后即得到羟基磷灰石接枝RGD肽材料。
所述步骤（1）中的硅烷偶联剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷、3-氨丙基三甲氧基硅烷、3-氨丙基甲基二乙氧基硅烷中的一种。
所述步骤（1）中纳米羟基磷灰石与硅烷偶联剂的摩尔比为1:1-1：1.5。
所述步骤（2）中的二醛为戊二醛、己二醛、1，4-丁二醛中的一种。
所述步骤（2）中表面修饰了-NH2的纳米羟基磷灰石与二醛的摩尔比为1:1-1:1.5。
所述步骤（3）中醛基化的纳米羟基磷灰石与RGD肽的摩尔比为1:1-1:1.5；
所述的纳米羟基磷灰石接枝RGD肽在组织工程和骨修复中的应用。
本发明制备的纳米羟基磷灰石表面接枝RGD肽的优点在于：1.本发明制备的纳米羟基磷灰石接枝RGD提高了纳米羟基磷灰石的骨诱导性和生物活性；2.本发明中制备的纳米羟基磷灰石表面接枝RGD肽，后处理简单，且不会残留有机溶剂，生物相容性良好。3.本发明所使用的方法较为简单，且都是在常温下进行，反应周期短，制备效率较高，有利于工业化的生产。4.本发明所制备的纳米羟基磷灰石接枝RGD肽增加了纳米羟基磷灰石的生物活性，改善了纳米羟基磷灰石骨诱导活性差的问题。
具体实施方式
实施例1
本实施例的纳米羟基磷灰石表面接枝RGD肽的制备方法，步骤如下：
（1）将0.01mol3-氨丙基三乙氧基硅烷溶于250mL乙醇水的混合溶液中，充分进行水解0.5h，然后将0.01mol羟基磷灰石加入到混合溶液中，反应6h，然后将反应后的产物进行离心分离，50℃干燥12h，将干燥后的产物用乙醇进行洗涤，然后再将洗涤后的产物进行真空干燥（含水量<20ppm），得到表面修饰了-NH2的羟基磷灰石；
（2）配制100ml0.1mol/L的戊二醛水溶液，然后将0.01mol氨基化的纳米羟基磷灰石加入到戊二醛水溶液中，磁力搅拌8h，离心，去离子水洗涤，乙醇洗涤，真空干燥得到表面含有醛基的羟基磷灰石；
（3）配制100mL0.1mol/L的RGD肽水溶液，然后将0.01mol的醛基化的纳米羟基磷灰石加入到RGD肽水溶液中，反应4h，将反应后的产物离心、去离子水洗涤，然后冷冻干燥，研磨后即得到羟基磷灰石接枝RGD肽材料。
实施例2
本实施例的纳米羟基磷灰石表面接枝RGD肽的制备方法，步骤如下：
（1）将0.015mol3-氨丙基三乙氧基硅烷溶于375mL乙醇水的混合溶液中，充分进行水解2h，然后将0.01mol羟基磷灰石加入到混合溶液中，反应7h，然后将反应后的产物进行离心分离，50℃干燥12h，将干燥后的产物用乙醇进行洗涤，然后再将洗涤后的产物进行真空干燥（含水量<20ppm），得到表面修饰了-NH2的羟基磷灰石；
（2）配制150ml0.1mol/L的戊二醛水溶液，然后将0.01mol氨基化的纳米羟基磷灰石加入到己二醛水溶液中，磁力搅拌9h，离心，去离子水洗涤，乙醇洗涤，真空干燥得到表面含有醛基的羟基磷灰石；
（3）配制150mL0.1mol/L的RGD肽水溶液，然后将0.01mol的醛基化的纳米羟基磷灰石加入到RGD肽水溶液中，反应4h，将反应后的产物离心、去离子水洗涤，然后冷冻干燥，研磨后即得到羟基磷灰石接枝RGD肽材料。
实施例3
本实施例的纳米羟基磷灰石表面接枝RGD肽的制备方法，步骤如下：
（1）将0.012mol3-氨丙基三甲氧基硅烷溶于250mL乙醇水的混合溶液中，充分进行水解1h，然后将0.01mol羟基磷灰石加入到混合溶液中，反应8h，然后将反应后的产物进行离心分离，50℃干燥12h，将干燥后的产物用乙醇进行洗涤，然后再将洗涤后的产物进行真空干燥（含水量<20ppm），得到表面修饰了-NH2的羟基磷灰石；
（2）配制120mL0.1mol/L的己二醛水溶液，然后将0.01mol氨基化的纳米羟基磷灰石加入到戊二醛水溶液中，磁力搅拌10h，离心，去离子水洗涤，乙醇洗涤，真空干燥得到表面含有醛基的羟基磷灰石；
（3）配制100mL0.1mol/L的RGD肽水溶液，然后将0.01mol的醛基化的纳米羟基磷灰石加入到RGD肽水溶液中，反应4h，将反应后的产物离心、去离子水洗涤，然后冷冻干燥，研磨后即得到羟基磷灰石接枝RGD肽材料。
实施例4
本实施例的纳米羟基磷灰石表面接枝RGD肽的制备方法，步骤如下：
（1）将0.01mol3-氨丙基甲基二乙氧基硅烷溶于250mL乙醇水的混合溶液中，充分进行水解1.5h，然后将0.01mol羟基磷灰石加入到混合溶液中，反应6h，然后将反应后的产物进行离心分离，50℃干燥12h，将干燥后的产物用乙醇进行洗涤，然后再将洗涤后的产物进行真空干燥（含水量<20ppm），得到表面修饰了-NH2的羟基磷灰石；
（2）配制100mL0.1mol/L的1,4-丁二醛水溶液，然后将0.01mol氨基化的纳米羟基磷灰石加入到1,4-丁二醛水溶液中，磁力搅拌8h，离心，去离子水洗涤，乙醇洗涤，真空干燥得到表面含有醛基的羟基磷灰石；
（3）配制120mL0.1mol/L的RGD肽水溶液，然后将0.01mol的醛基化的纳米羟基磷灰石加入到RGD肽水溶液中，反应5h，将反应后的产物离心、去离子水洗涤，然后冷冻干燥，研磨后即得到羟基磷灰石接枝RGD肽材料。
实施例5
本实施例的纳米羟基磷灰石表面接枝RGD肽的制备方法，步骤如下：
（1）将0.015mol3-氨丙基三甲氧基硅烷溶于375mL乙醇水的混合溶液中，充分进行水解，然后将0.01mol羟基磷灰石加入到混合溶液中，反应6h，然后将反应后的产物进行离心分离，50℃干燥12h，将干燥后的产物用乙醇进行洗涤，然后再将洗涤后的产物进行真空干燥（含水量<20ppm），得到表面修饰了-NH2的羟基磷灰石；
（2）配制150mL0.1mol/L的己二醛水溶液，然后将0.01mol氨基化的纳米羟基磷灰石加入到戊二醛水溶液中，磁力搅拌8h，离心，去离子水洗涤，乙醇洗涤，真空干燥得到表面含有醛基的羟基磷灰石；
（3）配制100mL0.1mol/L的RGD肽水溶液，然后将0.01mol的醛基化的纳米羟基磷灰石加入到RGD肽水溶液中，反应6h，将反应后的产物离心、去离子水洗涤，然后冷冻干燥，研磨后即得到羟基磷灰石接枝RGD肽材料。
实施例6
本实施例的纳米羟基磷灰石表面接枝RGD肽的制备方法，步骤如下：
（1）将0.015mol3-氨丙基甲基二乙氧基硅烷溶于375mL乙醇水的混合溶液中，充分进行水解，然后将0.01mol羟基磷灰石加入到混合溶液中，反应6h，然后将反应后的产物进行离心分离，50℃干燥12h，将干燥后的产物用乙醇进行洗涤，然后再将洗涤后的产物进行真空干燥（含水量<20ppm），得到表面修饰了-NH2的羟基磷灰石；
（2）配制150mL0.1mol/L的1,4-丁二醛水溶液，然后将0.01mol氨基化的纳米羟基磷灰石加入到戊二醛水溶液中，磁力搅拌8h，离心，去离子水洗涤，乙醇洗涤，真空干燥得到表面含有醛基的羟基磷灰石；
（3）配制150mL0.1mol/L的RGD肽水溶液，然后将0.01mol的醛基化的纳米羟基磷灰石加入到RGD肽水溶液中，反应4h，将反应后的产物离心、去离子水洗涤，然后冷冻干燥，研磨后即得到羟基磷灰石接枝RGD肽材料。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (7)

1.一种纳米羟基磷灰石表面接枝RGD肽的制备方法，其特征在于步骤如下：
（1）硅烷偶联剂在乙醇水溶液中充分水解0.5~2h，加入纳米羟基磷灰石反应6-8h，反应完成后离心回收固体物质，真空干燥后进行研磨、过筛，得到表面修饰了-NH2的纳米羟基磷灰石；
（2）将表面修饰了-NH2的纳米羟基磷灰石与浓度为0.1mol/L的二醛水溶液混合均匀，反应8-10h，反应完成后离心回收固体物质，真空干燥后研磨过筛，得到表面醛基化的纳米羟基磷灰石；
（3）配制浓度为0.1mol/L的RGD肽的水溶液，将表面醛基化的纳米羟基磷灰石加入到RGD肽的稀溶液中，反应4-6h，将反应后的产物离心、去离子水洗涤，然后冷冻干燥，研磨后即得到羟基磷灰石接枝RGD肽材料。
2.根据权利要求1所述的纳米羟基磷灰石表面接枝RGD肽的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中的硅烷偶联剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷、3-氨丙基三甲氧基硅烷、3-氨丙基甲基二乙氧基硅烷中的一种。
3.根据权利要求1所述的纳米羟基磷灰石表面接枝RGD肽的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中纳米羟基磷灰石与硅烷偶联剂的摩尔比为1:1-1：1.5。
4.根据权利要求1所述的纳米羟基磷灰石表面接枝RGD肽的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中的二醛为戊二醛、己二醛、1，4-丁二醛中的一种。
5.根据权利要求1所述的纳米羟基磷灰石表面接枝RGD肽的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中表面修饰了-NH2的纳米羟基磷灰石与二醛的摩尔比为1:1-1:1.5。
6.根据权利要求1所述的纳米羟基磷灰石表面接枝RGD肽的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中醛基化的纳米羟基磷灰石与RGD肽的摩尔比为1:1-1:1.5；
7.权利要求1所述的纳米羟基磷灰石接枝RGD肽在组织工程和骨修复中的应用。
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