CN107496990A - 一种可注射的抗菌软骨修复水凝胶及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医学工程技术领域，特别是骨组织修复材料制备技术领域，公开了一种可注射的抗菌软骨修复水凝胶及其制备方法，所述的抗菌软骨修复水凝胶由以下组分按重量份数计制成：透明质酸10份、纳米羟基磷灰石0.5‑1份、抗菌肽LL‑37 0.05‑0.1份。该可注射的抗菌软骨修复水凝胶能长时间高效抗菌，具有良好的生物相容性和骨诱导修复能力，对受损骨组织的再生有明显的促进作用。

Description

一种可注射的抗菌软骨修复水凝胶及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物医学工程技术领域，特别是骨组织修复材料制备技术领域，公开了一种可注射的抗菌软骨修复水凝胶及其制备方法。
背景技术：
因外伤、感染、肿瘤或先天性疾病等原因，造成的骨缺损和骨坏死的修复一直是临床手术的一大难点。作为金标准的自体骨移植具有骨引导、骨诱导和骨再生的三大优点，但自体骨的供体受到很大的限制，同时对患者来说存在创伤大、手术时间长和风险高等问题。虽然临床上已有诸多的异体骨基质产品以及其他以羟基磷灰石、β-磷酸三钙为主要成分表的骨修复瓷粉的应用，但研究发现这些骨移植修复材料的成骨能力有限，而且同样存在来源少、可能会引入病原体等额外风险。植入的骨修复材料多数仅仅起到了骨引导作用，而且其降解速度往往与新的骨组织的生长速度不匹配，造成骨愈合延迟和骨量不足等情况。另外，市面上大部分产品多为粉末状。临床操作不方便、塑性困难，尤其对于关节受损部位或是闭合性骨损伤，其临床使用困难且修复效果欠佳。
聚合物水凝胶已经被广泛用于骨缺损修复的临床实践及相关的研究中。聚合物水凝胶所具有的高含水量的三维网格结构同细胞外基质非常相似，广泛用于药物、生长因子、活性细胞等多种成分的负载，从而在临床植入材料、载药释放、组织工程等多个领域得以广泛的应用。特别是具有良好细胞相容性的水凝胶，可以为细胞的生长和分化提供不同时间和空间的诱导信号。近年来，可注射水凝胶因其简单的操作方式及优越的性能而受到广泛的关注，特别是在体内复杂的不规则的三维环境中更显其优越性。可注射水凝胶除了能为修复部位提供物理支撑之外，还能为细胞移行和生长提供三维基质支架。
透明质酸是一种可降解生物材料，具有良好的生物相容性，其亲水性对细胞吸附、生长和分化具有重要的作用，可以作为一种临时的骨架支持和刺激新骨组织的生长，在完成一定时间的机械支撑作用后，将会逐步降解并被新生的骨组织替代。
但是现有的可注射水凝胶的力学性能不理想且普遍缺乏抗菌能力，即使是具备抗菌性能的水凝胶，其抗菌性能往往是通过添加银离子抗菌剂或是抗生素来实现，这使到水凝胶的生物安全性大大降低，而且长期使用会产生耐药性。
因此，针对上述的情况，开发出一种具有良好力学性能和抗菌性能的可注射水凝胶骨修复材料，以实现相应的微创骨修复手术，并满足临床骨科微创手术以及不规则骨缺损修复手术的需要。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术的缺陷，克服现有的骨修复材料临床操作不方便、塑性困难，以及现有的可注射骨修复材料的力学性能不足和缺乏抗菌性能的缺点，提供一种可注射的抗菌软骨修复水凝胶及其制备方法，以满足临床骨科微创手术以及不规则骨缺损修复手术的需要。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：一种可注射的抗菌软骨修复水凝胶，由以下组分按重量份数计制成：透明质酸10份、纳米羟基磷灰石0.5-1份、抗菌肽LL-37 0.05-0.1份。
优选的，所述的透明质酸的分子量为1000-1500 KDa，购于美国Sigma-Aldrich公司；所述的抗菌肽LL-37购于美国Bead Tech公司；所述的纳米羟基磷灰石的平均粒径为150-250 nm。
为实现上述目的，本发明的另一技术方案为：一种可注射的抗菌软骨修复水凝胶的制备方法，所述的制备方法通过以下步骤实现：（1）制备具有抗菌性能的透明质酸；（2）将抗菌透明质酸与纳米羟基磷灰石复合。
进一步的，所述步骤（1）的具体制备步骤如下：
S1：称取一定量的吗啉乙磺酸溶于去离子水中，配制成摩尔浓度为0.1mol/L的吗啉乙磺酸溶液，然后按摩尔比3:1（n氯化钠：n吗啉乙磺酸）加入氯化钠，搅拌至氯化钠完全溶解，得吗啉乙磺酸/氯化钠缓冲液，所得缓冲液置于2-8℃冰箱中备用；
S2：按配方比称取一定量的透明质酸，将其溶于S1所得的吗啉乙磺酸/氯化钠缓冲液中，搅拌24h配得质量浓度为2%wt的透明质酸溶液，置于4℃冰箱中备用；
S3：将1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDS）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）分别溶于S1所得的缓冲液中，配成浓度为0.8mg/mL的EDS溶液和浓度为0.4 mg/mL的NHS溶液，然后将EDS溶液和NHS溶液等体积混合即得EDS/NHS溶液，备用；
S4：将S2制得的透明质酸溶液和S3制得的EDS/NHS溶液按2:1的体积比混合，搅拌3-4h，然后按配方比加入抗菌肽LL-37，室温下搅拌24h，备用；
S5：将S4制得的混合溶液加入到透析袋中，流水透析3天，再将透析袋内的溶液置于-80℃冷冻干燥机中，冷冻干燥，即得具有抗菌性能的透明质酸。
更进一步的，所述步骤（2）的具体制备步骤如下：
S6：将S5所制得的抗菌透明质酸溶于磷酸盐缓冲溶液中，配制成质量浓度为2%的抗菌透明质酸溶液，备用；
S7：按配方比称取一定量的纳米羟基磷灰石，分散于磷酸盐缓冲溶液中，配制成质量浓度为0.1-0.2%的纳米羟基磷灰石悬浮液，然后将S1所得的抗菌透明质酸溶液与纳米羟基磷灰石悬浮液等体积混合，搅拌3-4 h，分装于灭菌注射器中，即得一种可注射的抗菌软骨修复水凝胶。
优选的，所述的吗啉乙磺酸为一水化合物，所述的透析袋其截留分子量为14000。
本发明的有益效果为：
（1）本发明以改性的透明质酸为基质，所制得的可注射抗菌水凝胶具有良好的生物相容性和骨诱导能力，可以促进成骨细胞的分化和生长，有益于骨缺损部位的修复；
（2）本发明以抗菌肽LL-37为抗菌成分，通过其肽链上的伯氨基与透明质酸钠上的羧基在EDC/NHS的条件下发生反应，将抗菌肽LL-37接枝到透明质酸的分子链上使其具用抗菌性能。通过本发明所公开的具有抗菌性能的透明质酸的制备方法，所制得的抗菌透明质酸具用高效持久的抗菌性能，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌均有较强的长效抑菌作用（接触细菌24和72小时后，抑菌率均能达95%以上）。此外，可以克服抗菌肽LL-37因突释而导致浓度过高所引起的对宿主细胞有毒性作用、发生溶血现象等不足。
（3）本发明通过将纳米羟基磷灰石与抗菌透明质酸复合制得可注射抗菌骨修复水凝胶，通过添加纳米羟基磷灰石能有效地克服透明质酸水凝胶本身力学强度不足，不具有成骨细胞的识别位点和成骨活性不足的问题，能赋予所制得的水凝胶良好的成骨能力和骨诱导能力。
附图说明
图1为实施例5实验的实施例和对比例的抗菌性能评价结果；
图2为实施例6实验的实施例和对比例与间充质干细胞（MSCS）共培养1天和7天后细胞毒性评价结果；
图3为实施例7实验的实施例和对比例的碱性磷酸酶试验结果；
图4为实施例9实验的力学性能测试结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。
实施例1
一种可注射的抗菌软骨修复水凝胶为流质凝胶状，由以下组分按重量份数计制成：透明质酸10份、纳米羟基磷灰石0.5份、抗菌肽LL-37 0.05份。
实施例2
一种可注射的抗菌软骨修复水凝胶为流质凝胶状，由以下组分按重量份数计制成：透明质酸10份、纳米羟基磷灰石0.75份、抗菌肽LL-37 0.075份。
实施例3
一种可注射的抗菌软骨修复水凝胶为流质凝胶状，由以下组分按重量份数计制成：透明质酸10份、纳米羟基磷灰石1份、抗菌肽LL-37 0.1份。
实施例4
实施例1～3任一例的一种可注射的抗菌软骨修复水凝胶，其制备方法的具体步骤如下：
1.制备具有抗菌性能的透明质酸：
S1：称取一定量的吗啉乙磺酸溶于去离子水中，配制成摩尔浓度为0.1mol/L的吗啉乙磺酸溶液，然后按摩尔比3:1（n氯化钠：n吗啉乙磺酸）加入氯化钠，搅拌至氯化钠完全溶解，得吗啉乙磺酸/氯化钠缓冲液，所得缓冲液置于2-8℃冰箱中备用；
S2：按配方比称取一定量的透明质酸，将其溶于S1所得的吗啉乙磺酸/氯化钠缓冲液中，搅拌24h配得质量浓度为2%wt的透明质酸溶液，置于4℃冰箱中备用；
S3：将1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDS）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）分别溶于S1所得的缓冲液中，配成浓度为0.4 mg/mL的NHS溶液和浓度为0.4 mg/mL的NHS溶液，然后将EDS溶液和NHS溶液等体积混合即得EDS/NHS溶液，备用；
S4：将S2制得的透明质酸溶液和S3制得的EDS/NHS溶液按2:1的体积比混合，搅拌3-4h，然后按配方比加入抗菌肽LL-37，室温下搅拌24h，备用；
S5：将S4制得的混合溶液加入到透析袋中，流水透析3天，再将透析袋内的溶液置于-80℃冷冻干燥机中，冷冻干燥，即得具有抗菌性能的透明质酸。
2.将抗菌透明质酸与纳米羟基磷灰石复合：
S6：将S5所制得的抗菌透明质酸溶于磷酸盐缓冲溶液中，配制成质量浓度为2%的抗菌透明质酸溶液，备用；
S7：按配方比称取一定量的纳米羟基磷灰石，分散于磷酸盐缓冲溶液中，配制成质量浓度为0.1-0.2%的纳米羟基磷灰石悬浮液，然后将S6所得的抗菌透明质酸溶液与纳米羟基磷灰石悬浮液等体积混合，搅拌3-4 h，分装于灭菌注射器中，即得一种可注射的抗菌软骨修复水凝胶。
实施例5
对比例：为一种可注射型抗菌骨水泥（参考公开号为CN105396178A所公开的一种可注射型抗菌骨水泥所制得）。
实验组1~3：为实施例1～3所得的一种可注射的抗菌软骨修复水凝胶，采用实施例4的方法制备而成。
将上述实施例1～3所制备的一种可注射的抗菌软骨修复水凝胶与对比例进行抗菌能力评价实验，对比实施例1~3和对比例对大肠杆菌、金黄葡萄球菌和接触24小时和48小时后的抑菌效果。实验结果如图1所示。
从图1可见实施例在与大肠杆菌接触24小时后抑菌率为96.44%（实施例1）、98.06%（实施例2）、99.77%（实施例3），而对比例为80.22%；与大肠杆菌接触48小时后抑菌率为95.04%（实施例1）、96.08%（实施例2）、96.78%（实施例3），而对比例为75.12%；
而与金黄普通球菌接触24小时后抑菌率为95.34%（实施例1）、98.88%（实施例2）、99.56%（实施例3），而对比例为90.12%；与金黄普通球菌接触48小时后抑菌率为95.55%（实施例1）、96.02%（实施例2）、96.12%（实施例3），而对比例为80.12%；
从图1可知实施例1~3均具有起效快且抑菌能力强的广谱抗菌性能，在与大肠杆菌和金黄葡萄球菌接触24小时后抑菌率均能达到95%以上，而且在48小时后实施例1~3对大肠杆菌和金黄葡萄球菌的抑菌效果均无明显下降，说明按本发明所公开的技术所制得的实施例1~3均有长效的抗菌能力。
实施例6
对比例：为一种可注射型抗菌骨水泥（参考公开号为CN105396178A所公开的一种可注射型抗菌骨水泥所制得）。
实验组1~3：为实施例1～3所得的一种可注射的抗菌软骨修复水凝胶，采用实施例4的方法制备而成。
将上述实施例1～3所制备的一种可注射的抗菌软骨修复水凝胶与对比例进行细胞毒性评价实验（按国标GB/T 16886.5-2003进行实验），对比实施例1~3和对比例对。实验结果如图2所示。
图2显示实施例1~3在与间充质干细胞（MSCS）共培养1天后其细胞相对增殖率为92.4%（实施例1）、95.22%（实施例2）、97.08%（实施例3），而对比例为91.21%，从图2可知实施例1~3和对比例的细胞毒性评级均为0级，无细胞毒性；
实施例1~3在与间充质干细胞（MSCS）共培养7天后其细胞相对增殖率均明显较阴性组要高122.55%（实施例1）、131.44%（实施例2）、158.72%（实施例3），证明采用本发明所公开的制备方法所制得的一种可注射的抗菌软骨修复水凝胶具有促进间充质干细胞（MSCS）的生长，有利于受损部位的修复。
实施例7
对比例：为一种可注射型抗菌骨水泥（参考公开号为CN105396178A所公开的一种可注射型抗菌骨水泥所制得）。
实验组1~3：为实施例1～3所得的一种可注射的抗菌软骨修复水凝胶，采用实施例4的方法制备而成。
将上述实施例1～3所制备的一种可注射的抗菌软骨修复水凝胶与对比例分别与MG-63（人成骨肉瘤细胞）进行共培养7天后对其碱性磷酸酶值进行检测，对比实验组和对比例的骨诱导能力。实验结果如图3所示。
碱性磷酸酶（alkaline phosphate ALP）是分化成骨细胞的标志物，能促进骨基质的矿化。从图3可知，与对比例相比，实施例1~3的ALP值明显较对比例要高。由此可见，本发所制备的一种可注射的抗菌软骨修复水凝胶具有较高的骨诱导能力，可以促进软骨组织的诱导再生。
实施例8
实验组1~3：为实施例1～3所得的一种可注射的抗菌软骨修复水凝胶，采用实施例4的方法制备而成。
将上述实施例1～3所制备的一种可注射的抗菌软骨修复水凝胶进行急性毒性评价和体外溶血评价已评价其生物安全性。
测试方法：
急性毒性评价方法：按GB/T 16886.11-2011《医疗器械生物学评价 第11部分：全身毒性试验》中的急性毒性检测方法进行检测。
体外溶血评价方法：将2 mL血液于1000×g离心5min，去除上层清液，加入适量PBS溶液（pH=7.4），缓慢摇匀，将红细胞清洗三次后再以1000×g离心 5 min，取下层红细胞悬液用PBS溶液配制成16%的红细胞悬浮液。取50μL上述红细胞悬浮液，分别加入1 mL蒸馏水、PBS溶液和1mg/mL的样品浸提液溶液中，分别设为阳性对照组、阴性对照组和试验组，轻轻混匀后在37℃下孵育1 h，将各组样品于1000×g离心5 min，取上清液200μL加入96孔板中，每组3个平行样，在540nm波长下测试其吸光度，重复试验3次。根据测得的吸光度，由公式（1）计算各试验的溶血率（Y）：Y(%) = （A-A0）/(A100-A0) ×100
评价结果如表1所示：
表1 急性毒性评价和体外溶血评价结果
实施例1 实施例2 实施例3
急性毒性评价 正常，无症状 正常，无症状 正常，无症状
体外溶血评价 0.64% 1.02% 0.91%
从上表结果可知，实施例1~3所制得的一种可注射的抗菌软骨修复水凝胶均无急性毒性，体外溶血均符合溶血率合格标准，证明本发明所制备的一种可注射的抗菌软骨修复水凝胶具有良好的生物安全性。
实施例9
对比例：为一种可注射型抗菌骨水泥（参考公开号为CN105396178A所公开的一种可注射型抗菌骨水泥所制得）。
实验组1~3：为实施例1～3所得的一种可注射的抗菌软骨修复水凝胶，采用实施例4的方法制备而成。
将实施例1-3和对比例加入到聚四氟乙烯磨具中制成高为3cm，直径为1.5cm的圆柱体，脱模后，于万用能测试机下测定样品的压缩强度。采用圆柱探头（100N），并以0.5mm/min的速度下降，每组样品设置5个平行组，结果如图4所示。
从图4可知本发明所制得的抗菌骨修复水凝胶相比于对比例压缩强度有一定的增强，而且随着纳米羟基磷灰石的用量的增加，其力学性能也有相应的增加。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定；对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举；凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种可注射的抗菌软骨修复水凝胶，其特征在于，所述的抗菌软骨修复水凝胶由以下组分按重量份数计制成：透明质酸10份、纳米羟基磷灰石0.5-1份、抗菌肽LL-37 0.05-0.1份。
2.根据权利要求1所述的一种可注射的抗菌软骨修复水凝胶，其特征在于，所述的透明质酸的分子量为1000-1500 KDa，所述的纳米羟基磷灰石的平均粒径为150-250 nm。
3.权利要求1或2所述的一种可注射的抗菌软骨修复水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的制备方法通过以下步骤实现：（1）制备具有抗菌性能的透明质酸；（2）将抗菌透明质酸与纳米羟基磷灰石复合。
4.根据权利要求3所述的一种可注射的抗菌软骨修复水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）的具体制备步骤如下：
S1：称取一定量的吗啉乙磺酸溶于去离子水中，配制成摩尔浓度为0.1mol/L的吗啉乙磺酸溶液，然后按摩尔比3:1（n氯化钠：n吗啉乙磺酸）加入氯化钠，搅拌至氯化钠完全溶解，得吗啉乙磺酸/氯化钠缓冲液，所得缓冲液置于2-8℃冰箱中备用；
S2：按配方比称取一定量的透明质酸，将其溶于S1所得的吗啉乙磺酸/氯化钠缓冲液中，搅拌24h配得质量浓度为2%wt的透明质酸溶液，置于4℃冰箱中备用；
S3：将1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDS）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）分别溶于S1所得的缓冲液中，配成浓度为0.8mg/mL的EDS溶液和浓度为0.4 mg/mL的NHS溶液，然后将EDS溶液和NHS溶液等体积混合即得EDS/NHS溶液，备用；
S4：将S2制得的透明质酸溶液和S3制得的EDS/NHS溶液按2:1的体积比混合，搅拌3-4h，然后按配方比加入抗菌肽LL-37，室温下搅拌24h，备用；
S5：将S4制得的混合溶液加入到透析袋中，流水透析3天，再将透析袋内的溶液置于-80℃冷冻干燥机中，冷冻干燥，即得具有抗菌性能的透明质酸。
5.根据权利要求3所述的一种可注射的抗菌软骨修复水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）的具体制备步骤如下：
S6：将S5所制得的抗菌透明质酸溶于磷酸盐缓冲溶液中，配制成质量浓度为2%的抗菌透明质酸溶液，备用；
S7：按配方比称取一定量的纳米羟基磷灰石，分散于磷酸盐缓冲溶液中，配制成质量浓度为0.1-0.2%的纳米羟基磷灰石悬浮液，然后将S6所得的抗菌透明质酸溶液与纳米羟基磷灰石悬浮液等体积混合，搅拌3-4 h，分装于灭菌注射器中，即得一种可注射的抗菌软骨修复水凝胶。
6.根据权利要求4所述的一种可注射的抗菌软骨修复水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的吗啉乙磺酸为一水化合物，所述的透析袋的截留分子量为14000。
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