EA008354B1 - Инъецируемые твердые переносчики гиалуроновой кислоты для доставки остеогенных протеинов - Google Patents

Abstract

Предлагается инъецируемая или имплантируемая стержневидная композиция для доставки остеогенных протеинов. Композиция включает в свой состав производные гиалуроновой кислоты и остеогенные протеины с возможным добавлением наполнителей и активных ингредиентов, таких как ингибитор резорбции кости. Предлагаются также способы приготовления инъецируемых стержневидных фармацевтических композиций и способы использования остеогенных композиций для лечения кости, пораженной остеопорозом и/или нарушением остеогенеза.

Description

Предмет изобретения относится к области остеогенных протеинов и фармацевтических композиций на его основе. В частности, предмет изобретения включает в себя инъецируемые или имплантируемые фармацевтические композиции, содержащие производные гиалуроновой кислоты и остеогенные протеины.

Предпосылки создания изобретения

Идиопатический остеопороз - болезнь неизвестной этиологии, характеризующаяся прогрессирующей потерей костной массы и повышенной хрупкостью костей, что приводит к заметно возрастающей восприимчивости к переломам. Остеопороз относится к числу наиболее распространенных вариантов нарушения костно-мышечных тканей, поражающих 65% женщин старше 45 лет (Ргаетег с1 а1., Микси1о5кс1с1а1 Οοηάίΐίοη ίη 1Пе Иикеб 81а1ек, Атепсап Асабету о£ ОПйораебю Зигдеоик, Рагк Кгбде, 1Ь, 1992). Из-за увеличения числа случаев заболевания остеопорозом с возрастом и доли людей преклонного возраста в общей численности населения со временем остеопороз будет становиться все более распространенным заболеванием. Остеопороз с трудом поддается локальному лечению, а средств его излечения к настоящему времени не найдено. Что наиболее важно, остеопороз сопровождается большим числом случаев заболеваемости и смертности. К числу наиболее серьезных переломов, обусловленных остеопорозом, относится проксимальный перелом бедра в области тазобедренного сустава. При общем ежегодном числе случаев таких переломов свыше 300000 наибольшая доля повреждений тазобедеренного сустава приходится на лиц преклонного возраста. Каждая из шести проживающих на Кавказе женщин получит такой перелом в течение своей жизни (Ситтшдк е! а1., Агсй 1п!ет Меб 149:2455-2458, 1989), а из достигших возраста 90 лет перелом тазобедренного сустава получит каждая третья женщина.

Из обеспеченных пациентов с переломом тазобедренного сустава, проживающих дома, примерно 20% нуждаются в разносторонней помощи в течение года или более после травмы. В этот период смертность таких больных примерно на 15% больше, чем в среднем для лиц этого возраста, что отражается на соотношении числа женщин и мужчин в этой возрастной группе (Ргаетег е! а1., см. выше). Возросшее число случаев проксимального перелома бедра, наблюдавшееся у пациентов преклонного возраста, в основном связано с уменьшенной плотностью костной ткани в этой области, а также повышенной склонностью к падениям. Чем меньше плотность костной ткани, обусловленная возрастными потерями костной массы, тем выше вероятность получения перелома тазобедренного сустава. Уменьшение плотности костной ткани в области шейки бедра на величину, соответствующую стандартному отклонению от среднего значения (8Ό), увеличивает риск получить перелом тазобедренного сустава в среднем в 2,6 раза (доверительный интервал 95% составляет 1,9-3,6). При этом для женщин с максимальным изменением плотности ткани этот риск в 8,5 раз выше, чем для женщин с минимальным ее изменением (Ситтшдк е! а1., ТПе Ьаисе! 341:72-75, 1993). Наличие соотношения между массой костной ткани в области бедра и степенью риска его перелома позволяет классифицировать пациентов по степени риска получения перелома тазобедренного сустава. Пациенты, которые имеют отклонение значения костной массы от пикового значения на величину 28Ό, рассматриваются как переступившие порог возможности перелома.

Современные методы терапии остеопороза являются системными и заключаются в применении лекарственных средств, содержащих такие соединения, как фториды, бисфосфонаты, кальцитонин, эстрогены и прогестины, тестостерон, метаболиты витамина Ό и/или кальций. В США для предотвращения перелома шейки бедра у больных остеопорозом женщин постклимактерического возраста назначаются только эстрогены и такой бисфосфонат, как алендронат. Каждый из них следует постоянно употреблять в течение нескольких лет.

В дополнение к методам лечения остеопороза необходимо иметь методы лечения или предотвращения связанных с остеопорозом переломов, например, путем назначения остеогенных протеинов. Это обусловливает потребность в безопасных и эффективных переносчиках общего применения для локального лечения костных дефектов, несмотря на большое количество известных материалов-переносчиков для доставки остеогенных протеинов и их доступность. Необходимость в разработке эффективного метода восстановления и/или лечения кости, пораженной остеопорозом или нарушением остеогенеза, и минимизации или уменьшения числа случаев перелома костей, связанных с остеопорозом, или их серьезности сохраняется, несмотря на большие затраченные усилия в этом направлении.

Краткое изложение сущности изобретения

В настоящем изобретении предлагаются инъецируемые или имплантируемые твердые композиции стержневидной формы для внутрикостной доставки остеогенных протеинов. В одном из примеров осуществления изобретения эта композиция включает в свой состав остеогенный протеин и сложные эфиры гиалуроновой кислоты. В другом примере осуществления изобретения композиция дополнительно может содержать ингибитор резорбции кости, например бисфосфонат. В еще одном примере осуществления изобретения в состав композиции могут входить один или несколько наполнителей, таких как фармацевтически приемлемая соль, полисахарид, пептид, протеин, аминокислота, синететический полимер, природные полимеры или поверхностно-активные вещества. Твердые инъецируемые или имплантируемые композиции стержневидной формы, предлагаемые в настоящем изобретении, обеспечивают пролонгированное удерживание остеоиндуктивного агента на участке введения.

В настоящем изобретении предлагаются также способы и композиции для увеличения костной мас

- 1 008354 сы и ее качества и для минимизации или уменьшения числа случаев костных переломов, связанных с остеопорозом, или их серьезности. В соответствии с этим в настоящем изобретении предлагаются способы и композиции, которые могут способствовать снижению числа случаев перелома пораженной остеопорозом или нарушением остеогенеза кости. В частности, в настоящем изобретении предлагаются способы лечения пациентов с остеопорозом или с проявлениями остеопороза либо нарушения остеогенеза. Среди предпочтительных примеров осуществления изобретения, позволяющих продемонстрировать особую его значимость, можно назвать лечение соединительных костных тканей, к которым относятся проксимальная бедренная кость (шейка бедра), проксимальная плечевая кость (верхняя часть руки), периферическая лучевая кость (лучезапястный сустав) и позвоночные костные элементы (спинной хребет), особенно позвоночные элементы.

Способ заключается в введении в участок кости с нарушением остеогенеза или с остеопорозом либо с низкими массой или плотностью костной ткани лекарственного средства в виде твердой композиции стержневидной формы, содержащей эффективное количество не менее одного активного ингредиента, который может индуцировать рост костной ткани, усиление образования костной ткани или уменьшение ее потерь в этом участке. Массу кости обычно определяют как содержание костного минерала или ВМС и измеряют ее в граммах. Плотность костной массы обычно определяют как плотность костной массы, или ΒΜΌ и выражают ее в граммах на единицу площади или в граммах на единицу объема. В одном из примеров осуществления изобретения способом введения лекарства является внутрикостная инъекция. В используемых в качестве иллюстрации примерах осуществления изобретения активным агентом служит один из протеинов (или несколько протеинов), выбранный из группы протеинов, известных как суперсемейство трансформирующих бета-факторов роста (ТСЕ-β) протеинов, выбранных в предпочтительном варианте из морфогенетических протеинов кости (ΒΜΡ), из факторов роста и дифференцировки (СЭЕ), а также из других протеинов, которые описаны в данном изобретении более подробно. Способы и композиции настоящего изобретения имеют такие достоинства, как обеспечение не систематического лечения, а локализованного лечения пораженной остеопорозом или нарушением остеогенеза кости. Преимуществом настоящего изобретения также является использование в качестве активных агентов остеогенных протеинов, которые могут быть получены с помощью рекомбинантной ДНК-технологии и, следовательно, потенциально в неограниченных количествах. К другим преимуществам способов и композиций, предлагаемых настоящим изобретением, относится возможность регенерации костной ткани, которая приводит к увеличению массы/плотности костной ткани и ее прочности и тем самым - к уменьшению серьезности заболевания остеопорозом или снижению числа случаев поражения остеопорозом и в конечном случае - числа случаев костных переломов.

В других примерах осуществления изобретения активный агент в качестве добавки к одному или нескольким протеинам из числа протеинов суперсемейства ТСЕ-β содержит один или несколько дополнительных протеинов, таких как Небдейод, Νοββίη, Сйотбш, Егахх1сб. СегЬегик, ΕοΙΙίδΙαίη. растворимые ΒΜΡ-рецепторы или другие протеины либо ингредиенты, которые будут описаны далее.

В настоящем изобретении далее предлагаются способы увеличения костной массы и ее качества и минимизации или уменьшения числа случаев или серьезности переломов, связанных с остеопорозом, путем лечения с помощью инъецируемой композиции стержневидной формы, которая содержит не менее одного остеогенного протеина, и второй композиции, содержащей эффективное количество ингибитора резорбции кости. Вторая композиция, включающая ингибитор резорбции кости, может применяться до введения остеогенной композиции, после нее или непосредственно одновременно с ней.

Помимо лечения пораженной остеопорозом кости, патентуемые композиции могут быть полезными при использовании инъецируемых составов ΒΜΡ для инъекции в суставы с целью лечения и восстановления костных дефектов, хрящевых дефектов, подавления деградации хряща и ускорения восстановления хряща. Эти составы можно также инъецировать в сухожилия, связки и/или участки их соединения с костью. Инъецируемые составы на основе ΒΜΡ могут также найти применение при лечении костной кисты, костной имплантации, лечении открытых и закрытых переломов и нарушения остеогенеза.

В одном из примеров осуществления изобретения для получения предлагаемых композиций используют процесс, включающий этапы смешивания остеогенного протеина и производного гиалуроновой кислоты для получения остеогенной смеси. Полученную остеогенную смесь затем подвергают формованию путем экструзии на воздухе или в не растворяющем ее органическом соединении (например, этаноле) и сушки. На этапе получения смеси в состав этих композиций могут быть введены ингибитор резорбции кости и/или наполнитель.

Производное гиалуроновой кислоты может представлять собой природную или синтетическую гиалуроновую кислоту либо их модификации. Гиалуроновая кислота является природным полисахаридом, содержащим чередующиеся элементарные звенья из η-ацетил-Э-глюкозамина и моносахарида Όглюкуроновой кислоты, соединенных с помощью бета-1-4-связей, и элементарных звеньев дисахарида, соединенных с помощью бета-1-3-глюкозидных связей. Гиалуроновая кислота обычно существует в виде натриевой соли и имеет молекулярную массу в диапазоне от 50000 до 8х10⁶. В качестве ингибитора резорбции кости можно использовать один из бисфосфонатов, например алендронат, цимадронат, клодро

- 2 008354 нат, ЕВ-1053, этидронат, ибандронат, неридронат, олпадронат, памидронат, резидронат, тилудронат, ΥΗ 529, золедронат и их фармацевтически приемлемыми соли, сложные эфиры и смеси. Наполнителем может служить один из реагентов, стабилизирующий и/или модулирующий выделение активных ингредиентов, такой как фармацевтически приемлемая соль, полисахарид, пептид, протеин, аминокислота, синтетический полимер, природные полимеры и/или поверхностно-активное вещество. Остеогенный протеин может быть как твердым, так и жидким, а производное гиалуроновой кислоты и наполнитель(и) могут быть твердыми. Формование может быть выполнено путем экструзии остеогенной смеси на воздухе или в этаноле; сушка может быть осуществлена на воздухе или путем замораживания. В состав препарата с непрерывным выделением активного агента может также входить ингибитор резорбции кости, например бисфосфанат.

В настоящем изобретении также предлагается способ приготовления инъецируемого препарата с непрерывным выделением активного ингредиента, который содержит этапы смешивания остеогенного протеина с гиалуроновой кислотой или материалом на основе гиалуроната для получения смеси, прессования полученной смеси для получения плотной остеогенной смеси и последующего формования этой плотной остеогенной смеси в виде твердого цилиндрического стержня, пригодного для инъекции или имплантации в тело. Этап формовки может быть выполнен путем экструзии, прессования, формования, сверления и/или резки для получения цилиндрического стержня диаметром. Инъецируемый препарат с непрерывным выделением активного агента также может содержать ингибитор резорбции кости, например бисфосфонат, и один или несколько наполнителей, таких как описанные выше.

В соответствии с настоящим изобретением инъецируемые твердые остеоиндуктивные композиции, выделяющие остеогенные протеины, могут иметь диаметр около 0,1-3,0 мм, а в предпочтительном варианте около 0,5-1,5 мм. Длина твердых стержневидных композиций может составлять около 1 мм-10 см и, в частности, около 2-5 см. Композиции в соответствии с настоящим изобретением могут иметь следующие значения отношения длины цилиндрического стержня к его диаметру: около 1000:1, 500:1, 250:1, 100:1, 50:1, 25:1, 10:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1. Предлагаемые в настоящем изобретении остеоиндуктивные композиции являются твердыми (но не хрупкими) и выдерживают нагрузку в стандартных игле или шприце и инъекцию во внутрикостный участок. Эти остеоиндуктивные композиции имеют плотность около 0,5-100% материала, а в предпочтительном варианте около 50-90%, низкую макропористость и влагосодержание, составляющее около 0,1-10,0% и, в частности, 0,1-5,0%. Количество активного ингредиента может составлять 0,01-0,90 г на 1 г переносчика и, в частности, 0,1-0,3 г. Производные гиалуроновой кислоты могут представлять собой частичные или полные сложные эфиры, степень этерификации гиалуроновой кислоты в которых составляет 50-100%.

Краткое описание чертежа

На чертеже представлен график зависимости изменения относительной степени удерживания ВМР2 (в %) для композиций на основе гиалуроновой кислоты и ВМР-2 разного состава, внутрикостно инъецированных в периферическую кость бедра кролика, от длительности эксперимента (в сутках) для пяти образцов разного состава (см. табл. 1).

Описание примеров осуществления изобретения

В соответствии с настоящим изобретением предлагаются способы и композиции для лечения пациентов с признаками остеопороза или нарушениями остеогенеза, включающими остеопоротическое поражение костной ткани. Для выявления таких пациентов могут применяться хорошо известные для этих целей методики. Среди этих методик можно назвать измерение костной массы/плотности с использованием спектрометрии двулучевого поглощения рентгеновского излучения (ΌΕΧΑ), Кйдиз е! а1., 1. Вопе & Ιοίηΐ 8игдегу, 75-В:279-287 (1992); Магке1 е! а1., Ас1а Ог11юр. 8сапб. 61:487-498 (1990); количественной компьютерной томографии (ОСТ). Ьауа1-1еап!е! е! а1., 1. Сотри! Αδδίδΐ. Тотодг., 17:915-921 (1993); Магке1, Са1с1£. Т188ие Ιη!. 49:427-432 (1991); спектрометрии однофононного поглощения, Магке1 е! а1., Са1сг£. Т188ие Ιη! 48:392-399 (1991); определения скорости пропускания УЗ колебаний (ИТУ); Неапеу е! а1., 1АМА 261:2986-2990 (1989); Ьапд!оп е! а1., С11п. Рйуз. РЬ.у8ю1. Меаз., 11:243-249 (1990); и радиографического анализа, О1иег е! а1., 1. Вопе Мт. Кез., 9:671-677 (1994). Среди других способов выявления пациентов с риском перелома костей - оценка возрастных показателей, таких как подверженность переломам или наличие перенесенных ранее переломов, связанных с остеопорозом. Рог!ег е! а1., ВМ1 301:638641 (1990); Нш е! а1., 1. С1т. 1пуез!.81:1803-1809 (1988). Указанные выше публикации включены в данное изобретение путем ссылки.

В состав предлагаемых в настоящем изобретении способов лечения входит инъекция в участок кости, пораженный остеопорозом или нарушением остеогенеза, твердой стержневидной композиции, содержащей один или несколько очищенных остеогенных протеинов, которые эффективно индуцируют образование костной ткани и/или ее сохранение, и гиалуроновую кислоту в качестве переносчика. В отличие от существующих инъецируемых препаратов, остеогенные композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, при лечении используются в твердом виде, что позволяет избежать недостатков, присущим жидким или вязким препаратам. Например, в случае применения жидких или желеобразных препаратов остеоиндуктивный агент может быть преждевременно разбавлен жидкостью до того, как будет достигнут требуемый эффект ускоренного лечения заболевания кости. Применение предлагаемых в на

- 3 008354 стоящем изобретении способов лечения позволяет избежать эффекта разбавления путем использования твердого переносчика, который медленно разлагается внутри организма и тем самым обеспечивает замедленное постоянное выделение активного(ых) ингредиента(ов). Кроме того, в отличие от жидких и вязких препаратов, которые могут мигрировать от подвергаемого лечению участка, предлагаемые в настоящем изобретении композиции остаются на этом участке и принимают участие в процессе роста кости, активно ускоряя процесс роста. Обычно композиция должна оставаться на участке после введения в течение от семи дней до шести месяцев. Если композиция преждевременно диспергируется, то желаемый эффект ускорения роста костной ткани либо совсем не достигается, либо не реализуется в заданной степени. Хотя предлагаемые в настоящем изобретении остеогенные композиции при лечении используются в твердом виде, их цилиндрическая стержневидная форма позволяет осуществлять введение в организм путем инъекции или имплантации. Кроме того, применение твердых композиций вместо жидких и вязких обеспечивает существенное снижение вероятности такого хорошо известного осложения при хирургическом вмешательстве, как эмболия, в процессе проведения внутрикостной инъекции. Возможность потенциального смещения внутрикостных фрагментов или эмболии, вызванной инъекцией под давлением больших объемов жидкого или желеобразного переносчика, уменьшается, так как доза инъекции твердого стержневидного переносчика с высокой концентрацией лекарственного препарата по объему существенно меньше, чем требуемая в случае введения аналогичной дозы в форме жидкости или геля. Для нанесения композиции на заданный участок костной ткани может использоваться любой стандартный прием, например, с помощью шприца или иглы для подкожного впрыскивания.

Предлагаемые в настоящем изобретении композиции приготавливают путем смешивания остеогенного протеина, переносчика на основе гиалуроновой кислоты и различных наполнителей в зависимости от формы гиалуроновой кислоты в исходном материале для получения вязкой жидкости/геля или пасты. Из образующейся при этом массы изготавливают цилиндрические стержни, которые затем сушат. Изготовление этих стержней можно осуществлять с помощью одного из известных методов, например формования, прессования, сверления и/или резки. Согласно предпочтительному примеру осуществления изобретения остеогенную смесь уплотняют и подвергают экструзии через поршень шприца для подкожного впрыскивания. Образующиеся при этом непрерывные цилиндрические стержни сушат при комнатной температуре и разрезают на небольшие стержни, которые могут использоваться для инъекций.

Если исходный материал гиалуроновой кислоты представляет собой гидрофобное твердое тело, например НуаШ-11®, его вначале растворяют в органическом растворителе, например в фармацевтически приемлемом Ν-метилпирролидоне (ΝΜΡ) или диметлсульфоксиде (ΌΜ8Ο), предпочтительно в ΝΜΡ. Такой раствор может содержать около 1-50 об.% гиалуроновой кислоты, в предпочтительном варианте около 5-20 об.%, а наиболее предпочтительно около 10 об.%. В этом растворе диспергируют высушенный порошок остеогенного протеина до получения концентрации около 1-50 мас.%, в предпочтительном варианте около 20 мас.%. Возможными наполнителями являются аминокислоты, сахара, соли, поверхностно-активные вещества, полимеры и т.д., добавляемые в концентрации около 1-50 мас.%, в предпочтительном варианте около 20-40 мас.%. Предлагаемые в настоящем изобретении композиции могут дополнительно содержать ингибитор резорбции кости, который может быть введен в исходную смесь на этапе получения сухого порошка или растворимой формы индивидуально или в сочетании с остеогенным протеином.

Если исходный материал гиалуроновой кислоты представляет собой гидрофильный материал, например Нуай-11р65®, то гиалуроновую кислоту можно смешивать с водным буферным раствором, в котором могут содержаться наполнители, до получения пастообразной консистенции. В таком материале концентрация гиалуроновой кислоты составляет около 1-40 об.%, в предпочтительном варианте около 530 об.%, а в наиболее предпочтительном около 15-20 об.%. В одном из примеров осуществления изобретения пастообразное вещество содержит 18,75 об.% гиалуроновой кислоты. Сухой порошок остеогенного протеина затем смешивают с пастой гиалуроновой кислоты перед изготовлением стрежневидных образцов. Исходный материал гиалуроновой кислоты также можно смешивать с водным буферным раствором, который содержит не только наолнители, но и остеогенный протеин, до получения материала пастообразной консистенции, в виде вязкой жидкости или геля. В состав композиций также может входить ингибитор резорбции кости, добавляемый на этапе сушки порошка или получения растворимой формы индивидуально или в сочетании с остеогенным протеином.

Полученный в виде пасты, вязкой жидкости или геля остеогенный материал уплотняют в цилиндрической пресс-форме, воздухо- или газопроницаемых трубках (например, из силастика или Тейои®/РЕР) или путем экструзии в таком устройстве, как шприц. При использовании шприца с помощью поршня обеспечивают достаточно высокое давление, чтобы на сухой поверхности формировать непрерывный слой пасты большой длины, если гиалуроновая кислота растворима в воде. В противном случае формируют слой геля непрерывной длины путем экструзии в среде, из которой возможна преципитация этого материала. Полученную цилиндрическую заготовку затем разрезают на отдельные секции с использованием режущего инструмента типа бритвы, скальпеля, ножа или т. п. для получения стержневидных композиций, пригодных для инъекций. Полученные таким образом композиции сушат, например, на воздухе или путем вымораживания.

- 4 008354

В настоящем изобретении дополнительно предлагается способ получения инъецируемых препаратов, непрерывно выделяющих активный ингредиент, содержащий этапы смешивания остеогенного протеина, гиалуроновой кислоты или материала на основе гиалуронана и наполнителей для получения плотной остеогенной смеси и последующей формовки полученной плотной остеогенной смеси в твердый цилиндрический стержень, пригодный для инъекции или имплантации в тело пациента.

Активный агент может быть выбран из суперсемейства трансформирующих бета-факторов роста (ΤΟΡ-β) протеинов, которое включает в свой состав активины, ингибины и морфогенетические протеины кости (ВМР). В частности, активный агент включает в свой состав по меньшей мере один протеин, выбранный из подкласса протеинов ВМР, которые имеют остеогенную активность, а также обладают свойствами активации типа роста и дифференцировки. К таким протеинам относятся ВМР-2, ВМР-3, ВМР-4, ВМР-5, ВМР-6, ВМР-7 (патенты США 5108922; 5013649; 5116738; 5106748; 5187076 и 5141905), ВМР-8 (РСТ АО 91/18098) и ВМР-9 (РСТ АО 93/00432), ВМР-10 (РСТ АО 94/26893); ВМР-11 (РСТ АО 94/26892), или ВМР-12, или ВМР-13 (РСТ АО 95/16035); ВМР-15 (патент США 5635372); или ВМР-16 (патент США 6331612). В соответствии с настоящим изобретением в качестве активных агентов могут быть полезны и другие ΤΟΡ-β-протеины, например Удт-2 Допез е! а1., Мо1. Εηάοοτίηο1. 6:1971-1968, 1992) и любой из описанных (РСТ АО 94/15965; АО 94/15949; АО 95/01801; АО 95/01802; АО 94/21681; АО 94/15966; АО 95/10539; АО 96/01845; АО 96/02559 и др.) факторов роста и дифференцировки (ΟΌΡ). Также полезными могут быть В1Р (протеин, индуцирующий образование кости) (АО 94/01557); НР00269 (заявка Японии № 7-250688); и МР52 (РСТ АО 93/16099). Раскрытие сущности всех указанных выше заявок включено в данное изобретение путем ссылки. С точки зрения настоящего изобретения наиболее предпочтительны ВМР-2, ВМР-7, ВМР-10, ВМР-12 и ВМР-13. В иллюстративном примере осуществления настоящего изобретения в качестве активного агента используется протеин ВМР-2 (последовательность которого раскрыта в патенте США 5013649), включенный в данное изобретение путем ссылки. Также могут применяться другие протеины ВМР-протеины и ΤΟΡ-β-протеины.

Для получения активного агента могут использоваться рекомбинантная технология или очистка протеиновой композиции. Активный агент, например ВМР или другой димерный протеин, может представлять собой как гомодимер, так и гетеродимер в сочетании с другими ВМР (например, гетеродимер может состоять из мономера ВМР-2 и мономера ВМР-6) или с другим представителем суперсемейства ΤΟΡ-β, например активином, ингибином и ΤΟΡ-β1 (в таком гетеродимере содержится мономер ВМР и один из представителей суперсемейства ΤΟΡ-β). Примеры таких гетеродимерных протеинов приведены в заявке на патент РСТ АО 93/09229, описание которой включено в данное изобретение путем ссылки.

Активный агент может далее содержать дополнительные компоненты, например протеины семейств Сйотбш (8аза1 е! а1., Се11, 79:779-790, 1990); Νοββίη (РСТ АО 94/05800); СегЬегиз; Ροϊΐίδίαΐίη (Рикш е! а1., Эе\. Вю1. 159:131-139, 1993); 11есСе11оу (АО 96/16668; АО 96/17924; АО 95/18856); ЕпЫеб (Аапд е! а1., 1. Вю1. СНет., 271:4468-4476, 1996). Последнее семейство протеинов и генов, которое открыто относительно недавно, характеризуется высокой гомологией по отношению к внеклеточному связующему домену протеина-рецептора. Активный агент может также включать в свой состав другие растворимые рецепторы, например усеченные (РСТ АО 95/07982). Изучение этого патента специалистом в области протеинов позволит установить, что усеченные растворимые рецепторы могут быть получены для большого числа других протеинов-рецеторов. Этому вопросу также будет уделено внимание в настоящем изобретении. Указанные выше публикации включены в данное изобретение путем ссылки.

Полезное количество активного агента определяется как эффективное для стимуляции увеличенной остеогенной активности имеющегося или инфильтрирующего прогенитора или других клеток и зависит от размера и природы излечиваемого дефекта. Обычно количество доставляемого протеина составляет около 0,1-500,0 мг (в частности, около 10-300 мг и наиболее часто около 150-250 мг) на 1 см³ требуемого материала-переносчика.

В соответствии с настоящим изобретением в состав материалов, которые могут использоваться в качестве переносчиков, входят фармацевтически приемлемые материалы, жесткость которых при смешивании с морфогенетическим протеином кости с последующей сушкой позволяет получить композицию с приемлемыми для инъекции и имплантации в участок, пораженный остеопорозом или нарушением остеогенеза, характеристиками. Внедрение морфогенетического протеина кости в твердый переносчик обеспечивает сохранение протеина в больном или пораженном участке в течение периода времени, которое достаточно для увеличения природной скорости регенеративной остеогенной активности инфильтрирующего прогенитора млекопитающих и других клеток и образования пространства, в котором возможны рост новых тканей и встраивание клеток. При использовании переносчика морфогенетический протеин кости может выделяться из больного или пораженного участка в течение такого периода времени, который соответствует оптимальному увеличению скорости регенеративной остеогенной активности клеток прогенитора. Переносчик также может быть источником остова для индуцирования новообразований в кости с серьезным поражением остеопорозом.

В используемых в качестве иллюстрации примерах осуществления изобретения семейство переносчиков содержит сложные эфиры гиалуроновой кислоты или материалы на основе гиалуронана. В на

- 5 008354 стоящем изобретении термины гиалуроновая кислота, материал на основе гиалуронана и производные гиалуроновой кислоты являются взаимозаменяемыми при обозначении гиалуроновой кислоты и ее натриевой, калиевой, магниевой, кальциевой и других аналогичных солей. После формования и сушки переносчики на основе гиалуроновой кислоты имеют пригодную для инъекций или имплантации форму в виде цилиндрического стержня, подробно описанную ниже. Такие стержни имеют достаточно высокую жесткость, позволяющую выдерживать нагрузку в стандартных игле для подкожного впрыскивания или шприце, а также инъекцию в пространство внутрикостной ткани. При этом носители на основе гиалуроновой кислоты характеризуются высокой прочностью на растяжение и низкой хрупкостью. В соответствии с настоящим изобретением твердые стержневидные композиции имеют относительно высокую плотность (30-100%) и низкие макропористость и влагосодержание.

В природе гиалуроновая кислота содержится в разных тканях, включая синовиальную жидкость, стекловидное тело, пуповину человека и петушиные гребешки, и является основным компонентом внутриклеточной матрицы соединительных тканей, таких как кожа, сухожилия, мускулы и хрящ. Гиалуроновая кислота является не только механической опорой для этих тканей, но и облегчает реализацию других важных биологических функций, включая гидратацию, смазку, клеточную миграцию и дифференцировку (см. Ва1а/5 е! а1., Сокшебск & ТоНеМек, 5(84):8-17). Гиалуроновую кислоту можно извлекать из природных тканей, таких как петушиные гребешки, или синтезировать с помощью рекомбинантной технологии. Молекулярная масса гиалуроновой кислоты, полученной из природных тканей, составляет (813)х10⁶ е.м. Как все полисахариды, гиалуроновая кислота имеет химически неустойчивую структуру и легко деградирует под воздействием физических факторов (механических, излучения) и химических реагентов. В результате обычная методика очистки приводит к получению гидролизованных фрагментов гиалуроновой кислоты с низкой молекулярной массой (Βαίαζκ е! а1., см. выше).

В настоящем изобретении под термином гиалуроновая кислота подразумевается кислотный полисахарид, содержащий Ό-глюкуроновую кислоту и остатки Ν-ацетил-Э-глюкозамина, независимо от молекулярной массы, которые представляют собой смесь фрагментов разной молекулярной массы и их производных. К производным гиалуроновой кислоты могут быть отнесены ее химические модификации, полученные путем этерификации, сшивания, сульфирования и другими методами. Гиалуроновая кислота может быть в виде сложного эфира, например метилового (см. Καηίοζ е! а1., Ι.ΒίοΙ. Сйет., 186:495-511, 1950; Еще г е! а1., 1. Вас!етю1о§у 1065-167; Вюсйет. 1., 167:711-716, 1977; Καηίοζ е! а1., 1. Βίο1. Сйет. 194:141-150, 1952; 1еап^ е! а1., НеКейса СЫтюа Ас!а, 35:262-271, 1952).

В используемом в качестве иллюстрации примере осуществления изобретения гиалуроновая кислота представлена в виде ее сложного эфира с алифатическим, ароматическим, ароалифатическим, циклоалифатическим или этероциклическим спиртом. В такой кислоте все карбоксильные группы или их часть этерифицированы (см. патент США № 5336767, включенный в данное изобретение путем ссылки полностью).

Исходными материалами для получения гиалуроновой кислоты могут быть описанные в совместно рассматриваемой заявке США № 09/687283, поданной 13 октября 2000 г., которая включена в данное изобретение путем ссылки. В частности, исходными для получения материалов на основе гиалуронана являются твердые материалы, такие как нетканые прокладки, войлочные, слоистые, порошковые, пористые материалы и микросферы из материала с торговой маркой НуаГГ®, разработанного итальянской фирмой Р1б1а Абуапсеб Вюро1утет8, АЬапо Тегте. Такие материалы (см. патенты США №№ 4851521, 5965353 и 5202431 и ЕР 0216453, включенные в данное изобретение путем ссылки) представляют собой сложные эфиры гиалуроновой кислоты, имеющие одну или несколько эфирных групп (например, бензил, этил, пропил, пентил или молекулы большего размера, такие как гидрокортизон и метилпреднизон), а также разные степени этерификации, т.е. являющиеся полными или частичными эфирами. Частичные эфиры материалов НуаГГ® в обозначении содержат указание на процент этерификации в диапазоне 5099%, например НуаГГ-11р65© и НуаГГ-11р80®, чем отличаются по обозначению от эфиров, имеющих 100%-ную этерификацию гиалуроновой кислоты НуаГГ-11®. Материалы НуаГГ® не только удобны в обращении, но и позволяют управлять биодоступностью активного(ых) ингредиента(ов) и их кинетикой абсорбции (см. патент США №№ 6339074, 6232303 и 6066340, которые все включены в данное изобретение путем ссылки полностью).

В другом иллюстративном примере осуществления изобретения в качестве исходных материалов на основе гиалуронана применяются нетканые материалы, состоящие из смеси волокон сложных эфиров гиалуроновой кислоты и природных полимеров, полусинтетические производные природных полимеров и/или синтетические полимеры. В состав таких смесей может входить около 1-100% гиалуроновой кислоты. В качестве природных полимеров пригодны без ограничения коллаген или его совместные преципитаты с глюкозаминогликанами; целлюлоза; полисахариды (например, хитин, хитозан, пектин или пектиновая кислота, агар-агар, агароза, ксантан в виде смолы, геллан, альгиновая кислота или ее соли, полиманнан или полигликаны); крахмалы и натуральные смолы. Среди полисинтетических производных природных полимеров, пригодных для реализации настоящего изобретения, можно назвать природные полимеры, такие как коллаген, который соединен с помощью поперечных связей с альдегидами или их исходными соединениями, дикарбоновыми кислотами или их галоидными производными, диаминами,

- 6 008354 производными целлюлозы, альгиновой кислотой, крахмалом, гиалуроновой кислотой, хитином или хитозаном, агар-агаром, гелланом, ксантаном, пектином или пектиновой кислотой, полигликанами, полиманнаном, агарозой, натуральными смолами и гликозамигликанами. Синтетические полимеры могут включать в свой состав полимер молочной кислоты, полигликолевую кислоту, полидиоксаны, полифосфазины, полисульфоны, полиуретаны, а также их сополимеры и производные. Примеры нетканых материалов и способ их изготовления в соответствии с настоящим изобретением описаны в патенте США № 5520916, выданном 28 мая 1996 г., который включен в данное изобретение путем ссылки.

Остеогенные свойства протеинов суперсемейства ТСР-β хорошо известны, однако, в недавних публикациях указывается, что локальное применение некоторых остеоиндуктивных агентов, таких как ВМР2, стимулирует переходные процессы расчленения костной ткани на участке введения лекарства. Индуцированная введением ВМР реакция, протекающая в костном новообразовании, получила название явление переходной резорбции.

Агенты, известные как ингибиторы костной резорбции, могут играть важную роль в торможении или уменьшении степени исходной костной резорбции, связанной с локальным применением ВМР, без подавления последующего процесса формирования костной ткани. Клинические исследования показали, что терапия с использованием бисфосфоната приводит к резкому снижению показателей смещения кости, увеличению плотности минерала костной ткани и снижению вероятности риска перелома шейки бедра и спинного хребта для женщин, страдающих нарушением остеогенеза (см. Р1ещсй Η., Вйр1ю5р11опа1е5 ίη Вопе ЭБеа^е. Ргот Тйе ЬаЬота1оту ίο Тйе Райей, 3тй Ей., Раййепоп РиЫщЫпд, 1997, включенный в данное изобретение путем ссылки полностью). Так, в одном из примеров реализации изобретения бисфосфонат в качестве ингибитора резорбции кости вводят совместно с остеоиндуктивным агентом для предотвращения или минимизации первоначальной резорбции кости, связанной с внутрикостным введением ВМР. Этот реагент блокирует фазу нежелательной резорбции при сохранении возможности возникновения эффекта нарастания костной ткани.

Несмотря на терапевтические преимущества бисфосфонатов, они плохо адсорбируются в желудочно-кишечном тракте при пероральном приеме. Для преодоления этой плохой биодоступности бисфосфонатов использовали внутривенное введение лекарства, однако, как было показано, такой способ лечения является дорогостоящим и неудобным из-за его длительности и необходимости частого использования инъекций. В настоящем изобретении этот недостаток преодолевается путем введения бисфосфоната в переносчик, который локально доставляется непосредственно на заданный участок.

В одном из примеров использования настоящего изобретения ингибитор резорбции кости вводят в инъецируемую остеоиндуктивную композицию в качестве второго активного ингредиента. Перед проведением этапов формования и сушки такой ингибитор резорбции кости можно смешивать с остеогенным протеином, переносчиком на основе гиалуроновой кислоты и/или наполнителем(ями). Полученную окончательную смесь можно подвергать экструзии на воздухе или в среде, не являющейся ее растворителем.

В другом примере использования настоящего изобретения ингибитор резорбции кости применяют последовательно или одновременно с остеогенной композицией. В соответствии с этим примером, эту остеогенную композицию можно вводить локально в заданную область с целью выращивания костной массы или восстановления ее пораженных участков с либо одновременным, либо последовательным введением ингибитора резорбции кости в отдельных средствах доставки. Так, инъекцию или имплантацию ингибитора резорбции кости можно проводить непосредственно в излечиваемый участок, например, путем инъекции или хирургической имплантации в непрерывно выделяющий остеогенный протеин переносчик. Им может быть любой фармацевтически приемлемый переносчик, широкая гамма которых хорошо известна и легко доступна в этой области (см. Матйп Е.^, РетищЮп'х Рйаттасеийса1 8с1епсе§, Маск РиЬ.Со., современная редакция, включено в данное изобретение в качестве ссылки). Предпочтительным видом переносчика является непрерывно выделяющий остеогенный протеин переносчик, к наиболее предпочтительным относятся описанные в настоящем изобретении сложные эфиры гиалуроновой кислоты или материалы на ее основе, которым придают форму стержневидных образцов.

Используемый в настоящем изобретении термин подавление резорбции кости означает предотвращение потери костной массы, особенно подавление удаления фрагментов существующей кости путем непосредственного или косвенного изменения формирования остеокласта либо активности этого процесса. Таким образом, используемый в настоящем изобретении термин ингибитор резорбции кости относится к реагентам, которые предотвращают или подавляют потерю костной массы путем непосредственного или косвенного изменения формирования остеокласта или активности этого процесса.

Применяемый в настоящем изобретении термин бисфосфонат относится к бисфофоновой кислоте и ее солям, а также различным кристаллическим и аморфным формам бисфосфонатов. В одном из вариантов примера использования настоящего изобретения бисфосфонат выбирают из группы, в состав которой входят алендронат, цимадронат, клодронат, ЕВ-1053, этидронаты, ибандронат, неридронат, олпадронат, памидронат, ризедронат, тилудронат, ΥΗ 529, цолендронат, а также их фармацевтически приемлемые соли, сложные эфиры, кислоты и смеси.

Использование ингибитора резорбции кости в количестве, которое обеспечивает эффективное пре

- 7 008354 дотвращение или подавление потерь исходной костной ткани, обычно связано с локальным применением ВМР путем непосредственного или косвенного изменения формирования остеокласта или активности этого процесса. Точная необходимая доза ингибитора зависит от размера и природы излечиваемого дефекта, а также количества доставляемого остеогенного реагента. Обычно количество фосфоната составляет около 1-3000 мг, в частности около 10-1000 мг и как пример около 100-500 мг на 1 см³ общего количества материала. Ингибитор обычно вводят локально внутрикостно, но для систематической доставки его можно вводить внутримышечно или подкожно.

Согласно настоящему изобретению целесообразно использовать дополнительные добавки или наполнители, к которым без ограничений относятся фармацевтически приемлемые соли, полисахариды, пептиды, протеины, аминокислоты, синтетические полимеры, природные полимеры и/или поверхностноактивные вещества. Такие наполнители хорошо известны и используются при изготовлении препаратов для стабилизации и/или модуляции выделения активного(ых) ингредиента(ов). Примеры таких полимеров описаны в патенте США № 5171579, полное описание которого включено в данное изобретение путем ссылки. Из синтетических полимеров или поверхностно-активных веществ без ограничений пригодны плюрониксы, такие как гель Ро1охатег 407, которые представляют собой класс растворимых в воде блочных сополимеров поверхностно-активных веществ типа АВА, обладающих уникальным свойством обратимого термического гелеобразования. Из других синтетических полимеров можно использовать полиактиды и полиэтиленгликоли, включая поли(лактид)/поли(этиленгликоль), поливинилпирролидон (РУО), поли(этиленгликоль), оксид полиоксиэтилена, полимер карбоксивинила и поливиниловый спирт. Из природных полимеров без ограничений можно применять алгинат натрия, хитозан, коллаген, желатин, гиалуронан и различные целлюлозы, например гидроксицеллюлозы. Из других пригодных к использованию наполнителей можно отметить пептиды, протеины и аминокислоты.

В одном из примеров осуществления настоящего изобретения наполнитель представляет собой порошок, который затем смешивают с активным(и) агентом(и) с образованием растворимого в органическом растворителе материала Нуа!Т-11® и подвергают экструзии в этаноле (не являющемся растворителем) для получения стержневидных образцов, которые затем промывают и сушат. Окончательная композиция может содержать один или комбинацию наполнителей, из которых предпочтительны какая-либо соль, сахар (например, сахароза) и/или аминокислота (например, глицин и/или глютаминовая кислота). В состав таких композиций могут входить около1-60 мас.% аминокислоты, около 1-60 мас.% сахара и около 1-60 мас.% синтетического полимера. В другом примере осуществления настоящего изобретения препарат содержит около 20-50 мас.% аминокислоты и/или около 5-50 мас.% сахара и/или около 20-50 мас.% синтетического полимера.

В соответствии с настоящим изобретением инъекцию композиций можно осуществлять любым клинически приемлемым способом, например, с помощью различных имеющихся в продаже шприцов. К ним относятся шприц марки Са1а§ер® (18 Иеи1а1 МашГасФтшд, КтбдейеИ СТ), содержащий стерильную пасту гидроксида кальция в изотоническом солевом растворе, который находится в патроне шприца, работающего без отсасывания или с модифицированным отсасывающим картриджем; отсасывающий шприц марки Непке-1ес1® и зубные шприцы/иглы марки Нуро® (8ιηί11ι & Ыерйете МРЬ, РтапкИп Рагк, II); иглы для внутрикостной инъекции (МРЬ, 1пс., СЫсадо 1Ь); и шприцы марки Тиет-Ьок® (Вес1оп Эккшзоп, Ртапкйп Ьакек, N1). Можно также использовать любые шприцы, которые позволяют размещать и подавать инъецируемый стержневидный образец композиции и/или осуществлять экструзию с обтуратором.

В одном из примеров осуществления настоящего изобретения твердые композиции стержневидной формы вводят внутрикостно с использованием иглы для подкожного впрыскивания соответствующего размера, которая подкожно или путем оперативного вмешательства предварительно размещена в выбранном участке тела. Подкожное размещение иглы для подкожного впрыскивания можно осуществлять путем ручной пальпации известных анатомических ориентиров с использованием флуороскопии для визуализации участка размещения иглы или без нее. Флуороскопия может также применяться в сочетании с имплантацией композиции оперативными методами до размещения иглы и/или одновременно с ним.

В одном из иллюстративных примеров реализации настоящего изобретения используют направляющую нить (обычно называемую к-нитью), которая вводится подкожно в заданный участок тела и служит направляющей для иглы для подкожного впрыскивания, располагаемой поверх этой нити и удаляемой после введения иглы. После этого в игле со стороны поршня размещают твердую стержневидную композицию, вводят в нее вторую к-нить, которая находится на кончике иглы перед твердой композицией. После осуществления впрыскивания иглу удаляют, а остающаяся к-нить фиксирует композицию на требуемом участке кости. После этого нить удаляют. В другом примере реализации настоящего изобретения предварительное размещение твердой стержневидной композиции осуществляют внутри полости иглы. После введения иглы в заданный участок тела плунжер шприца, размещенный в полости иглы, удаляют, в результате чего твердая стрежневидная композиция остается на этом участке.

В одном из примеров реализации настоящего изобретения при лечении остеопороза в качестве остеоиндуктивного агента используют морфогенетические протеины кости. Тех пациентов, которым такое лечение может пойти на пользу, можно выявить с применением одной из стандартных методик, вклю

- 8 008354 чающих в свой состав измерение массы/плотности кости с помощью спктрометрии двулучевого поглощения рентгеновского излучения (ΌΕΧΑ), количественной компьютерной томографии (ОСТ), спектрометрии однофононного поглощения, измерения скорости пропускания УЗ колебаний и/или радиографического анализа. Применение таких методик обеспечивает клинициста информацией относительно расположения пораженных остеопорозом или нарушением остеогенеза участков костной ткани и серьезности этих нарушений. Помимо выяснения местоположения пораженных болезнью участков, клиницист может использовать такую информацию для выбора вида лечения и дозы выделяемого остеоиндуктивного агента для данного пациента.

В другом примере реализации настоящего изобретения морфогенетические протеины кости использованы в качестве остеоиндуктивного агента в процессе, известном как остеогенез с дистракцией. Этот процесс является альтернативным процессу регенерации сегментной костной ткани, протекающему при имплантации остеоиндуктивных агентов. При традиционном восстановлении сегментной костной ткани остеоиндуктивный агент вместе с его переносчиком размещают в дефектной области между концами родительской кости. Для реализации процесса формирования костной ткани остеоиндуктивный агент должен оставаться в области дефекта в течение достаточно длительного периода времени, чтобы стимулировать дифференцировку достаточно большого числа клеток, образующих костную ткань, и поддержать формирование новой костной ткани. При протекании процесса остеогенеза нарушенного участка создается обновленная конструкция между концами нарушенной родительской кости. Такая конструкция имеет высокий уровень васкуляризации и содержит большое количество стволовых клеток, которые предназначены для превращения в формирующие костную ткань клетки. В результате обновленная конструкция представляет собой более подходящую окружающую среду для факторов роста и дифференцировки и клеток, например гйВМР-2, что обеспечивает более быструю индукцию костной ткани, чем при индукции сегментного дефекта.

Процесс остогенеза с дистракцией имеет начальный скрытый период. В течение этого периода происходит образование волокнистых соединений между концами поврежденной кости, которые будут подвергаться растяжению. По завершении скрытого периода концы кости пациента медленно стягивают с контролируемой скоростью порядка 1 мм в сутки в больничных условиях. После того как образована обновленная конструкция и концы кости растянуты до соответствующей длины, требуется длительный период их объединения для восстановления формы кости, который может составлять 4-6 месяцев и связан с высоким уровнем заболеваемости. Одним из частых осложнений является инфекция соединительного канала, обусловленная необходимостью длительного использования внешнего фиксирующего устройства, с помощью которого осуществляли растяжение. Кроме того, наличие внешнего фиксирующего устройства в течение длительного периода времени существенным образом влияет на физиологические процессы в организме пациента и стиль его жизни. Помимо этого, у ряда пациентов регенерация кости не протекает должным образом, и соединение участков происходит с задержкой или вообще не происходит. Так как регенированный участок содержит необходимое количество требуемых для остеогенеза клеток и характеризуется высоким уровнем васкуляризации, применение морфогенетических протеинов кости может привести к быстрому ускорению процесса формирования кости с нормальной продолжительностью фазы объединения участков кости. Возможности ускорения фазы растяжения участков кости ограничены растяжением связанных с костью мягких тканей. Созданные в процессе остеогенеза с дистракцией клетки можно собрать и использовать их далее в качестве источника для остеогенеза. Эти клетки можно культивировать для приготовления группы клеток, сохраняющих живучесть. В случае необходимости эти клетки также можно сделать иммунотолерантными с использованием таких реагентов, как рецепторы СТЬА4 (патент США 54343131) или лиганды СТЬА4 либо моноклональные антитела В7 (АО 96/40915). В указанных выше ссылках рассматриваются способы и материалы для реализации такой иммунотолерантности, а также вопросы совместной трансфекции или обработки с использованием этих факторов. Полное описание этих патентов включено в данное изобретение путем ссылок.

Помимо лечения остеопороза и закрытых переломов, стержневидные композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, могут также найти применение при лечении других поражений костной ткани, например костных кист или дефектов. Инъецируемые твердые композиции можно также применять для лечения не содержащих кости участков тела пациента, например сухожилий, поврежденной хрящевой ткани, связок и/или областей их присоединения к кости.

Рассмотренные выше вопросы предполагают применение единственной остеоиндуктивной композиции, однако, настоящее изобретение допускает совместное использование нескольких активных ингредиентов в индивидуальных препаратах, например, описанных выше композиций на основе бисфосфонатов. Несколько активных ингредиентов можно вводить одновременно или последовательно с использованием раздельных средств доставки, а также индивидуально либо совместно.

Дозировка композиций будет определяться клиническими показаниями, а также различными характеристиками пациента (массой, возрастом, полом) и клиническими параметрами пораженного участка (например, его размером и положением).

Предлагаемые в настоящем изобретении композиции обеспечивают терапевтически эффективные количества остеоиндуктивного протеина, который должен быть доставлен в пораженный участок, где

- 9 008354 требуется формирование хряща и/или кости. Они могут применяться вместо пересадки живой ткани в свежих и не заживших переломах, при размягчении позвоночника и восстановлении дефектной кости в ортопедической практике; в операциях по челюстной/челюстно-лицевой реконструкции; для реконструкции кости при остеомиелите и в стоматологии для заращивания альвеолярных канавок, дефектов околозубной ткани и углублений после удаления зубов. При лечении остеомиелита или восстановлении кости с минимальным уровнем инфекции остеогенный протеин можно использовать в сочетании с антибиотиками. Антибиотик выбирают с учетом его эффективности для снижения уровня инфекции при обеспечении минимального отрицательного влияния на процесс формирования кости. Предпочтительно использование с этой целью таких антибиотиков, как ванкомицин и гентамицин. Антибиотик может иметь любую фармацевтически приемлемую форму, например, в виде растворов гидрохлорида вантомицина или сульфата гентамицина с концентрацией около 0,1-10,0 мг/мл. Стандартные требования к фармацевтическим формам (отсутствие пирогенных компонентов, соответствующие значения рН и изотоничности, стерильность и т.д.) хорошо известны специалистам в данной области и применимы к композициям, представленным в настоящем изобретении.

Твердые стержневидные композиции, предложенные в настоящем изобретении, могут также применяться в сочетании с другими лекарственными средствами, стимуляторами роста, пептидами, протеинами, цитокинами, олигонуклеотидами, десенсибилизированными олигонуклеотидами, ДНК и полимерами. Такие соединения можно вводить в виде смеси с переносчиком на основе гиалуроновой кислоты или путем образования ковалентных связей с такими переносчиками. Композиции на основе гиалуроновой кислоты могут также использоваться с ДНК-кодированием для получения ВМР и клеток, преобразованных или зараженных ВМР-протеинами с генным кодированием.

Ниже приводятся некоторые иллюстративные примеры осуществления настоящего изобретения, которые ни в коей мере не являются его ограничением. Возможны модификации, различные варианты и небольшие усовершенствования в пределах существа изобретения.

Пример 1. Препараты стержне видной формы на основе Нуа££-11.

Проведены эксперименты по определению времени удерживания рекомбинантного морфогенетического протеина кости человека (г11ВМР-2) и эффективности препарата для формирования костной ткани при инъекции препаратов НуаГГ-111 диаметром 1 мм на основе сложного эфира гиалуроновой кислоты с 100%-ной степенью этерификации в качестве переносчика. Использовали стержне видные композиции, содержащие материал Нуа££-11® на основе гуалуронана в качестве переносчика, две дозы (см. таблицу) гйВМР-2 в качестве активного ингредиента и разные количества наполнителей для модуляции кинетики выделения активного ингредиента. Наполнителем служили сухие порошки эфира глютаминовой кислоты и буферные соли. Буферные соли содержали 0,5% сахарозы, 2,5% глицина, 5 мМ Ь-глютаминовой кислоты, 5 мМ ΝηΟΊ и 0,01% полисорбата 80. Для формовки стержневидных образцов из композиций на основе Нуа££-11® использовали процесс с фазовой инверсией. Для этого смесь гйВМР-2 и наполнителей (глютамат и буферные соли) растворяли в органическом растворителе, например в Ν-метилпирролидоне (ΝΜΡ), подвергали экструзии в раствор этанола с использованием шприца и катетера (например, № 16) и фазовой инверсии в течение 1 ч, промывали и сушили (24 ч сушки на воздухе с последующей лиофильной сушкой). Экструзию осуществляли с помощью всасывающего насоса со скоростью 0,2 мл/мин. Были приготовлены следующие композиции на основе НуаГГ-11®: Нуа££-11®, 20 мас.% гйВМР-2 и 40 мас.% глютамата (т.е. 40/40/20 (мас.%) Нуа££-11®)/глютамат/г11ВМР-2; Нуа££-11®, 60 мас.% гйВМР-2/буферные соли (т.е. 40/60 (мас.%) Нуа££-11®)/г11ВМР-2; и Нуа££-11®, 20 мас.% гйВМР-2 и 20 мас.% буферные соли (т.е. 60/20/20 (мас.%) НуаГГ-11®)/буферные соли/г11ВМР-2. Образцы с высокими дозами ГЙВМР2 получали с использованием процесса обессоливания протеина, который проводили до приготовления смеси с Нуа££-11. После сушки стержневидные образцы разрезали на сегменты длиной 1 или 2 см. Теоретические дозы ВМР-2 в стержнях показаны в таблице. При применении препарата предпочтительно использовать иглу для подкожного впрыскивания 16 номера, снабженную обтуратором, что позволяет осуществлять инъекцию стержневидных образцов во внутрикостную ткань.

Таблица Дозы гйВМР-2 для инъецируемых препаратов стержневидной формы на основе Нуа££-11®

Теоретическая доза

Состав препарата, мас.% (мкг ΒΜΡ-2/мг) (мг ΒΜΡ-2/см)

40/40/20 НуаГГ-11 ®/Г лютамат/гЬВМР-2	200	1,5
40/60 Нуа£Г-11®/гйВМР-2	71	0,5
60/20/20 НуаГГ-11 ©/буферные соли/гйВМР-2	200	1,3
80/20 НуаГГ-11р65®/гйВМР-2	200	1,2
60/40 НуаГ£-11р65®/гЬВМР-2	400	2,4

- 10008354

Пример 2. Препараты стержневидной формы на основе НуаГГ-11 р65®.

Аналогичные исследования проводились с использованием стержневидных композиций на основе НуаГГ-11р65 с 65%-ной этерификацией гиалуроновой кислоты и двух разных доз тйВМР-2 в качестве активного ингредиента (см. таблицу). Были приготовлены следующие композиции на основе НуаГГ11р65®: 20 мас.% гЬВМР-2 (т.е. 80/20 (мас.%) НуаГГ-11р65®)/тйВМР-2) или 40 мас.% гЬВМР-2 (т.е. 60/40 (мас.%) НуаГГ-11р65®)/тйВМР-2). Образцы диаметром 1 мм получали путем смешивания обессоленного тйВМР-2 и нетканых образцов НуаГГ-11р65® в сухом виде с последующей гидратацией до концентрации 18,75 мас.% по нетканому материалу, полученную смесь пастообразной консистенции переносили в шприц, проводили экструзию через катетер № 16 и последующую сушку. В качестве возможного метода получения препарата использовали сушку вымораживанием при температуре -80°С или в жидком азоте, размещение стержневидного образца в катетере большего диаметра (например, № 14) и проведение двухэтапной сушки (24 ч сушки на воздухе и 24 ч сушки лиофилизацией). Другой способ получения композиции стержневидной формы включает формование пасты НуаГГ-11р65® в ампуле из силастика или тефлона ТеДои®/БЕР с внутренним диаметром 1,5 мм с последующей сушкой. При применении препарата предпочтительно использовать иглу для подкожного впрыскивания, снабженную обтуратором, что позволяет осуществлять инъекцию стержневидных образцов во внутрикостную ткань.

Пример 3. Характеристики, полученные в экспериментах ίη νίΐτο.

Все стержневидные композиции представляли собой жесткие прямоугольные удобные в обращении образцы, пригодные для инъекций с использованием иглы № 16. Согласно данным исследований с помощью растрового электронного микроскопа, композиции на основе НуаГГ-11® обычно представляют собой твердое тело с высокой плотностью и гладкой поверхностью, в то время как композиции на основе НуаГГ-11р65® являются плотноупакованными волокнистыми сегментами малой длины, состоящими из природных нетканых волокон. Биоактивность тйВМР-2, экстрагированных из этих композиций, оценивали по возможности образования щелочной фосфотазы (признак формирования костной ткани) в основных клетках ^-20-17 мышей. Обнаружена биоактивность тйВМР-2, экстрагированного как из композиций НуаГГ-11®, так и из композиций НуаГГ-11р65®.

Пример 4. Характеристики локального биораспределения, полученные в экспериментах ίη νίνο.

В экспериментах использовали композиции на основе НуаГГ-11® и НуаГГ-11₃65®, описанные в примерах 1, 2. Значения времени локального удерживания тйВМР-2 определяли по ¹²⁵1 с помощью гаммасцинтиллятора на подопытных кроликах путем инъекции композиции внутрикостно в периферическую бедренную кость. Полученные результаты представлены на чертеже. Как видно из этого чертежа, композиции на основе НуаГГ-11® характеризуются медленным непрерывным выделением тйВМР-2, независимо от дозы ВМР-2 и используемого наполнителя. Стерилизация глютамата с помощью оксида этилена обеспечивала несколько более интенсивное его выделение в течение первых трех суток по сравнению со стерилизацией гамма-излучением. Наилучшая кинетика выделения тйВМР-2 получена для образца с составом 80/20 (мас.%) НуаГГ-11р65®/тйВМР-2.

Пример 5. Эффективность препарата и его биосовместимость.

Композиции на основе НуаГГ-11®, полученные описанным выше способом, подвергали испытаниям на биосовместимость и эффективность формирования костной ткани в течение двух недель с использованием подкожного введения в брюшину и грудную клетку и внутрикостного введения в периферическую бедренную кость образцов длиной 10 и 2 мм соответственно, подопытным крысам. Радиографический и гистологический анализ участков с подкожным введением инъекций продемонстрировали формирование костной ткани в прилегающих к композициям областях и, следовательно, подтвердили остеоиндуктивные свойства препарата (данные не показаны). И при внутрикостном, и при подкожном введении препарата обнаружена минимальная воспаленность инъецированных участков, что свидетельствует о хорошей биосовместимости композиций, содержащих гиалуроновую кислоту и ВМР-2. Композиции НуаГГ-11® и НуаГГ-11р65® дополнительно вводили в периферическую бедренную кость кролика. Через 7 недель обнаружено заметное костное новообразование в участке внутрикостной инъекции с помощью гистологического анализа (данные не показаны), особенно для образцов препарата с составом 80/20 (мас.%) НуаГГ-11р65®/тйВМР-2 и 40/40/20 (мас.%) НуаГГ-11®/глютамат/тйВМР-2. Инъекция образца препарата с составом 80/20 (мас.%) НуаГГ-11р65®/тйВМР-2 в периферическую лучевую кость стерилизованной самки бабуина привела к увеличению на 30% объема трабекулярной кости по сравнению с контрольным гистологическим образцом (данные не показаны).

Claims (52)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Композиция для инъецируемой доставки остеогенных протеинов, содержащая остеогенный протеин и сложный эфир гиалуроновой кислоты, причем указанная композиция имеет форму цилиндрического стержня, пригодного для внутрикостной инъекции в твердом состоянии в тело.
2. 2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что остеогенный протеин выбран из группы, содержащей ВМР-2, ВМР-4, ВМР-5, ВМР-6, ВМР-7, ВМР-10, ВМР-12, ВМР-13 или МР-52.
3. 3. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что дополнительно содержит ингибитор резорбции кости.

   - 11 008354
4. 4. Композиция по п.3, отличающаяся тем, что ингибитор резорбции кости представляет собой бисфосфонат.
5. 5. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что степень этерификации гиалуроновой кислоты в сложном эфире гиалуроновой кислоты составляет около 50-100%.
6. 6. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что сложный эфир гиалуроновой кислоты представляет собой Нуа££-11р65.
7. 7. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что сложный эфир гиалуроновой кислоты представляет собой Нуа££-11р65, а остеогенный протеин представляет собой ВМР-12, ВМР-13 или МР-52.
8. 8. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что сложный эфир гиалуроновой кислоты является производной гиалуроновой кислоты с поперечными связями.
9. 9. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что диаметр указанного цилиндрического стержня составляет около 0,5-1,5 мм.
10. 10. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что длина указанного цилиндрического стержня составляет около 2-5 см.
11. 11. Композиция для лечения пораженной остеопорозом кости, которая приготовлена с использованием процесса, содержащего этапы:

    (a) смешивания остеогенного протеина и сложного эфира гиалуроновой кислоты для получения остеогенной смеси и (b) формовки и сушки остеогенной смеси в виде цилиндрического стержня, пригодного для внутрикостной инъекции в твердом состоянии в тело.
12. 12. Композиция по п.11, отличающаяся тем, что этап смешивания дополнительно включает смешивание остеогенного протеина и сложного эфира гиалуроновой кислоты с ингибитором резорбции кости.
13. 13. Композиция по п.12, отличающаяся тем, что ингибитор резорбции кости является бисфосфонатом.
14. 14. Композиция по п.11, отличающаяся тем, что сложный эфир гиалуроновой кислоты получен гидратацией или растворением нерастворимых или частично растворимых частиц, пленок, волокон, нетканых материалов или пористых бензиловых эфиров гиалуроновой кислоты в воде, органическом растворителе или водном буферном растворе.
15. 15. Композиция по п.11, отличающаяся тем, что остеогенный протеин выбран из группы, содержащей ВМР-2, ВМР-4, ВМР-5, ВМР-6, ВМР-7, ВМР-10, ВМР-12, ВМР-13 и МР-52.
16. 16. Композиция по п.11, отличающаяся тем, что этап смешивания включает смешивание остеогенного протеина и сложного эфира гиалуроновой кислоты с растворителем; а этап формовки и сушки остеогенной смеси в виде цилиндрического стержня включает экструзию остеогенной смеси в среде, не являющейся растворителем.
17. 17. Композиция по п.16, отличающаяся тем, что растворитель представляет собой Νметилпирролидинон (ΝΜΡ) или диметилсульфоксид (ΌΜ8Θ).
18. 18. Композиция по п.11, отличающаяся тем, что этап формовки и сушки остеогенной смеси в виде цилиндрического стержня включает экструзию остеогенной смеси в среде, не являющейся растворителем.
19. 19. Композиция по п.18, отличающаяся тем, что среда, не являющаяся растворителем, представляет собой этанол или воду.
20. 20. Композиция по п.11, отличающаяся тем, что этап формовки и сушки остеогенной смеси содержит экструзию остеогенной смеси на воздухе и сушку.
21. 21. Композиция по п.11, отличающаяся тем, что диаметр указанного цилиндрического стержня составляет около 0,5-1,5 мм.
22. 22. Композиция по п.11, отличающаяся тем, что длина указанного цилиндрического стержня составляет около 2-5 см.
23. 23. Способ приготовления инъецируемого стержневидного непрерывно выделяющего активный ингредиент препарата, включающий этапы:

    (a) смешивания остеогенного протеина со сложным эфиром гиалуроновой кислоты для получения остеогенной смеси, содержащей сложный эфир гиалуроновой кислоты в количестве около 1-50 мас.%;

    (b) формования остеогенной смеси для получения изделия стержневидной формы, пригодного для внутрикостной инъекции в твердом состоянии в тело; и (c) сушки изделия стержневидной формы, полученного на этапе (Ь).
24. 24. Способ по п.23, отличающийся тем, что этап (а) далее включает смешивание остеогенного протеина и сложного эфира гиалуроновой кислоты с ингибитором резорбции кости.
25. 25. Способ по п.24, отличающийся тем, что ингибитор резорбции кости представляет собой бисфосфонат.
26. 26. Способ по п.23, отличающийся тем, что этап (а) включает растворение сложного эфира гиалуроновой кислоты в органическом растворителе.
27. 27. Способ по п.26, отличающийся тем, что органический растворитель является Νметилпирролидиноном (ΝΜΡ) или диметилсульфоксидом (ΌΜ8Θ).

    - 12 008354
28. 28. Способ по п.23, отличающийся тем, что этап (а) включает гидратацию сложного эфира гиалуроновой кислоты в водном буферном растворе.
29. 29. Способ по п.23, отличающийся тем, что содержание сложного эфира гиалуроновой кислоты на этапе (а) составляет около 10-25 мас.%.
30. 30. Способ по п.23, отличающийся тем, что процесс формования на этапе (Ь) включает экструзию остеогенной смеси в среде, не являющейся растворителем.
31. 31. Способ по п.23, отличающийся тем, что процесс формования на этапе (Ь) включает экструзию остеогенной смеси на воздухе и сушку.
32. 32. Способ по п.23, отличающийся тем, что остеогенный протеин выбран из группы, содержащей ВМР-2, ВМР-4, ВМР-5, ВМР-6, ВМР-7, ВМР-10, ВМР-12, ВМР-13 и МР-52.
33. 33. Способ по п.23, отличающийся тем, что степень этерификации гиалуроновой кислоты в сложном эфире гиалуроновой кислоты составляет около 50-100%.
34. 34. Способ изготовления инъецируемого препарата с непрерывным выделением активного ингредиента, содержащий этапы:

    (a) смешивания остеогенного протеина с материалом на основе гиалуронана для получения смеси;

    (b) прессования смеси, полученной на этапе (а), для получения плотной остеогенной смеси; и (c) формовки плотной остеогенной смеси, полученной на этапе (Ь), в виде твердого цилиндрического стержня, пригодного для внутрикостной инъекции в тело.
35. 35. Способ по п.34, отличающийся тем, что смешивание на этапе (а) включает смешивание остеогенного протеина и материала на основе гиалуронана с ингибитором резорбции кости.
36. 36. Способ по п.35, отличающийся тем, что ингибитор резорбции кости представляет собой бисфосфонат.
37. 37. Способ по п.34, отличающийся тем, что указанная формовка на этапе (с) состоит в экструзии, прессовании, формовании, сверлении или резки для получения цилиндрического стержня диаметром около 0,5-1,5 мм.
38. 38. Способ по п.34, отличающийся тем, что остеогенный протеин выбран из группы, содержащей ВМР-2, ВМР-4, ВМР-5, ВМР-6, ВМР-7, ВМР-10, ВМР-12, ВМР-13 и МР-52.
39. 39. Способ по п.34, отличающийся тем, что материал на основе гиалуронана представляет собой сложный эфир, содержащий гиалуроновую кислоту со степенью этерификации около 50-100%.
40. 40. Способ лечения млекопитающих, имеющих костный дефект, включающий введение в участок костного дефекта посредством внутрикостной инъекции эффективного количества остеогенной композиции по пп.1-22.
41. 41. Способ лечения млекопитающих, имеющих костный дефект, включающий введение в участок костного дефекта посредством внутрикостной инъекции эффективного количества остеогенной композиции, отличающийся тем, что остеогенная композиция содержит остеогенный протеин и сложный эфир гиалуроновой кислоты, при этом указанная композиция представлена в форме цилиндрического стержня, пригодного для внутрикостной инъекции в твердом состоянии в тело.
42. 42. Способ по п.41, отличающийся тем, что костный дефект представляет собой кость, пораженную остеопорозом или нарушением остеогенеза.
43. 43. Способ по п.41, отличающийся тем, что остеогенный протеин выбран из группы, содержащей ВМР-2, ВМР-4, ВМР-5, ВМР-6, ВМР-7, ВМР-10, ВМР-12, ВМР-13 и МР-52.
44. 44. Способ по п.41, отличающийся тем, что степень этерификации гиалуроновой кислоты в сложном эфире гиалуроновой кислоты составляет 50-100%.
45. 45. Способ лечения млекопитающих с костным дефектом, содержащий этапы:

    (a) введения в участок костного дефекта посредством внутрикостной инъекции эффективного количества остеогенной композиции, отличающийся тем, что остеогенная композиция содержит остеогенный протеин и сложный эфир гиалуроновой кислоты, при этом указанная композиция представлена в форме цилиндрического стержня, пригодного для внутрикостной инъекции в твердом состоянии в тело; и (b) введения в этот участок костного дефекта эффективного количества ингибитора резорбции кости.
46. 46. Способ по п.45, отличающийся тем, что костный дефект представляет собой пораженную остеопорозом или нарушением остеогенеза кость.
47. 47. Способ по п.45, отличающийся тем, что остеогенный протеин выбран из группы, содержащей ВМР-2, ВМР-4, ВМР-5, ВМР-6, ВМР-7, ВМР-10, ВМР-12, ВМР-13 и МР-52.
48. 48. Способ по п.45, отличающийся тем, что степень этерификации гиалуроновой кислоты в сложном эфире гиалуроновой кислоты составляет 50-100%.
49. 49. Способ по п.45, отличающийся тем, что этап (а) осуществляют до этапа (Ь).
50. 50. Способ по п.45, отличающийся тем, что этап (Ь) осуществляют до этапа (а).
51. 51. Способ по п.45, отличающийся тем, что этап (а) осуществляют по сути одновременно с этапом (Ь).
52. 52. Композиция для инъецируемой доставки остеогенных протеинов, состоящая из остеогенного протеина и сложного эфира гиалуроновой кислоты, причем указанная композиция имеет форму цилиндрического стержня, пригодного для внутрикостной инъекции в твердом состоянии в тело.