JP2002504083A

JP2002504083A - ヒアルロン酸および増殖因子による骨の増殖を促進する方法

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Publication number: JP2002504083A
Application number: JP53207097A
Authority: JP
Inventors: マイケルラドムスキー
Original assignee: オーケストインコーポレイテッド
Priority date: 1996-03-05
Filing date: 1997-03-05
Publication date: 2002-02-05
Also published as: WO1997032591A1; CN1149088C; EP0910389A1; EP0910389A4; CN1212628A

Abstract

(57)【要約】ヒアルロン酸および増殖因子を含む骨増殖促進組成物が提供される。本組成物は骨の増殖を促進するに充分な期間の間、骨の増殖が望まれる部位に維持されるために充分な粘度と生分解性を有する。ヒアルロン酸は組成物中に0.1〜４重量％で使用されるのが好ましく、好ましい増殖因子はbFGFであり、約10^-6〜100mg/mlであることが好ましい。

Description

【発明の詳細な説明】ヒアルロン酸および増殖因子による骨の増、殖を促進する方法発明の背景ヒアルロン酸は、N-アセチル-D-グルコサミンとD-グルクロン酸単糖単位がベータ１−４結合で交互に結合し、この２糖単位がベータ１−３グリコシド結合で結合したものを含む、天然に存在する多糖である。通常ナトリウム塩として存在し、約50,000から8x10⁶の分子量を有する。発明の概要本発明はヒアルロン酸及び増殖因子を含む骨の増殖を促進する組成物で、その組成物が、骨の増殖を促進するのに充分な期間の間骨の増殖が望まれる部位に維持されるために充分な粘度があり生分解性である骨増殖促進組成物に関する。必要な粘度と生分解性を有する、ヒアルロン酸および成長因子を含む組成物が提供される。本明細書においては、ヒアルロン酸の語は、HAと略記され、ヒアルロン酸および、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩その他のような、ヒアルロン酸の塩を含む。増殖因子とは、骨、靭帯、軟骨または骨若しくは関節と関連する他の組織の増殖の誘導又は伝導においてある役割を果たすことが見いだされている、タンパク質性の、あるいはそうでない因子を意味する。より詳細には、これらの増殖因子には、bFGF、aFGF、EGF(上皮増殖因子)、PDG F(血小板由来増殖因子)、IGF(インシュリン様増殖因子)、TGF-βＩからIII、TGF -βスーパーファミリー（BMP-1〜12、GDF １〜12、dpp、60A、BIP、OF）が含まれる。図面の簡単な説明図１は、以下の実施例１に述べた実験データをグラフ的に表したものである。図1Aは形成される骨の厚さをbFGF投与量の関数として示したものである。図1Bは、形成される骨の厚さをヒアルロン酸濃度の関数として示したものである。図２は以下の実施例２に記載した実験データをグラフに表したものである。図３は実施例３の処置後２３日および３０日におけるウサギの治癒腓骨の破損荷重(load at failure)をグラフに示したものである。図４は実施例３の処置後２３日および３０日におけるウサギの治癒腓骨の破損エネルギー(energy to failure)をグラフに（ポンドで）示したものである。図５は実施例４の処置後のラットにおける骨の厚さをグラフに示したものである。好ましい実施態様の説明本組成物及びその使用方法を更に詳細に説明する。ヒアルロン酸は脱架橋され、500,000かそれ以上、典型的には10⁴から10⁷の範囲の分子量を有することが好ましい。骨増殖促進組成物は典型的には約0.1から４重量％までの非架橋ＨＡを水性溶液中に含み、その水性溶液は緩衝塩類、糖類、抗酸化剤および成長因子の生理活性および組成物の適切なｐＨを維持するための保存剤のような他の溶液賦形剤も含む。約0.1から２重量％の非架橋ＨＡを含む組成物が好ましい。この溶液の典型的なpHは４から９の範囲であろうが、約6. 0±1.0が好ましく、約5.0が最も好ましい。増殖因子はこの溶液中に典型的には約10^-6から100mg/mlの範囲の濃度で存在し、特にbFGFの場合は約0.1から20mg/mlが好ましい。この濃度は特定の骨の部位および処置に依存するであろうし、注射量および増殖因子の比活性にも依存するであろう。増殖を促進するために使用される溶液が、シリンジ又はかテーテルを通して注入できるが、骨促進効果が達成される前に体液で早く希釈されすぎないような粘性を持つことは重要である。この組成物の粘度は10から10⁶cPの範囲内であることが好ましく、bFGF含有組成物の場合は、約75,000cPが好ましい。この組成物は、骨増殖促進活性を現すために、骨の増殖が望まれる部位に維持されるに充分な生分解性を有することもまた重要である。本組成物は骨の増殖が望まれる部位に通常約３から約３０日の期間、典型的には３から約14日の期間維持されなければならない。もしこの組成物が早く分散しすぎると、必要な骨増殖促進効果は生じないか又は形成された骨が望みの強度を有しないであろう。もし、本組成物が骨の増殖が望まれる部位に過剰な期間存続していると、その骨の部位にこの組成物が存在することにより骨の通常の増殖が阻害され、時には全く骨形成が起こらないかもしれない。本組成物は、典型的にはHAと増殖因子を、クエン酸ナトリウム、EDTAおよびショ糖のような賦形剤と適当な量で混合することにより、HAと増殖因子が望みの濃度で溶液中に維持され、その溶液が適当な粘度と生分解性を示すように、溶液として形成される。この溶液は骨の増殖が望まれる部位にどんな都合のよい方法によって適用してもよく、典型的にはシリンジ又はカテーテルを通して導入されるであろう。本発明の骨増殖組成物の投与は傷の治癒を促進し、傷ついた後にそれ以上の組織の損傷を防ぎ、自然治癒過程を妨害する処置を避け、かつ治癒のための最適な物理的および生物学的条件を作り出すために望ましいかも知れない。骨の増殖が望まれる部位には以下のものが含まれる；脛節／腓骨の骨折；大腿骨／上腕骨の骨折；前腕骨折；背側移動遠位撓骨（コーレス）骨折(posteriorly displaced d istal radius fractures);脛痛症および脚の怪我と関連するスポーツ骨折（spor ts fractures）を含む疲労骨折；脊椎圧迫骨折、肋骨骨折、および鎖骨骨折。骨の増殖が望まれる部位には、骨粗鬆症症、骨軟化症、副甲状腺機能亢進症、腎性骨ジストリフィー、骨の原発および転移癌と関連する病理的な骨欠損が含まれる。本発明を以下の実施例で詳細に説明するが、これは説明のためであり請求の範囲に記載する本発明を限定することを意図したものではない。実施例１ヒアルロン酸ナトリウム(Genzyme,MW 2x10⁶、無菌、１％溶液の粘度6500cP)、 bFGF（Scios-Nova、９％ショ糖溶液(pH５)中4.3mg/ml、20mMクエン酸ナトリウムおよび1mMEDTA）を混合した。この配合物をbFGFの滅菌濾過溶液と他の賦形剤（クエン酸ナトリウム、水その他）を適切な量の滅菌した固体のHAと混合することによって作った。粒子の大きな凝集塊が形成されるのを防ぐためにシリンジで繰り返し前後させることによりHAを素早く分散させた。配合物を無菌的に調製し、予め満たしておいた21Gの針のついた1mlプラスチックシリンジで、アセプロマジン、キシラジン、ケタミンで麻酔した雄のSprague-Dawleyラット（８−９週齢、160〜180グラム）に投与した。矢状縫合およびラムダ状縫合の交差をつける(locate)ために首の後ろの皮膚を横に５〜10ミリメートル切開した。50マイクロリットルのテスト配合物を21Gの針で骨膜と頭頂骨の間に注射した。この動物を処置後14日後に安楽死させた。組織学的解析のために組織を10％の中性緩衝化ホルマリン中で固定した。組織をギ酸中で少なくとも２時間連続的にゆっくり撹拌しながら脱灰した(RapidBone Decal)。サンプルを脱水し、パラフィンを浸透させた。試料を横断面で埋込み、５μmに切片を作った。組織学的解析のため切片をヘマトキシリンとエオジンで染色した。表１に示したように新しい骨の形成に０から４のスケールでスコアをつけた。表１：骨膜下注射後の頭頂骨における、新しい網状骨形成の定性的記述頭頂骨の全体の厚さはNodaら、Endocrinology，124:2991-4，1989の方法と同様にして測定した。各組織切片の写真を矢状縫合線の２〜３mm横（矢上縫合腺と切片の端のほぼ中央）で撮影した。全骨の３回の骨厚測定を写真の左、中央、右側で測定し、全体の骨厚を決定するためにスケーリングした。密度のある皮質骨と新しい網状骨の双方がこの測定には含まれている。全ての群において、各処置に対する応答は同じ処置群においては動物間で一致した。定性的には、すべてのbFGF/HAゲル配合物で処置された動物の群は新しい骨の形成を示したが、プラセボ処置および増殖対照の動物は最小限しか、あるいは全然新しい骨の形成を示さなかった(表２)。この検討で調べたbFGF/HA配合物間では小さな差異しかないのは明らかである。しかしながら、確かに用量応答効果があるのは明らかである(図1A、1B)。表２：処置の14日後にbFGF配合物の骨膜下注射を受けた動物の組織学的スコアリング（表１）の定性的な結果表３は骨膜下注射によって異なる配合物を投与された後のラット頭蓋冠の全骨厚を示す。bFGFおよびHAを含む全ての配合物は新しい骨の形成を示した。表３の最初の２つの記録は反復実験を示す。２％HAゲル中の100μgのbFGFを与えた反復動物群は最初の調査では0.49±0.10mmの全頭頂骨厚を示し、第２の調査では0.59± 0.12mmで、17％の違いがあった。しかしながら両方の群の全体の骨厚は定性的および定量的に対照と有意に異なっていた。100μgのbFGFとHAを含む全ての配合物は処置を受けなかった動物に比較して新しい骨の形成において少なくとも61％の増加を示した。図1Aおよび1Bは全骨厚に対するbFGFおよびHAの濃度の効果を示すものである。bFGFの用量が10から100μgに増加するに従って、全骨厚は0.45から0.54mmまで20％増加した。HAの濃度が増加するに従って、全骨厚の増加が見られ、骨形成の最大増加は0.5％ HA付近で見られた。HA濃度を0.5％より高く増大させても、このモデルにおいてはbFGFによって引き起こされる新しい骨形成に更なる増強は起こらなかった（図１Ｂ）表３：処置後14日のラットの、ラムダの前方2mmの頭蓋冠および頭頂溝の２から３mm横の断面の全骨厚。骨厚は動物あたり３回の測定の平均である。ｎは繰り返しの動物数であり、パーセント増加は増殖対照に対する増加割合を示す。これによりHAゲル中100μgのbFGFの１回の骨膜下注射が、対照に対して膜内骨形成における有意な定性的かつ定量的効果を示すことが分かった。投与14日後、 HAゲル中の100μgbFGFで処理した動物において、注射した部位で111％に達する新しい骨が形成された。プラセボおよび対照群は全て注射後14日後に骨厚の増加は１８％に満たなかった。bFGFの投与量が10から100μgまで増加すると、全骨厚が0.45から0.54mmまで20％増加した。HAの濃度を0.5％を越えて増加させても、このモデルではbFGFによって引き起こされる新しい骨形成の更なる増大は起こらなかった。実施例２実施例１に記載したテストを８種の異なる配合物を用いて行なった。bFGFはヒアルロン酸との組み合わせで用い、bFGFを他の担体と共に用いるかまたはプラセボとして単独で担体を用いる他の７種の組成物と比較した。その結果を以下に示し、図２および表４に要約した。表４：骨形成スコアと動物数＊電荷を持たない多糖実施例３ウサギの骨折部位に投与するため、ヒアルロン酸ナトリウム（２％）とbFGF（４mg/ml）の配合物を実施例１のように調製した。４mg/ml bFGF、６mg/mlウサギフィブリノーゲン、0.2mg/mlアプロチニンおよびｐＨと安定性を維持するための他の賦形剤を含む配合物も調製した。このフィブリノーゲン製剤は骨折の修復に用いられる¹、従来から公表されている組成物に類似している。骨折モデルを作るため、ニュージーランドホワイトウサギ（New Zealand White rabbits）に外科的に１mmの切り込みを腓骨中央骨幹(fibula mid-diaphysis)に入れた。この実験方法はウサギで骨折治癒を調べるために従来から用いられてきた²。動物は50μＬのHA/bFGF製剤、50μＬのフィブリノーゲン／bFGF製剤で処置するかまたは未処置のままとした。処置後23日に処置群あたり治癒した１０の腓骨の機械的強度を４点折り曲げ法 (four point bending technique)で測定した。図３は、未処置、HA/bFGF処置、およびフィブリノーゲン/bFGF処置腓骨の破損荷重を示したものである。HA/bFGF 処置した腓骨は未処置の対照よりも53％強く、一方フィブリン/bFGF処置腓骨は未処置の対照よりも30％強かった。図４は３つのすべての処置群について破損エネルギーを示したものである。この測定によれば、HA/bFGF処置した腓骨は未処置の対照より４３％強く、フィブリン／bFGF処置した腓骨は未処置の対照より３％弱かった。加えて、10の未処置のおよび10のHA/bFGF処置腓骨の機械的強度を処置後30日に測定した。図３はHA/bFGF処置した動物においては対照に対して破損荷重が36 ％高く、この相違は統計的に有意である（P=0.02）ことを示している。図４はHA /bFGF処置した動物においては対照に対して破損エネルギーは79％高く、この相違は統計的に有意である（p=0.01）ことを示している。図３および図４はまたHA /bFGF処置腓骨の強度は未処置の腓骨より早く無傷の骨の強度まで回復することを示しており、骨の治癒を加速することを示している。１．Hiroshi Kawaguchiら、Stimulation of Fracture Repair by Recombinant H uman Basic Fibroblast Growth Factor in Normal and Streptozotocin-Diabeti c Rats ，Endocrinology,135:774-781，1994．２．A.A.Pillaら、Non-invasive Low-intensity Pulsed Ultrasound Accelerate s Bone Healing in the Rabbit ，Journal of Orthopaedic Trauma，4:246-253， 1990．実施例４実施例１の方法を用いて、実施例１のHA/bFGF製剤、実施例３のフィブリン／b FGF製剤および水性ショ糖／クエン酸バッファー製剤中のbFGFについて全骨形成を比較した。50μLの各製剤中の100μgのbFGFを骨膜下注射によって投与し、投与後７および14日後に動物を犠牲にした。加えて、処置を受けていない動物を対照として用いた。４つの各群において各処置に対する応答は動物間でよく一致した。７日目にbF GF処置したすべての動物はbFGFに応答して頭蓋冠において膜内骨（intramembran ous bone）形成を示した。対照の動物は最小限しか、または全く新しい骨形成を示さなかった。定性的には、HAゲル中のbFGFで処置した動物の群は他のどのbFGF 製剤よりもよく新しい骨の形成を示した。14日の標本ではbFGF/HAゲル処置動物における骨形成の量の差はさらにはっきりしていた。bFGF処置したすべての動物において新しい骨が形成されたが、bFGF/HAゲル処置した動物では他のどの処置群におけるよりも厚い骨塊が形成されることが容易に明らかになった。図５は、骨厚測定の定量的結果を示したものである。処置後７日の厚さは、２％HAゲル中の100μgのbFGFを投与した動物において、全く処置を受けない動物（すなわち対照）よりも、95％厚かった。他のbFGF処置群は、フィブリンゲル中の bFGF、および水性クエン酸バッファー中のbFGF処置によって、それぞれ86および 55％の骨形成の増加を示した。 14日目においてHAゲル中の100μgFGFで処置した動物は111％の新しい骨が形成された(図５)。他のbFGF処置群は、フィブリンゲル中のbFGFで処置したラットおよび水性クエン酸バッファー中のbFGFで処置したラットにおいてそれそれ25および21％の骨形成増加を示した。実施例５膜内骨形成における塩基性繊維芽細胞増殖因子（bFGF）製剤中のヒアルロン酸の分子量の効果をラットの頭頂骨に骨膜下注射することにより調べた。材料と方法 760から2300KDaの分子量のHA（GenzymeおよびLifecore Biomedicalより）を用いて製剤を調製した。bFGFは９％ショ糖、20mMクエン酸ナトリウム、１mM EDTA のpH5.0の溶液（4.3mg/ml）で提供された(Scios-Nova)。他の試薬（ショ糖、クエン酸ナトリウム、EDTA）はSigmaから購入した。滅菌濾過したbFGF(２mg/ml)を適当量のHA（20mg/ml）の混合することによって製剤を調製した。溶液と担体は最初は活栓で接続された別々のシリンジに入れた。シリンジを繰り返し前後させることによりこの製剤を混合した。無菌的に製剤を調製し、予め満たした21G針の1mlプラスティックシリンジで投与した。雄のSprague-Dawleyラット（８−９週齢、160〜180g）をアセプロマジン、キシラジンおよびケタミンの混合物で麻酔した。首の後ろの皮膚に横に小さな(５〜10mm)切り込みを入れた。矢状縫合およびラムダ状縫合の交差を探し当て、50 μＬの各製剤を21Gの針で骨膜と頭頂骨の間の左側に注射した。処置後14日で動物をCO₂窒息で安楽死させた。組織学的解析のための組織を10％中性緩衝化ホルマリンで固定した。組織をギ酸中で少なくとも２時間連続的に穏やかに撹拌しながら脱灰した(RapidBone Dec al)。サンプルを脱水し、パラフィンを浸透させた。標本を横断面で埋込み５μm に切片を作った。切片は、組織学的解析のためにヘマトキシリンとエオジンで染色した。新しい骨の形成を０〜４のスケールにスコアした。スコア０は新しい網状骨の無いことを表し；スコア１は網状骨の僅かなまたは断片的領域を表し；スコア２は骨形成のより広い断片的領域を表し；スコア３は薄い連続的な網状骨（元の頭頂骨の＜50％）を表し；スコア４は厚い、連続的な網状骨（元の頭頂骨の＞50％）を表す。骨厚測定頭頂骨全体の厚さを注射した部位で測定した。各組織学的切片の写真を矢上縫合の２から３mm横（矢上縫合と切片の端の間のほぼ真ん中）で撮った。３回の全骨厚測定を写真の左、中央、右側で行ない全骨厚を測定するためスケーリングした。密度のある皮質骨と新しい網状骨の両方を測定に含めた。結果定性的には、bFGF処置されたすべての動物はいくらかの新しい骨の形成を示したが、HAのみのゲルで処置した動物および対照は新しい骨形成を最小限かまたは全く示さなかった。組織学的に、bFGF処置動物では新しい、網状骨および、成熟した層状骨の存在が示された。注射部位においては新しい網状骨の著しい層が、より成熟した下層の骨の上に形成されていた。ときには、網状骨は右側に存在するが、左側にみられるのと同じ程度に存在しないことがある。新しい網状骨は、正常な反転線(reversal line)、骨髄空隙(marrow spacing)を示しかつ通常の染色特性を示した。これらの群の動物の大部分は骨形成スコア３であり(28/30 )、一方、２体の動物は最大スコアの４であった。網状骨の上には、新しい網状骨にすぐ隣接して脂肪組織および繊維組織の領域があり、正常に形作られているように見えた。HA/bFGF製剤の抗原性能を示すであろう慢性炎症細胞のフォーカスを示す領域はなかった。 HAゲル処置動物では新しい骨形成が全くあるいはほとんど見られず、大部分の動物は骨形成スコア０であった(26/30)。30体の動物のうち３体は骨形成スコア１であり、一方、１体の動物は骨形成スコア３であった。新しい骨形成は外科的手術の過程での骨膜の隆起(elevation of theperiosteum)の結果かもしれない。組織のどの部分においても異常は観察されず、調べたどのHA製剤においても抗原性は示されなかった。手術をせず処置をしなかった動物では新しい骨形成は見られず、６体の動物全てが骨形成スコア０であった。この群は、HAゲルを与えた群と非常に類似しているが、但し、骨膜の隆起の結果としての新しい骨形成がなかった。成熟した骨の標本では、正常な骨細胞が脱落部分に存在し、骨髄空隙(marrow space)が見られた。全ての領域で骨組織の表面に細かい繊維状組織が少量存在していた。骨の厚さに関しては、FGF処置群は増殖対照に体して骨厚の68〜100％の増加を示した。入手できるLifecore社の最も高分子量のHAで作ったゲル中のbFGFで処置した動物は骨厚について最大の増加を示した(100％)。骨形成に対して分子量は僅かな効果があった。HAの分子量が増加すると、形成される新しい骨の量も増加した。骨形成におけるこの増加は製剤の粘度の増加によるものかもしれない。粘度が増加すると、FGFのより大きな拡散障壁となり、FGFはより長い期間その部位に局所的に維持される。HAの残留時間が長くなると骨形成がより盛んになる。実施例６この実施例はHA＋bFGFケルの骨膜下注射後のヒアルロン酸の局所的分布と残留性について記述する。この検討は、塩基性繊維芽細胞増殖因子（bFGF）を含むHA ゲルの骨膜下注射後の、骨膜の増殖、新しい骨形成、およ、びヒアルロン酸（HA ）の局所分布と残留性を調べたものである。３日目の骨膜の厚さと10日目の骨の厚さを組織学的評価により測定した。材料と方法材料ヒアルロン酸ナトリウムはLifecore Biomedical(Chaska,MN,1300kDa)から購入した。bFGFはScios-Novaから、pH5に調製した９％ショ糖、20mMクエン酸ナトリウムおよび１mM EDTAの凍結溶液として供給された。製剤バッファー試薬（ショ糖、クエン酸ナトリウム、EDTA、BSA）はSigmaから購入した。アジピン酸ジヒドラジド（AD）および1-エチル-3[3-（ジメチルアミノ）プロピル]カルボジイミド（EDC）はAldrichから購入した。スルホ-NHS-ビオチン(SNB)、2-（4'ヒドロキシフェニルアゾ）安息香酸(HABA)、3,3'ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド(DAB)金属増感基質キット、アビジン-西洋わさびペルオキシダーゼ（AV-HRP）結合物はPierce社より購入した。Tween20はBaker社から購入した。ビオチン化 HA-ビオチン結合物（HA-Bi）を２段階の反応で調製した。PouyaniおよびPrest wich、Bioconjugate Chem ．5:370-372(1994)の方法により、、ヒドラジド-HAを合成し、続いてHA-Biを調製した。200mgのHAを50mlの水に溶解してヒドラジド-H Aを調製した。AD（3.5g）をHA溶液に加え0.1NのHClでpHを4.75に調整した。EDC （382mg）をこの溶液に加えて反応を開始させた。pHを定期的にモニターし0.1N のHClを加えて4.75に維持した。４時間後（この時点以後はpHの更なる上昇は観察されなかった）に１NのNaOHでpH７に中和することにより反応を停止させた。生成物を72時間透析し(Specta／Por、6000から8000MWカット)、48時間凍結乾燥した。 HA-Bi結合物は15mgのヒドラジド-HAを1.5mlの0.1M NaHCO₃に溶解して調製した。SNB（50mg）を加えて反応を開始させた。この溶液を室温で小さなマグネティック・スターラーバーで20時間撹拌した。この溶液を７２時間透析して、４８時間凍結乾燥した。置換の程度はメーカー説明書(Pierce)による置換アッセイで決定した。簡単に言うと、900μLのアビジン-HABA試薬を1mlのキュベットに入れた。500nmでの吸収を900μLのアビジン-HABAプラス100μLの１mg/mlのHA-ビオチン溶液の吸収に比較した。置換の平均程度は１モルのビオチンあたり二糖の繰り返し単位３０モルであった。製剤表５に記載したようにbFGF溶液の滅菌濾過を固体HAと混合することによって製剤を調製した。製剤は活栓で接続された２本のシリンジを繰り返し前後に動かすことによって混合した。製剤は無菌的に調製し、21Gの針の、予め満たしてある1 mlのプラスティックシリンジで投与した。表５：HA-Bi製剤動物モデル雄のSprague-Dawleyラット(６〜７週齢、160-180ｇ、群あたりｎ=5)をアセプロマジン、キシラジンおよびケタミンの混合物で麻酔した。首の後ろの皮膚に小さな切り込み（5-10mm）を横に入れた。矢状およびラムダ状縫合を探し出し、50 μLの各製剤を21Gの針で骨膜と頭頂骨の間の左側に注射した。処置後14日に動物をCO₂窒息により安楽死させた。組織学組織学的評価のための組織を10％の中性緩衝化ホルマリン中で固定し、次にED TAの13から15％溶液中で連続的に、ゆっくり撹拌しながら脱灰した。試料を脱水し、パラフィンを浸透させた。試料を横断面で埋込み４μmで切片を作った。各試料につき２枚の切片を調製し、ヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ）で染色するか又はHAに対しては以下の方法でBi:Av-HRP組織化学で染色した。組織切片はブロック溶液（PBS中１％BSA/0.05％Tween）中で30分間インキュベーションし、続いて検出用結合物溶液（PBS中１％BSA/0.05％Tweenに溶解した１μg/mlアビジン-HRP）中で60分間インキユベーションした。この組織切片を次に洗浄液（ Tween 0.05％ PBS）中に５分間おいた。PBS/Tween中での洗浄は新しい溶液で５回繰り返した。金属増感DABキットをHA-Bi：Av-HRP複合体の染色に用いた。DAB 基質を適用してから数分後、切片を水中でリンスした。この複合体の存在下で黒い沈殿が形成された。最後にこれらの切片は細胞の詳細部分のため、ヘマトキシリンでカウンター染色した。骨膜および骨厚の測定骨膜および頭頂骨の全体の厚さを注射した部位で測定した。各組織学的切片の写真を矢状縫合の２から３mm横（矢状縫合と切片の端とのほぼ真ん中）で撮った。３回の厚さ測定を写真の左側、中央、右側で行ない、全体の骨厚または骨膜の厚さを決定するためにスケーリングした。正常な骨膜と同様な染色特質および細胞形態を示す組織は骨膜の厚さに含めた。密度のある皮質骨と新しい、網状骨の双方を骨厚の測定に含めた。結果 HAゲル中のbFGFで処置した動物においては３日で骨膜の厚さに増加が見られ10 日で有意に網状骨形成が見られた。bFGF無しに処置された動物は骨膜の肥厚および骨形成を僅かしか示さなかった。HA-Biは肥厚した骨膜にすぐ隣接する組織で３日目に検出され、新しく形成された骨は10日目に検出された。HA-Bi に関して、３日目の投与注射した部位にHAのはっきりした塊が骨膜の上に存在していた。外科手術の傷による層状骨から隆起した骨膜部分があった。HAに対して染色された領域で線維性組織が局在した領域があり、リンパ球および変性細胞(degenerating cell)が明らかに見られる非特異的細胞浸潤があった。周辺組織は細い繊維状組織からなっていた。HA-Bi 、10日目の投与 HA-Bi処置動物では正常な層状骨が見られ、その上には肉芽組織に似た非特異的な繊維状組織の領域が見られた。この領域はリンパ球、細い血管、脂肪細胞、および未染色物質のいくつかの断片を含んでいた。茶色がかった黒色のペルオキシダーゼの染色が、左側の頭蓋冠表層の密度のある繊維状組織内に見られた。HA はこの繊維状組織内に非特異的に分布していた。HA-Bi ＋bFGFについて３日目の投与注射部位において、以前から存在していた層状骨を覆って骨膜層が過形成されていた。定量的には、HA-Bi+FGF処置動物における骨膜はHA-Biゲルのみで処置した動物よりも403％厚かった。肥厚した骨膜の上に、血管新生した、過増殖した繊維状組織の塊が存在していた。この繊維状組織の内部には、脂肪細胞が存在し、ある種の多形核白血球、組織球およびプラズマ細胞を含む、非特異的な浸潤細胞の浸潤があった。残ったHAは中央縫合腺(midline suture)を横切って広がっており被包化されているように見えた。これらのサンプルでは茶色がかった黒色に染色される物質（すなわちHA）の集中は主として、被包化された組織の範囲に集中していた。この物質の多くは繊維状のネットワーク内に非特異的に維持されているように見え、いくらかは局所的な組織球の細胞質内に非特異的に蓄積しているように見えた。HA-Bi+bFGF 、１０日目での投与注射部位では、以前より存在していた頭蓋冠層状骨はその構造および染色性について正常な成熟した網状骨の厚い層で覆われていることが示された。全骨厚は HA-Bi+FGF処置動物においてHA-Biゲルを与えられた動物よりも70％厚かった。この新しい骨は典型的には中央縫合線を越えて頭蓋冠の右側まで広がっていた。HA に対するDAB染色が、新しく形成された網状骨を取り囲む繊維状組織が増殖した表層に見られた。ペルオキシダーゼ染色はHAが典型的には新しく形成された骨に隣接する組織に存在することを示した。網状骨の上には繊維-骨膜層が存在した。その表層には血管新生があり脂肪細胞を含む細かい繊維状組織領域の広がりがあった。ある種のリンパ球、プラズマ細胞および組織球も、薄い繊維状組織層で区切られた、このよく発達した領域に存在した。HA+bFGF ３日および10日めの投与定性的および定量的に、HAにビオチンを結合させることは製剤に対する生物学的応答に影響を与えなかった(表６)。HA+FGF処置群の骨膜及び骨の厚さはHA-Bi+ FGF処置群と統計的に異ならなかったが(p>0.05)、HA-Bi処置の対照と有意に異なっていた(p<0.001)。組織学的にはビオチンのないHA+bFGFで処置された動物は、 DAB基質による茶色がかった黒色に染色された領域を除いてHA-Bi+bFGFと同様であった。少数の細胞は内在性のペルオキシダーゼ活性が存在するために陽性に染色された。表６：この研究で調べた３群の骨膜および骨の厚さ HA+bFGFゲルの骨膜下注射による投与は、骨膜の増殖と活発な骨形成にかなりの効果があった。投与３日後で、骨膜は対照よりも５倍近く厚かった。加えて、投与後10日の頭頂骨の厚さはHA/bFGF処置ラットでは対照よりも70％厚かった。ここで調べた製剤中のHA担体は、この製剤をそこに維持することにより新しい骨の形成を起こさせるものである。HAは活発な骨形成がある領域に見られた。HA+b FGFの注射後、HAは新しい骨形成部位に隣接するbFGFの貯蔵所を提供する。 bFGFの部位指向性放出を提供することに加えて、HAは骨形成を補助するように見える生物学的特性を有している。HAはFGFと相乗的効果を有しているかもしれない。本発明のこれまでの開示および説明は、本発明の例示および説明的なものであり、好ましい実施態様の大きさ、形態、物質および詳細な点において種々の変更が本発明の精神から逸脱することなくなされ得るであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 43/00 １１１Ａ６１Ｋ 37/36 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒアルロン酸および増殖因子を含む骨増殖促進組成物であって、骨の増殖を促進するのに充分な期間、骨の増殖が望まれる部位に維持されるために充分な粘度と生分解性を有している前記組成物。２．ヒアルロン酸が架橋されていない、請求項１に記載の組成物。３．組成物がヒアルロン酸を溶液中に0.1〜４重量％で含む、請求項１に記載の組成物。４．増殖因子がbFGFを含む、請求項１に記載の組成物。５．組成物中にbFGFが約10^-6〜100mg/mlで存在している、請求項４に記載の組成物。６．骨の増殖が望まれる部位において骨の増殖を促進する方法であって、ヒアルロン酸および増殖因子を含む組成物を前記部位に適用するステップを含み、前記組成物が骨の増殖を促進するに充分な期間前記部位に維持されるために充分な粘度と生分解性を有する、骨の増殖を促進する方法。７．ヒアルロン酸が架橋されていない、請求項６に記載の方法。８．組成物中のヒアルロン酸が組成物の約0.1〜４重量％を構成する、請求項６に記載の方法。９．増殖因子がbFGFを含む、請求項６に記載の方法。 10．組成物中にbFGFが約10^-6〜100mg/mlで存在する、請求項９に記載の方法。