DD271268A5 - Verfahren zur herstellung einer topisch anwendbaren pharmazeutischen zusammensetzung zur verhinderung von fibrinablagerungen oder verwachsungen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer topisch anwendbaren pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verhinderung von Fibrinablagerungen oder der Bildung oder Neubildung von Verwachsungen. Ziel der Erfindung ist es, neue pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verhinderung von Fibrinablagerungen oder der Bildung oder Neubildung von Verwachsungen bereitzustellen. Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, Verfahren zur Herstellung von Arzneimitteln zur Verhinderung von Fibrinablagerungen oder der Bildung oder Neubildung von Verwachsungen an Stellen von moeglichen Fibrinablagerungen oder der Bildung von Verwachsungen bereitzustellen. Im erfindungsgemaessen Verfahren wird ein maessig loesliches Enzym mit einem inerten, haftungsfoerdernden Traeger vermischt.

Description

. ί .1.

Titel der Erfindung

Verfahren zur Herstellung von therapeutischen Zusammensetzungen zur Verhinderung von Fibrinablagerungen oder Verwachsungen.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Anwendung der vorliegenden Erfindung erfolgt auf dem

Gebiet der therapeutischen Zusammensetzungen zur Verhinderung j der Bildung oder Neubildung von Verwachsungen, insbesondere t_t\ der Bauchfellhöhle oder Beckenhöhle aufgrund von chirurgischen Gingriffen, Infektionen, Entzündungen oder Verletzungen.. Die Anwendung der Erfindung erfolgt auf dem Gebiet der Human- und Veterinärmedizin.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die Bildung von postoperativen intraperitonealen Verwachsungen (Adhäsionen), d.h. pathologischen Verwachsungen , von Organen und Gewebeflächen, stellt die Hauptursache von Darmverschlüssen im Anschluss an abdominale chirurgische ,Eingriffe dar (H. Ellis, Surg. Gynec. Obstec, Bd. 133 (1971)). Eine Verwachsung umfasst typischerweise organisiertes, fibrinöses Exsudat, das an der Ofc-rfläche einer serösen Membran, die gegenüberliegende Oberflächen von Geweben oder Organen verbindet, vorsteht. Verwachsungen stellen auch

27(2<β '

einen wesentlichen Faktor dar, der zur 3'nfertilität nach wiederherstellenden chirurgischen Eileitereingriffen beiträgt (V. C. Buttram, Fert. and Star., Bd. 40, (1983), S. 5). Rs wurde berichtet, dass 50 - 90% aller Patienten nach einem abdominalen chirurgischen Eingriff Verwachsungen bilden (L·. Colleti und B, Bassart, Arch. Surg. Fert., Bd. 88 (1964), S. 774). Die Bildung von Verwachsungen wurde auch im Anschluss an intraabdominale Infektionen beobachtet (T. Hau et al., Surg. Gyn. & Ob., Bd. 148 (1979), S. 415-418). Ferner wurde die Bildung von Verwachsungen im Anschluss an chirurgische Eingriffe an Sehnen festegstellt (C. Weiss et al..· Bull. Hosp. Joint Diseases, Bd. 47 (1), (1987), S. 31).

Schon zu Beginn der Abdominalchirurgie beobachteten Chirurgen fibrinöse Verwachsungen, die innerhalb einiger Stunden nach chirurgischen Eingriffen, Entzündungen oder Verletzungen zu Verechlingungen von Gedärmen und anderen abdominalen Eingeweiden führen. Das fibrinöse Exsudat kann entweder unter Rückbildung zu einer sauberen peritonealen Höhle vollständig 2Q resorbiert werden oder es kann sich unter Einwachsen von Kapillaren und Fibroblasten unter Bildung von dauerhaften fibrösen Verwachsungen organisieren. Die bis zum heutigen "fuge noch unbeantwortete wichtige Frage besteht darin; welcher Faktor dafür verantwortlich ist, ob das fibrinöse Exsudat ' t resorbiert wird oder sich organisiert. Es wurde eine Theorie % entwickelt, gemäss der die Bildung von Verwachsungen aine <*

Folge einer Zerstörung des peritonealen Endothels ist. Zahlreiche Untersuchungen widerlegten diese Theorie (vgl. z.B. H. Ellis, Brit. J. Surg., Bd. 50 (1962), S. 10.)

Es wurde gezeigt, dass eine normale Verheilung von peritonealen Verletzungen oder Defekten mit der Bildung einer Fibrinmatix beginnt, wonach sich die Phagozytose dieser Matrix durch Makrophagen, Monozyten, Lymphozyten und polymorphkernige Leukozyten anschliesst. Fibroblasten und Kollagenbündel werden beobachtet, bevor das Peritoneum ein normales Aussehen

271266

annimmt. Der normale Heilungsprozess dauert etwa drei Tage (R F. Buckman et al., J. Surg. Res., Bd. 23. (1976), S. 67). Oiu Frage, ob die Fibrinmatrix resorbiert w\ rd, steht offensichtlich im Zusammenhang damit, ob das Gewebe ischämisch war (I. C. Rubin, Surg. Obstet. Bd. 12 (1911), S. 117). H. Ellis et al., Brit. J. Surg., Bd. 52 (1965), S. 471, entwickelten ein ischämisches, peritonea]es Modell und zeigten, dass 83 % von ischämischen Verletzungen zur Bildung von Verwachsungen führten, während nur etwa 9 % der nichtig ischämischen Modelle Verwachsungen bildeten. Unter Anwendung der Elektronenmikroskop^ wurde gezeigt, dass die Fibroblasteninvasion von Makrophagen herrührt, die das Gebiet infiltrieren und sich zu Fibroblasten, Riesenzellen und epithelartigen Zellen entwicklen (G. Eskeland, Acta Path. Microbiol. Scand., Bd. 62 (1964), S. 459). Die Bildung vonVerwachsungen gemäss Ellis wirkte als ein Gefässtransplantat. Unter Anwendung eines dem Ellis-Modell ähnlichen Modells zeigten^ Buckman et al., a.a.O., dass peritoneale Defekte sino hohe Plasminogenaktivität aufweisen, die verloren geht, wenn das Peritoneum ischämisch wird.

Die Fibrinablagerung im Anschluss ai eine bakterielle Infiltration der Bauchfellhöhle stellt einen Abwehrmechanismus zur Verhinderung von Septikämie dar (D. H. Ahrenholz und R. L.

Simmons, Surgery, Bd. 88 (1980), S. 41-47; H. H. Zinser und

A. W. Pryde, Ann. Surg., Bd. 136 (1982), S. 818). Die Bakterien werden zwar eingeschlossen, jedoch führt die Fibrinablagerung häufig zur Abszessbildung (Ahrenholz und Simmons, a.a 0.). Die Fibrinablagerung erfolgt in einem frühen Stadium der

Peritonitis, wenn fibrinogenreiches Exsudat in der

Bauchfellhöhle in Fibrin umgewandelt wird (Hau, a.a.O.). Postoperative, intraabdominale Abszesse stellen eine potentielle Infektionsquelle dar und können lutztlich zum ""od führen. Peritonitis und deren Komplikationen bringen eint hohe

Mortalitätsrate mit sich. B« i älteren Personen liegt dia Mortalitätsrate im Bereich von 60 - 80 % (T. Hau et al., Curr.

271248

- 4 -Prob. Surg., Bd. 16 (1979), S. 1-65).

Plasminogenaktivatoren, die sowohl im Mesothel als auch in subn><5sothelialen Blutgefässen vies Peritoneums vorhanden sind/ sind für die Auflösung und Entfernung von intraperitonealen Fibrinablagerungen verantwortlich (J. M. Porter et al., L. Surg. Forum, Bd. 20 (1969), S. 80; R. F. Buckman et al., J. Surg. Res.. F^. 20 (1976), S. 1). Serosa- oder Peritoneumschädigungen, wie Entzündungen oder Verletzungen,führen zur Bildung eines Exsudats von zellulären Bestandteilen und Fibrin aufgrund von Rissen in kleinen Venen des traumatisierten Bereichs (A. L. Aurora et al., Indian J. Med. Res., Bd. 62 (1972)) sowie zu einer lokalen Abnahme der fibrinolytischen Aktivität (R. F. Buckman, a.a.O.). Es wurde

_L5 gezeigt, dass bei einer Verminderung der lokalen

fibrinolytischen Aktivität um 50 % oder mehr, Fibrin nichtmehr beseitigt werden kann und sich dauerhafte Verwachsungen \bilden (A. S. Gervin et al., Am. J. Surg., Bd. 125 (1973)). [

Es wurden zahlreiche Arbeiten veröffentlicht, die dich mit der t Verhinderung der Bildung von Verwachsungen befassen. ^*

Zahlreiche prophylaktische Verfahren wurden versuchsweise angewandt, um die Ablagerung von Fibrin und die Bildung von Verwachsungen zu verhindern. Zur Verhinderung der Ablagerungvon Fibrin im peritonealen Exsudat hat man Natriumeitrat,Heparin und andere Antikoagulantien verwendet. Zur Entfernung von bereits gebildetem Fibrin wurden eine Reihe von Enzymen eingesetzt, z.B. Trypsin, Pepsin, Papain, Kyaluronidase, Streptokinase und Streptodornase. Gemäss anderen

Lösungsvorschlägen zur Entfernung von Fibrin verwendet man

Salze, wie Natrium-ricinoleat, oder Spülungen zur mechanischen Fibrinentfernung.

Heparin und Dicumarol waren die ersten Mittel, die zur Verhinderung von Fibrinablagerungen eingesetzt wurden (E. P. Lehman und F. Boys, Ann. Surg., Bd. 112 (1940), S. 969; B. H.

-δ-White, Ann. Surg., Bd. ? 30 (1949), S. 942), Bei Patienten, denen Heparin verabreicht wurde, wurde über Todesfälle und postoperative Hämorrhagien berichtet. In neuerer Zeit haben die antithrombogenen Eigenschaften von Dextran dazu geführt, dass man diese Substanz zur Verhinderung von Verwachsungen einsetzt (W. H. Choate et al., Arch. Surg., Bd. 88 (1964), S. 249). Es wurde festgestellt, dass eine intraperitoneale Verabreichung von Dextran die achtrere von Verwachsungen mindert, aber d?ren Bildung nicht verhindert (B. M. L. Kapur et al., Indian J. Med. Res., Bd. 56 (1968), S. 1406). Man bediente sich auch einer oralen Verabreichung des entzündungshemmenden Mittels Oxyphenbutazon zur Verringerung der Bildung von Verwachsungen (B. M. L. Kapur et al., Arch. Surg., Bd. 98 (1959), S. 301).

Spülungen mit Kochsalzlösung, Dextrose oder insbesondere mit

einer hypertonischen Dextroselösung wurden vorgeschlagen, jedoch erwiesen sich die Lösungen aufgrund ihrer raschen Resorption als unwirksam (J. R. Buchbinder, Surg. Gynec. Obstet.,Bd. 45 (1927), S. 769; H. P. Totten, Surgery, Bd. 8 (1940), S. 456). Man nahm an, dass Verdauungsenzyme, wie Pepsin und Trypsin, sich aufgrund einer Zerstörung von Fibrin als wertvoll erweisen. Jedoch werden diese beiden Substanzen durch peritoneale Exsudate rasch neutralisiert, so dass sie sich als unwirksamerwiesen (T. Kubota, Japan M. World, Bd. 11 (1922), S. 226). Man hat auch die Anwendung von Papain, einem proteolytischen Enzym versucht, es hat sich jedoch herausgestellt, dass dieses durch das peritoneale Exsudat neutralisiert wird. Auch bei oraler Verabreichung von Papain wurde festgestellt, dass eine

g_r Verminderung der Schwere von Verwachsungen eintritt, derenAuftreten jedoch nicht verhindert wird (B. M. L. Kapur et al., Arch. Surg., Bd. 98 (1969), S. 301). Eine intraperitoneale Verabreichung von Papain an Ratten hatte keinen Einfluss auf die Bildung von Verwachsungen (L. E. Stevens, Amer. J. Surg.,Bd. 115 (1968), S. 535).

Eine Anzahl von fibrinolytischen Mitteln wurde auf ihre Hemmwirkung gegen Verwachsungen getestet. Unter dem fibrinolytischen System wird typischerwaise das System im Blut verstanden, in dem die Umwandlung von Plasminogen in Plasmin erfolgt. Ein natürlicher Plasminogenektivator tritt in Wechselwirkung mit Plasminogen unter Umwandlung der Vorläuferverbindung zu Plasmin, das sodann vernetztes Fibrin auflöst. Exogene Aktivatoren, wi« Streptokinase oder Urokinase, aktivieren ebenfalls die Um Handlung von Plasminogen au Plasmin. Thrombolytische Mittel umfassen Plasmin und Plasminogenaktivatoren, wie Streptokinase, Streptodornase und Urokinase. Diese thrombolytischen und fibrinolytischen Mittel sowie andere Mittel wurden eingesetzt, um Fibrinablagerungen zu verhindern und Verwachsungen zu entfernen. Anfängliche Arbeiten zeigten, dass Streptokinase und Streptodornase traumatisch induzierte Verwachsungen bei Kaninchen, jedoch nicht bei Hunden verhinderten (I·. T. Wright et al., Proc. Soc. Exp. Bio?.. Med., Bd. 75 (1950), S. 602). In einer Untersuchung wurde beobachtet, dass eine intraperitoneale Therapie an drei aufeinanderfolgenden Tagen wirksamer als eine einzigeInjektion war (J. J. Knightly et al., Surgery, Bd. 52 (1962), -_f S,250). Andere Untersuchungen waren weniger gfinsta,g. In einer · Serie von Untersuchungen mit intravenöser und . ^

intraperitonealer Verabreichung einer Reihe von |

fibrinolytischen Enzymen an Hunde, Kaninchen und Ratten, sowie unter Anwendung verschiedener Techniken zur Bildung von Verwachsungen, wurden keine signifikanten prophylaktischen oder therapeutischen Wirkungen beobachtet (T. C. Jewett et al., Surgery, Bd. 57 (1965), S. 280). Kochgereinigte Streptokinase-Präparate, die in einer Einzeldosis oder in Form von mehreren Einzelinjektionen an drei aufeinanderfolgenden Tagen an Ratten verabreicht wurden, hemmten nicht die Bildung von Verwachsungen (D. C. O. James et al., J. Path. Bact., Bd. 90 (1965), S. 279). Weitere Untersuchungen unter Anwendung von gereinigter Streptokinase bei Kaninchen zeigten, dass Verwachsungen an Bereichen von

parietalen Verletzungen gehemmt werden konnten» indem man mehrfache Injektionen von Streptokinase in Lösung intraperitoneal an zwei oder drei aufeinanderfolgenden Tagen verabreicht. (D. C. 0. James et al., a.a.O.), Eine thrombolytische Therapie wurde zur Verhinderung von Fibrinablagerungen bei En^-karditiB bei Kaninchen eingesetzt (D. T. Duraug, J. Pat»»., b : ^9 (1975), S. 537). Fibrinolytische Mittel wurden *ur Verringerung von Wundinfektionen, die durch infizierte Plasmagerinnsel an Hauteinschnitten von Meerschweinchen induziert wurden, verwendet (G. Rodeheauer et al.« Am. J. Surg., Bd. 129 (1975), S. 537-544).

Weitere Verbindungen, bei denen eine fibrinolytische Wirkung beobachtet wurde, wurden ebenfalls zur Verhinderung von Verwachsungen eingesetzt. Bei Protoporphyrin, das eine fibrinolytische Wirkung besitzt, wurde festgestellt, dass es den prozentualen Anteil an Verwachsungen, die sich aufgrund einer Laparatomie bei Ratten bilden, verringert (N. lijima et al., Postgrad. Med. J., Bd. 46 (1970), S. 278). Hyaluronidase, ein Enzym, das Hyaluronsäure, ein eine interzelluläre Grundsubstanz darstellendes Polysaccharid, hydrolysiert,

to

verhinderte bei Hunden bei intraperitonealer Verabreichung die Bildung von Verwachsungen, wobei gleichzeitig Talkum verabreicht wurde, um die Bildung von Verwachsungen zu induzieren (J. E. Connolly und V. Richards, Surg. Forum, Bd. 2 (1951), S. 85). Andere Untersuchungen an Ratten im Anschluss an eine zökale Quetschung zeigten keine Verringerung des Auftretens von Verwachsungen · ach intraperitonealer Verabreichung von Hyaluronidase (J. Thomas et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., Bd. 74 (1950), S. 497).

Dexamethason, Methylprednisolon, Natriumsuccinat, Promethazinhydrochlorid und humanes Fibrinolysin allein und in Kombination wurden intramuskulär öder intraperitoneal an Ratten verabreicht, um die Bildunj von Verwachsungen zu

- 8 -ι verhindern (λ. O. Gazziniga et al., Arch. Surg., Bd. 110(1975), S. 429). Keines dieser Mittel führte bei alleiniger

Anwendung zu einem Ausbleiben ier Bildung von Verwachsungen.

Methylprednisolon, Promethazin und humanes Fibrinolysin führten bei kombinierter intraperitoneaJer Verabreichung in

einer Einzeldosis offensichtlich zu einem Ausbleiben der j

Bildung von Verwachsunger (A. G. Oazziniga et al., a.a.O.). j

Neben den vorerwähnten Substanzen wurden auch andere ,Q Substanzen in die Bauchfellhohle gebracht, um eine Bildung von Verwachsungen zu verhindern, z.B zerkleinertes

Ochssnperitoneum, Olivenöl, Epinephrinlösung, ;

Amnionflüssigkeit und Natriumricinoleat. Keine dieser Substanzen verhinderte die Bildung oder Neubildung von - Verwachsungen.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, neue pharmazeutische Q Zusammensetzungen zur Verhinderung der Fibrinablagerung oder der Bildung von Verwachsungen bereitzustellen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

_!5 Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue pharmazeutischeZusammensetzungen zur Verhinderung der Ablagerung von Fibrin , oder der Bildung von Verwachsungen bereitzustellen. Zu derartigen Ablagerungen oder Verwachsungen kommt es bei verschiedenen chirurgischen und klinischen Situationen, z.B.

Q bei chirurgischen Eingriffen im Bauch- und Beckenbereich,

chirurgischen Eingriffen an Sehnen, Laminektomie, abdominalen ' Infektionen, Entzündungen oder Verletzungen. Diese Zusammensetzungen sollen leicht und bequem an den Stellen, an denen die Gefahr von Fibrinablagerungen oder de'. Bildung von ^₅ Verwachsungen besteht, eingesetzt werden können. Durchtopi ;che Anwendung dieser Zusammensetzungen an den Organen

271248

- 9 - h

ι und/oder dem umgebenden Gewebe, an denen die Gefahr von |!

Fibrinablaperungen oder der Bildung von Verwachsungen besteht, <qy sollen diese Fibrinablagerungen oder Bildung von Verwachsungen

verhindert werden. Ferner coil erfindungsgemäss die I

. Notwendigkeit einer Einführung von nicht-abbaubaren ί

Feststoffen als Massnahme zur Freisetzung von Mitteln, die ^: Fibrinablagerungen oder die Bildung von Verwachsungen

verhindern, entfallen. Ferner sollen fjrfindunggemass Enzyme ';

zur Verhinderung von Fibrinablagerumgen oder der Bildung von \

,( Verwachsungen in solcher Form bereitgestellt Herden, dass sie j

nicht durch Substanzen in der in Mirage stehenden biologischen Flüssigkeit inaktiviert werden. Sohiiesslich sollen .

erfindungsgemäss derartige Enzyme in einem Präparat bereitgestellt werden, das eine kontinuierliche , Wirkstoffreisetzung ohne Notwendigkeit von exogenen Matrices oder Vorrichtungen gewährleistet.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eirur topisch anwendbaren pharmazeutischen Zusammensetzung zur

_;,,. Verhinderung von Fibrinablagerungen oder der Bildung oder Neubildung von Verwachsungen an Stellen von möglichen Fibrinablagerungen oder Bildung von Verwachsungen, das durch Vermischen eines massig löslichen Enzyms und eines inerten haftungsfördernden Trägers gekennzeichnet ist. Das massig

,,,, lösliche Enzym ermöglicht den kontinuierlichen Einsatz desEnzyms an der Stelle von möglichen Fibrinablagerungen oder der Bildung von Verwachsungen. Ein massig lösliches Enzym, das fibrinolytisch oder thrombolytisch wirkt, erweist sich bei der Behandlung von Verwachsungen, insbesondere im Anschluss an _;

₍ . chirurgische Eingriffe, Infektionen, Verletzungen oderEntzündungen, als wertvoll, wenn es topisch an die Stelle der /möglichen Fibrinablagerungen oder Bildung von Verwachsungen so abgegeben wird, dass das Enzym mindestens etwa drei Tage lang ständig an dieser Stelle verfügbar ist. Das massig lösliche Enzym wird vorzugsweise in Form von suspendierten festen Teilchen in einem inerten, haftungsfördernden Träger, der die

-ιοί Abgabe dee Enzmys über einen längeren Zeitraum hinwegerleichtert, abgegeben. Bis zum Zeitpunkt der vorliegenden Erfindung war es nicht bekannt, dass eine einzige topische Anwendung eines massig löslichen, festen Enzyms an einer bestimmten Stelle eine kontinuierliche Abgabe des Enzyms unter Verhinderung der Ablagerung von Fibrin oder der Bildung von Verwachsungen gewährleistet. Vorzugsweise handelt es sich beim erfindungsgemäss verwendeten Enzym um präzipitierten Gewebe-Plasminogenaktivator. Demzufolge ist die Erfindung auf eine

IQ pharmazeutische Zusammensetzung abgestellt, die ein massig

lösliches Enzym. z.B. Gewebe-Plasminogenaktivator, enthält, um die Bildung von Verwachsungen in verschiedenen Situationen, z.B. im Anschluss an chirurgische Eingriffe oder Infektionen, zu verhindern. Somit wird eine Möglichkeit der Behandlung vonklinischen Fibrinablagerungen oder Verwachsungen unter Verwendung der erfindungsgemässen Zusammensetzungen bereitgestellt.

Kurze Erläuterung der Zeichnungen Fig. 1 zeigt den Einfluss der Dosierungen von rekombinantem

Gewebe-Plasminogenaktivator auf die Verhinderung der Bildung von Verwachsungen bei Kaninchen. Unterschiedliche Mengen von rekombinantem Gewebe-

Plasminogenaktivator wurden in 2,5 g eines halbfesten

Trägers auf traumatisierte Gewebebereiche im Peritoneum aufgebracht. Nach einer Woche wurden die Tiere getötet, und das Ausmass der Verwachsungen wurde bewertet. Die Anzahl der Kaninchen, die bei Dosierungen von 0,125 und

₃q 0,25 mg rekombinantem Gewebe-Plasminogenaktivator/g GelVerwachsungen zeigten, unterschied sich signifikant (p < 0,01) von der Kontrollgruppe und von der Gruppe mit \ 0,062 mg rekombinantem Gewebe-Plasminogenaktivator/g \ Gel, bestimmt gemäss dem nicht-parametrischen Mann- *

ge Whitney-Test.

- 11 -

Fig. 2 zeigt den Einfluss von lekombinantem Gewebe-Plasminogenaktivator auf die Verhinderung der ; Neubildung von Verwachsungen nach chirurgischer Lösung. [ Das Ausmass von bei unbehandelten Kaninchen gebildeten |

Verwachsungen nach Ablauf von sieben Tagen ist |

angegeben. Nach chirurgischer Lösung der gebildeten Verwachsungen wurden die Tiere in zwei Gruppen eingeteilt. Die Kontrolltiere erhielten nur den Träger und die behandelten Tiere 0,25 mg rekombinanten Gewebe-Plasminogenaktivator/g Gel. Am 14. Tag zeigte sich bei den Tieren, denen 4er rekombinante Gewebe-Plasminogenaktivator verabreicht worden war, eine drastische Verringerung des Grads an neu gebildeten Verwachsungen.

Fig. 3 zeigt den Einfluss der Dosierungen «n rekombinantem

Gewebe-Plasminogenaktivator in Bezug auf die Verhinderung der Bildung von Verwachsungen bei Kaninchen. Unterschiedliche Mengen an rekombinantem Gewebe-Plasminogenaktivator in 2,5 g eines 2,8 %igen Gels von Natriumhyaluronat wurden an den traumatisierten Gewebebereichen im Peritoneum angewandt. Nach einer Woche wurden die Tiere getötet und das Ausmass der Verwachsungen wurde bewertet.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Der hier verwendete Ausdruck "massig lösliches Enzym" bedeutet ein Enzym in einer Molekülform, die sich in einer biologischen

QQ Flüssigkeit mit einer gewünschten Geschwindigkeit löst, so

dass es möglich ist, eine Ablagerung von Fibrin oder die ' Bildung von Verwachsungen durch eine einzige topischeAnwendung an der Stelle einer möglichen Fibrinablagerung oder der Bildung von Verwachsungen zu verhindern. Das Enzym wird andie Stelle der möglichen Fibrinablagerung oder Bildung von Verwachsungen in Form eines Feststoffs, beispielsweise eines

271 2*8

- 12 -Pulvers, einer Aufschlämmung oder Suspension angewandt.

"Massig löslich" bedeutet die relativ geringe Löslichkeit des Enzyms in biologischen Flüssigkeiten« wie Plasma, Interstitial- oder Peritonealflüssigkeit. Die Geschwindigkeit der Auflösung wird so gewählt, dass sich das Enzym in derbiologischen Flüssigkeit im Verlauf eine* Zeitspanne löst, die ausreicht, um die Ablagerung von Fibrin oder die Bildung oder Neubildung von Verwachsungen an der Zielstelle zu verh* lern, typischerweise in einem Zeitraum von etwa 3 bis 14 Tagen. DieAuflösung des massig löslichen Enzyms an der Stelle der möglichen Fibrinablagerung oder der möglichen Bildung von Verwachsungen über eine bestimmte Zeitspanne hinweg ist auf die relativ geringe Löslichkeit zurückzuführen. Diese verzögerte Auflösung innerhalb einer bestimmten Zeitspanne

_L5 ermöglicht eine einzige topische Anwendung unter

Gewährleistung einer kontinuierlichen Freisetzung eines aktiven Enzyms im Verlauf der gewünschten Zeitspanne. Vorzugsweise handelt es sich beim massig löslichen Enzym zum Anwendungszeitpunkt um einen Feststoff. Zu den

2Q erfindungsgemäss geeigneten Enzymen gehören thrombolytische oder fibrinolytische Enzyme, wie Plasmin, Streptokinase, Urokinase, Gewebe-Plasminogenaktivator und S-;reptodornase. Zu den fibrinolytischen Enzymen gehören Enzyme, die Plasminogen in Plasmin umwandeln, wie Streptokinase, Urokinase und

2g Plasminogenaktivator, oder die Fibrin direkt abbauen. Zu den thrombolytischen Enzymen gehören fibrinolytische Enzyme sowie andere proteolytische Enzyme. Ein Beispiel für ein derartiges proteolytisches Enzym ist Brinase. Ein bevorzugtes massig lösliches, festes Enzym ist ''Gewebe-Plasminogenaktivator",

OQ worunter hier ein Enzym zu verstehen ist, das aus natürlichen Quellen extrahiert und gereinigt werden kann (vgl. US-PS 4 / 603) oder das unter Anwendung rekombinanter Techniken erhalten werden kann (vgl. EP-A-093 619). Die erfindungsgemäss geeigneten Enzyme lassen sich aus Säugetier-*, Bakterien- oder

_Oc Hefequellen erhalten. Vorzugsweise wird das homologe Enzym für die zu behandelnde Spezies verwendet. Beispielsweise wird von

2712*8

- 13 -

Hunden stammendes Enzym erfindungsgemäss zur Verhinderung der Bildung von Verwachsungen bei Hunden eingesetzt. Unter den Schutzumfang der Erfindung fallen auch feste Enzyme, bei denen es sich um Varianten mit Aminosäure-Substitutionen und/oder

Deletionen und/oder Additionen, organische und anorganische Salze und kovalent modifizierte Derivate von Gewebe- , -_t Plasminogenaktivator handelt. ' Der Ausdruck "fest" beschreibt den bevorzugten Zustand des |

Enzyms zum Zeitpunkt der Anwendung an der Stelle der möglichen Bildung von Verwachsungen. Das Enzym liegt in einer im wesentlichen homogenen Form vor, ohne dass ein Mittel vorhanden ist, das eine kovalente oder nicht-kovalente Bindung mit dem Enzym eingeht, um eine Freistzung des Enzyms innerhalbeiner bestimmten Zeitspanne zu gewährleisten. Das feste Enzym liegt im Fall von Gewebe-Plasminogenaktivator als weisses, amorphes Pulver vor. Der feste Zustand des Enzyms kann unter Anwendung verschiedener, dem Fachmann geläufiger Verfahren erreicht werden, beispielsweise durch Dialyse, Fällung oder

>q Lyophilisation. Die Fällung des Bnsyms kann beispielsweise erreicht werden, indem man den pH-Wert, die Zusammensetzung des Kolösungsmittels, die -Temperatur und die Salzbeschaffenheit verändert. Eine Lyophilisation des Enzyms lässt sich beispielsweise in Form einer nicht-wässerigenLyophilisation unter Verwendung von tert.-Butanol, durch eine wässerige Lyophilisation unter Anwendung von beispielsweise Wassersublimation oder eines flüchtigen Puffers, wie Ammoniumacetat oder Ammoniumbicarbonat, und Wasser und schliesslich durch eine wässerige/nicht-wässerige

₃q Lyophilisation erreichen. Die wässerige Lyophilisation wird

bevorzugt. Besonders bevorzugt wird eine wässerige ' Lyophilisation unter Verwendung von Ammoniumbicarbonat und Wasser.

27t 2Ä8

- 14 -

Die Zusammensetzung der Erfindung umfaßt eine therapeutisch wirksame Menge eines mäßig löslichen Enzyms in beispielsweise pulverisierter Form. Die Zusammensetzung kann zusätzlich einen inerten, haftungsfordernden Träger enthalten. Die Zusammensetzung der Erfindung wird direkt an der stelle einer möglichen Fibrinabiagerung oder der möglichen Bildung von Verwachsungen angewandt, um das Enzym kontinuierlich über eine bestimmte Zeitdauer an dieser Stelle freizusetzen. Eine Suspension des Enzyms in einem inerten, nicht-toxischen, haftungsfordernden Träger verringert die Wahrscheinlichkeit eines Abbaus durch endogene Proteasen. Die' haftende Beschaffenheit des inerten Trägers ermöglicht ein Verweilen des festen Enzyms ar der Anwendungsstelle. Dies ermöglicht eine lokalisierte, kontinuierliche Freisetzung des Enzyms an der Anwendungsstellc über einen bestimmten Zeitraum hinweg. Unter dem Ausdruck "kontinuierlich" ist eine ununterbrochene Freisetzung des Enzyms an der Anwendungsstelle über einen bestimmten Zeitraum hinweg zu verstehen. Somit wird durch das neue Präparat die Auflösung des festen Enzyms in den biologischen Flüssigkeiten kontrolliert und ein Schutz gegen einen Abbau gewährleistet. Das mäßig lösliche Enzym kann in einer Dosierung verabreicht werden, die ausreicht, um im Anschluß an chirurgische Eingriffe, Infektionen, Traumata oder Entzündungen Fibrinablagerungen oder die Bildung von Verwachsungen zu verhindern. Therapeutisch wirksame Mengen des mäßig löslichen Enzyms werden in Übereinstimmung mit der erfindungsgemäß gegebenen Lehre verabreicht. Beispielsweise liegen therapeutisch wirksame Mengen an Streptokinase in mäßig löslicher Form im Bereich von etwa 300 Einheiten/g Gel bis 12 500 Einheiten/g Gel. Eine bevorzugte therapeutische Menge an Treptokinase liegt im Bereich von etwa 10 000 Sinheiten/g Gel bis etwa 375 000 Einheiten/g Gel. Im Fall von Gewebe-Plasminogenaktivator in fester Form liegen therapeutisch wirksame Menqen im Bereich von etwa 0,02 bis 25 mg/g Gel, Eine bevorzugte thera~ peutische Menge an Gewebe-Plasminogenaktivator Ziegt im Bereich

- 15 -

von 0,125 bis 2,5 mg/g GeX. Eins besonders bevorzugte therapeutische Menge an Gewebe-Plasminogenaktivator liegt im Bereich von etwa 0,25 bis etwa 1,0 g/g Gel.

Ein haftungsfördernder Träger ist als halbfester, muzilaginöser, pharmazeutisch inerter Träger definiert, mit dem das mäßig lösliche Enzym an der Stelle einer möglichen Bildung von Verwachsungen in Position gebracht wird. Die Träger sind inert, nichttoxisch, nicht-reizend und physiologisch und pharmazeutisch verträglich. Die Träger sind im allgemeinen biologisch abtragbar, da sie von der Anwendungsstelle abgewaschen bzw. abgetragen werden, im Unterschied zu biologisch abbaubaren Trägern, bei denen ein chemischer Abbau des Trägers erforderlich ist, um das aktive Enzym freizusetzen. Die inerten, haftungsfordernden Träger gewährleisten eine kontinuierliche Freisetzung des festen Enzyms an der Anwendungsstelle, wobei das Auftreten des Enzyms an unerwünschten Stellen, z.B. im Blut, vermindert wird. Die mäßig lösliche Form des Enzyms kann haftende Eigenschaften besitzen, so daß die Verwendung eines inerten, haftungsfordernden

:0 Trägers unnötig ist. Langkettige Kohlenwasserstoffe oder pflanzliche öle una Wachse, die aus Gemischen von gesättigten und ungesättigten Fettsäureglyceriden oder aus Gemischen von modifizierten gesättigten oder ungesättigten Fettsäureglyceriden zusammengesetzt sind, können als derartigeiherte, haftunqs-

.4 5 fördernde Träger verwendet werden. Derartige Träger umfassen (ohne Beschränkung hierauf) halbfeste Träger, wie Petrolatum" Gelee oder halbsynthetische G.lyceride, PolyhydroxylöBungsmitte.1._r wie Glycerin, langkettige Kohlenwasserstoffe, biologisch abtragbare Polymere oder Liposomen. Zu den biologisch abtragbaren Polymeren gehören niedermolekulare Polymere, die in Form halbfester Präparate gebracht werden können. Zu derartigen halbfesten Polymeren gehören Polyester, Polyamide, Polyaminosäuren, Polyacetale, Polyanhydride, Polyorthoester und Polysaccharide, z.B. das natürliche Kohlenhydrat, das aus abwechselnden Einheiten von ß-D-Glucuronsäure und 2-Acetamido-2-desoxy-ß-D-glucose besteht und als Hyaluronsäure bekannt ist.

2712Ä8 "

- 16 -

ι Polysaccharide werden als inerte, haftungsfordernde Träger bevorzugt. Besonders bevorzugt ist Hyaluronsäure. Die inerten,nicht· toxischen Träger der Erfindung sollen keine biologisch abbaubaren oder nicht-abbaubare Feststoffe mit Ausnahme des mäßig löslichen Enzyme enthalten, da festgestellt worden ist, daß die Anwendung von Pulvern, wie Magnesiumsilikat, Talkum und Stärke, zu Verwachsungen führt (S.L. Corson, J. Reprod. Med., Bd. 29 (3) (1984), S. 143).

Die mäßig lösliche Form des Enzyms kann im pharmazeutisch inerten, haftungsfordernden Träger dispergiert sein, um an der Anwendungsstelle eine entsprechende Auflösungsgeschwindigkeit zu erreichen. Die mäßig lösliche Form kontrolliert die Freisetzung in die biologische Flüssigkeit und gewährleistet eine entsprechende Aktivität über eine gewünschte Zeitdauer hinweg. Dies steht im Gegensatz zu einer löslichen Form des Enzyms, die sofort verfügbar wäre. Vorhersagen über die Freisetzung des Enzyms können aufgrund von dessen Löslichkeit und dessen Teilchengröße gemacht werden, wie nachstehend gezeigt ist. Für einen monolithisehen Träger, bei dem das Enzym in Form von festen Teilchen in einer inerten Matrix dispergiert ist, ergibt sich die Freisetzungsgeschwindigkeit des Enzyms gemäß folgender Gleichung«

dT- ⁼ J5 und die zu einem beliebigen Zeitpunkt nach der Verabreichung freigesetzte Menge kann annähernd durch folgende Gleichung bestimmt werden:

M = (2ADC t)^1/2 .

In diesen Gleichungen bedeutet M die Menge des freigesetzten Enzyms, A die Arzneistoffmenge pro Einheitsmasse des Trägers, C_s die Löslichkeit des Enzyms im Träger, D den Diffusionskoeffizienten des Enzyms, t die Zeit und dx die Dicke der vom Enzym befreiten Zone innerhalb der Matrix (T. Higuchi, J. ßoc. Cosmetic Chemists, Bd. 11, 1060. S. 85, T. Higuchi. J. Pharm. Sei. Bd. 50 (1961), S. 874. Infolgedessen läßt sich die Freisetzunqsgeschwindigkeit aus einem derartigen Präparatetyp durch

-πι Variieren von C_s, d.h. der Löslichkeit des Enzyms, (beispielsweise unter Verwendung von unterschiedlichen Arten von Trägern) oder durch Kontrolle der Arzneistoff menge im Träger modifizieren.

Wenn das Enzym in Form von festen Teilchen in einem wasserlöslichen Träger suspendiert wird, läßt sich die Freisetzungsgeschwindigkeit des Proteins durch die klassische Noyes-Gloichung beschreiben:

dM _ DA (C₄₅-C) dt - "K ^s

Dabei bedeutet M clie freigesetzte oder gelöste Menge, t die Zeit, D den Diffusionskoeffizionten der Arznei stoffmoleküle im Medium, A die betroffene Oberfläche, h die Dicke der Dif-

is sionsschicht, C und C die Löslichkeit und die Konzentration des Enzyms an der Anwendungsstelle. Im Fall von festen Enzym- ! teilchen, die sich in einem rasch auflösbaren Träger befinden, * verbleibt nach Auflösung des Trägers im dazwischenliegenden | Raum eine Dispersion des Enzyms in diesem Raum. Da das Enzym ^ relativ unlöslich ist, geht es je nach seiner Löslichkeit und seiner Teilchengröße innerhalb eines gewünschten Zeitraums in Lösung. Gemäß dieser G..eichung läßt sich die Fre.'.setzungsgeschwindigkeit das mäßig löslichen Enzyms aus einem wasserlös-· liehen Träger durch Variation von A, der freiliegenden Teilchenoberflache kontrollieren bzw.. steuern. Dies kann durch Kontrolle der Teilchengröße erreicht werden. Größere Teilchen führen zu einer kleineren Oberfläche und einer kleineren Freisetzungsgeschwindigkeit, während kleinere Teilchen eine erhöhte freiliegende Gesamtfläche ergeben und somit zu einer höheren Freisetzungsgeschwindigkeit führen.

Das mäßig lösliche Enzym ist nicht so unlöslich, daß es in der biologischen Flüssigkeit extrem lange bei sehr niedriger Aktivität vorliegt. Die Form von geringer Löslichkeit gewährleistet eine kontinuierliche Freisetzung über die gewünschte Zeitspanne hinweg. Diese kontinuierliche Freisetzung kann auch

- 18 -

durch Verwendung eines inerten Trägers gefördert werden. Die bevorzugten Träger sind se beschaffen, daß aie die Freisetzung des Enzyms über die gewünschte Zeitspanne hinweg gewährleisten, Die Zeitspanne, in der das Enzym kontinuierlich freigesetzt wird, beträgt mindestens etwa 3 Tage bis etwa 2 Wochen. Die bevorzugte Zeitspanne für die Freisetzung des Enzyms beträgt mindestens etwa 4 Tage bis etwa 10 Tage.

Ein geeignetes Abgabesystem zum Auftragen des mäßig löslichen _ Enzyms an der Stelle der möglichen Bildung einer Verwachsung umfaßt ein Behältermischsystem mit einer Vorrichtung zum Vermischen des Inhalts von zwei Behältern. Das Abgabesystem weist einen ersten flexiblen Behälter, der zur getrennten Aufbewahrung, eines sterilen, haftungsfordernden Trägers geeignet ist, und einen zweiten flexiblen Behälter auf, der zur Aufbewahrung des mäßig löslichen Enzyms geeignet ist. Der erste flexible Behälter weist ein Öffnungselement mit einem durchstoßbaren Diaphragma auf. Der zweite flexible Behälter besitzt eine reziproke öffnung, die zum Mischen der.sterilen Lösung mit dem mäßig löslichen Enzym in die entsprechende Stellung an der öffnung des ersten Behälters gebracht wird. Die Flexibilität beider Behälter oder zumindest eines Behälters ermöglicht das Vermischen des Inhalts der Behälter. Der zweite Behälter weist eine flexible Verschlußeinrichtung auf, mit dem er dicht verschlossen werden kann. Dia flexible Verschlußeinrichtung weist eine Arstrittsöffnung auf, durch die das gelförmige Medikament, das eine therapeutisch, wirksame Menge des mäßig löslichen Enzyms und das Verdünnungsmittel oder einen inerten, haftungsfördernden Träger enthält, an die Stelle der möglichen Bildung _n von Verwachsungen gelangt.

Eine Verabreichung der erfindungsgemäßen Enzym-Zusamrcensetzung kann vor d<=».i Legen einer chirurgischen Naht erfolgen. Bei abdominalen chirurgischen Eingriffen wird die erfindungsgemäße Zusammensetzung, d.h. das mäßig lösliche Enzym allein, oder in Kombination mit einem inerten, haftungsfordernden Träger von Hand, durch Massage oder nach einem anderen geeigneten Verfah-

2712*8

-ΙΟΙ ren. z.B. über ein Laparoskop, in Form eines dünnen Films auf die abdominalen Organe aufgebracht, bevor das Omentum über die Organe vor dem Nähen gezogen wird. Dem Chirurgen ist es klar, auf welche Organe die Zusammensetzung aufzutragen ist. Beispielsweise ist im Fall eines abdominalen chirurgischen Eingriffs der Dünndarm eine infrage kommende Anwendungsstelle. Die Menge der aufzubringenden Zusammensetzung entspricht den vorstehenden Angaben und wird je nach den klinischen Erfahrungen, z.B. dem Grad der Schädigung, der Art des Eingriffs, dem Zustand des Patienten, der thrombolytischen Aktivitäten des Enzyms und anderen derartigen Faktoren, wie sie dem Fachmann geläufig sind, gewählt.

Ausführungsbeispiel; 15

Beispiel

Materialien und Methoden (1) Kaninchenversuch

Der stärkste Stimulus zur Bildung von Verwachsungen besteht in der Anwesenheit von ischämischem Gewebe, das sich beim Nähen oder Flicken von peritonealen Defekten eher als an der fre'.ge-. legten peritonealen Oberfläche ergibt. Weiße New Zeidand-Kaninchen (etwa 3,0 kg Gewicht) wurden mit Fluanizone und Fentanyl betäubt. Unter Anwendung sauberer operativer Techniken wurde eine Mittellinien-Laparotomie durchgeführt. Eine Fläche von 9 cm² der peritonealen Wand wurde entfernt und mit einer Seidennaht an den Ecken wieder angenäht, wodurch ein ischämischer Flecken des peritonealen Gewebes entstand. Ein proximaler Bereich des Zökums (etwa 75 cm²) wurde mit trockener Gaze abgeschürft, bis eine punktuelle Blutung auftrat. Ein unlösliches oder relativ unlösliches Enzym mit thrombolytischer oder fibrinolytischer Aktivität wurde auf das ischämische Gewebe entweder als Film auf die erfindungsgemäße Weise direkt auf die ausgewählten Organe oder in Form einer Spülung (0,5 mg Gewebe-Plasminogenaktivator/150 ml isotone Kochsalzlösung) oder über

- 20 -

eine vaskuläre Zugangsöffnung, dia dia Arzneiatofflösung direkt auf das genähte peritoneale Gewebe über eine externe Anwendung des Präparats auf der Fläche (2,5 g Gel mit einem Gehalt an 0,25 mg Gewebe-Plaaminogenaktivator/g Prifcarat transportiert , aufgebracht. Nach Rückführung dee zökums in die Abdominalhöhle wurde die Muskelschicht des Abdomens durch eine Naht mit 1,0 Prolin und die Hautschicht mit 2,0 Prolin geschlossen. Nach 7 Tagen wurden die Kaninchen getötet. Eine erneute Laparatomie wurde durchgeführt, um das Ausmaß der ge-

[Q bildeten Verwachsungen zu bestimmen. Pie Kriterien für das Auftreten einer Verwachsung war die Haftung dea Zökums am ischämischen Flecken des Gewebes an der peritonealen Wand. Zur Bewertung der Schwere der Verwachsungen wurde folgendes Bewertungssystem angewandt:

_L5 0 = Keine Verwachsungen beobachtet

1 = weniger als 10 % des ischämischen Fleckens sind mit

Verwachsungen bedeckt

2 =► 25 % des ischämischen Fleckens sind mit Verwachsungen

bedeckt.

2Q 3 = 50 % des ischämischen Fleckens sind mit Verwachsungen bedeckt.

4 = 100 % des ischämischen Fleckens sind mit Verwachsungen

bedeckt,

5 = Eine Fläche, die größer als der ischämische Flecken ist, ist mit Verwachsungen bedeckt.

2) Gewebe-Plasminogenaktiyator-Pulyer

Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Pulver wurde hergestellt, indem man den lösenden Puffer aus einer Vorratslösung durch Dialyse entfernte. Hierzu wurden 1000 ml einer Lösung mit einem Gehalt an 2,5 mg/ml Gewebe-Plasminogenaktivator, 87,1 mg/ml L-Arginin, 26,8 mg/ml Phosphorsäure (85 % Gew. /Gew. ) und 0,1 mg/ml Polysorbate 80 in Portionen von je 100 ml aufgeteilt und in Dialyse-Membranschläuche (Spectrapor-MembranschlUuche mit einer Molekulargewichtsausschlußgrenze von 6000 bis 8000) gebracht. Die einzelnen Portionen wurden bu 5⁰C ge-

27ί 268

- 21 -

L gen 1000 ml gereinigtes und steriles Wasser dialysiert. Nach viermaligem Austausch des Dialysats wurde der Proteinniederschlag im Innern der Schläuche gewonnen. Nach Zentrifugation (15 min bei 4000 U/min bei 5⁰C in einer Beckman Accu-spin-

> Kühlzentrifuge) und Dekantieren der überstehenden Flüssigkeit/ wurde gereinigtes und steriles Wasser in den Schlauch gegeben. Das Protein wurde mittels eines Mischers (Vortex-Mischer) gespült und wieder durch Zentrifugation abgetrennt. Dieser Vorgang wurde dreimal wiederholt. Das Produkt wurde in Form eines weißen, amorphen Pulvers erhalten. Nach der letzten Spülung wurde der Gewebe-Plasminogenaktivator gewonnen und in Form eines sterilen Pulvers in einem Einheitsdosis-Präparat bereitgestellt.

3) Einheitsdosis-Pulverpräparat

a) Wasserfällung

t-PA-Masse (t-PA = Gewebe-Plasminogenaktivator) wurde 24-fach durch Ultrafiltration von Wasser und Argininphosphat ]< onzentriert. Die konzentrierte Masse wurde steril filtriert. t-PA wurde durch Zugabe von Wasser zur konzentrierten Masse ausgefällt. Argininphosphat und restlicher löslicher t-PA wurde aus der gefällten Suspension durch aufeinanderfolgende Waschungen mit Wasser entfernt. Die gewaschene Suspension wurde in Form einer Aufschlämmung in Fläschchen gefüllt. Der Inhalt der Fläschchen w-.irde zur Bildung von t-PA-Pulver lyophilisiert.

b) pH-Fällung

Der pH-Wert der t-PA-Masse wurde mit Phosphorsäure auf 4 eingestellt. Argininphosphat in der t-PA-Masse wurde durch Diafiltration mit Salzsäurelösung (pH-Wert 4) ausgetauscht. Die t-PA-Salzsäure-Masse wurde sodann steril filtriert. T-PA wurde durch Einstellen des pH-Werts der filtrierten Masse mit

)5 verdünnter Matriumhydroxidlösung auf 6 ausgefällt. Natriumchlorid und restlicher löslicher t-PA wurden aus der ausgefäll-

- 22 -

! ten Suspension durch aufeinanderfolgende Waschungen mit Wasser entfernt. Die gewaschene Suspension wurde in Form einer Aufschlämmung in Fläschchen gefüllt. Der inhalt der Fläschchen wurde zur Bildung von t-PA-Pulver lyophilisiert.

c) Ammoniumblcarbonat -Lyopftll·l8a,tlon

E;«.n Austausch der t-PA-Masse-Lösung mit einem Gehalt an Q, 5 m Argininphosphat vom pH-Wert 7,2 und Tween 80 (0,19 mg/ml) durch einen flüchtigen Puffer, wie Ammoniumbicarbonat, mit einer Konzentration im Bereich von 0,2 bis 0,8 m (bevorzugter Konzentrationsbereich 0,25 ,.,is 0,5 m) und einem pH-Wert im Bereich von 7,0 bis 10,5 wurde bei einer Temperatur im Bereich von 2 bis 28°C über eine G-25-Säulo durchgeführt. Der mit Ammoniumbicarbonat und Tween 80 eluierte t-PA wurde gewonnen und durch Ultrafiltration .bei einer Ammoniuinbicarbonatkonzentration auf der Basis der Löslichkeit von t-PA im gewählten Ammoniumbicarbonatpuffer und bei der Verfahrenstemperatur konzentriert. Die t-PA/Ammoniumbicarbonat-Masse wurde sodann steril filtriert. Die filtrierte Masse wurde in zwei Fläschchen abgefüllt. Der Fläschcheninhalt wurde zur Bildung von t-PA-Pulver lyophüisiert.

4) Präparat in Dosierungsform

Verschiedene wäßrige Lösungen, die Lösungen gemäß dem Stand der Technik ähnlich waren, wurden hergestellt und getestet, beispielsweise unter Verwendung von kolloidalen Polysacchariden, wie Dextran oder modifizierte Cellulosegummen (Präparate 1 und 2 von Abschnitt 4), modifiziertes Kollagen oder Poloxamere (Präparate 3 und 4 von Abschnitt 4) und durch Zuoabe von Polyäthvlenglvkolpolvmeren eingedicktes Glycerin (Präparat 5 von Abschnitt 4). Die Präparate 1 bis 4 fallen in zwei Kategorien: In einem wäßrigen Gel solubilisierter Gewebe-Plasminogenaktivator (Präparate 1 und 3); und in Form von mäßig löslichen Teilchen in einem wäßrigen Gel suspendierter Gewebe-Plasminogenaktivator (Präparate 2 und 4).

- 23 -

Präparat 1 ι

A»Pufferlösung L-Arginin

H₃PO₄ (35 % Gew./Gew.) gereinigtes Wasser ad

27f268

3,48 g 1/54 g 100 g

L-Arginin wurde in 90 ml gereinigtem Wasser gelöst. 1,54 g Phosphorsäure wurde langsam unter Bildung einer Lösung vom pHrWert 6,0 zugesetzt. Das Volumen der Lösung wurde mit gereinigtem Wasser auf 100 ml gebracht. Die Lösung wurde durch ein Sterilfilter von 0,22 μΐη Filterporengröße (Millex-GV oder äquivalentes Produkt) gegeben und bei 5⁰C aufbewahrt.

B. Fertiges Präparat

Dextran (MG 2 000 000) Gewebe-P.lasminogen-Aktivator Pufferlösung A ad

0,1 - 0,5 g 0,00025 g 1,00 g

Der Gewebe-Plasminogenaktivator wurde zu der Puffevlösung A gegeben und darin gelöst. Dextran wurde langsam unter heftigem Mischen zugesetzt, um das Polymer unter Bildung einer homogenen Lösung zu lösen.

Präparat 2

Dextran (MG 2 000 000)

Gewebe-Plasminogenaktivator mäßig lösliche Teilchen

gereinigtes Wasser ad

0,1 - 0,3 g

0,00025 g 1,00 g

Das Dextran wurde in Wasser unter heftigem Mischen gelöst, bis eine homogene Lösung entstand. Der Gewebe-Plasminogenaktivator wurde zu der Lösung gegeben und vermischt, und das Protein wurde bis zur Homogenität dispergiert.

- 24 -

Präparat 3

A. Pufferlösung

L-Arginin H₃PO₄ (85 % Gew./Gew.)

gereinigtes Wasser ad

3,48 g 1,54 g 100 g

Das .V-Arginin wurde in 90 ml gereinigtem Wasser gelöst. Phosphorsäure wurde langsam zu einer Bildung einer Lösung vom pH-Wert 6,0 zugesetzt. Die Menge betrug etwa 1,54 g. Das Volumen der Lösung wurde mit gereinigtem Wasser auf 100 ml gebracht. Die Lösung wurde durch ein Sterilfilter von 0,22 μΐη Filterporengröße (Millex-GV oder Äquivalentes· Produkt) gegeben. Die Lösung wurde bei 5⁰C aufbewahrt und zur Herstellung des fertigen Präparats verwendet.

B. Fertiges Präparat

Polaxamer 407	0,	05 - 0,	3 g
Löslicher Gewebe-Plasminogen- Aktivator	0,	00025	g
Pufferlösung A ad	1,	0	g

Die Pufferlösung A wurde auf 5⁰C gekühlt und mit dem Plasminogen-Aktivator unter Lösung dieses Produkts versetzt. Sodann wurde das Poloxamer zugesetzt und unter heftigem Mischen gelöst, bis eine homogene Lösung entstand. Dia Lösung wurde durch ein Sterilfilter von 0,22 μπι Por&ngröbe (rfillex-GV oder äquivalentes Produkt) gegeben.

Präparat 4 Poloxamer 407

Gewebe-Plasminogen-Aktivator mäßig lösliche Teilchen

gereinigtes Wasser ad

0,05 - 0,3 g

0,00006 1,00

g g

Das Wasser wurde auf 5⁰C gekühlt. Poloxamer 407 wurde zugesetzt und unter heftigem Mischen gelöst, bis eine homggene Lösung entstand, Gewebe-Plasminogen-Aktivator wurde zugesetzt

und homogen dispergiert.

Bei den Präparaten 5 bis 9 handelt es sich um weitere Beispiele für erfindungsgemäße Zusammensetzungen, die sich in drei breite Kategorien einteilen lassen: Gewebe-Plasminogenaktivator, suspendiert als mäßig lösliche Teilchen in einem wasserfreien, wasserlöslichen Gel (Präparat 5); Gewebe-Plasminogenaktivator, suspendiert als mäßig lösliches Teilchen in einer Grundlage aus langkettigen Kohlenwasserstoffen (Präparat 6); und Gewebe-Piasminogenaktivator, suspendiert als mäßig lösliche Teilchen in einem biolocri3ch abtragbaren, halbsynthetischen öl und Wachs, das aus Gemischen von ungesättigten und qesättigten Fettsäureglyceriden zusammengesetzt ist (Präparate 7, 8 und 9).

Präparat 5

Polyäthylenglykol, (MG 800 - 1500) 0,0 - 0,3 g Gewebe-Piasminogen-Aktivator 0,00025 g

Glycerin ad 1,00 g

Glycerin wurde auf etwa 35 bis 45⁰C erwärmt, Polyäthylenglykol wurde zugesetzt und bis zur Bildung einer homogenen Lösung vermischt. Gewebe-Plasminogen-Aktivator wurde zugesetzt und homogen dispergiert. Das Präparat wurde gekühlt und bei Raumtemperatur tunter kontinuierlichem Rühren zum Erstarren gebracht.

Präparat 6

Gewebe-Plasminogenaktivator 0,00025 g

weißes Petrolatum ad 1,00 g

Das Pretolatum wurde bei etwa 35 bis 45⁰C geschmolzen. Der

Gewebe-Plasminogenaktivator wurde zugesetzt und bis zur homo- '

genen Beschaffenheit dispergiert. Das Präparat wurde gekühlt ;'

und bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Mischen zum Er- i

starren gebracht. |

- 26 -

Präparat 7

Gewebe-Plasminogen-Aktivator Glykolysierte polyoxyäthylenierte ölsäureglyceride (Labrafil M1944 CS)

Präparat 8

Gewebe-Plasminogen-Aktivator Glykolysierte, polyoxyäthylenierte ölsäureglyceride (Labrafil M1944CS) Umgeesterte gesättigte Fettsäureglyceride {Suppocire (AIM) ad

Präparat 9 .

Gewebe-Plasminogen-Aktivator neutrales pflanzliches öl (Caprylsäure/Caprinsäure-Triglyceride; Miglyol 812)

umgeesterte, gesättigte Fettsäureglyceride, Witepsol W32) ad

0,00025 g 0,05 - 0,5 g

Glykolysierte polyoxyäthylenierte Stearinsäure-Lauropalmito-Glyceride

(Labrifil M2130CS) ad 1,00

0,00025 g

0,05 - 0,5 g

1,00 g

0,00025 g

0,05 - 0,5 g

1,00 g

Die Präparate 7, 8 und 9 wurden folgendermaßen hergestellt: Die öle wurden auf etwa 35 bis 45^QC erwärmt. Die festen Fettsäureglyceride wurden zugesetzt und geschmolzen. Der Gewebe-Plasminogenaktivätor wurde zugesetzt und im Gemisch homogen dispergiert. Die Präparate wurden gekühlt und bei Raumtemperatur unter ständigem Mischen zum Erstarren gebracht.

Die Präparate 10 und 11 sind weitere Beispiele für erfindungsgemäße Zusammensetzungen.

27(2*8

- 27 -

Präparat 10:

t-PA-Pulver 0,0001 - 0,5 g

Natriumstärke-glykolat

(Explotab) ad 1 g

Ein trockenes Gemisch aus t-PA-Pulver mit dem Stärkeglykolat wurde hergestellt. Dieses trockene Gemisch kann direkt auf eine feuchte biologische Oberfläche unter in situ-Bildung eines Gels gesprüht werden.

>

Präparat 11:

A. Gel-Vorgemisch;

Natriumhyaluronat 0,01 - 0,05 g

wasserfreies Glycerin 0,006- 0,25 g

[5 Natriumphosphatpuffer 0,01 m, pH-Wert 6,0

Wasser für Injektionszwecke ad 1g

B. Wirkstoff

t-PA-Pulver 0,0001 - 0,05 g

Glycerin und Natriumphosphat wurden in Wasser gelöst. Der pH-Wert wurde auf 6,0 eingestellt. Natriumhyaluronat wurde in der Pufferlösung bis zur Bildung eines homogenen Gels gelöst (Gelvorgemisch).

Das Gel wurde in einen ersten flexiblen Behälter, beispielsweise eine sterile Spritze, gefüllt. t-PA-Pulver wurde in einen zweiten flexiblen Behälter, wie vorstehend-beschrieben, gegeben. Unmittelbar vor der Anwendung wurde das t-PA-Pulver für die Mischung mit dem Gelvorgemisch im ersten flexiblen Behälter vorbereitet, indem man ein festes Volumen einer Mischlösung, z.B. Wasser für In'jektionszwecke, normale Kochsalzlösung oder 5 % Dextrose-Lösung, zusetzte. Die Mischlösung wurde zum t-PA-Pulver im zweiten flexiblen Behälter in einer Menge von 1 g/pro 4 g Gel gegeben und gründlich vermischt. Das feste Vo-

271

- 28-

lumen der Mischlösung kann auf der Grundlage der zu verabreichenden Menge des Gel-t-PA verändert werden. Der zweite flexible . Behälter wurde mit dem ersten flexiblen Behälter, der das Gelvorgemisch enthielt, über eine sterile öffnung (z.B. eine Burron-Flüssigkeitsabgabe-Verbindungsvorrichtung) verbunden. t-PA und Gelvorgemisch wurden vermischt, indem man das Gel zwischen den beiden Behältern bis zur Erzielung einer homogenen Beschaffenheit hin und her-bewegte.

Beispiel 2

Einfluß der mäßig löslichen Zusammensetzung auf peritoneale Verwachsungen

Bildung von Verwachsungen

Die Tiere wurden auf die vorstehend beschriebene Weise mit Gewebe-Plasminogen-Aktivator entweder in Form eines festen Enzyms oder in löslicher Form behandelt. Im Fall des löslichen Enzyms wurde die Peritonealhöhle vor dem Schließen des Schnitte einmal gespült. Das Ausmaß der gebildeten Verwachsungen wurde nach 14 Tagen bestimmt. Alternativ wurden wiederholte äußere Verabreichungen der Lösung auf die ischämische Stelle mittels · einer vaskulären Zugangsöffnung durchgeführt. Das Ausmaß der Verwachsungen bei Anwendung mittels der Zugangsöffnung wurde nach 5 Tagen festgestellt. In sämtlichen Fällen wurde Kochsalzlösung als Kontrolle verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt.

- 29 Tabelle I

Kaninchen-Identifikation 12 3 4

Behandlungsverfahren Grad

Spülung mit 150 ml Kochsalzlösung 3 3 0 3

Spülung mit 150 ml Kochsalzlösung mit einem Gehalt an 0,5 mg Gewebe-Plasminogenaktivator 2 0 2 4

Vaskuläre Zugangsöffnung (5 ml Kochsalzlösung/2 χ täglich/5 Tage) 5 4

Vaskuläre Zugangsöffnung

0,5 mg Gewebe-Plasminogen-

Aktivator/2 χ täglich/5'Tage 0 0 0

Bei sämtlichen unbehandelten Tieren ergab sich eine hohe Bewertungsziffer für die Verwachsungen, was zeigt, daß mit diesem Modell reproduzierbar postoperative Verwachsungen erzeugt werden können. Kaninchen mit einer einzigen Spülung zeigten im Vergleich zu den Kontrolltieren eine im Durchschnitt niedrigere Bewertung der Verwachsungen. Die Verbesserung war jedoch stärker ausgeprägt, wenn Gewebe-Plasminogen-Aktivator direkt zweimal täglich 5 Tage lang auf den ischämisehen Bereich aufgebracht wurde. Von drei Tieren ergab sich bei keinem Anzeichen von Verwachsungen. Die beiden Tiere der Kontrollgruppe zeigten Verwachsungen der Stufe 4 bzw. 5.

Gewebe-Plasminogenaktivator wurde in die halbfesten erfindungsgemäßen Präparate einverleibt und topisch über den herausgeschnittenen und wieder eingenähten Bereich der Peritonealwand und über das abgeschürfte Zökumsegment aufgebracht. Die Menge des aufgebrachten Gewebe-Plasminogenaktivators wurde konstant auf 0,25 mg Gewebe-Plasminogenaktivator pro g Gel gehalten. Etwa 2,5 g der erfindungsgemäßen Zusammensetzung wurde von Hand aufgebracht und in Form eines dünnen Films auf der Fläche der möglichen Verwachsungen einmassiert.

2712*8

- 30 -

In den meisten untersuchten Fällen entwickelten Kontrolltiere, die mit Placebos ohne Gehalt an Gewebe-Plasminogen-Aktivator behandelt worden waren, umfangreiche Verwachsungen im gesamten traumatisierten Bereich. Löslich gemachter und in Form eines wäßrigen Gels (Präparate 1 und 3) aufgebrachter Gewebe-Plasminogenaktivator ergab im Vergleich zur Kontrollgruppe eine geringfügige Verbesserung im Bezug auf die Verhinderung der Bildung von Verwachsungen. Wie bei der Spülungsbehandlung wird der löslich gemachte Gewebe-Plasminogenaktivator in vivo rasch inaktiviert, und seine Aktivität bleibt nicht ausreichend lange erhalten, km die Bildung von Verwachsungen vollständig zu unterdrücken. Eine Hemmung der Bildung von VerwacUsungen wurde in sämtlichen übrigen Gruppen, die mit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung behandelt wurden, beobachtet. Nur drei von 29 Versuchstieren, bei denen die Präparate 5, 6, 7, 8 und 9 angewandt wurden, entwickelten Verwachsungen. £ Ein relativ unlösliches Enzym in fester Form, z.B. Gewebe- * Plasminogenaktivator in einem wasserlöslichen Träger suspendiert (Präparat 5), erwies sich ebenfalls im Bezug auf eine

Verhinderung der Bildung von Verwachsungen als wirksam, was den Schluß nahelegt, daß die von Natur aus gegebene begrenzte Löslichkeit von Gewebe- Plö.sminogenaktivatorebenfalls einen Faktor darstellt, der zur in vivo-Stabilität des Mittels und zur verlängerten fibrinolytischen Aktivität, die für therapeutische Zwecke erforderlich ist, beiträgt.

Weitere Versuche unter Verwendung von unterschiedlichen Mengen an Gewebe-Plasminogenaktivator wurden durchgeführt. 24 Kaninchen (3 kg Gewicht) wurden in vier gleiche Gruppen

^ou unterteilt. Nach chirurgischer Verletzung wurden 2,5 g Träger mit einem Gehalt an einer Gesamtdosis von Q, 0,16, 0,31 bzw. 0,63 mg rekombinantem Gewebe-Plasminogenaktivator auf das traumatisierte Gewebe der Kaninchen aufgebracht. Die Ergebnisse der Bewertuncr der gebildeten Verwachsungen sind in

Fig. 1 zusammengestellt. Bei der niedrigsten Dosis von rekombinantem Gewebe-Plasminogenaktivator in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung war kein Einfluß auf den Grad der ge-

2 7f 2 έ 8

- 31 - j

bildeten Verwachsungen erkennbar, während sich bei den^-Do- j

sierungen von 0,31 und 0,63 mg eine drastische Abnahme der !

Bildung von Verwachsungen ergab. !

> Die Schwere der gebildeten Verwachsungen wurde ferner charak- j terisiert, indem man die mechanischen Kräfte bestimmte, die | zur Trennung von verwachsenen Geweben erforderlich waren. Zur Ausübung der mechanischen Kräfte wurde eine stumpfe · <

Dissektion, beispielsweise unter Verwendung einer Schere in Γ

υ geschlossenem Zustand, durchgeführt, um das haftende Gewebe zu trennen, oder es wurde im Fall einer schweren Verwachsung tatsächlich geschnitten. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengestellt. Die Verwachsungen, die bei den mit 0,31 bzw. 0,63 mg Gewebe-Plasminogenaktivator behandelten Tieren ent-

: 5 standen, konnten durch eine bloße stumpfe Dissektion getrennt werden. Die bei der niedrigen Dosis oder ohne Verwendung von rekombinanten Gewebe-Plasminogenaktivator gebildeten Verwachsungen erforderten häufig eine zeitaufwendige scharfe Dessektion zur Trennung.

Es wurden Versuche unter Verwendung von verschiedenen Mengen an rekombinantem Gewebe-Plasminogenaktivator in Hyaluronsäure gemäß den Angaben zu Präparat 11 durchgeführt. 24 Kaninchen (3 kg Gewicht) wurden in vier gleiche Gruppen unterteilt. / 5 Mach chirurgischer Verletzung wurden 2,8 g Träger mit einem Gehalt an einer Gesamtdosis von 0, 0,168, 0,225 bzw. 0,70 mg rekombinantem Gewebe-Plasminogenaktivator auf die traumatisierten Gewebe der einzelnen Kaninchen aufgebracht. Die Ergebnisse in Bezug auf das Ausmaß der gebildeten Verwachsungen sind in Fig. 3 zusammengestellt. Die Bildung von Verwachsungen wird praktisch bei sämtlichen Testkaninchen durch den rekombinanten Gewebe-Plasminogenaktivator in der erfindungsgeraäßen Zusammensetzung unterdrückt.

27(2^8

- 32 -

Neubildung von Verwachsungen

Obgleich das erfindungsgemäße Präparat mit einem Gehalt an einem thrombolytischen oder fibrinolytischen Mittel, wie rekombinantem Gewebe-Plasminogenaktivator, und einem Träger zur Verhinderung von Verwachsungen verwendet werden kann, läßt es sich auch zur Verhinderung von Neubildungen von Verwachsungen im Anschluß an eine Durchtrennung von Verwachsungen verwenden. Der folgende Versuch wurde durchgeführt, um festzustellen, ob die Zusammensetzung mit dem rekombinanten Gewebe-Plasminogenaktivator die Neubildung von Verwachsungen nach deren Lösung beeinflußt. ¹J Kaninchen wurden betäubt und einer Mittellinien-Laparatomie unterworfen. Ein ischämischer, neritonealer Flecken wurde in der rechten Planke geschaffen und anschließend wurde eine Zökumabschürfung auf die vorstehend beschriebene Weise durchgeführt. Vor dem abdominalen Verschließc.i wurden auf die traumatisierten Gewebe kein Träger aufgebracht. Nach 7 Tagen wurde eine erneute Laparatomie durchgeführt. Bei der Untersuchung wurden die verwachsenen Struk- ; türen getrennt und alle Blutungen durch elektrische Verschor- '{

ε fung gestoppt. 9 von 10 Kaninchen wiesen Verwachsungen der $

Stufe 3 oder darüber auf. Ein Kaninchen wies keine Verwachsun- ^l gen auf und wurde aus der Untersuchung entfernt. Bei vier Kaninchen wurden die abgetrennten, mit Fibrin überzogenen ( 25 Oberflächen mit 2,5 g Träger mit einem Gehalt an 0,63 mg rekombinantem Gewebe-Plasminogenaktivator bedeckt. Diö fünf Kontrollkaninchen erhielten die gleiche Menge an Träger ohne '.rekombinanten Gewebe-Plasminogenaktivator. Die Kaninchen wurden durch Nähen in zwei Schichten verschlossen und nach 7 Tagen wieder geöffnet. Die Ergebnisse in Bezug auf das Ausmaß der Beseitigung von bereits bestehenden Verwachsungen und der Neubildung von postoperativen Verwachsungen (Fig. 2) zeigen, daß ein thrombolytisches oder fibrinolytiscijes Mittel, wie rekombinanter Gewebe-Plasminogenaktivator, der in Form der erütndungsgemäßen Zusammensetzung auf die entsprechende Stelle vor der Bildung der Verwachsung so aufgebracht wird, daß eine kon··

27!268

- 33 -

tinuierliche Freisetzung des Mittels gegeben ist, in Bßzug auf die Beseitigung und auf die Verhinderung der Neubildung von Verwachsungen nach einer chirurgischen Lösung ebenso wirksam ist wie im Bezug auf eine Verhinderung der ursprünglichen Bildung von Verwachsungen.

Es wurde gezeigt, daß hohe Dosen von rekombinantem Gewebe-Plasminogenaktivator, die als thrombolytisches oder fibrinolytisches Mittel verabreicht wurden, eine mäßige Abnahme an systemischem Fibrinogen bewirken (A.K. Rao et al., Clin. Res., Bd. 34 (1986), S. 337A). Die Frage, ob die Verwendung von rekombinantem Gewebe-Plasminogenaktivator in Gel bei der Verhinderung der Bildung von Verwachsungen zum systemischen Fibrinogenabbau beiträgt, wurde überprüft, indem man Blutproben von vier Kaninchen unter Verwendung des rekombinanten Gewebe-Plasminogenaktivator-Inhibitors D-Phe-Prc-Arg-Chlormethylketon (M.A. Mohler et al., Thromb. Hae_m., Bd. 56 (1986), S. 2) 0, 2, 3, 4 bzw. 24 Stunden nach der Anwendung von 2,5g Träger mit einem Gehalt an 0,63 mg rekombinantem Gewebe-

2Q Plasminogenaktivator in der Peritonealhöhle testete. Die Plasmaproben wurden auf rekombinanten Gewebe-Plasminogenaktivator durch einen speziellen ELISA-Test mit einer Empfindlichkeit von 15 ng rekombinantem Gewebe-Plasminogenaktivator pro ml Plasma getestet. Zu keinem Zeitpunkt gab es Anzeichen für zirkulierenden rekombinanten Gewebe-Plasminogenaktivator. Da der rekombinante Gewebe-Plasminogenaktivator rasch durch die Leber entfernt wird, wurden die gleichen Plasmaproben in Bezug auf Veränderungen des Fibrinogens durch eine thrombinabhängige Methode gemessen. Es ergab sich keine Abnahme an zirkulierendem Fibrinogen, was zeigt, daß der rekombinante Gewebe-Plasminogenaktivator nicht leicht in den Blutkreislauf aus der Peritonealhöhle mit einer Geschwindigkeit resorbiert wird, die Veränderungen im Koagulationssystem von Kaninchen hervorrufen würde.

2 7 f 2 6 8

- 34 -

R.P. Buckman et al., J. Surg. Res. 20 (1976), Seite 1 haben die Ansicht vertreten, daß eine andauernde Unterdrückung der Aktivität von Plasminogenaktivator aufgrund eines Traumas unter anschließender ischämischer Schädigung der peritonealen Fläche einen Hauptanreiz zur Bildung von Verwachsungen darstellt. Umgekehrt kann die Aufrechterhaltung eines körpereigenen fibrinolytischen Systems zur Auflösung von Fibrin führen, so daß sich keine dauerhaften Verwachsungen bilden können. Obgleich der zeitliche Verlauf der Unterdrückung der

ι ο Aktivität von Plasminogenaktivator bei der Pathogenese der Bildung von fibrösen Verwachsungen nicht bekannt ist, ist eine einzelne intraperitoneale postoperative Dosis eines löslichen fibrinolytischen Mittels, wie vorstehend erörtert, nicht ausreichend. Erfindung&gemäß wurde erstmals festge-

;5 stellt, daß eine mäßig lösliche Form eines thrombolytischen Mittels, z.B. eines rekombinanten Gewebe-Plasminogenaktivators, bei direktem Aufbringen auf die Stelle einer möglichen Bildung 'von Verwachsungen das unterdrückte endogene fibrinolytische System unter Verhinderung der Bildung von Verwach-

:0 sungen höchstwahrscheinlich durch eine verlängerte, langsame, kontinuierliche Freisetzung des Enzyms unterstützt.

Mögliche Komplikationen der intraperitonealen Verwendung des rekombinanten Gewebe-Plasminogenaktivators,. wie eine systemi- >5 sehe Fibrinogenolyse und Wundheilung, wurden nicht beobachtet. Bei den vorgenommenen Tierversuchen traten keine intraperitonealen Blutungen auf.

- 35 -

Tabelle II

Kaninchen-Identil'ikation 1 2 3 4 5 6

Behandlungsmethode Grad

Präparat 1:

Kontrolle 4 3 0 4 4 3

behandelt 0 3 3 Q 5 ΰ

Präparat 2t

Kontrolle 5 4 4 10 0

behandelt 0 0 0 0 0 4

Präparat 3:

Kontrolle 444444

behandelt 3 3 5 5 5

Präparat 4;

Kontrolle 444444

behandelt 0 10 3 0 0 15

Präparat 5:

Kontrolle 444455

behandelt 0 0 0 0 0 3

Präparat 6;

Kontrolle 2 2 3 5 5 5

behandelt 0 0 0 0 0 1

Präparat 7;

Kontrolle 14 4 4 5 5

behandelt 0 0 0 0' 0 3

Präparat 8:

Kontrolle 0 4 4 4 5 5

behandelt 0 0 0 0 0 0

Präparat 9;

Kontrolle 4 5 5 5 4 3

behandelt 0 0 0 0 0 0

	- 36 - Tabelle III	stumpfe Disek- ticn	as harfe Dissek- tion	S3 harfe (unter keiten)	Dissekfcicn Schwierig-
		3	2		1
	keine Haf tung
Träger allein	O

+ 0,16 rag rekcmbinanter Gevebe-Flasminogenaktivator

Träger + 31 rag rekombinanter Gewebe-Plasrainogenaktivator

Träger + 0,63 mg rekorabinanter Gewebe-Plasrainogenaktivator

Die Schwere der Verwachsungen, die sich bei der Dosis-Wirkung-Untersuchung (Fig. 1) bildeten, wurde in Bezug auf die chirurgischen Anstrengungen, die zur Trennung des verwachsenen Gewebes erforderlich waren, bewertet. Die Anzahl von Tieren, bei denen eine chirurgische Lösung erforderlich war, ist angegeben.

Beispiel 3

Einfluß der mäßig löslichen Zusammensetzung auf Beckenverwachsungen

Weibliche weiße New Zealand-Kaninchen (etwa 3,0 kg Gewicht) wurden mit Ketamin, Rompun und Accepromazin betäubt und der Laparatomie unterzogen. Die gesamte Oberfläche des Uterushorns _t wurde freigelegt und bis zum Auftreten von punktförmigen Blutungen abgeschürft ν Anschließend wurde durch elektrische Schürfung eine schwere Gewebeschädigung des Horns hervorgerufen. Gewebe-Plasminogenaktivator wurde in Form der erfindungsgemäßen Zusammensetzung auf das traumatisierte uterushorn als Gelpräparat (Amogel; vgl. vorstehendes Präparat 5) aufgebracht.

- 37 -

Nach Zurücksetzen des Uterushorns in die Beckenhöhle wurde die Muskelschicht des Abdomens durch eine Naht geschlossen, und die Hautschicht wurde durch chirurgische Heftung verschlossen. Nach 14 Tagen wurden die Kaninchen wieder auf die vorstehend beschriebene Weise betäubt und einer erneuten Laparatomie unterzogen, um das Ausmaß der gebildeten Verwachsungen zu bestimmen. Das Ausmaß der Verwachsungen wurde durch quantitative Ermittlung der Oberfläche des Uterushorns, die aneinander haftete, bestimmt.

2,5 g erfindunqsqemäfle Zusammensetzung

% haf- kein Gel Gel allein 0,125 mg/g* 0,25 mg/ q* 0,5 mg/g*» Gewebe ^53% - ³² 35,6 % J₁ 20 31,67% + 22,1 25% £ 16,3 18,9% ± 11,3

* mg/g: mg Gewebe-Plasminogenaktivator/g Gel

** ρ <0,05. bestimmt durch den Student-t-Test im Vergleich zur Gruppe ohne Gel.

Tiere mit Verwachsungen, die einer chirurgischen Lösung der Verwachsungen zugänglich waren, wurden so eingeteilt, daß der durchschnittliche prozentuale Wert an haftendem Gewebe etwa 25 % betrug. Nach der Abtrennung der Verwachsungen wurden auf die vorstehend beschriebene Weise die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen mit einem Gehalt an Gewebe-Plasminogenaktivator aufgebracht. Nach 14 Tagen wurden die Tiere getötet, und der prozentuale Wert des haftenden Gewebes wurde durch makroskopische Prüfung des Uterushorns bewertet.

-.gis:

- 30 -

2,5g erfindungsgemäße Zusammensetzung 1 mg/g* 5 mg/g * 10 mg/g*

37,36

O%+13,2

7,5

-12,5%+0

Gel allein

% erneut

haftendes Gewebe 61,86

Veränderung des Ausmaßes der anfänglichen Verwachsungen im 40,63%j-12, 9 Vergleich zur Neu~ bildung von Verwachsungen

* mg /g : mg Gewebe-Plasmin.ogenaktiva,tor/g Gel

Beispiel 4

Einfluß einer mäßig löslichen Zusammensetzung auf ophthalmologische Verwachsungen

;0 Eine Komplikation bei der chirurgischen Behandlung von grauem Star besteht in der Bildung von Verwachsungen, die zu chirurgischen Eingriffen zur Behandlung von Strabismus führen. Man hat versucht, die Bildung von Verwachsungen im Anschluß an ophthalmologische Eingriffe unter Verwendung von Hyaluronsäure zu verhindern. Hyaluronsäure ist ein natürliches Kohlenhydrat, das aus alternierenden Einheiten von ß-D-Glucuronsäure und 2-Acetamido-2-desoxy-ß-D-glucose besteht, über die Verwendung von Hyaluronsäure oder einer chemisch modifizierten Form dieser Verbindung zur Verringerung von postoperativen Verwachsungen bei Augen- und Sehnenoperationen wurde berichtet (S.S. Searl, H.S. Meta und K.J. Lindahl, Ann. Ophthalmol., Bd.19, (7), (1987), S. 259; C. Weiss, H. Levy, J. Denlinger, M. Suros und H. Weiss, Bull. Hosp. Jt. Dis. Orhtop. Inst., Bd. 46 (1986), Seiten 9 bis 15; C. Weiss, J. Suros, A. Michalow,

J. Denlinger, M. Moore und W. Tejeiro, Bull. Hosp., Jt. Dis. Orthop. Inst., B^V 47 (1987), S. 31 bis 39). Die Wirksamkeit

2712(58

- 39 -

dieser Substanzen bei der Verhinderung von Verwachsungen konnte in diesen Untersuchungen nicht schlüssig dargelegt werden. Jedoch können aufgrund ihrer biologischen Verträglichkeit Lösungen von Hyarulonsäure zur Abgabe eines mäßig löslichen Enzyms, wie t-PA verwendet werden. Das folgende Präparat ist ein Beispiel für die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen mit einem Gehalt an einem mäßig löslichen Enzym, wie Gewebe-Piasminogenaktivator, der in einem biologisch abtragbaren, muzilaginösen Träger, wie Hyaluronsäure, suspendiert ist. 10

Präparat	0	,1 -	1	mg	0
t-PA	3	bis	50	mg
Hyaluronsäure	4	,5 -	a,
NaOH, zur Einstellung des pH-Werts auf	1	ml
WFI ad

Die Hyaluronsäure wurde in sterilem Wasser gelöst, wobei die Lösung mit NaOH auf den gewünschten pH-Wert (vorzugsweise 5,Q bis 6,0) titriert wurde. Das t-PA-Pulver wurde unter homogener Dispersion zugesetzt. Die Zusammensetzung wurde gerührt, bis ein muzilaginöses Gel entstand. Das muzilagihäse t-PA-Präparat der Erfindung wurde unmittelbar im Anschluß an chirirgusche Eingriffe bei grauem Star und Strabismus auf die ₂g Stelle einer möglichen Fibrinablagerung oder Bildung von Verwachsungen aufgebracht.

Beispiel 5

₃q Einfluß einer wenig löslichen Zusammensetzung auf die Fibrinablagerung

Zu Fibrinablagerungen kommt es typischerweise am Ort von intraabdominalen Infektionen, wodurch sich eine inseiförmige Abteilung mit oakteriellem Wachstum ergibt. Diese Kompartimentisierung führt zu einer, Isolierung der Infektion, bewirkt aber

- 40 -

auch eine Abschottung der Infektion vom Abwehrmechanismus des Wirts. Ein ähnliches Problem von bakterieller Peritonitis wurde bei Patienten mit ständiger ambulanter Peritonealdialyse (CAPD) beobachtet (K.D. Norris et al., Am. J. of Kidney Disease, Bd. 10 (1), (1987), Seiten 62 bis 65). Der Einschluß von Bakterien in Pibringerinnseln bei CAPD wird als Bakteriennest angesehen, das die Bakterien vor einer Abtötung durch Antibiotika und Leukozyten schützt. Diese CAPD-Patienten wurden Heparin und

Streptokinase in Lösung verabreicht.

Ein Fibringerinnsel-Peritonitis-Modell wurde entwickelt, um Ratten intraperitoneal mit infizierten Gerinseln zu beimpfen (CL. Wells et al., J. Antimicrob. Chemoth.,Bd. 15 (Suppl: C), (1985), S. 199 bis 206). Die erfindungsgemäße Zusammensetzung wird im Anschluß an einen chirurgischen Eingriff an der Stelle einer möglichen Fibrinablagerung und Abszessbildung oder in der Nähe dieser Stelle aufgebracht. Eine Laparatomie wird durchgeführt. Die PeritonealhÖhe wird auf Abszessbildung geprüft.

Beispiel 6

Einfluß einer mäßig löslichen Zusammensetzung auf'Sehnenverwachsungen

Die Bildung von Verwachsungen nach einer chirurgischen Wiederherstellung von Flexor-Sehnen führt zu einer Störung der Wiederherstellung der verletzten Sehne (F. Matthews et al., J. of Bone und Joint Surgery, Bd. 58B (1976), S. 230 - 236). Es wurde festgestellt, daß die anfängliche Verletzung einer Sehne selbst keinen Anreiz für die Entwicklung von Verwachsungen darstellt. Wird eine Flexor-Sehne in einem Finger durchtrennt, so ziehen sich deren Enden zusammen, runden sich glatt und liegen frei innerhalb der Scheide. Es bilden sich keine Verwachsungen und im umgebenden Gewebe tritt keine Reaktion auf.

Nur wenn die Sehnenenden auf chirurgischen Wege zusammengefügt werden, kommt es zu adhesiven Reaktionen.

- 41 -

Für die Untersuchung wurden ausgewachsene weiße New Zealand-Kaninchen ausgewählt. Bei sämtlichen Versuchen wurde das gleiche ursprüngliche Präparat verwendet. Die Kaninchen wurden durch intravenöse Nembutal-Verabreichv.ag betäubt. Anschließend wurde eine Blutentnahmebinde angebracht. Die Haut wurde sodann mit 1 % Hibitane-Lösung in Alkohol vorbereitet und mit sterilen Tüchern abgedeckt.

Der »,auteinschnitt wurde nicht an der Zehe selbst sondern am ^: Palmarbereich vorgenommen. Sodann wurden die Flexor-Sehnen an \ ihrer Eintrittsstelle in die Scheide identifiziert,und die \ synoviale Unibchlagsstelle wurde geöffnet. Durch vollständige *k Flexion der mittleren Zehe und proximales Ziehen am Profundus ließ sich ein Stück des intrasynovialen Teils der Sehne in die '.5 Wunde ziehen. Die Sehne wurde sodann an einer möglichst distalen Stelle durch Anbringen von Querschnitten mit einem Skalpell traumatisiert. Der kurz vor einer vollständigen Durchtrennung abgebrochene Einschnitt ließ nur einen ausreichenden intakten Anteil an Sehnenfasern zurück, um deren Verlauf aufrechtzuerhalten. }0 Der Zug wurde sodann losgelassen. Die traumatisierta Zone der Sehne wich über das distale Drittel der proximalen Phalanx in die normale Scheide zurück. Das erfindungsgemäße t-PA-Gel wurde frei auf die traumatisierte Zone verteilt, ρφβ Haut wurde mit einer feinen Katgut-Naht verschlossen, und auf die Wunde ( 25 wurde ein Aerosol-Kollodiumverband gesprüht. Nach dam Verschließen der Wunde wurde die gesamte betroffene Gliedmasse mit einer eng anliegenden Gipsschiene umschlossen, um die Zehen ruhigzustellen. Der Gips wurde insgesamt 24 Tage beibehalten, wonach die Gliedmasse freigelegt wurde.

Bei sämtlichen Maßnahmen wurde aseptisch gearbeitet. Die Sehnen wurden möglichst vorsichtig behandelt. Es wurden ausschließlich Schnitte mit einem scharfen Skalpell durchgeführt.

Die Kaninchen wurden in Abständen bis zu 12 Wochen getötet.

Die operierte Zehe wurde zunächst vorsichtig unter Verwendung eines

- 42 -

Sezierraikroskops untersucht, wobei der Heilungszuatand der Sehne, die Gewebereaktion in der Nähe der Verletzung und die Anwesenheit von Verwachsungen festgestellt wurden. Die Sehne wurde sodann aus dem umgebenden weichen Gewebe entfernt und in 10 % Formol-Kochsalzlösung fixiert. Nach Verarbeiten und Einbetten wurden serielle Längsschnitte für die Mikroskopische Untersuchung gemacht. Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin, James-Silberfärbemittel und kolloidalem Eisen-PAS-Färbemittel nach Haie's gefärbt. 10

Claims (5)

- 43 ERFINDUNGSANSPRUCH 27126B

1. Verfahren zur Herstellung einer topisch anwendbaren pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verhinderung von Fibrinablagerungen oder der 3ildung oder Neubildung von Verwachsungen an Stellen von möglichen Fibrine. Lagerungen oder der Bildung von Verwachsungen/ gekennzeichnet durch Vermischen eines mäßig löslichen Enzyms und eines inerten,haftungsfOrdernden Trägers.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge des mäßig löslichen Enzyms im Bereich von etwa 0,125 mg/g bis 2,5 mg/g des inerten, haftungsfordernden Trägers liegt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge des mäßig löslichen Enzyms im Bereich von etwa 0,25 bis 1,0 mg/g des inerten, haftungsfordernden Trägers liegt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das mäßig ',3sliche Enzym ein Feststoff ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym Gewebe-Piasminogenaktivator ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der inerte, haftungsfordernde Träger ein wasserlösliches Gel ist.

, 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der inerte,haftungsfordernde Träger ein halbfester Träger ist.

27126B

- 44 -

ι. 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der halbfeste Träger Petrolatum-Gelee ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger ein biologisch abtr'gbares Polymer ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger Hyaluronsäure ist.

11. Abgaoevorrichtung zur Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verhinderung der Fibrinablagerung oder der Bilduna von Verwachsungen, dadurch gekennzeichnet, daß es

, 5 a) einen ersten flexiblen Behälter mit einem Gehalt an

einem mäßig löslichen Enzym und b) einem zweiten flexiblen Behälter m.it einem Gehalt an

einem haftungsfördernden Träger aufweist.
,;o

12. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das mäßig lösliche Enzym im ersten flexiblen Träger Gewebe Plasminogenaktivator enthält,

'5 13. Vorrichtung nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß der haftungsfordernde Träger im zweiten flexiblen Behälter Hyaluronsäure ist.