DE69723725T2

DE69723725T2 - Verfahren zur herstellung von konzentrierten lösungen von fibronectin ohne puffer

Info

Publication number: DE69723725T2
Application number: DE69723725T
Authority: DE
Inventors: Andre Beaulieu; Robert Paquin
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1996-12-17
Filing date: 1997-12-12
Publication date: 2004-04-22
Anticipated expiration: 2017-12-13
Also published as: EP0951294A1; AU747209B2; ES2203827T3; US5821220A; ATE245443T1; EP0951294B1; DK0951294T3; AU5470998A; DE69723725D1; JP2001510463A; PT951294E; CA2275193A1; WO1998026797A1

Description

VERWANDTE ANMELDUNG
Die vorliegende Patentanmeldung ist eine Teilfortführung der US-Patentanmeldung mit Aktenzeichen 08/488253, eingereicht am 7. Juni, 1995, über "Humanplasma-Fibronektin enthaltende Formulierungen zur Wundheilung".
GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft topische Dosierungsformen, die Humanplasma-Fibronektin zur Verwendung für die Förderung der Wundheilung enthalten. Speziell betrifft die vorliegende Erfindung das Heilen chronischer venöser Geschwulste.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Fibronektin ist ein großes Glykoprotein, das etwa 5% Kohlehydrat enthält. Die charakteristische Form von Plasma-Fibronektin ist ein Disulfid-gebundenes Dimer von 440.000 Dalton, wobei jede Untereinheit eine relative Molekülmasse von etwa 220.000 Dalton hat. Normalerweise wird Fibronektin im Plasma bei einer Konzentration von etwa 300 μg/ml angetroffen und extrahiert und gereinigt, indem eine von Hynes¹ beschriebene Methode zur Anwendung gelangt. Plasma-Fibronektin ist auch unter zahlreichen anderen Namen bekannt, einschließlich kalt-unlösliches Globulin, Antigelatinefaktor, Zellanhaftungsprotein, Hyaluronidase und opsonisch α2-oberflächebindendes Glykoprotein. Diese Bezeichnungen spiegeln die biologischen Aktivitäten von Fibronektin wieder, wie beispielsweise Zellrekrutierung, Opsonisierung spezieller Zelltrümmer und die Förderung der Wundkontraktion. Übersichtsarbeiten über die Struktur und Wirkungen von Fibronektin sind anderswo veröffentlicht worden²'³.
Die Wundheilung wird gewöhnlich in 3 Phasen unterteilt: die Entzündungsphase, die proliferative Phase und die Rekonstruktionsphase. Von Fibronektin weiß man, dass es in jeder Stufe des Prozesses der Wundheilung beteiligt ist und speziell bei der Erzeugung eines Gerüstes, an dem die eindringenden Zellen haften können. Zu Anfang werden zahlreiche Mediatoren, wie beispielsweise Fibronektin und Fibrinogen, zu der Wundstelle freigesetzt. Fibronektin fördert die Wanderung der inflammatorischen Zellen in die Wunde und die Phagozytose der Zelltrümmer durch die Monozyten. Danach findet die Angiogenese und Reepithelisierung statt. In diesem Stadium übt das Fibronektin eine chemotaktische Wirkung auf die Endothelzellen aus und fördert die Abwanderung von Epithelzellen und Fibroblasten auf die Basalmembran. Fibronektin scheint auch eine wichtige Komponente der Rekonstruktionsphase zu sein, wo es eine bedeutende Rolle in der Organisation von Kollagenfibrillen spielt. Das fibrillare Kollagen bildet schließlich Faserbündel, die die Zugfestigkeit des Gewebes wesentlich verstärken und zur Schließung der Wunde führen.
Von topisch aufgebrachtem Plasma-Fibronektin ist berichtet worden, dass es bei der Erhöhung der Geschwindigkeit der Wundheilung nützlich ist, wie beispielsweise in Hornhautwunden⁴'⁵ und bei Beingeschwulsten⁶. Es hat jedoch noch keiner einen geeigneten topischen Träger zur Verwendung bei der Wundbehandlung beschrieben, der die Freisetzung einer wirksamen Menge des Fibronektins gewährleisten kann. Ein wichtiger begrenzender Faktor in der Entwicklung einer wirksamen topischen Dosierungsform eines Arzneimittels besteht nicht nur darin, über ein aktives Arzneimittel zu verfügen, sondern auch eine Formulierung zu besitzen, mit der die Passage des wirksamen Arzneimittels von dem Träger (Creme, Salbe, Gel, usw.) in die Freisetzungsstelle ermöglicht wird (was im Fall der vorliegenden Erfindung eine Wunde der Haut ist). Sehr wirksame Arzneimittel, wie beispielsweise Wachstumsfaktoren, können unter Umständen keinerlei therapeutischen Wert haben, wenn die topische Formulierung die Bewegung des Arzneimittels von dem halbfesten Träger in die Wunde nicht ermöglicht. Es wird daher besonders die Entwicklung einer Formulierung angestrebt, die die Kontaktdauer des Fibronektins mit der Wunde auf ein Maximum bringen könnte und auch die Freisetzung von Fibronektin für die Wunde kontrolliert und dadurch zu hohen Aufnahmewerten führt. Die vorliegende Erfindung gewährt ein derartiges Zuführungssystem in Form wässriger Gele und einer Creme.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung gewährt wässrige Gel-Formulierungen und eine Creme-Formulierung, die Fibronektin enthalten, und gewährt deren Verwendung für die Zuführung einer wirksamen Menge von Fibronektin zu einer Wundstelle für die Wundheilung. Die Gel-Formulierung weist ein wasserlösliches, pharmazeutisch zulässiges Polymer auf, das aus einer wirksamen Menge von Fibronektin hergestellt wird. Beispiele für derartige Verbindungen schließen ein: Vinylpolymere, z. B. Polyacrylsäure; Polyoxyethylen/Polyoxypropylen-Blockcopolymere, z. B. Poloxamer; und Cellulose-Derivate, z. B. Hydroxypropylcellulose (HPC). Das Polymer vermittelt Viskositätswerte zwischen 50.000 und 1.000.000 cP bei Raumtemperatur. Die Creme-Formulierung wird hergestellt aus einer kommerziell verfügbaren Cremebasis, d. h. Schering^®-Base (Schering Canada Inc., Point-Claire, Quebec), die Viskositätswerte zwischen 60.000 und 80.000 cP bei Raumtemperatur hat.
Zahlreiche Vorteile werden auf diese Dosierungsformen zurückgeführt. Gel- und Creme-Formulierungen der vorliegenden Erfindung setzen wirksame Mengen eines Beschleunigers zur Wundheilung frei. Andere Vorteile von Gel-Formulierungen schließen ein: die Fähigkeit, die Wunde feucht zu halten (was aus dem hohen Wassergehalt der Gele resultiert), ein leichter Auftrag und Entfernung (durch Waschen) von der Wunde. Außerdem vermitteln sie einen kühlenden Eindruck bei topischer Aufbringung, was das Wohlbefinden des Patienten verbessern kann.
Das System der langsamen Freisetzung von Gel-Formulierüngen der vorliegenden Erfindung erlaubt eine verlängerte Freisetzung von Fibronektin an der Wundstelle. Diese Eigenschaft dieser Formulierungen ermöglicht einen weniger häufigen Auftrag auf die Wunde, was zu einer geringeren Störung des Heilungsprozesses führt. Derartige Formulierungen halten eine Zuführung von Fibronektin bis zu 24 Stunden aufrecht, wobei jedoch aufgrund aus Permeationsuntersuchungen erhaltenen Daten ein Therapieplan von "zwei Mal täglich" eine bevorzugte Ausführungsforrn der vorliegenden Erfindung ist.
Bei der Formulierung topischer Dosierungsformen, die für die Einbeziehung von Fibronektin vorgesehen sind, sollten mehrere Qualitätskriterien berücksichtigt werden. Alle Komponenten des Präparats, einschließlich Lösemittel, Gelbildner und Konservierungsmittel, sollten für die Wunde ungiftig und mit dem Arzneimittel kompatibel sein. Das endgültige Produkt sollte eine optimale Freisetzung des Arzneimittels zu seiner Wirkungsstelle fördern, sollte eine angemessene Konsistenz zur Erhöhung der Kontaktdauer der Arzneimittels mit der Wunde haben und steril sein.
Die bevorzugten Formulierungen der vorliegenden Erfindung lassen sich mit anderen Beschleunigern der Wundheilung verwenden, die eine dem Fibronektin ähnliche Zusammensetzung haben, wie beispielsweise Proteine ähnlicher Größe (extrazelluläre Matrixproteine wie Thrombospondin, Laminin, Vitronektin, Fibrinogen) oder eine kleinere Größe haben (wie beispielsweise Peptide, in die Wachstumsfaktoren einbezogen sind). Human- oder andere Säuger Wundheilungsbeschleuniger können in Formulierngen für veterinäre Anwendungen verwendet werden.
Die bevorzugten Formulierungen lassen sich mit den Ergebnissen der Bewertung dieser Formulierungen unter Anwendung eines in vitro-Diffusionszellensystems korrelieren, das aus einem starren Rezeptor besteht, der eine deepithelisierte Hautprobe enthält, wobei die deepithelisierte Seite nach oben in das Donator-Kompartiment zeigt und die dermale Seite nach unten in ein Rezeptor-Kompartiment zeigt. Die deepithelisierte Hautprobe wird durch Entfernung eines 8 μm-Schnittes von der epidermalen Oberfläche der Haut unter Verwendung eines Dermatoms (1/10.000-Schneidmaßstab) und die dermale Seite sorgfältig von etwaigen anhaftenden subkutanen Gewebeteilen und/oder Blutgefäßen gesäubert. Das Rezeptor-Kompartiment wird mit einem zirkulierenden Pufferkreis verbunden, wobei die Puffertemperatur bei 37°C gehalten wird, während sich die Hautoberfläche bei etwa 32°C befindet. Bevorzugte Formulierungen werden einen "Abs-Wert" größer als 7,8 und vorzugsweise mindestens 13,40 haben.
Eine bevorzugte Methode zum Herstellen der Gele der Erfindung besteht darin, Human-Fibronektin in demineralisiertem Wasser aufzukonzentrieren, das den Polymerisationsbeschleuniger (NaOH) bei einem pH-Wert von etwa 8,0 bis etwa 11,0 enthält. Bei stärker konzentrierten Fibronektin-Gelen (0,5 bis 1,0%) wird das Fibronektin vorzugsweise lyophilisiert. In beiden Fällen verfügen die resultierenden Lösungen über einen pH-Wert von etwa 8,0 bis etwa 11,0. Sofern ein Carbomer-Gel hergestellt werden soll, wird ein pH-Wert von etwa 9,0 bevorzugt. Auf diese Weise ist es möglich, hoch konzentrierte, nicht ausfällende Lösungen von Fibronektin ohne die Verwendung von Puffern herzustellen, wie beispielsweise Saccharide oder Stabilisiermittel (z. B. Albumin). Konzentrierte Lösungen von Fibronektin mit 2 mg/ml bis 10 mg/ml lassen sich mühelos unter Anwendung dieser Methoden erzielen. Die gleiche Methode kann zur Erzeugung von hoch konzentrierten wässrigen Formulierungen anderer Wundheilungsbeschleuniger und anderer im Allgemeinen wasserunlöslicher Proteine zur Anwendung gelangen.
Die geeignete Fibronektin-Lösung wird mit einer konzentrierten Lösung Gelbildner gemischt. Die zwei Lösungen werden durch mehrfache Wechsel unter Druck unter Verwendung von Vorrichtungen gemischt, wie beispielsweise Spritzen, mit denen die Mischung nicht heftig bewegt wird, um eine Ausfällung von Fibronektin zu vermeiden. Die Vorrichtungen zum Mischen sind über eine Adaptervorrichtung miteinander verbunden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die kumulative Absorption von radiomarkiertem Fibronektin in Abhängigkeit von der Zeit von verschiedenen Gel-Formulierungen, die Carbopol^® P-934-Carbomer (0,375%) enthalten, Pluronic^® F127 Poloxamer (20,0%), Natriumcarboxymethylcellulose (CMC 3,0%) sowie von der Kontrolle (Phosphat-gepufferte Salzlösung);
2 zeigt die kutane Absorption von radiomarkiertem Fibronektin von verschiedenen Dosierungsformen sowie von der Kontrolle (Phosphat-gepufferte Salzlösung) über eine Zeit von 12 Stunden;
3 zeigt die Elektrophorese von Humanplasma (FN), das in eine Carbopol^®-Carbomer-Gel (Carbopol^® P-934-Carbomer 0,375% + Chlorkresol 0,1%) einbezogen ist, und zwar nach 0, 2, 6 und 9 Monaten. Abschnitt A: Gewinnung von FN nach einem Gelatine-Bindungsversuch. Abschnitt B: Unversehrtheit von FN nach 240 Tagen Aufbewahrung in Gel bei 4°C. Es ist zu beachten, dass in Abschnitt B die Auflösung des Bandes durch das Vorhandensein von Verunreinigungen, wie beispielsweise Carbopol^®-Carbomer, in der Probe beeinflusst ist;
4 zeigt eine graphische Darstellung der dermalen Absorption in Abhängigkeit von der Viskosität verschiedener topischer Präparate;
5 zeigt die Absorptionswerte in deepithelisierter Haut unter Verwendung steigender Konzentrationen von Fibronektin in 0,28% Carbomer enthaltendem Carbomer-Gel sowie von der Kontrolle (Phosphat-gepufferte Salzlösung);
6 veranschaulicht den Einfluss zweier unterschiedlicher Konzentrationen von Carbomer auf die Absorptionswerte von Fibronektin in deepithelisierter Haut. Beide Carbomer-Formulierungen enthalten 0,2% Fibronektin; die Kontrolle ist eine Phosphat-gepufferte Lösung.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung gewährt Dosierungsformen, die speziell für die therapeutische Verwendung von Fibronektin als topischer Wundheilungsbeschleuniger formuliert sind. Die Dosierungsformen sind für topische Aufbringungen gewählt und sollten im idealen Fall große Mengen an Fibronektin freisetzen und für die Wunde steril und ungiftig sein. Beim Abmischen dieser Formulierungen sind mehrere Faktoren zu berücksichtigen, wie beispielsweise die physiko-chemischen Eigenschaften des Glykoproteins sowie die klinischen Anwendungskriterien.
Unter diesen Einschränkungen bezieht sich die wichtigste auf die Löslichkeit von Fibronektin in Wasser, die gering ist und daher der Herstellung von konzentrierten Gelen oder Cremen entgegengerichtet ist. Fibronektin ist in Wasser lediglich geringfügig löslich und kann bei Konzentrationen bis herab zu 5 mg/ml in wässriger Lösung ausfällen.
Seine Löslichkeit wird außerdem durch pH-Wert-Änderungen und niedrige Temperaturen beeinflusst. In der gleichen Weise können nicht ohne weiteres Formulierungen, die eine Verteilung des Polymer-Pulvers in der Fibronektin-Lösung unter Bewegung erfordern, hergestellt werden, da eine Ausfällung des Glykoproteins auftreten kann. Unter Bewegung kann Fibronektin aggregieren und lange Matten von unlöslichem Material bilden. Die Viskosität muss optimal sein, um eine ausreichende Haftung an der Wunde sowie ein gutes Freisetzungsvermögen zu erlauben.
Durch Temperaturen oberhalb von 60°C, wie sie häufig zur Erzeugung steriler Präparate erforderlich sind, wird Fibronektin denaturiert. Da an dem Endprodukt ein abschließender Sterilisationsprozess nicht ausgeführt werden kann, ist der Ansatz einer konzentrieren Basis von Vehikeln ohne Fibronektin in der Regel unvermeidbar. Es werden dann Portionen dieser sterilen Basismengen mit einer festgelegten Menge einer Lösung von Fibronektin verdünnt. Um eine angemessene Verteilung von Fibronektin in den halbfesten Dosierungsformen zu erzielen, ist oftmals ein Schritt des Abmischens unter Einbeziehen von Bewegung erforderlich, der zur Ausfällung des Arzneimittels führen kann.
Mit Gelbildnern, wie beispielsweise Carbopol^®-Carbomer und Poloxamer kann dieses Problem umgangen werden, da sie vor der Gelbildung unter einer flüssigkeit-ähnlichen, viskosen Form sterilisiert wurden. Ein hoch konzentriertes Präparat von Carbopol^®-Carbomer wird hergestellt und autoklaviert und entsprechend der nachstehenden Beschreibung die Lösung von Fibronektin, die außerdem den Polymerisationsbeschleuniger (NaOH) enthalten kann, anschließend in Spritzen mit der Basis von Carbopol^®-Carbomer gemischt und das Gel während der Verteilung des Arzneimittels darin aufgebaut. Im Fall von Poloxamer setzt man das Polymer der Arzneimittel-Lösung zu und lässt sie bei 4°C auflösen, eine Temperatur bei der sie ihren flüssigkeitähnlichen Aspekt bewahrt. Die Sterilisierung dieser Lösung vor Bakterien wird bei 4°C unter Verwendung eines 0,22 μm-Filters ausgeführt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden der Dosierungsform nicht toxische, nicht sensibilisierende Konservierungsmittel, die mit den Komponenten der Formulierung kompatibel sind, zugesetzt. Die vorgenannten Bedingungen werden insgesamt in den bevorzugten Dosierungsformen berücksichtigt, wie sie nachfolgend detailliert beschrieben werden.
Eine wirksame Menge zur Wundheilung von Humanplasma-Fibronektin zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung liegt im Bereich von etwa 0,5 bis etwa 1,0% und beträgt vorzugsweise etwa 1,0%. Fibronektin wird von Humanplasma unter Anwendung einer Prozedur der Gelatine-Sepharose-Affinitätschromatographie isoliert. In dieser Methode ist Gelatine mit Sepharose 4B nach CNBr-Aktivierung kovalent gekoppelt. Die Bindungskapazität für Humanplasma-Fibronektin, die durch dieses System vermittelt wird, beträgt > 1 mg/ml Gel.
Autologes, homologes Humanplasma-Fibronektin oder Fibronektin, das mit Hilfe der Technologie der rekombinanten DNA erhalten wird, kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden^1,7. Sollte homologes Plasma-Fibronektin zur Anwendung gelangen, müssten von verschiedenen Spendern hergestellte Chargen auf atypische Antikörper, Hepatitis B (HBV), Hepatitis C (HCV), Human-Immunodeficiency-Virus (HIV), Human-T-Zellen-lymphotrophen Virus (HTLV), Zytomegalovirus (CMV) und Syphilis getestet werden. Diese Tests sind an Spendern unmittelbar vor der Spende und 6 Monate danach auszuführen. In der Zwischenzeit muss das Spenderplasma bei –20°C tiefgefroren aufbewahrt werden. Darüber hinaus müssen spezielle Schritte eingeleitet werden, um potentielle Viren zu inaktivieren. Eine Methode zur Inaktivierung unter Verwendung von Tri-(n-butyl)phosphat/Tween-80 (Warenzeichen) oder Tri-(n-butyl)phosphat/Triton X-100 (Warenzeichen) (Lösemittel/Detergens-Methode) sollte an allen Spenden^7,8 vorgenommen werden.
In der Gel-Formulierung für die topische Wundheilung kann die Viskosität im Bereich von 50 bis 1.000 Ns/m² (50.000 bis 1.000.000 cP), mehr bevorzugt zwischen 100 und 650 Ns/m² (100.000 und 650.000 cP) liegen. In der Creme-Formulierung kann die Viskosität im Bereich von 60 bis 80 Ns/m² (60.000 bis 80.000 cP) liegen. Sämtliche Viskositätswerte sind in "Ns/m²" (Centipoise (cP)) angegeben, die unter Verwendung eines Brookfield-Viskosimeters gemessen wurden. Die Assays wurden bei 0,5 U/min und bei Raumtemperatur ausgeführt.
In einer der Ausführungsfonnen der vorliegenden Erfindung kann die Gel-Formulierung 0,25% bis 1,0 Gew.% Polyacrylsäwe mit einer relativen Molekülmasse von etwa 740.000 bis 5.000.000 aufweisen. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt die Polyacrylsäwe mit 0,35% bis 0,75 Gew.% vor und verfügt über eine Viskosität von etwa 350 Ns/m² (350.000 cP). Der pH-Wert des Polyacrylsäure-Gels sollte im Bereich von 5 bis 8 und mehr bevorzugt zwischen 6,5 und 7,5 liegen. Das Polyacrylsäure-Polymer, auch bekannt als Carbomer, wird unter dem Warenzeichen Carbopol^® vertrieben. Die bevorzugte Qualität von Carbopol^®-Carbomer ist P-934.
In einer anderen Ausführungsform kann die Gel-Formulierung 18% bis 35 Gew.% Polyoxyethylen/Polyoxypropylen-Blockcopolymer mit einer relativen Molekülmasse von etwa 2.000 bis 13.000 aufweisen. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt das Polyoxyethylen/Polyoxypropylen-Blockcopolymer mit 18% bis 25 Gew.% vor und hat eine Viskosität von etwa 450 Ns/m² (450.000 cP) bei Raumtemperatur. Der pH-Wert des Blockcopolymer-Gels sollte im Bereich von 6 bis 8 und mehr bevorzugt zwischen 6,5 und 7,5 liegen. Das Polyoxyethylen/Polyoxypropylen-Blockcopolymer ist auch als "Poloxamer" bekannt und wird unter dem Warenzeichen Pluronic^® vertrieben. Die bevorzugte Qualität von Pluronic^®-Poloxamer ist F-127 (Poloxamer 407).
In einer weiteren Ausführungsform kann die Gel-Formulierung 1 bis 5% Cellulosederivat aufweisen, bei dem es sich um Hydroxypropylcellulose (HPC) handeln kann und das eine Viskosität von etwa 25 bis 150 Ns/m² (25.000 bis 150.000 cP) hat. HPC hat eine relative Molekülmasse von etwa 370.000 bis 1.150.000. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt das lose Derivat mit 2,0% bis 4,0 Gew.% vor und hat eine Viskosität von etwa 150 Ns/m² (150.000 cP) für HPC. Cellulose-Derivate, die in der vorliegenden Erfindung zur Anwendung gelangen, sind allgemein als Klucel für HPC bekannt. Die bevorzugte Qualität ist Klucel-HF.
In einer weiteren Ausführungsform wird eine Creme-Formulierung aus einer kommerziell verfügbaren Cremebasis angesetzt, d. h. Schering^®-Base. Diese Cremebasis (Öl-in-Wasser-Emulsion) enthält Ceteth-20, Cetostearylalkohol, Chlorkresol, Mineralöl, einbasisches Natriumphosphat, Phoshorsäure, Natriumhydroxid, Wasser und Alvolen. Die Viskosität des Präparats kann durch Änderung des Gehaltes an Wasser und Polyethylenglykol modifiziert werden.
Formulierungen der vorliegenden Erfindung enthalten eine wässrige Phase in Kombination mit einem Protein und sind damit gegenüber Angriff durch Bakterien und Pilze emfpindlich. Mikrobielles Wachstum verdirbt nicht nur die Formulierung, sondern ist auch eine potentielle toxische Gefährdung und eine Quelle für Infektion von Patienten. Obgleich das mikrobielle Wachstum, wenn es in einem topischen Präparat auftritt, wahrscheinlich nicht so gefährlich ist, kommt es darauf an, topische Präparate zu konservieren, die von den Patienten auf verletzte oder entzündete Haut aufgebracht werden sollen. Der Viskositätsabbau, der bei einigen Polymeren berichtet wird, wenn sie einer mikrobiellen Kontamination ausgesetzt sind, ist ebenfalls ein Thema. Um eine langzeitige Sterilität und Stabilität zu garantieren, muss dem Präparat daher ein Konservierungsmittel zugesetzt werden. Die vorliegende Erfindung gewährt Gele, die ein Konservierungsmittel aufweisen, das ausgewählt ist aus Phenol- oder den p-Hydroxybenzoat-Verbindungen. In einer der Ausführungsformen kann die Gel-Formulierung 0,1% bis 0,2 Gew.% Chlorkresol enthalten, ein Phenol-Derivat, oder 0,01% bis 0,3 Gew.% p-Hydroxybenzoat als Methyl- und Propylparaben. In einer anderen Ausführungsform enthält die Creme-Formulierung 0,1% bis 0,2 Gew.% Chlorkresol.
Der Formulierung können Stabilisiermittel zugesetzt werden, um stabile Zusammensetzungen von Fibronektin zu gewähren. Sie können dazu beitragen, die biologischen Wirkungen auf langfristiger Basis zu bewahren und können die Wasserlöslichkeit von Fibronektin verbessern. Unter diesen Mitteln sind Stabilisiermittel der Wahl: Albumin, Disaccharide, wie beispielsweise Saccharose, und cyclische Oligosaccharide, wie beispielsweise Cyclodextrine. Diese Mittel können entweder allein oder in Kombination verwendet werden. Hinsichtlich der Antigenität ist Humanalbumin bevorzugt und sollte frei sein von mikrobieller Kontamination. Cyclodextrine der β-Gruppe (7 Glucose-Einheiten) können gewählt werden, wobei Hydroxypropyl-β-cyclodextrin bevorzugt ist. Die Formulierung kann aufweisen: 0,01% bis 0,1 Gew.% Albumin, vorzugsweise 0,01% bis 0,05%; und/oder 0,5% bis 5,0 Gew.% Saccharin und bevorzugt 3,0% bis 5,0%; und/oder 1,0% bis 10 Gew.% wobei Hydroxypropyl-β-cyclodextrin und bevorzugt 2,0% bis 5,0%.
Einige Autoren haben vorgeschlagen, dass die Protease-Aktivität in einigen chronischen Wunden einen Abbau der Adhäsionsproteine bewirken kann, wie beispielsweise Fibronektin, und die für die normale Wundschließung erforderliche Zelladhäsion verhindert⁹. In chronischer Wundflüssigkeit sind Metalloproteasen und Serinproteasen identifiziert worden^9,10 sowie Fibronektin, von dem berichtet wurde, dass es gegenüber einer Aufspaltung durch Proteasen hoch empfindlich ist". Der Schutz der Unversehrtheit von Fibronektin kann durch Zusatz von Protease-Inhibitoren in der Dosierungsform erzielt werden. Die vorliegende Erfindung gewährt ebenfalls Formulierungen, die einen Metalloprotease-Inhibitor aufweisen können, wie beispielsweise EDTA, und/oder einen Serinprotease-Inhibitor, wie beispielsweise Aprotinin (Trasylol^®, Miles), wenn auf eine solche Aufgabe abgezielt wird. In einer der Ausführungsfomen kann die Dosierungsform 0,01% bis 1,0 Gew.% EDTA und/oder 1,5 bis 45,0 Gew.% Inh U Aprotinin aufweisen, worin 1 Inh U = 26 Kallikrein-Inhibitor-Einheiten sind.
Formulierungen der vorliegenden Erfindung können auf die Wundstelle mit Hilfe jedes beliebigen geeigneten Mittels aufgebracht werden, das gewährleistet, dass die Wundoberfläche vollständig bedeckt ist. Beispielsweise können sie direkt auf die Wundstelle aufgebracht oder zur Beschichtung von Fasern eines saugfähigen Verbandes verwendet werden, um einen Wundheilverband zu erzeugen, der dann auf eine Wunde aufgebracht werden kann.
Die nachfolgenden Beispiele sollen weitere Aspekte der Erfindung veranschaulichen und sind in keiner Weise zur Beschränkung ihres Geltungsbereichs auszulegen.
BEISPIEL 1
ISOLATION VON FIBRONEKTIN AUS HUMANPLASMA

1) Bei allen homologen Plasmaspendern ist ein Sterilisationsschritt obligatorisch. Um potentielle Viren zu inaktivieren wird eine Sterilisationsprozedur unter Anwendung der Lösemittel/Detergens-Methode verwendet. Es werden 1% Tri-(n-butyl)phosphat (TNBP) und 1% Triton X-100 (Warenzeichen) dem Plasma für 6 Stunden bei 24°C zugesetzt. Danach wird dem Plasma Sojaöl zugegeben und für mindestens 30 min gemischt, um TNBP zu extrahieren. Restliches Triton wird mit Hilfe der Dialyse eliminiert. Dieser erste Schritt wird übersprungen, wenn autologes Plasma verwendet wird.
2) Eine Gelatine-Separose 4B-Säule wird zuerst mit einer Vorwäsche mit einer Tris-HCl-Lösung versehen, um das Gel zu äquilibrieren.
3) Das Plasma wird mit einer Tris-HCl-Lösung verdünnt (1 : 1) und durch die Säule in Gegenwart von Phenylmethylsulfonylfluorid, 0,001 M, (PMSF) für etwa 15 Stunden bei 4°C gepumpt.
4) Anschließend wird die Säule 3 Mal gewaschen, um nicht spezifisch gebundene Plasmaproteine aus dem Gel zu eluieren. Alle Waschvorgänge werden unter Verwendung einer Tris-HCl-Lösung bei pH 7,5 ausgeführt. Eine 1 M NaCl-Lösung wird dem zweiten Waschvorgang zugesetzt, um Kontaminanten zu eluieren.
5) Die Eluierung von Fibronektin wird unter Verwendung von 0,1 M Na-Acetat + 1 M KBr-Lösung ausgeführt.
6) Anschließend werden zwei Dialyseschritte ausgeführt, um Kontaminanten zu eliminieren (Triton X-100 (Warenzeichen), KBr, Na-Acetat). Es wird eine Dialyse gegenüber PBS bzw. sterilem Wasser ausgeführt.
7) Die Lösung wird durch Ultrafiltration unter Stickstoffdruck eingeengt.
8) Die abschließende sterilisierende Filtration unter Verwendung eines 0,22 μm-Filters erfolgt, um eine Sterilität zu gewährleisten.
9) Es werden Fraktionen in aliquote Teile aufgeteilt und bei –20°C bis zu ihrer Einarbeitung in die topische Dosierungsform tiefgefroren.

BEISPIEL 2
POLYACRYLSÄURE-GELE
Es wurden Polyacrylsäure (Carbomer)-Gele hergestellt (Carbopol^®-Carbomer, BF Goodrich). Carbomer ist ein von Acrylsäure deriviertes Polymer. Es ist ein Polymer mit hoher relativer Molekülmasse (740.000 bis 5.000.000), das bei Neutralisierung mit starkem Alkali (NaOH) oder Aminen (Triethanolamin) geliert. Es bildet Gele bei relativ geringen Konzentrationen bis herab zu 0,25%, wobei seine Viskosität durch den Zusatz von Elektrolyten stark herabgesetzt wird.
Die bevorzugte Qualität von Polyacrylsäure ist Carbopol^® 934-P-Carbomer bei Konzentrationen im Bereich von 0,35% bis 0,75% (Gewicht/Gewicht). Geringere Konzentrationen sind unzureichend, um die Haftung an der Wunde zu unterstützen, während höhere Konzentrationen die Freisetzung von Fibronektin aus dem Gel verringern. Die Viskosität von Polyacrylsäure-Gelen ist zwischen einem pH-Wert von 6 bis 8 mit einem bevorzugten pH-Bereich zwischen 6,5 bis 7,5 stabil. Die Viskosität wird in Gegenwart von starken Elektrolyten herabgesetzt.
Ein Polyacrylsäure-Gel, das 0,2% (Gewicht/Gewicht) enthält, 0,375% Carbopol^® 934-P-Carbomer und 0,1% Chlorkresol, wurde folgendermaßen angesetzt: es wurde Chlorkresol (1,0 g) in warmem (65°C) deionisiertem Wasser (95 ml) unter leichter Bewegung aufgelöst. Sobald das Chlorkresol vollständig aufgelöst war, wurde die Lösung bei Raumtemperatur gekühlt, während die Bewegung aufrecht erhalten wurde. Anschließend wurde Carbopol^® 934-P-Carbomer (3,75 g) zugesetzt, dieses langsam auf der Oberfläche der Lösung verteilt und mit einem Rührwerk vom Schaufeltyp für etwa 3 Stunden gemischt. Diese Dispersion wurde anschließend autoklaviert, um eine sterile konzentrierte Gelbase zu schaffen (3,75% Gewicht/Gewicht). Eine Stammlösung von Fibronektin mit 2,2 mg/ml (90 ml) wurde durch ein 0,22 μm-Acetatfilter filtriert. Ein Polylmerisationsbeschleuniger, Natriumhydroxid, wurde der Fibronektin-Lösung in einer Menge zugesetzt, mit der eine 10 g-Portion des Carbopol^®-Carbomer-3,75%-Dispersion neutralisiert wird, d. h. 1.250 μl 3 M NaOH.
Die Stammlösung von Fibronektin und Carbopol^®-Carbomer-Dispersion wurde in die Spritzen gemischt und dabei darauf geachtet, dass die Einführung von Luftbläschen vermieden wurde und indem eine Kontamination durch Arbeiten in einer aseptischen Umgebung vermieden wurde, wie beispielsweise unter einem Abzug mit laminarer Strömung. Im Allgemeinen werden zwei Spritzen verwendet und mehrfache Wechsel unter Druck vorgenommen. Um die Spritzen oder andere Wechselapparate miteinander zu verbinden kann eine Adaptervorrichtung verwendet werden, wie beispielsweise eine Einschraubverlängerung nach Luer. Eine heftige Bewegung wird auf ein Minimum herabgesetzt, um eine Ausfällung von Fibronektin zu vermeiden. Diese Herstellung liefert ein klares, konserviertes Gel (100 g) Fibronektin, das frei von Mikroorganismen ist und eine Viskosität von etwa 350.000 cP hat.
Diese Gel-Formulierung wurde zwei Mal täglich auf Bein-Geschwulsten in einer Pilotstudie am Menschen aufgetragen und zeigte eine erhöhte Geschwindigkeit des Wundheilens ohne irgendwelche nachteiligen Einflüsse.
In einer bevorzugten Ausführungsform lassen sich konzentrierte Lösungen von Fibronektin mit bis zu mindestens 10 mg/ml ansetzen. Diese Lösungen können dann verwendet werden, um ein konzentriertes Fibronektin-Gel herzustellen. Um das Fibronektin-Gel herzustellen, müssen die folgenden Inhaltsstoffe nacheinander zugesetzt werden und werden für den Ansatz von 10 g Gel benötigt, das variierende Fibronektinkonzentrationen von 0,5 bis 1,0% aufweist. Erstens, wird der pH-Wert von 9,8 g demineralisiertem Wasser auf etwa 8,0 bis etwa 11,0 mit 0,094 g 3 M NaOH eingestellt. Anschließend wird lyophilisiertes Fibronektin in demineralisiertem Wasser mit pH 8,0 bis 11,0 in Mengen aufgelöst, die von 0,05 bis 0,1 g variieren. Bei Herstellung eines Carbomer-Gels wird ein pH-Wert von 9,0 für das demineralisierte Wasser bevorzugt. In einem letzten Schritt der Prozedur werden der Mischung 0,028 g Carbomer zugesetzt.
BEISPIEL 3
GELE AUS POLYOXYETHYLEN/POLYOXYPROPYLEN-BLOCKCOPOLYMER
Es wurden Gele von Polyoxyethylen/Polyoxypropylen-Blockcopolymer (Poloxamer) (Pluronic^®-Poloxamer, BASF Wyandotte) hergestellt. Die bevorzugte Qualität von Poloxamer ist Pluronic^® F-127-Poloxamer bei Konzentrationen im Bereich von 18% bis 25 Gew.% (Gewicht/Gewicht). Bei Pluronic^® F-127-Poloxamer handelt es sich um ein niedermolekulares Polymer (2.000 bis 13.000), das Merkmale einer thermischen Gelbildung zeigt. Die Gelbildung tritt auf, wenn die Konzentration 18% Poloxamer erreicht. Die Viskosität von Poloxamer ist proportional zur Konzentration des Polymers, des Typs des verwendeten Polymers (Molekulargewicht) und der Temperatur. Bei 4°C flüssig, erstarrt das Polymer mit zuznehmenden Temperaturen und bietet hohe Viskositätswerte bei Raumtemperatur. Im Gegensatz zu Carbopol^®-Carbomer erhöht der Zusatz von Ionen die Viskosität des Präparats.
Es sind konzentrierte wässrige Lösungen (20 bis 30%) bekannt geworden, die eine dramatische Zunahme der Viskosität zeigen, wenn sie von 4°C bis Körpertemperatur erwärmt werden. Darüber hinaus nimmt die Viskosität, wenn die Ionenkonzentration der Lösung erhöht wird, mit steigender Temperatur rascher zu. Es stehen mehrere Qualitäten zur Verfügung, wobei jedoch die Qualität F-127 am wenigsten toxisch ist und die Gelbildung bei geringeren Konzentrationen eintreten kann. Gele von Poloxamer, die in der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, sind Lösungen mit geringer Viskosität bei 4°C und erstarren rasch, wenn sie bis Körpertemperatur erwärmt werden.
Es wurde wie folgt Poloxamer-Gel hergestellt, das 0,2% (Gewicht/Gewicht) Fibronektin und 20% Pluronic^® F-127-Poloxamer enthält: es wurde eine Stammlösung von 2,2 mg/ml (80 ml) Fibronektin durch ein 0,22 μm-Acetatfilter filtert. Zu 80 ml der Fibronektin-Lösung wurde Pluronic^® F-127-Poloxamer (20 g) zugesetzt und ohne Bewegung bei 4°C für etwa 3 Tage auflösen gelassen. Die resultierende Lösung (100 g) ist einer Flüssigkeit sehr ähnlich. Die Gelbildung tritt sofort ein, wenn die Lösung in Kontakt mit der Wunde gelangt. Sofern kein steriles Poloxamer-Pulver erhalten werden kann, kann ein Prozess einer sterilisierenden Filtration, der bei 4°C ausgeführt wird, auch auf die fertige Lösung angewendet werden. Die Viskosität variiert von nicht detektierbaren Werten bei 4°C bis 450.000 cP bei Raumtemperatur.
BEISPIEL 4
GELE AUS CELLULOSE-DERIVAT
Es wurden Gele aus Hydroxypropylcellulose (HPC) hergestellt. Um diesen Typ von Formulierungen zu veranschaulichen, wird nachfolgend die Herstellung eines 3%igen HPC-Gels beschrieben. Die bevorzugte Qualität ist Klucel-HF-Hydroxypropylcellulose bei Konzentrationen im Bereich von 2% bis 4 Gew.% (Gewicht/Gewicht).
Eine Gel-Formulierung mit einem Gehalt von 0,1 Gew.% (Gewicht/Gewicht) Fibronektin, 3% HPC und Parabenen wurde wie folgt hergestellt: es wurden Methylparaben (0,05 g) und Propylparaben (0,02 g) in warmem deionisiertem Wasser (94 ml) aufgelöst. HPC-Pulver wurde unter Anwendung eines Prozesses der trockenen Wärmesterilisierung sterilisiert. Sodann wurde HPC (6 g) in dieser Lösung dispergiert und mit einem Rührer vom Schaufeltyp für etwa 3 Stunden gemischt. Dieses liefert eine sterile konzentrierte Gelbasis (6% Gewicht/Gewicht). Eine Stammlösung von 2 mg/ml (50 ml) Fibronektin wurde durch ein 0,22 μm Acetatfilter filtert. Sodann wurde die Fibronektin-Lösung (50 ml) langsam einer Portion (50 g) dieser konzentrierten Basis unter Verwendung des Rührers mit einer langsam drehenden Welle zugesetzt. Dieses lieferte ein konserviertes Gel (100 g) mit einer Viskosität von etwa 150.000 cP.
BEISPIEL 5
CREME-FORMULIERUNG
Es wurde eine Creme-Formulierung mit einem Gehalt von 0,1 Gew.% (Gewicht/Gewicht) Fibronektin, steriler Cremebasis (Schering-Basis, Schering) und 0,1% Chlorkresol wie folgt hergestellt: es wurde eine Stammlösung von 2 mg/ml (50 ml) Fibronektin durch ein 0,22 μm Acetatfilter filtriert. Anschließend wurde die Fibronektin-Lösung (50 ml) langsam zu einer Portion (50 g) der Cremebasis unter Verwendung eines Rührers mit langsam drehender Welle zugesetzt. Dieses lieferte eine konservierte Creme (100 g) mit einer Viskosität von etwa 70.000 cP.
BEISPIEL 6
KINETIK DER FREISETZUNG VON VERSCHIEDENEN TOPISCHEN DOSIERUNGSFORMEN
Die Wirksamkeit jeder topischen Formulierung im Bezug auf die Freisetzung von Fibronektin wurde unter Verwendung eines in vitro-Diffusionszellensystems bewertet. Die Permeationsuntersuchungen wurden alle an einer menschlichen Brust und abdominalen deepithelisierten Hautproben ausgeführt, die von einer Brustverkleinerung und abdominalen Lipektomie-Eingriffen erhalten wurden. Es wurde ein 8 μm-Abschnitt aus der epidermalen Oberfläche der Haut unter Verwendung eines Dermatoms (1/10.000 Schnittmaßstab) entfernt und die dermale Seite sorgfältig von etwaigen anhaftenden, subkutanen Gewebeteilen und/oder Blutgefäßen gereinigt. Die epithelisierte menschliche Haut wurde verwendet, um den pathologischen Zustand zu reproduzieren, der in chronischen venösen Geschwulsten angetroffen wird, wo die Epidermisschicht fehlt.
Das Diffusionszellsystem, das gewählt wurde, bestand aus einem starren Rezeptor, der die Hautprobe enthielt, wobei die deepithelisierte Seite nach oben in das Donator-Kompartiment zeigte und die dermale Seite nach unten in das Rezeptor-Kompartiment zeigte. Das Rezeptor-Kompartiment war mit. einem zirkulierenden Pufferkreis verbunden. Die Puffertemperatur wurde bei 37°C gehalten, währenddessen sich die Hautoberfläche bei etwa 32°C befand. Jede Analyse wurde an einer Hautprobe von 0,64 m² unter Verwendung eines 100 μl-Aliquots von einer ¹²⁵I-Fibronektin-topischen Formulierungsprobe ausgeführt. Nach dem Versuch wurde die Haut von der Diffusionszelle entfernt, 10 Mal mit einem 8 ml-Wasservolumen gewaschen und auf ihren Gehalt an Radioaktivität in einem Gammastrahlenzähler analysiert. Die aufgenommene Gesamtmenge (Dermis + Rezeptorkompartiment), dividiert durch die aufgebrachte Dosis, ergab die prozentuale Absorption. Dieses Diffusionszellensystem hat hervorragende und reproduzierbare intra- und interexperimentelle Ergebnisse geliefert.
Alle Dosierungsformen wurden in salzfreier Lösung angesetzt, da die Viskositätswerte durch das Vorhandensein von Elektrolyten hätten beeinflusst werden können. Beispielsweise werden die Viskositätswerte von Carbomer-Gelen in Gegenwart starker Elektrolyte im Gegensatz zu Poloxamer-Gelen herabgesetzt, die viskoser sind, wenn dem Präparat Elektrolyte zugesetzt werden.
Von mehreren Autoren sind perkutane Absorptionsuntersuchungen unter Anwendung von in vitro- und in vivo-Methoden verglichen worden, um die Zuverlässigkeit von Ergebnissen unter Anwendung dieser Methoden zu ermitteln¹³'¹⁴'¹⁵. Diese Vergleiche haben eindeutig gezeigt, dass in vitro-Untersuchungen den Lebendzustand exakt wiedergeben können. Die auf unsere Versuche zur Anwendung gebrachte statistische Analyse hat einen guten Korrelationswert zwischen Untersuchungen ergeben, die an Haut ausgeführt wurden, die von unterschiedlichen Quellen erhalten wurde. Diese Daten haben gezeigt, dass die Herkunft der Haut keinerlei Einfluss auf die Ergebnisse hat.
Perkutane Absorptionsuntersuchungen werden in der Regel an intakter Haut ausgeführt und sind so konzipiert, dass die Freisetzung einer Substanz von einem topischen Vehikel und seine Absorption durch die größere kutane Barriere ausgewertet werden, d. h. dem Stratum corneum. In kutanen Geschwulsten fehlt der Barriereeffekt des Stratum corneums. Unter diesem pathologischen Zustand wird lediglich die Diffusion von dem dermatologischen Vehikel ein Hauptfaktor für die Ulkus-Penetration des Arzneimittels in die Dermis sein.
Das vorstehend beschriebene Diffusionszellensystem ist für kutane Geschwulste ein geeignetes in vitro-Modell.
Es wurden kinetische Daten über die Freisetzung von Fibronektin von verschiedenen Dosierungsformen bei 4, 12 und 24 Stunden erhalten. In Tabelle 1 sind diese Daten für t = 12 Stunden zusammengestellt. Die Kontrolle bestand aus ¹²⁵I-Fibronektin in Phosphat-gepufferter Salzlösung mit einem pH-Wert von 7,4. Die in dem Carbopol^® 934 P-Carbomer (1%) verwendeten Liposomen + Liposomen-Formulierung (15%) (Lipogel) wurden aus Proliposomen hergestellt (Pro-Lipo 3090SH^TM, Lucas Mayer, Frankreich). Cellulose-Derivate wurden für die Natriumcarboxymethylcellulose als CMC und HPC für Hydroxypropylcellulose bezeichnet. Bei Dermabase^®-Basis (Borden, Ltee., Don Mills, Ontario, Kanada) und Schering^®-Basis sind Creme-Basissubstanzen, die auf dem Markt verfügbar sind und die für diese Versuche auf 1 : 1 verdünnt wurden. Das Symbol [] bezeichnet die Komponentenkonzentration und "Abs-Wert" den Prozentanteil von radioaktiv markiertem Fibronektin, das in der Dermis nach einer Exponierungszeit von 12 Stunden gefunden wurde.

TABELLE 1
1 zeigt eine graphische Darstellung der kinetischen Daten von 3 Gel-Dosierungsformen und einer Kontrolllösung in Abhängigkeit von der Zeit. Aus dieser graphischen Darstellung ist ersichtlich, dass der Absorptionsprozess dazu neigt, zwischen einer Zeit von Null und 12 Stunden stärker ausgeprägt zu sein als zwischen einer Zeit von 12 und 24 Stunden, was nahelegt, dass 2 Aufträge pro Tag mehr Fibronektin freisetzen könnten als auf einer Basis 1 Mal täglich.
2 stellt die kutane Absorption von radioaktiv markiertem Fibronektin verschiedener Dosierungsformen und einer Kontrolle für eine Zeit von 12 Stunden dar. Um statistisch signifikante Unterschiede zwischen Carbopol^®-Carbomer-Gel und anderen Formulierungen zu identifizieren, wurde das statistische Prüfverfahren nach Dunnett angewendet. Dieses Verfahren hat auch signifikante Unterschiede zwischen Lipogel, Carbogly und Carbopol^®-Carbomer-Gel als Ergebnisse ergeben, die mit denen der Wirksamkeit in Korrelation gebracht werden können, die während klinischer Versuchsreihen erhalten wurden (siehe Beispiel 8). Die Wirksamkeit von Carbopol^®-Carbomer-Gel-Formulierung ist deshalb besonders überraschend, weil Carbopol^®-Carbomer-Gel einen höheren Viskositätsgrad hat als viele der anderen untersuchten Formulierungen. Ebenfalls bemerkenswert ist die Differenz in den Abs-Werten zwischen dem Carbopol^®-Carbomer-Gel- und den CMC-Formulierungen, da sie beide den gleichen Viskositätsgrad haben.
4 zeigt, dass nicht immer eine eindeutige Beziehung zwischen Viskosität und Absorption besteht, wenn man einige der Präparate betrachtet, bei denen Viskositätswerte ermittelt wurden. Beispielsweise präsentiert Dermabase^®-Basis, die über eine relativ niedrige Viskosität (119.000 cP) im Vergleich zu Carbopol^®-Carbomer-Gel (411.300 cP) verfügt, ein schlechtes Freisetzungsvermögen (5,80%) im Vergleich zu Carbopol^®-Carbomer-Gel (13,40%).
5 zeigt, dass höhere Absorptionswerte als 13,40% unter Verwendung von 0,28% Carbomer und höherer Konzentrationen von Fibronektin erhalten werden können. In 6 werden die Absorptionswerte direkt verglichen, die im deepithelisierten Haut-Diffusionszellensystem für 0,28% und 0,375% Carbomer-Gele erhalten wurden, die beide über 0,2% Fibronektin verfügen.
In 5 und 6 wurde die Menge von Fibronektin unter Anwendung von ELISA-Prozeduren gemessen. Es wurde eine Polystyrol-Mikrotiterplatte mit 100 μl verschiedener Fibronektinproben in 50 mM Carbonat/Hydrogencarbonat-Puffer bei pH 9,6 und 4°C über Nacht inkubiert. Es wurde eine Lösung von 5% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS Tween mit pH 7,5 als blockierender Puffer für 30 min bei 37°C verwendet. Die Platte wurde 4 Mal mit PBS Tween, pH 7,5, und 100 μl Kaninchen-Anti-FN gewaschen, das mit Hilfe auf dem Gebiet gut bekannter Methoden erzeugt wurde, auf 1 : 100.000 in 0,5% PBS Tween, pH 7,4, verdünnt und zugegeben und die Platte für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Nach 4-maligem Waschen mit PBS-Puffer wurden 100 μl der Ziegen-Anti-Kaninchen-Meerrettich-Peroxidase konjugiert (Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., PA), auf 1 : 100.000 in 0,5% PBS Tween (Warenzeichen), pH 7,4, verdünnt, zugesetzt und die Platte für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde überschüssiges Konjugat durch Waschen gründlich entfernt und die Peroxidase in den Titermulden fixiert und durch Zusatz von ABTS (2,2'-Azino-bis(3-ethylbenz-thiazolin-6-sulfonsäure) in Citrat-Puffer bei pH 4,6 mit einem Gehalt von 0,015% Wasserstoffperoxid detektiert. Die Reaktion wurde durch Zunahmen des Absorptionsvermögens bei 410 nm im Vergleich mit einer Fibronektin-Peroxidase-Standardreaktion verfolgt.
BEISPIEL 7
STABILITÄT VON FIBRONEKTIN IN GEL
Es wurde die biologische Aktivität und Unversehrtheit der Makrostruktur von Fibronektin in Gel-Formulierungen ausgewertet (3). Die Assays wurden an einer Probe von Gel mit einem Gehalt von 0,2 Gew.% (Gewicht/Gewicht) Fibronektin, 0,375% Carbopol^® P-934-Carbomer und 0,1% Chlorkresol ausgeführt. Die Proben wurden für 32 Wochen bei 4°C aufbewahrt.
Um die Unversehrtheit der Makrostruktur von Fibronektin in Gel zu ermitteln, wurden Methoden der Elektrophorese angewendet. Nachdem die Gelprobe in einer Lösung von 1 M NaCl + Tris-HCl bei pH 6,8 bis 7,4 aufgelöst wurde, ließ man sie auf einem 7,5%igen Acrylamid-Gel entsprechend der Methode von Laemmli ("Denaturing (SDS) discontinous gel electrophoresis: Laemmli gel method," S.: 10.2.4.–10.2.9, Current Protocols in Molecular Biology (1994)) migrieren. Im Vergleich mit einer frischen Standardlösung (Säule 0) zeigten die Ergebnisse, dass im Bereich des 220.000 (Säule B) Bandes nahezu 100% des Fibronektins identifiziert werden kann, was zeigt, dass, wenn überhaupt, eine sehr geringe Degradation auftritt.
Die biologische Aktivität wurde unter Anwendung einer Affinitätschromatographie-Prüfung bewertet. Eine dieser biologischen Aktivitäten ist das Binden der Gelatine, das relativ leicht bestimmt werden kann. Nachdem eine Probe eines Gels in einer 1 M NaCl-Lösung aufgelöst wurde, wurde eine bekannte Menge dieser viskosen Lösung in ein Eppendorf-Röhrchen in Gegenwart von Gelatine-Sepharose- 4B gegeben und sodann vortexiert. Der Inhalt wurde weiter mit einer frischen 1 M NaCl-Lösung gespült, zentrifugiert und der Überstand verworfen, um die Kontaminanten zu eliminieren, wie beispielsweise Carbopol^®-Carbomer und Chlorkresol, die von der Auflösung des Gels herrührten. Fibronektin wurde aus Gelatine-Sepharose-4B unter Verwendung einer 1 M KBr-Lösung eluiert. Die aufgenommene Fraktion ließ man auf 7,5% Acrylamid-Gel entsprechend der Methode nach Laemmli migrieren. Das Band wurde sodann im Bezug auf seinen Gehalt von Fibronektin unter Anwendung eines densitometrischen Scanning-Assays ausgewertet. Die aufgenommene Probe konnte außerdem spektrophotometrisch unter Benutzung der optischen Dichte bei einer Wellenlänge von λ = 280 nm auswerten.
Im Vergleich mit einem frisch hergestellten Gel von Fibronektin (Säule 0) konnte festgestellt werden, dass eine große Menge (80%) des Fibronektins aus der Probe der Gel-Formulierung (Säule-8 Monate) gewonnen wurde, was darauf hinweist, dass die Aktivität der Gelatinebindung des Glykoproteins für eine lange Zeitdauer in dieser Dosierungsform aufrecht erhalten werden kann.
BEISPIEL 8
KLINISCHE VERSUCHSREIHEN: BEHANDLUNG CHRONISCHER BEINGESCHWULSTE
Wir haben 5 klinische Versuchsreihen (Pilotstudien) ausgeführt, um die Anwendbarkeit unterschiedlicher Dosierungsformen, die exogenes Humanplasma-Fibronektin enthalten, bei der Behandlung chronischer Venengeschwulste der unteren Gliedmaßen zu untersuchen. In diesen Versuchsreihen wurde autologes Plasma-Fibronektin verwendet, wobei Patienten mit Geschwulsten zur Auswahl kamen, die für mindestens 3 Monate gegenüber der konventionellen Therapie resistent waren.
Die spezielle Aufgabe des ersten Versuchs bestand darin, die Wirksamkeit von topisch aufgebrachtem Fibronektin als einen Wundheilungsbeschleuniger zu bestimmen. In diese Studie wurden 7 Patienten einbezogen und angeleitet, den Wundbereich mit einer Lösung Fibronektin, 1 mg/ml (0,1%) in PBS (Phosphat-gepufferte Salzlösung), 2 Mal täglich "auszuschwemmen". Nach 2 Monaten eines regelmäßigen Auftrags dieser Lösung zeigten 5 von diesen Patienten eine dramatische Abnahme ihrer Wundgröße mit speziell mindestens 75%iger Verringerung der zusammenhängenden Oberfläche.
Es wurde ein zweiter Versuch konzipiert, um die Wirksamkeit einer halbfesten Dosierungsform zu bewerten, die 0,1 Gew.% Fibronektin gekapselt in 15% Liposom enthielt, was wiederum in eine Carbopol^®-Carbomer (1%)-Formulierung eingebaut war, die als Lipogel bekannt ist. Die Hypothese bestand darin, dass, wenn die Kontaktdauer des Glykoproteins mit der Wunde erhöht werden konnte, theoretisch eine raschere Abnahme der Dauer der Heilung zu beobachten sein müsste. Es wurden in diese Studie 6 Patienten einbezogen, die 2 Mal täglich die Formulierung auf ihre Wunde aufbringen mussten. Bei keinem zeigte sich eine wesentliche Abnahme ihrer Wundgröße während der folgenden 3 Monate der regelmäßigen Behandlung.
In einem Versuch zur Verbessenung der Dosierungsform wurde ein Versuch ausgeführt, das therapeutische Potential einer topischen Gel-Formulierung auszuwerten, die 0,2 Gew.% (Gewicht/Gewicht) Fibronektin eingebaut in 0,375% Carbopol^®-Carbomer und 10% Glycerin (Carbogly) enthielt. Der Formulierung ist Glycerin zugesetzt worden, um dessen Vorteil hinsichtlich seiner Wirkung als Feuchthaltemittel zu nutzen, was für die Wunde förderlich sein konnte. Für diese Studie wurden 11 Patienten rekrutiert, die ebenfalls das Gel 2 Mal täglich anzuwenden hatten. Unter diesen Patienten hatten 27% eine Rückentwicklung von mehr als 50% ihrer Wundgröße nach 3-monatiger Behandlung.
Die Ergebnisse aus den Permeationsuntersuchungen können mindestens zum Teil erklären, was in den früheren Experimenten abgelaufen war. 2 zeigt, dass Präparate, wie beispielsweise Lipogel und Carbopol^®-Carbomer + Glycerin nicht zu hohen Absorptionswerten führten. Im Gegensatz dazu führte Carbopol^®-Carbomer mit 0,375% ohne Glycerin zu signifikant höheren Absorptionswerten (p < 0,001). Dieser Effekt von Glycerin wurde nicht bei Formulierungen beobachtet, die mehr als 0,2% Fibronektin enthielten. Die in dem ersten Versuch verwendete Lösung wurde in dieser graphischen Darstellung als Kontrolle bezeichnet. Dieses letzte Präparat gewährte das größte Freisetzungsvermögen, stellt jedoch keine Formulierung dar, die für Patienten aufgrund ihrer flüssigen Konsistenz von Nutzen sein könnte.
Unter Beachtung dieser Ergebnisse wurde eine Formulierung an 8 Patienten untersucht, die 0,2 Gew.% (Gewicht/Gewicht) Fibronektin in Carbopol^®-Carbomer mit 0,375% ohne Glycerin enthielt. Nach klinischen Untersuchungen und Permeationsuntersuchungen ist diese Formulierung der bevorzugte Träger unter Verwendung von Carbopol^®-Carbomer, das für die Verwendung von Fibronektin bei der topischen Wundheilung verfügbar ist. Vorläufige Daten zeigten, dass 50% der untersuchten Patienten eine Rückbildung von mehr als 50% ihrer Wundgröße innerhalb von 3 Monaten der Behandlung zeigten, einschließlich von 2 Fällen eines vollständigen Ansprechens (100% Heilung), das innerhalb der ersten 8 Wochen der Behandlung auftrat.
Es wurde eine fünfte klinische Versuchsreihe mit 40 Patienten mit der Formulierung ausgeführt, die 0,2 Gew.% (Gewicht/Gewicht) Fibronektin in Carbopol^®-Carbomer ohne Glycerin enthielt. In dieser klinischen Versuchsreihe wurden Patienten nach der Dauer der Hautgeschwulst (Alter der Geschwulst) bei Beginn der Versuchsreihe stratifiziert. Bei Patienten mit Geschwulsten einer Dauer von 6 Monaten oder weniger war die Formulierung, die 0,2 Gew.% (Gewicht/Gewicht) Fibronektin in 0,375% Carbopol^®-Carbomer ohne Glycerin enthielt, nicht besser als das Plazebo. Das Plazebo war Carbopol^®-Carbomer ohne Glycerin und enthielt kein Fibronektin. Allerdings war bei Patienten mit Geschwulsten einer Dauer von 7 Monaten oder mehr zum Zeitpunkt der Randomisierung die Fibronektin-Formulierung, die 0,2 Gew.% (Gewicht/Gewicht) Fibronektin in 0,375% Carbopol^®-Carbomer ohne Glycerin enthielt, eindeutig überlegen. Nach einer Behandlung über 20 Wochen hatten 58% der behandelten Gruppe (7/12) eine Verringerung der Wundgröße von mindestens 75% nach 20-wöchiger Behandlung. Diese heilsame Wirkung hatten lediglich 25% (1/4) in der Plazebo-Gruppe. Insgesamt verschlechterten sich mit Plazebo behandelte Patienten (n = 4), bei denen die mittlere Wundgröße um etwa 60% der Größe zunahm. In der mit Fibronektin behandelten Gruppe (n = 11) nahm die mittlere Wundgröße durch Schließen von 30% nach 20-wöchiger Behandlung ab.
Die vorliegende Erfindung gewährt außerdem andere Formulierungen, die genauso verwendbar sind, wie diejenige, die bei der in Beispiel 5 als ein Modellsystem zur Prüfung der verschiedenen Formulierungen beschrieben wurde.
BEISPIEL 9
FALLSTUDIEN
Zur Veranschaulichung der Wirksamkeit der Formulierung, die Fibronektin und Carbopol^®- Carbomer 934-P mit 0,375% (Gewicht/Gewicht) enthält, präsentieren wir 2 spezielle Fälle einer chronischen venösen Beingeschwulst. Diese Fälle sind insofern von Interesse, dass der erste Fall gegenüber einer konventionellen Therapie stark resistent war und es sich beim zweiten Fall um eine große Geschwulst handelte. Von mehreren Autoren sind Faktoren identifiziert worden, wie beispielsweise Dauer und Oberfläche, die eine Hauptrolle in der Prognose der venösen Geschwulst spielen.
FALL 1
Eine 37 Jahre alte Frau präsentierte eine 10 jährige Anamnese einer chronischen venösen Geschwulst am rechten Unterschenkel. Ihre Krankengeschichte war mit Ausnahmen von 4 Episoden einer Phlebitis nicht signifikant. Die letzte Episode trat während der Schwangerschaft auf und führte schließlich zu einer Geschwulst. Eine Betrachtung der medizinischen Behandlungen, die versucht worden waren, zeigte die Verwendung topischer Antiseptika, Stützstrümpfe und Hauttransplantation ohne jegliches positive Ergebnis.
Die Patientin kam in unsere Klinik mit einer schmerzenden Wunde von 1,60 cm². Trotz der Tatsache, dass ihre Geschwulst relativ klein war, zeigte sie sich gegenüber der Therapie hoch resistent. 6 Wochen nach Beginn des Auftrags des Gels von Fibronektin konnte eine 92%ige Verringerung ihrer Wundgröße beobachtet werden. Eine vollständige Reepithelisierung war nach einem 10-wöchigen Behandlungsablauf festzustellen. Eine einen Monat später angesetzte Nachuntersuchung ergab keine Beeinträchtigung ihrer Wundbeschaffenheit.
FALL 2
Ein 39 Jahre alter Mann präsentierte eine 7-monatige Anamnese einer chronischen venösen Geschwulst am linken Bein. Seine Krankengeschichte war mit Ausnahme einer Saphenektomie des linken Unterschenkels 12 Jahre zuvor nicht signifikant. Dem Patienten wurden topische Antibiotika verschrieben ohne irgendeine Wirkung auf die Wundgröße.
Er kam zu unserer Klinik mit einer Geschwulst von 10,5 cm², die aus einem lokalen Trauma resultierte. Von Bedeutung war ein Lymphödem des linken Unterschenkels und eine große krustige nekrotische Lage, die die Wunde begrenzte. Die berufliche Tätigkeit des Patienten zwang ihn, über längere Zeitdauer zu stehen. Obgleich diese Situation seine Wundbeschaffenheit wahrscheinlich verschlechterte, ließ sich diese nicht ändern.
Nach 4 Wochen eines regelmäßigen Auftrags eines Plazebo-Gels und normaler Salzlösung nahm die Wundgröße bis 21,5 cm² als Folge einer lokalen Wundtoilette zu. Das Plazebo-Gel wies 0,375% Carbopol^®-Carbomer 934-P auf, 0,1% Chlorkresol, gereinigtes Wasser und NaOH zur Einstellung des pH-Werts. Die aktive Behandlung mit der Fibronektin enthaltenden Carbopol^®-Carbomer-Gel-Formulierung begann zu diesem Zeitpunkt. Die maximale Wundgröße wurde 6 Wochen später mit 37,5 cm² aufgezeichnet und offenbarte eine größere Geschwulst als anfangs angenommen wurde. Der Wundheilungsprozess beanspruchte zwischen 6 bis 8 Wochen und war nach 31 Wochen einer aktiven Behandlung beendet. Die einen Monat später angesetzte Nachuntersuchung ergab keine Beeinträchtigung seiner Wundbeschaffenheit.
Obgleich die vorliegende Erfindung im Bezug auf ihre speziellen Ausführungsformen beschrieben wurde, sind dem Fachmann auf dem Gebiet zahlreiche andere Variationen und Modifikationen und andere Anwendungen offensichtlich.
REFERENZEN

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Claims

Verfahren zum Herstellen einer nichtgepufferten wässrigen Lösung, enthaltend mindestens 2 mg/ml Fibronektin, welches Verfahren den Schritt des Zusetzens von gereinigtem Fibronektin zu basischem Wasser umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem das Wasser demineralisiertes Wasser ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem das Fibronektin Humanplasma-Fibronektin ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem das gereinigte Fibronektin lyophilisiert ist.
Verfahren zum Herstellen einer nichtgepufferten wässrigen Lösung, enthaltend mindestens 2 mg/ml Fibronektin, welches Verfahren die Schritte umfasst: a) Einstellen des pH-Wertes des demineralisierten Wasser auf 8,0 bis 11,0 und b) Zusetzen von ausreichendem gereinigtem Fibronektin zu dem Wasser von Schritt a), um eine Konzentration von 2 mg/ml Fibronektin zu erreichen.
Verfahren nach Anspruch 5, bei welchem die nichtgepufferte wässrigen Lösung 2 bis 10 mg/ml Fibronektin enthält.
Verfahren nach Anspruch 5, bei welchem das Fibronektin Humanplasma-Fibronektin ist.
Verfahren nach Anspruch 5, bei welchem das gereinigte Fibronektin lyophilisiert ist.
Verfahren zum Herstellen einer nichtgepufferten wässrigen Lösung, enthaltend mindestens 2 mg/ml Fibronektin, welches Verfahren die Schritte umfasst: a) Einstellen des pH-Wertes des demineralisierten Wasser auf 9,0 und b) Zusetzen von ausreichendem gereinigtem Fibronektin zu dem Wasser von Schritt a), um eine Konzentration von 2 mg/ml Fibronektin zu erreichen.
Nichtgepufferte wässrige Lösung mit einem pH-Wert von 8,0 bis 11,0, enthaltend mindestens 2 bis 10 mg/ml Fibronektin.
Pharmazeutische Formulierung, aufweisend mindestens 0,5% bis 1,0 Gew.% Fibronektin bezogen auf das Gesamtgewicht der pharmazeutischen Formulierung, aufweisend: a) eine nichtgepufferte wässrigen Fibronektin-Lösung, hergestellt nach Anspruch 5, und b) einen pharmazeutisch zulässigen Träger.
Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 11, worin der pharmazeutisch zulässige Träger ein wasserlösliches pharmazeutisches Polymer mit einer Viskosität bei Raumtemperatur von 50 bis etwa 1.000 Ns/m² (50.000 bis 1.000.000 cps) ist.
Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 11, ferner aufweisend mindestens ein extrazellulläres Matrixprotein ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Thrombospondin, Laminin, Vitronektin und Fibrinogen.
Pharmazeutische Formiulierung nach Anspruch 11, ferner aufweisend mindestens einen Wachstumsfaktor.
Wässrige Gel-Formulierung zum Heilen chronischer Wunden, aufweisend 0,28 Gew.% Carbomer und 0,5% bis 1,0 Gew.% Fibronektin bezogen auf das Gesamtgewicht der Gel-Formulierung.