ES2203827T3 - Procedimiento para la preparacion de soluciones de fibronectina concentradas sin tampon. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A SOLUCIONES ACUOSAS NO TAPONADAS QUE CONTIENEN UNAS CONCENTRACIONES ELEVADAS DE FIBRONECTINA Y OTROS ADYUVANTES DE LA CICATRIZACION DE HERIDAS, QUE SE PUEDEN UTILIZAR LUEGO PARA PREPARAR FORMULACIONES DE GELES Y CREMAS TOPICOS QUE CONTIENEN UNAS CONCENTRACIONES ALTAS DE ADYUVANTES DE LA CICATRIZACION DE HERIDAS. SE USAN ESTAS FORMULACIONES PARA LA CICATRIZACION DE HERIDAS CUTANEAS. AL SER DE LIBERACION LENTA, ALARGAN EL TIEMPO DE CONTACTO DE LA FIBRONECTINA Y OTROS ADYUVANTES DE LA CICATRIZACION DE HERIDAS EN EL PROPIO SITIO DE LA HERIDA, LO QUE PERMITE UNA ABSORCION EFECTIVA DE DICHOS ADYUVANTES.

Description

Procedimiento para la preparación de soluciones de fibronectina concentradas sin tampón.

Solicitud afín

Esta solicitud es Continuación en Parte de la Solicitud Estadounidense Nº 08/488.253, presentada el 7 de junio de 1995 para Formulaciones que Son para la Curación de Heridas y Contienen Fibronectina Plasmática Humana.

Ámbito de la invención

La presente invención se refiere a formas de dosificación tópica que contienen fibronectina plasmática humana y están destinadas a ser usadas para suscitar la curación de heridas. En particular, la invención se refiere a la curación de úlceras venosas crónicas.

Antecedentes de la invención

La fibronectina es una gran glucoproteína que contiene aproximadamente un 5% de carbohidrato. La forma característica de la fibronectina plasmática es la de un dímero de 440.000 daltons con unión por disulfuro, teniendo cada subunidad un peso molecular de aproximadamente 220.000 daltons. Encontrándose normalmente en el plasma a una concentración de aproximadamente 300 \mug/ml, la fibronectina es extraída y purificada usando un método descrito por Hynes^{1}. La fibronectina plasmática es también conocida por otros varios nombres, entre los que se incluyen los de globulina insoluble en frío, factor antigelatina, proteína de unión intercelular, factor de difusión celular y \alpha2-glucoproteína opsónica de fijación en superficie. Estos nombres reflejan actividades biológicas de la fibronectina tales como el reclutamiento de células, la opsonización de residuos particulados y el fomento de la contracción de las heridas. Otros^{2,3} han publicado estudios sobre la estructura y las actividades de la fibronectina.

La curación de las heridas se divide habitualmente en tres fases, que son la fase inflamatoria, la fase proliferativa y la fase de remodelación. Se ha descrito que la fibronectina interviene en cada estadio del proceso de curación de las heridas, en particular creando un andamio al cual pueden adherirse las células invasoras. Inicialmente son liberados al sitio de la herida muchos mediadores tales como fibronectina y fibrinógeno. La fibronectina suscita la migración de las células inflamatorias al interior de la herida y la fagocitosis de los residuos por parte de los monocitos. A continuación tienen lugar la angiogénesis y la reepitelización. En este estadio, la fibronectina ejerce actividad quimiotáctica en las células endoteliales, y suscita la migración de células epiteliales y fibroblastos a la membrana basal. La fibronectina parece ser también un componente esencial de la fase de remodelación, en la que desempeña un papel importante en la organización de las fibrillas de colágeno. El colágeno fibrilar forma finalmente haces fibrosos que incrementan en gran medida la resistencia a la tracción del tejido, dando lugar al cierre de la herida.

Se ha descrito que la fibronectina plasmática aplicada tópicamente es útil para incrementar la velocidad de curación de las heridas en casos tales como los de las heridas corneales^{4,5} y los de las úlceras de las piernas^{6}. Sin embargo, nadie ha descrito un adecuado vehículo tópico que esté destinado a ser usado en el tratamiento de heridas y pueda asegurar la liberación de una cantidad eficaz de fibronectina. Un importante factor limitativo para el desarrollo de una forma de dosificación tópica eficaz de una droga es el consistente en el hecho de que no tan sólo debe contarse con una droga activa, sino que también es necesario contar con una formulación que permita el paso de la droga activa del vehículo (que puede ser una crema, una pomada, un gel, etc.) al sitio de suministro (que en el caso de la presente invención es una herida cutánea). Drogas muy activas, tales como los factores de crecimiento, pueden carecer de valor terapéutico si la formulación tópica no permite que la droga se traslade del vehículo semisólido a la herida. Por consiguiente, sería muy deseable desarrollar una formulación que maximizase el tiempo de contacto de la fibronectina con la herida y también controlase la liberación de fibronectina a la herida, dando con ello lugar a altos valores de absorción. La presente invención aporta un sistema de liberación de este tipo realizado en forma de una crema y geles acuosos.

Breve exposición de la invención

La presente invención aporta formulaciones en forma de geles acuosos y una formulación en forma de crema que contienen fibronectina y su uso para el suministro de una cantidad de fibronectina eficaz para la curación de la herida a un sitio de una herida. La formulación en forma de gel comprende un polímero farmacéuticamente aceptable y soluble en agua que es preparado a partir de una cantidad eficaz de fibronectina. Los ejemplos de tales compuestos incluyen los siguientes: polímeros vinílicos, como p. ej. ácido poliacrílico; copolímeros en bloques de polioxietileno-polioxipropileno, como p. ej. poloxámeros; y derivados celulósicos, como p. ej. hidroxipropilcelulosa (HPC). El polímero proporciona valores de viscosidad de entre 50.000 y 1.000.000 cps a temperatura ambiente. La formulación en forma de crema es preparada a partir de una base de crema que está disponible comercialmente, es decir a partir de la base Schering® (de la Schering Canada Inc., de Point-Claire, Quebec), que tiene unos valores de viscosidad de entre 60.000 y 80.000 cps a temperatura ambiente.

Se atribuyen muchas ventajas a estas formas de dosificación. Las formulaciones en forma de gel y de crema de la presente invención liberan cantidades eficaces de un promotor de la curación de heridas. Otras ventajas de las formulaciones en forma de gel incluyen la de su capacidad para mantener húmeda la herida (lo cual es resultado del alto contenido de agua de los geles) y la de la facilidad con la que las mismas pueden ser aplicadas a la herida y retiradas (por lavado) de la herida. Estas formulaciones producen también una sensación de frescor al ser aplicadas tópicamente, lo cual puede incrementar el confort del paciente.

El sistema de liberación lenta de las formulaciones en forma de gel de la presente invención proporciona una prolongada liberación de fibronectina al sitio de la herida. Esta propiedad de estas formulaciones permite una aplicación menos frecuente a la herida, lo cual redunda en una menor perturbación del proceso de curación. Tales formulaciones mantienen la liberación de fibronectina por espacio de hasta 24 horas; pero según los datos cinéticos obtenidos de los estudios de permeación efectuados, una realización preferida de la presente invención es un programa terapéutico según el cual las aplicaciones son efectuadas "dos veces al día".

En la formulación de formas de dosificación tópica destinadas a la incorporación de fibronectina deberán respetarse varios criterios de calidad. Todos los componentes de la preparación, incluyendo el disolvente, el agente gelificante y el preservativo, deberán ser atóxicos para la herida y compatibles con la droga. El producto final deberá suscitar una óptima liberación de la droga a su sitio de acción, deberá tener una consistencia adecuada para incrementar el tiempo de contacto de la droga con la herida, y deberá ser estéril.

Las formulaciones preferidas de esta invención pueden ser usadas con otros promotores de la curación de heridas que tengan una composición similar a la de la fibronectina, tal como es el caso de las proteínas de tamaño similar (proteínas de la matriz extracelular tales como la trombospondina, la laminina, la vitronectina y el fibrinógeno) o de menor tamaño (tales como péptidos entre los que se incluyen factores de crecimiento).

En las formulaciones para aplicaciones veterinarias pueden usarse promotores de la curación de heridas humanos o de otros mamíferos.

Las formulaciones preferidas pueden ser correlacionadas con los resultados de evaluar estas formulaciones usando un sistema celular de difusión in vitro que consta de un receptor rígido que contiene una muestra de piel desepitelizada, estando el lado desepitelizado encarado hacia arriba al interior de un compartimento dador y estando el lado dérmico encarado hacia abajo al interior de un compartimento receptor. La muestra de piel desepitelizada es preparada retirando una sección de 8 \mum de la superficie epidérmica de la piel usando un dermátomo (escala de tijera de 1/10.000), y el lado dérmico fue cuidadosamente limpiado retirándole todos los vasos sanguíneos y/o tejidos subcutáneos adheridos. El compartimento receptor es conectado a un circuito de solución tampón circulante, siendo la temperatura de la solución tampón mantenida al nivel de 37ºC, mientras que la superficie de la piel está a aproximadamente 32ºC. Las formulaciones preferidas tendrán un "valor Abs" de más de 7,8, y preferiblemente de al menos 13,40.

Un método preferido para preparar los geles de la invención es el de concentrar fibronectina humana en agua desmineralizada que contiene el promotor de la polimerización (NaOH) a un pH de aproximadamente 8,0 a aproximadamente 11,0. Para geles de fibronectina más concentrados (0,5-1,0%), es preferible liofilizar la fibronectina. En ambos casos, las soluciones resultantes tienen un pH de aproximadamente 8,0 a aproximadamente 11,0. Cuando debe prepararse un gel de carbómero, se prefiere un pH de aproximadamente 9,0. De esta manera es posible producir soluciones de fibronectina no precipitantes altamente concentradas sin usar soluciones tampón tales como las de sacáridos o estabilizadores (como p. ej. albúmina). Usando estos métodos pueden lograrse con fiabilidad soluciones concentradas de fibronectina de 2 mg/ml a 10 mg/ml. Puede usarse el mismo método para producir formulaciones acuosas altamente concentradas de otros promotores de la curación de heridas y otras proteínas en general insolubles en agua.

La apropiada solución de fibronectina es mezclada con una solución concentrada de agente gelificante. Las dos soluciones son mezcladas mediante múltiples intercambios en dispositivos que usan presión, tales como jeringas, que no agitan vigorosamente la mezcla a fin de evitar la precipitación de la fibronectina. Los dispositivos mezcladores están conectados mediante un dispositivo adaptador.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 ilustra la absorción acumulativa de fibronectina radiomarcada referida al tiempo y producida por varias formulaciones en forma de gel que contienen carbómero Carbopol® P-934 (0,375%), poloxámero Pluronic® F127 (20,0%), carboximetilcelulosa sódica (CMC 3,0%) y producida por el control (solución salina tamponada con fosfato).

La Figura 2 ilustra la absorción cutánea de fibronectina radiomarcada de varias formas de dosificación y del control (solución salina tamponada con fosfato) a las 12 horas.

La Figura 3 ilustra la electroforesis de fibronectina plasmática humana incorporada en un gel de carbómero Carbopol® (carbómero Carbopol® P-934 0,375% + clorocresol 0,1%) tras haber transcurrido 0, 2, 6 y 8 meses. Parte A: Recuperación de fibronectina tras un ensayo de fijación sobre gelatina. Parte B: Integridad de la fibronectina después de 240 días de almacenamiento en gel a 4ºC. Hay que señalar que en la parte B la resolución de la tira está afectada por la presencia de contaminantes tales como carbómero Carbopol® en la muestra.

La Figura 4 muestra un gráfico de la absorción dérmica referida a la viscosidad de distintas preparaciones tópicas.

La Figura 5 demuestra los valores de absorción en piel desepitelizada usando concentraciones crecientes de fibronectina en gel de carbómero que contiene un 0,28% de carbómero y del control (solución salina tamponada con fosfato).

La Figura 6 ilustra el efecto de dos distintas concentraciones de carbómero en los valores de absorción de fibronectina en piel de desepitelizada. Ambas formulaciones de carbómero contienen un 0,2% de fibronectina; y el control es solución tampón de fosfato.

Descripción detallada de la invención

La presente invención aporta formas de dosificación que están formuladas especialmente para el uso terapéutico de fibronectina como promotor tópico de la curación de heridas. Las formas de dosificación seleccionadas para aplicaciones tópicas deberán idealmente liberar grandes cantidades de fibronectina y ser estériles y atóxicas para la herida. Al diseñar estas formulaciones deben considerarse varios factores tales como las propiedades fisicoquímicas de la glucoproteína, así como criterios de utilización clínica.

De entre estas limitaciones, la principal está relacionada con la solubilidad de la fibronectina en agua, que es escasa y por consiguiente actúa como un factor moderador contra la preparación de cremas o geles concentrados. La fibronectina es tan sólo ligeramente soluble en agua y puede precipitar a concentraciones tan bajas como la de 5 mg/ml en solución acuosa. Su solubilidad se ve también afectada por las variaciones de pH y las bajas temperaturas. De la misma manera, no pueden ser preparadas fácilmente las formulaciones que requieren la dispersión de polvo de polímero en la solución de fibronectina bajo agitación, puesto que puede producirse precipitación de la glucoproteína. Bajo agitación, la fibronectina puede agregarse y formar largas marañas de material insoluble. La viscosidad debe ser óptima a fin de permitir una suficiente adherencia a la herida, así como a fin de proporcionar buenas capacidades de liberación.

Las temperaturas de más de 60ºC, que son frecuentemente necesarias para lograr preparaciones estériles, desnaturalizan la fibronectina. Puesto que no puede ser llevado a cabo en el producto final un proceso de esterilización terminal, habitualmente es inevitable la preparación de bases concentradas de vehículos sin fibronectina. Porciones de estas bases estériles son entonces diluidas con una cantidad definida de una solución de fibronectina. Para lograr una adecuada dispersión de fibronectina en formas de dosificación semisólidas, a menudo es necesario un paso de incorporación que supone agitación y puede dar lugar a la precipitación de la droga.

Agentes gelificantes tales como poloxámero y carbómero Carbopol® pueden evitar este problema puesto que los mismos son esterilizados antes de la gelificación bajo una forma viscosa del tipo de la de un líquido. Es preparada y autoclaveada una preparación altamente concentrada de carbómero Carbopol®. Como se describe más adelante, la solución de fibronectina que contiene también el promotor de la polimerización (NaOH) es entonces mezclada en jeringas con la base de carbómero Carbopol®, formando el gel durante la dispersión de la droga en el mismo. En el caso en el que se usa poloxámero, el polímero es añadido a la solución de la droga y se le deja disolverse a 4ºC, que es una temperatura a la cual mantiene su aspecto del tipo del de un fluido. La esterilización de esta solución para liberarla de bacterias es llevada a cabo a 4ºC usando un filtro de 0,22 \mum.

En una realización preferida de la invención es añadido a la forma de dosificación un preservativo no sensibilizador atóxico y compatible con los componentes de la formulación. Todas las condiciones anteriormente descritas son respetadas en las formas de dosificación preferidas que se describen en detalle a continuación.

Una cantidad de fibronectina plasmática humana efectiva para la curación de heridas y destinada a ser usada en la presente invención está situada dentro de la gama de cantidades que va desde aproximadamente un 0,5 hasta aproximadamente un 1,0%, y es preferiblemente de poco más o menos un 1,0%. La fibronectina es aislada del plasma humano usando un procedimiento de cromatografía de afinidad en gelatina-Sepharose. En este método, la gelatina es acoplada en unión covalente a la Sepharose 4B tras activación con bromuro de cianógeno. La capacidad de fijación de fibronectina plasmática humana que se logra mediante este sistema es > 1 mg/ml de gel.

Puede ser usada en la presente invención^{1,7} fibronectina plasmática humana homóloga autóloga o fibronectina obtenida mediante la tecnología del DNA recombinante. Si se usase fibronectina plasmática homóloga, los lotes preparados a partir de distintos donantes tendrían que ser analizados para detectar la eventual presencia de anticuerpos atípicos, virus de la hepatitis B (HBV), virus de la hepatitis C (HCV), virus de la inmunodeficiencia humana (HIV), virus linfotrópico de células T humano (HTLV), citomegalovirus (CMV) y sífilis. Los donantes deben ser sometidos a estas pruebas justo antes de la donación y 6 meses después de la misma. En el entretanto, el plasma de los donantes deberá mantenerse congelado a -20ºC. Además deberán tomarse medidas especiales a fin de inactivar los virus potenciales. Deberá ser ejecutado en todas las donaciones de plasma^{7,8} un método de inactivación usando tri(n-butil)fosfato/Tween-80 (marca de fábrica) o tri(n-butil)fosfato/Triton X-100 (marca de fábrica) (método del disolvente/detergente).

En la formulación en forma de gel para la curación tópica de heridas, la viscosidad debe estar situada dentro de la gama de viscosidades que va desde 50 hasta 1.000 Ns/m^{2} (desde 50.000 hasta 1.000.000 cps), siendo la viscosidad más preferiblemente de entre 100 y 650 Ns/m^{2} (100.000 y 650.000 cps). En la formulación en forma de crema, la viscosidad puede estar dentro de la gama de viscosidades que va desde 60 hasta 80 Ns/m^{2} (desde 60.000 hasta 80.000 cps). Todos los valores de viscosidad son en centipoises (cps) según medición efectuada utilizando un viscosímetro Brookfield. Los análisis fueron llevados a cabo a 0,5 rpm y a temperatura ambiente.

En una realización de la presente invención, la formulación en forma de gel puede comprender de un 0,25 a un 1,0% en peso de ácido poliacrílico que tenga un peso molecular de aproximadamente 740.000 a 5.000.000. En una realización preferida, el ácido poliacrílico está presente en una cantidad de un 0,35 a un 0,75% en peso y tiene una viscosidad de aproximadamente 350 Ns/m^{2} (350.000 cps). El pH del gel con ácido poliacrílico deberá estar situado dentro de la gama de valores pH que va desde 5 hasta 8, y deberá ser más preferiblemente de entre 6,5 y 7,5. El polímero de ácido poliacrílico, también conocido como carbómero, es vendido bajo la marca de fábrica Carbopol®. La calidad del carbómero Carbopol® preferida es la P-934.

En otra realización, la formulación en forma de gel puede comprender de un 18 a un 35% en peso de copolímero en bloques de polioxietileno-polioxipropileno que tenga un peso molecular de aproximadamente 2.000 a 13.000. En una realización preferida, el copolímero en bloques de polioxietileno-polioxipropileno está presente en una cantidad de un 18 a un 25% en peso y tiene una viscosidad de aproximadamente 450 Ns/m^{2} (450.000 cps) a temperatura ambiente. El pH del gel de copolímero en bloques deberá estar situado dentro de la gama de valores pH que va desde 6 hasta 8, y deberá ser más preferiblemente de entre 6,5 y 7,5. El copolímero en bloques de polioxietileno-polioxipropileno, también conocido como poloxámero, es vendido bajo la marca de fábrica Pluronic®. La calidad del poloxámero Pluronic® preferida es la F-127 (poloxámero 407).

En una realización adicional, la formulación en forma de gel puede comprender de un 1 a un 5% de derivado celulósico que puede ser hidroxipropilcelulosa (HPC) y tiene una viscosidad de aproximadamente 25 a 150 Ns/m^{2} (de 25.000 a 150.000 cps). La HPC tiene un peso molecular de aproximadamente 370.000 a 1.150.000. En una realización preferida, el derivado celulósico está presente en una cantidad de un 2,0 a un 4,0% en peso y tiene una viscosidad de aproximadamente 150 Ns/m^{2} (150.000 cps) para la HPC. Los derivados celulósicos que son usados en la presente invención son comúnmente conocidos como Klucel para HPC. La calidad preferida es la Klucel-HF.

En una realización adicional, se prepara una formulación en forma de crema a partir de una base de crema que está disponible comercialmente, es decir de la base Shering®. Esta base de crema (emulsión de aceite en agua) contiene ceteth-20, alcohol cetoestearílico, clorocresol, aceite mineral, fosfato sódico monobásico, ácido fosfórico, hidróxido sódico, agua y vaselina líquida. La viscosidad de la preparación puede ser modificada variando el contenido de agua y polietilenglicol.

Las formulaciones de la presente invención contienen una fase acuosa en combinación con una proteína, y por consiguiente son susceptibles de ser atacadas por bacterias y hongos. La proliferación microbiana no tan sólo estropea la formulación, sino que es un potencial riesgo de toxicidad y un foco de infección para los pacientes. Aunque la proliferación microbiana es menos probable que sea peligrosa cuando tiene lugar en una preparación tópica, es especialmente importante preservar los tópicos que los pacientes deban aplicar a una piel rota o inflamada. Es también preocupante la degradación de la viscosidad que ha sido descrita en relación con algunos polímeros al verse los mismos expuestos a contaminación microbiana. Por consiguiente, deberá añadirse a la preparación un preservativo para garantizar la esterilidad y estabilidad a largo plazo. La presente invención aporta geles que comprenden un preservativo seleccionado de entre los miembros del grupo que consta de fenol o los compuestos de parahidroxibenzoato. En una realización, la formulación en forma de gel puede contener de un 0,1 a un 0,2% en peso de clorocresol, que es un derivado fenólico, o de un 0,01 a un 0,3% en peso de parahidroxibenzoato como parahidroxibenzoato de metilo y parahidroxibenzoato de propilo. En otra realización, la formulación en forma de crema contiene de un 0,1 a un 0,2% en peso de clorocresol.

Pueden ser añadidos a la formulación estabilizadores a fin de lograr composiciones estables de fibronectina. Dichos estabilizadores pueden ayudar a preservar las actividades biológicas a largo plazo y pueden mejorar la solubilidad de la fibronectina en agua. De entre estos agentes, son estabilizadores preferidos la albúmina, disacáridos tales como la sucrosa, y oligosacáridos cíclicos tales como la ciclodextrina. Estos agentes pueden ser usados ya sea en solitario o bien en combinación. La albúmina humana es preferible en cuanto a la antigenicidad, y deberá estar exenta de contaminación microbiana. Son adecuadas las ciclodextrinas del grupo \beta (con 7 unidades de glucosa), y es preferible la hidroxipropil-\beta-ciclodextrina. La formulación puede comprender de un 0,01 a un 0,1% en peso de albúmina, y preferiblemente de un 0,01 a un 0,05%; y/o de un 0,5 a un 5,0% en peso de sucrosa, y preferiblemente de un 3,0 a un 5,0%; y/o de un 1,0 a un 10% en peso de hidroxipropil-\beta-ciclodextrina, y preferiblemente de un 2,0 a un 5,0%.

Algunos autores han sugerido que la actividad de proteasa en algunas heridas crónicas puede ocasionar degradación de proteínas de adherencia tales como la fibronectina e impedir la adherencia celular que es necesaria para el cierre normal de las heridas^{9}. Han sido identificadas en fluido de heridas crónicas^{9,10} metaloproteasas y serina proteasas, y se ha descrito que la fibronectina es altamente sensible a la segmentación por proteasas^{11}. La protección de la integridad de la fibronectina puede lograrse mediante la adición de inhibidores de proteasa en la forma de dosificación. La presente invención aporta también formulaciones que pueden comprender un inhibidor de metaloproteasa tal como EDTA (EDTA = ácido etilenodiaminotetraacético) y/o un inhibidor de serina proteasa tal como aprotinina (Trasylol®, Miles) con la finalidad de alcanzar este objetivo. En una realización, la forma de dosificación puede comprender de un 0,01 a un 1,0% en peso de EDTA y/o de 1,5 a 45,0 Inh U% en peso de aprotinina, siendo 1 Inh U = 26 unidades de inhibidor de la calicreína.

Las formulaciones de la presente invención pueden ser aplicadas al sitio de la herida mediante cualesquiera medios adecuados que aseguren que quedará enteramente cubierta la superficie de la herida. Por ejemplo, la formulación puede ser aplicada directamente al sitio de la herida, o bien puede ser usada para recubrir las fibras de un apósito de gasa absorbente para formar un vendaje para la curación de heridas que puede ser entonces colocado sobre una herida.

Los ejemplos que se dan a continuación están destinados a ilustrar adicionales aspectos de la invención y no deberán ser interpretados como ejemplos que limitan su alcance en modo alguno.

Ejemplo 1 Aislamiento de fibronectina a partir de plasma humano

1) Es obligatorio para todas las donaciones de plasma homólogo un paso de esterilización. A fin de inactivar los virus potenciales, es utilizado un procedimiento de esterilización en el que se utiliza el método del disolvente/detergente. Son añadidos al plasma por espacio de 6 horas a 24ºC un 1% de tri(n-butil)fosfato (TNBP) y un 1% de Triton X-100 (marca de fábrica). Después de eso, es añadido aceite de soja al plasma y se deja que tenga lugar la mezcla por espacio de al menos 30 minutos a fin de extraer el TNBP. El Triton residual será eliminado por diálisis. Se prescinde de este primer paso si se usa plasma autólogo.

2) Una columna de gelatina-Sepharose 4B es primeramente prelavada con una solución de Tris-HCl a fin de equilibrar el gel.

3) El plasma es diluido (1:1) con una solución de Tris-HCl y es bombeado a través de la columna en presencia de fluoruro de fenilmetilsulfonilo 0,001M (PMSF) por espacio de aproximadamente 15 horas a 4ºC.

4) La columna es entonces lavada tres veces a fin de eluir del gel las proteínas plasmáticas fijadas inespecíficamente. Todos los pasos de lavado son llevados a cabo usando una solución de Tris-HCl a pH 7,5. Es añadida al segundo paso de lavado una solución de NaCl 1M para eluir los contaminantes.

5) La elución de fibronectina es llevada a cabo usando una solución de acetato de Na 0,1M + KBr 1M.

6) Son entonces llevados a cabo dos pasos de diálisis para eliminar los contaminantes (Triton X-100 (marca de fábrica), KBr, Acetato de Na). Son respectivamente efectuadas diálisis contra salina tamponada con fosfato y agua estéril.

7) Es concentrada la solución mediante ultrafiltración bajo presión de nitrógeno.

8) Es efectuada filtración esterilizante terminal usando un filtro de 0,22 \mum para garantizar la esterilidad.

9) Se forman partes alícuotas de las fracciones y las mismas se congelan a -20ºC hasta su incorporación en la forma de dosificación tópica.

Ejemplo 2 Geles de ácido poliacrílico

Fueron preparados geles de ácido poliacrílico (carbómero) (carbómero Carbopol®, de la BF Goodrich). El carbómero es un polímero derivado de ácido acrílico. Se trata de un polímero de alto peso molecular (de 740.000 a 5.000.000) que se gelifica al ser neutralizado mediante aminas (trietanolamina) o álcalis fuertes (NaOH). Dicho polímero forma geles a concentraciones relativamente bajas, o sea tan bajas como la del orden de un 0,25%, y su viscosidad se ve marcadamente reducida por la adición de electrólitos.

La calidad de ácido poliacrílico preferida es la del carbómero Carbopol® 934-P a concentraciones que van de un 0,35 a un 0,75% (en peso). Las concentraciones más bajas son insuficientes para suscitar la adherencia a la herida, y las concentraciones más altas reducen la liberación de fibronectina desde el gel. La viscosidad de los geles de ácido poliacrílico es estable a un pH de 6 a 8, siendo una gama de valores pH preferida la situada entre 6,5 y 7,5. La viscosidad se ve reducida en presencia de electrolitos fuertes.

Fue preparado de la manera siguiente un gel de ácido poliacrílico que contenía (en peso) un 0,2% de fibronectina, un 0,375% de carbómero Carbopol® 934-P y un 0,1% de clorocresol: Fue disuelto clorocresol (1,0 g) en agua desionizada caliente (a 65ºC) (95 ml) bajo agitación lenta. Al estar completamente disuelto el clorocresol, la solución es enfriada a temperatura ambiente manteniendo la agitación. Fue entonces añadido carbómero Carbopol® 934-P
(3,75 g), dispersándolo lentamente sobre la superficie de la solución, y se efectuó mezcla con un agitador del tipo de los de paletas por espacio de aproximadamente 3 horas. Esta dispersión fue entonces autoclaveada para formar una base de gel concentrada estéril (3,75% en peso). Una solución concentrada de fibronectina, de 2,2 mg/ml (90 ml), fue filtrada a través de un filtro de acetato de 0,22 \mum. Fue añadido a la solución de fibronectina un promotor de la polimerización, o sea hidróxido sódico, en una cantidad que neutralizará una porción de 10 g de la dispersión de carbómero Carbopol® al 3,75%, es decir 1250 \mul de NaOH 3M.

La solución concentrada de fibronectina y la dispersión de carbómero Carbopol® fueron mezcladas en jeringas actuando con precaución para evitar la introducción de burbujas de aire y para evitar la contaminación trabajando en un ambiente aséptico, tal como bajo una campana de flujo laminar. Son en general usadas dos jeringas, y se efectúan múltiples intercambios bajo presión. Puede ser usado un dispositivo adaptador tal como una conexión Luer hembra para conectar las jeringas o los otros aparatos de intercambio. La agitación vigorosa es minimizada a fin de evitar la precipitación de la fibronectina. Con esta preparación se obtiene un gel preservado transparente (100 g) de fibronectina que está exento de microorganismos y tiene una viscosidad de aproximadamente 350.000 cps.

Esta formulación en forma de gel fue aplicada dos veces al día a úlceras de las piernas en un estudio piloto en humanos, y con la misma se observó una velocidad incrementada de curación de las heridas sin efecto adverso alguno.

En una realización preferida, pueden ser preparadas soluciones concentradas de fibronectina de hasta al menos
10 mg/ml. Estas soluciones pueden ser entonces usadas para preparar un gel de fibronectina concentrado. A fin de preparar el gel de fibronectina, deben ser añadidos en secuencia los ingredientes siguientes, y los mismos son necesarios para la preparación de 10 gramos de gel cuya concentración de fibronectina varía desde un 0,5 hasta un 1,0%. Primeramente, el pH de 9,8 gramos de agua desmineralizada es ajustado a un valor de aproximadamente 8,0 a aproximadamente 11,0 con 0,094 gramos de NaOH 3M. A continuación es disuelta fibronectina liofilizada en el agua desmineralizada, a un pH de 8,0-11,0, en cantidades que varían desde 0,05 hasta 0,1 gramos. Cuando debe prepararse un gel de carbómero, se prefiere un pH de 9,0 para el agua desmineralizada. En un paso final del procedimiento, son añadidos a la mezcla 0,028 gramos de carbómero.

Ejemplo 3 Geles de copolímero en bloques de polioxietileno-polioxipropileno

Fueron preparados geles de copolímero en bloques de polioxietileno- polioxipropileno (poloxámero) (poloxámero Pluronic®, de la BASF de Wyandotte). La calidad de poloxámero preferida es la del poloxámero Pluronic® F-127 a concentraciones que van de un 18 a un 25% (en peso). El poloxámero Pluronic® F-127 es un polímero de bajo peso molecular (de 2.000 a 13.000) que presenta características de gelificación térmica. La gelificación se produce cuando la concentración llega a ser de un 18% de poloxámero. La viscosidad del poloxámero es proporcional a la concentración de polímero, al tipo de polímero usado (al peso molecular del mismo) y a la temperatura. Siendo fluido a 4ºC, el polímero se gelifica al aumentar la temperatura, presentando altos valores de viscosidad a temperatura ambiente. En contraste con el carbómero Carbopol®, la adición de iones incrementa la viscosidad de la preparación.

Se ha descrito que las soluciones acuosas concentradas (con una concentración de un 20 a un 30%) presentan espectaculares incrementos de la viscosidad al ser calentadas desde 4ºC hasta la temperatura corporal. Además, si es incrementada la concentración iónica de la solución, la viscosidad aumenta más rápidamente al aumentar la temperatura. Están disponibles varias calidades, pero la calidad F-127 es la menos tóxica, y la gelificación puede producirse con la misma a concentraciones más bajas. Los geles de poloxámero que son preparados en esta invención son soluciones de baja viscosidad a 4ºC y se gelifican rápidamente al ser calentados hasta la temperatura corporal.

Fue preparado como se indica a continuación un gel de poloxámero que contenía (en peso) un 0,2% de fibronectina y un 20% de poloxámero Pluronic® F-127: Una solución concentrada de fibronectina de 2,2 mg/ml (80 ml) fue filtrada a través de un filtro de acetato de 0,22 \mum. Fue añadido poloxámero Pluronic® F-127 (20 g) a 80 ml de la solución de fibronectina, y se dejó que la mezcla se disolviese sin agitación a 4ºC por espacio de unos 3 días. La solución resultante (100 g) es muy similar a un líquido. La gelificación tiene lugar instantáneamente cuando la solución entra en contacto con la herida. Podría ser también aplicado a la solución final un proceso de filtración esterilizante llevado a cabo a 4ºC si no puede obtenerse poloxámero en polvo estéril. La viscosidad varía desde valores no detectables a 4ºC hasta 450.000 cps a temperatura ambiente.

Ejemplo 4 Geles de derivados celulósicos

Fueron preparados geles de hidroxipropilcelulosa (HPC). A fin de ilustrar este tipo de formulaciones, se describe a continuación la preparación de un gel de HPC al 3%. La calidad preferida es la de la hidroxipropilcelulosa Klucel-HF a concentraciones que van de un 2 a un 4% (en peso).

Fue preparada de la manera siguiente una formulación en forma de gel que contenía (en peso) un 0,1% de fibronectina, un 3% de HPC y parahidroxibenzoatos: Fueron disueltos en agua desionizada caliente (94 ml) parahidroxibenzoato de metilo (0,05 g) y parahidroxibenzoato de propilo (0,02 g). Fue esterilizada HPC en polvo usando un proceso de esterilización por calor seco. La HPC (6 g) fue entonces dispersada en esta solución y mezclada con un agitador del tipo de los de paletas por espacio de aproximadamente 3 horas. Con esto se obtiene una base de gel concentrada estéril (al 6% en peso). Una solución concentrada de fibronectina de 2 mg/ml (50 ml) fue filtrada a través de un filtro de acetato de 0,22 \mum. La solución de fibronectina (50 ml) fue entonces añadida lentamente a una porción (de 50 g) de esta base concentrada usando el eje de baja velocidad del agitador. Con esto se obtiene un gel preservado (100 g) que tiene una viscosidad de aproximadamente 150.000 cps.

Ejemplo 5 Formulación en forma de crema

Fue preparada como se indica a continuación una formulación en forma de crema que contenía (en peso) un 0,1% de fibronectina, base de crema estéril (base Schering®, de la Schering) y un 0,1% de clorocresol: Fue filtrada a través de un filtro de acetato de 0,22 \mum una solución concentrada de fibronectina de 2 mg/ml (50 ml). La solución de fibronectina (50 ml) fue entonces añadida lentamente a una porción (de 50 g) de la base de crema usando el eje de baja velocidad de un agitador. Es así obtenida una crema preservada (100 g) que tiene una viscosidad de aproximadamente 70.000 cps.

Ejemplo 6 La cinética de liberación de distintas formas de dosificación tópica

La eficacia de cada formulación tópica para liberar la fibronectina fue evaluada usando un sistema celular de difusión in vitro. Los estudios de permeación fueron todos ellos llevados a cabo sobre muestras de piel desepitelizada abdominal y de mama humana obtenidas de cirugías de reducción de mama y de lipectomía abdominal. Fue retirada de la superficie epidérmica de la piel una sección de 8 \mum usando un dermátomo (escala de tijera de 1/10.000), y el lado dérmico fue limpiado cuidadosamente retirándole todos los tejidos subcutáneos adheridos y/o vasos sanguíneos. La piel humana desepitelizada fue usada a fin de reproducir el estado patológico que se encuentra en las úlceras venosas crónicas, en las que está ausente la capa de la epidermis.

El sistema celular de difusión seleccionado constaba de un receptor rígido que contenía la muestra de piel, estando el lado desepitelizado encarado hacia arriba al interior del compartimento dador, y estando el lado dérmico encarado hacia abajo al interior del compartimento receptor. El compartimento receptor estaba conectado a un circuito de solución tampón circulante. La temperatura de la solución tampón fue mantenida al nivel de 37ºC, mientras que la superficie de la piel estaba a aproximadamente 32ºC. Cada análisis fue llevado a cabo sobre una muestra de piel de 0,64 cm^{2} usando una parte alícuota de 100 \mul de muestra de formulación tópica de ^{125}I-fibronectina. Después del experimento, la piel fue retirada de la celda de difusión, lavada 10 veces con un volumen de 8 ml de agua por lavado y analizada para determinar su contenido de radiactividad en un contador de radiactividad gamma. La cantidad total absorbida (dermis + compartimento receptor) dividida por la dosis aplicada dio la absorción porcentual. Este sistema de la celda de difusión ha proporcionado resultados que son excelentemente reproducibles tanto intraexperimentalmente como interexperimentalmente.

Todas las formas de dosificación fueron hechas en solución exenta de sal puesto que los valores de viscosidad podrían haber sido influenciados por la presencia de electrólitos. Por ejemplo, los valores de viscosidad de los geles de carbómero se ven reducidos en presencia de electrólitos fuertes, en contraste con los geles de poloxámero, que son más viscosos cuando son añadidos a la preparación electrólitos.

Varios autores han comparado estudios de absorción percutánea usando técnicas in vitro e in vivo para establecer la fiabilidad de los resultados usando estos métodos^{13,14,15}. Estas comparaciones han demostrado claramente que los estudios in vitro pueden reflejar con precisión el estado viviente. El análisis estadístico aplicado a nuestros experimentos ha demostrado que existe un buen valor de correlación entre los estudios llevados a cabo con piel obtenida de distintas fuentes. Estos datos han demostrado que el origen de la piel no tenía efecto alguno en los resultados.

Los estudios de absorción percutánea son habitualmente llevados a cabo sobre piel intacta y están destinados a evaluar la liberación de una sustancia desde un vehículo tópico y su absorción a través de la principal barrera cutánea, es decir a través del stratum corneum. En las úlceras cutáneas está ausente el efecto de barrera del stratum corneum. Con este estado patológico, tan sólo la difusión desde el vehículo dermatológico será un determinante importante para la ulterior penetración de la droga al interior de la dermis. El sistema celular de difusión anteriormente descrito es un adecuado modelo in vitro para las úlceras cutáneas.

Los datos cinéticos de la liberación de fibronectina desde varias formas de dosificación fueron obtenidos a las 4, 12 y 24 horas. La Tabla 1 resume estos datos para t = 12 horas. El control constaba de ^{126}I-fibronectina en solución salina tamponada con fosfato a pH 7,4. Los liposomas usados en la formulación (Lipogel) de carbómero Carbopol® 934 P (1%) + liposomas (15%) fueron hechos a partir de liposomas Proliposomes (Pro-lipo 3090 SH^{MF}, de la Lucas Mayer, Francia). Los derivados celulósicos están identificados como CMC para carboximetilcelulosa sódica y HPC para hidroxipropilcelulosa. La base Dermabase® (Borden, Ltee., de Don Mills, Ontario, Canadá) y la base Schering® son bases de crema que están disponibles en el mercado, y fueron diluidas a 1:1 para estos experimentos. El símbolo [ ] se refiere a la concentración de los componentes, y el "valor Abs" se refiere al porcentaje de fibronectina radiomarcada encontrado en la dermis tras un tiempo de exposición de 12 horas.

TABLA 1

Formulación	[ ]	Valor Abs
Control		24.75%
Lipogel		3.70%
Base Dermabase®	(1:1)	5.80%
CMC	3%	6.70%
Carbómero Carbopol® 934 P + glicerina (Carbogly)	0.375%/10%	7.80%
Base Schering®	(1:1)	9.90%
Poloxámero Pluronic® F-127	20%	12.80%
Carbómero Carbopol® 934 P	0.375%	13.40%
NPC	3%	15.20%

La Figura 1 es un gráfico de los datos cinéticos de tres formas de dosificación en forma de gel y de la solución de control referidos al tiempo. Puede verse por este gráfico que el proceso de absorción tiende a ser más importante entre la hora 0 y las 12 horas en comparación con el tiempo que transcurre entre las 12 y las 24 horas, lo cual sugiere que mediante dos aplicaciones al día podría liberarse más fibronectina que con un programa de una aplicación al día.

La Figura 2 ilustra la absorción cutánea de fibronectina radiomarcada desde varias formas de dosificación y desde el control al haber transcurrido 12 horas. Fue usado para identificar las diferencias estadísticamente significantes entre las formulaciones realizadas en forma de gel de carbómero Carbopol® y otras formulaciones el análisis estadístico de Dunnett. Este análisis ha demostrado también que existen diferencias significantes entre los geles de carbómero Lipogel, Carbogly y Carbopol®, siendo éstos resultados que pueden ser correlacionados con los del rendimiento obtenidos durante las pruebas clínicas (véase el Ejemplo 8). La eficacia de la formulación realizada en forma de gel de carbómero Carbopol® es particularmente sorprendente dado que el gel de carbómero Carbopol® tiene un grado de viscosidad más alto que el de muchas de las otras formulaciones estudiadas. Son también dignas de mención las diferencias entre los valores Abs de las formulaciones realizadas en forma de gel de carbómero Carbopol® y de CMC puesto que ambas comparten el mismo grado de viscosidad.

La Figura 4 muestra que no siempre existe una clara relación entre la viscosidad y la absorción, cuando se consideran algunas de las preparaciones para las cuales fueron determinados los valores de viscosidad. Por ejemplo, la base Dermabase®, que tiene una viscosidad relativamente baja (119.000 cps) en comparación con el gel de carbómero Carbopol® (411.300 cps), presenta escasas capacidades de liberación (5,80%) en comparación con el gel de carbómero Carbopol® (13,40%).

La Figura 5 demuestra que pueden ser obtenidos valores de absorción de más de un 13,40% usando un 0,28% de carbómero y concentraciones más altas de fibronectina. La Figura 6 compara directamente los valores de absorción obtenidos en el sistema celular de difusión con piel desepitelizada para geles de un 0,28% y un 0,375% de carbómero que tienen ambos un 0,2% de fibronectina.

En las Figuras 5 y 6, la cantidad de fibronectina fue medida utilizando procedimientos de inmunoanálisis ligado a enzimas (ELISA). Una placa de cultivo de microtitulación de poliestireno es incubada con 100 \mul de distintas muestras de fibronectina en solución tampón de carbonato/bicarbonato 50mM, a un pH de 9,6 y a 4ºC durante la noche. Una solución de albúmina de suero bovino (BSA) al 5% en salina tamponada con fosfato Tween, a un pH de 7,5, es usada como solución tampón de bloqueo por espacio de 30 minutos a 37ºC. La placa de cultivo es lavada cuatro veces con salina tamponada con fosfato Tween a un pH de 7,5, y son añadidos 100 \mul de anti-FN de conejo, producido por métodos que son perfectamente conocidos en la técnica, diluidos en una proporción de 1/100.00 en salina tamponada con fosfato Tween al 0,5% a un pH de 7,4, y la placa de cultivo es incubada a 37ºC por espacio de 1 hora. Tras haber efectuado cuatro enjuagues con solución tampón consistente en salina tamponada con acetato, son añadidos 100 \mul de la peroxidasa del rábano anti-conejo de cabra conjugada (de la Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., PA) diluida en una proporción de 1/100.000 en salina tamponada con fosfato Tween (marca de fábrica) al 0,5% de pH 7,4, y la placa de cultivo es incubada a 37ºC por espacio de 1 hora. El conjugado sobrante es entonces retirado a fondo por lavado, y la peroxidasa fijada a las cavidades es detectada mediante la adición ABTS (ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenz-tiazolina-6-sulfónico)) en solución tampón de citrato de pH 4,6 que contiene un 0,05% de peróxido de hidrógeno. La reacción es seguida por incrementos de la absorbancia a 410 nm en comparación con una reacción estándar de la peroxidasa para la fibronectina.

Ejemplo 7 Estabilidad de la fibronectina en el gel

Fueron evaluadas (Figura 3) la actividad biológica y la integridad de la macroestructura de fibronectina en las formulaciones en forma de gel. Los análisis fueron llevados a cabo sobre una muestra de gel que contenía (en peso) un 0,2% de fibronectina, un 0,375% de carbómero Carbopol® P-934 y un 0,1% de clorocresol. La muestra había sido mantenida a 4ºC por espacio de 32 semanas.

Fueron usadas técnicas de electroforesis a fin de determinar la integridad de la macroestructura de fibronectina en el gel. Tras haber sido la muestra de gel disuelta en solución de NaCl 1M + Tris-HCl de pH 6,8-7,4, se la dejó migrar sobre un gel de acrilamida al 7,5% según el método de Laemmli ("Denaturing (SDS) discontinuous gel electrophoresis: Laemmli gel method", páginas: 10.2.4 - 10.2.9, Current Protocols in Molecular Biology (1994)). En comparación con una solución estándar sin usar (columna 0), los resultados demostraron que podía ser identificada cerca del 100% de la fibronectina en torno a la banda de 220.000 (columna B), lo cual indica que se produce muy poca degradación o ninguna.

La actividad biológica fue evaluada usando un análisis por cromatografía de afinidad. La fijación a la gelatina es una de estas actividades biológicas que pueden ser evaluadas con relativa facilidad. Tras haber sido una muestra de gel disuelta en una solución de NaCl 1M, una cantidad conocida de esta solución viscosa fue puesta en un tubo Eppendorf en presencia de gelatina-Sheparose 4B, y fue entonces sometida a agitación vorticial. El contenido fue enjuagado adicionalmente con una solución de NaCl 1M sin usar y fue centrifugado, y el supernatante fue descartado a fin de eliminar contaminantes tales como carbómero Carbopol® y clorocresol que procedían de la disolución del gel. La fibronectina fue eluída de la gelatina-Sepharose 4B usando una solución de KBr 1M. Se dejó que la fracción recogida migrase sobre un gel de acrilamida al 7,5% según el método Laemmli. La tira fue entonces evaluada con respecto a su contenido de fibronectina usando un análisis de exploración densitométrica. La muestra recogida pudo ser también evaluada espectrofotométricamente usando la densidad óptica a la longitud de onda \lambda = 280 nm.

En comparación con un gel de fibronectina recién preparado (columna 0) puede verse que fue recuperada a partir de la mezcla de formulación en forma de gel (columna de los 8 meses) una gran cantidad (80%) de fibronectina, lo cual indica que la actividad de fijación a la gelatina de la glucoproteína puede ser preservada por espacio de un largo período de tiempo en esta forma de dosificación.

Ejemplo 8 Pruebas clínicas: tratamiento de úlceras crónicas de la pierna

Hemos llevado a cabo cinco pruebas clínicas (estudios experimentales) para investigar la utilidad de distintas formas de dosificación que contenían fibronectina plasmática humana exógena en el tratamiento de úlceras venosas crónicas de los miembros inferiores. En estas pruebas fue usada fibronectina plasmática autóloga, y fueron seleccionados pacientes con úlceras que eran resistentes a la terapia convencional por espacio de al menos tres meses.

El objetivo específico del primer experimento era el de determinar la eficacia de la fibronectina aplicada tópicamente como promotor de la curación de heridas. Fueron incluidos en este estudio siete pacientes, y a los mismos se les indicó que "inundasen" dos veces al día la zona de la herida con una solución de fibronectina de 1 mg/ml (0,1%) en PBS (salina tamponada con fosfato). Después de dos meses de aplicación regular de esa solución, cinco de estos pacientes presentaban una espectacular reducción del tamaño de sus heridas, y específicamente al menos una reducción de un 75% del área superficial integrada.

Un segundo experimento estuvo destinado a evaluar la eficacia de una forma de dosificación semisólida que contenía un 0,1% en peso de fibronectina encapsulada en liposomas al 15%, que a su vez estaban incorporados en la formulación de carbómero Carbopol® (1%) conocida como Lipogel. La hipótesis era la de que si podía ser incrementado el tiempo de contacto de la glucoproteína con la herida, podría teóricamente observarse una más rápida disminución del tiempo de curación. Fueron incluidos en este estudio seis pacientes, y los mismos tenían que aplicar la formulación a su herida dos veces al día. Ninguno de los pacientes presentó una considerable disminución del tamaño de sus heridas durante los siguientes tres meses de tratamiento regular.

En un intento de mejorar la forma de dosificación, fue llevado a cabo un experimento para evaluar el potencial terapéutico de una formulación tópica en forma de gel que contenía (en peso) un 0,2% de fibronectina incorporada en un 0,375% de carbómero Carbopol® y un 10% de glicerina (Carbogly). La glicerina había sido añadida a la formulación a fin de aprovechar su efecto humectante, que podía ser beneficioso para la herida. Fueron reclutados para este estudio once pacientes, y los mismos tenían también que aplicar el gel dos veces al día. De entre estos pacientes, los que constituían un 27% experimentaron una regresión de más de un 50% del tamaño de sus heridas tras tres meses de tratamiento.

Los resultados de los estudios de permeación pueden explicar, al menos en parte, lo que podría haber ocurrido en experimentos anteriores. La Figura 2 muestra que preparaciones tales como las de carbómero Lipogel y Carbopol® + glicerina no dan lugar a altos valores de absorción. En contraste con ello, el carbómero Carbopol® al 0,375% sin glicerina proporciona valores de absorción significativamente más altos (p < 0,001). Este efecto de la glicerina no fue observado con las formulaciones que contenían fibronectina en una concentración de más de un 0,2%. La solución que fue usada en el primer experimento está identificada como el control en este gráfico. Esta última preparación presenta las más altas capacidades de liberación, pero no representa una formulación que pudiese ser útil para los pacientes debido a su consistencia fluida.

Considerando estos resultados, fue investigada en ocho pacientes una formulación que contenía un 0,2% (en peso) de fibronectina en carbómero Carbopol® al 0,375%, sin glicerina. Según los estudios clínicos y de permeación, esta formulación es el vehículo preferido usando carbómero Carbopol que está disponible para el uso de fibronectina en la curación tópica de heridas. Los datos preliminares pusieron de manifiesto que los de un 50% de los pacientes estudiados presentaban una regresión de más de un 50% de los tamaños de sus heridas a los tres meses de tratamiento, incluyendo dos respuestas totales (curación del 100%) que se produjeron a las primeras ocho semanas de tratamiento.

Fue llevada a cabo una quinta prueba clínica con 40 pacientes con la formulación que contenía un 0,2% (en peso) de fibronectina en carbómero Carbopol® sin glicerina. En esta prueba clínica, los pacientes fueron estratificados según la duración de la úlcera cutánea (la edad de la úlcera) al comienzo de la prueba. En los pacientes con úlceras de 6 meses o menos de duración, la formulación que contenía un 0,2% (en peso) de fibronectina en carbómero Carbopol® al 0,375% sin glicerina no resultó ser superior al placebo. El placebo era carbómero Carbopol® sin glicerina y que no contenía fibronectina. Sin embargo, en los pacientes con úlceras de 7 meses o más de duración al ser efectuada la aleatorización, la formulación de fibronectina que contenía un 0,2% (en peso) de fibronectina en carbómero Carbopol® al 0,375% sin glicerina resultó ser claramente superior. Tras 20 semanas de tratamiento, los del 58% de los pacientes del grupo tratado (7/12) presentaban una reducción del tamaño de las heridas de al menos un 75% después de 20 semanas de tratamiento. Tan sólo los de un 25% (1/4) de los pacientes del grupo tratado con placebo presentaban este efecto beneficioso. En conjunto, los pacientes tratados con placebo (n = 4) presentaban un deterioro, con un incremento de aproximadamente un 60% del tamaño medio de las heridas. En el grupo tratado con fibronectina (n = 11), el tamaño medio de las heridas había disminuido en casi un 30% después de 20 semanas de tratamiento.

La presente invención aporta también otras formulaciones que son tan útiles como ésta usando el estudio de permeación descrito en el Ejemplo 5 como sistema modelo para someter a ensayo las distintas formulaciones.

Ejemplo 9 Casuística

Para ilustrar la eficacia de la formulación que contiene fibronectina y carbómero Carbopol® 934-P al 0,375% (en peso), presentamos dos casos específicos de úlcera venosa crónica de las piernas. Estos casos son de interés por cuanto que el primer caso era muy resistente a la terapia convencional y el segundo caso era una gran úlcera. Varios autores han identificado factores tales como la duración y el área superficial como factores que desempeñan un importante papel en la prognosis de la úlcera venosa.

Caso 1

Una mujer de 37 años de edad se presentó con un historial de diez años de úlcera venosa crónica del miembro inferior derecho. Su historial médico no era significativo, exceptuando cuatro episodios de flebitis. El último episodio tuvo lugar durante el embarazo, y finalmente redundó en una úlcera. El estudio de los tratamientos médicos que fueron intentados reveló el uso de antisépticos tópicos, medias elásticas e injerto cutáneo sin resultado positivo alguno.

La paciente se presentó en nuestra clínica con una herida dolorosa de 1,60 cm^{2}. A pesar del hecho de que su úlcera era relativamente pequeña, la misma parecía ser muy resistente a la terapia. Seis semanas después de haber iniciado la aplicación del gel de fibronectina, podía observarse una reducción de un 92% del tamaño de su herida. Fue observada una reepitelización total tras un programa de tratamiento de diez semanas. Una visita de seguimiento programada para un mes después no reveló deterioro alguno del estado de su herida.

Caso 2

Un hombre de 39 años de edad se presentó con un historial de siete años de úlcera venosa crónica de la pierna izquierda. Su historial médico no era significativo, exceptuando una safenectomía del miembro inferior izquierdo doce años antes. Le habían sido prescritos al paciente antibióticos tópicos sin efecto alguno en el tamaño de su herida.

Este paciente se presentó a nuestra clínica con una herida dolorosa de 10,5 cm^{2} resultante de un trauma local. El linfedema del miembro inferior izquierdo era importante, y bordeaba la herida una gran capa necrótica costrosa. La profesión del paciente le obligaba a permanecer de pie por espacio de largos períodos de tiempo. A pesar de que esta situación probablemente empeoraba el estado de su herida, la misma no podía ser eliminada.

Después de cuatro semanas de aplicación regular de un gel de placebo y salina normal, el tamaño de la herida había aumentado hasta llegar a ser de 21,5 cm^{2} como consecuencia del desbridamiento local. El gel de placebo comprendía un 0,375% de carbómero Carbopol® 934-P, un 0,1% de clorocresol, agua purificada y NaOH para ajustar el pH. En este punto fue iniciado el tratamiento activo con la formulación realizada en forma de gel de carbómero Carbopol® con contenido de fibronectina. El máximo tamaño de la herida fue observado seis semanas después (37,5 cm^{2}), revelando una úlcera mayor que la inicialmente supuesta. El proceso de curación de la herida tuvo lugar entre las semanas seis y ocho, y quedó concluido tras 31 semanas de tratamiento activo. Una visita de seguimiento programada para un mes después no reveló deterioro alguno del estado de su herida.

A pesar de que la presente invención ha sido descrita en relación con realizaciones particulares de la misma, serán obvios para los expertos en la materia muchas otras variaciones y modificaciones y muchos otros usos.

Referencias

1 - Hynes, R. O., Methods for identification of fibronectin (chap. 2, page 12), IN: Fibronectins New-York: Springer-Verlag, 1990.

2 - Hynes, R. O., Methods for identification of fibronectin (chap. 2, page 7-23) and Wound healing, inflammation, and fibrosis (chap. 14, pages 349-64), IN: Fibronectins New-York: Springer-Verlag, 1990.

3 - Brotchie, H., Wakefield, D. Fibronectin: Structure, function and significance in wound healing: Australas J Dermatol 1990; 31:47-56.

4 - Nishida, T., Nakagawa, S., Awata, T. et al., Rapid preparation of purified autologous fibronectin eyedrops from patient's plasma. Jpn J Ophthalmol 1982; 26:416-24.

5 - Phan, T.M., Foster, C.S., Boruchoff, S.A. et al., Topical fibronectin in the treatment of persistent corneal epithelial defects and trophic ulcers. Am J Ophthalmol 1987; 104:494-501.

6 - Wysocki, A., Baxter, C.R., Bergstresser, P.R. et al., Topical fibronectin therapy for treatment of a patient with chronic stasis ulcers. Arch Dermatol 1988; 124:175-77.

7 - Edwards, C.A., Piet, M.P.J., Chin, S. et al., Tri (n-butyl) phosphate/detergent treatment of licensed therapeutic and experimental blood derivatives. Vox Sang 1987; 52:53-9.

8 - Horowitz, B., Bonomo, R., Prince, A.M. et al. Solvent/detergent-treated plasma: a virus-inactivated substitute for fresh frozen plasma. Blood 1992; 79:826-31.

9 - Grinnell, F., Ho, C.H., Wysocki, A., Degradation of fibronectin and vitronectin in chronic wound fluid: Analysis by cell blotting, immunoblotting, and cell adhesion assays. J Invest Dermatol 1992; 98: 410-6.

10 - Chen, W. Y. J., Rogers, A.A., Lydon, M.J., Characterization of biologic properties of wound fluid collected during early stages of wound healing. J Invest Dermatol 1992; 99: 559-64.

11 - Berman, M., Manseau, E., Law, M. et al., Ulceration is correlated with degradation of fibrin and fibronectin at the corneal surface. Invest Ophthalmol Vis Sci 1983; 24: 1358-66.

12 - Horowitz, B., Chang, M.D.Y., Preparation of fibronectin for therapeutic administration. IN: D.F. Mosher (ed.), Fibronectin, pages 441-55, San Diego, Academic Press 1989.

13 - Franz, T.J., Percutaneous absorption. On the relevance of in vitro data. J Invest Dermatol 1975: 64:190-95.

14 - Bronaugh, R.L., Stewart, R.F., Congdon, E.R. et al. Methods for in vitro percutaneous absorption studies. I: Comparison with in vivo results. Toxicol Appl Pharmacol 1982; 62:474-88.

15 - Bronaugh, R.L., Stewart, R.F., Methods for in vitro percutaneous absorption studies IV: The flow-through diffusion cell. J Pharm Sci 1985: 74:64-67.

Claims (15)

1. Método para preparar una solución acuosa no tamponada que contiene al menos 2 mg/ml de fibronectina, comprendiendo dicho método el paso de añadir fibronectina purificada a agua básica.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el agua es agua desmineralizada.

3. El método de la reivindicación 1, en el que la fibronectina es fibronectina plasmática humana.

4. El método de la reivindicación 1, en el que la fibronectina purificada es liofilizada.

5. Método para preparar una solución acuosa no tamponada que contiene al menos 2 mg/ml de fibronectina, comprendiendo dicho método los pasos de:

a) ajustar el pH del agua desmineralizada a un valor de 8,0 a 11,0, y

b) añadir al agua del paso a fibronectina purificada en cantidad suficiente para alcanzar una concentración de 2 mg/ml de fibronectina.

6. El método de la reivindicación 5, en el que la solución acuosa no tamponada contiene de 2 mg/ml a 10 mg/ml de fibronectina.

7. El método de la reivindicación 5, en el que la fibronectina es fibronectina plasmática humana.

8. El método de la reivindicación 5, en el que la fibronectina purificada es liofilizada.

9. Método para preparar una solución acuosa no tamponada que contiene al menos 2 mg/ml de fibronectina, comprendiendo dicho método los pasos de:

a) ajustar el pH del agua desmineralizada a 9,0, y

b) añadir al agua del paso a fibronectina purificada en cantidad suficiente para alcanzar una concentración de 2 mg/ml de fibronectina.

10. Solución acuosa no tamponada que tiene un pH de 8,0 a 11,0 y contiene de 2 mg/ml a 10 mg/ml de fibronectina.

11. Formulación farmacéutica que comprende al menos un porcentaje de un 0,5% a un 1,0% en peso de fibronectina sobre la base del peso total de la formulación farmacéutica, que comprende:

a) una solución acuosa no tamponada de fibronectina producida según la reivindicación 5, y

b) un vehículo farmacéuticamente aceptable.

12. La formulación farmacéutica de la reivindicación 11, en la que el vehículo farmacéuticamente aceptable es un polímero farmacéutico soluble en agua que tiene una viscosidad de 5 a aproximadamente 1.000 Ns/m^{2} (de 50.000 a aproximadamente 1.000.000 cps) a temperatura ambiente.

13. La formulación farmacéutica de la reivindicación 11, que comprende además al menos una proteína de la matriz extracelular seleccionada de entre los miembros del grupo que consta de trombospondina, laminina, vitronectina y fibrinógeno.

14. La formulación farmacéutica de la reivindicación 11, que comprende además al menos un factor de crecimiento.

15. Formulación acuosa en forma de gel que es para curar heridas crónicas y comprende un 0,28% de carbómero y de un 0,5% a un 1,0% en peso de fibronectina, sobre la base del peso total de la formulación en forma de gel.