ES2203827T3 - Procedimiento para la preparacion de soluciones de fibronectina concentradas sin tampon. - Google Patents
Procedimiento para la preparacion de soluciones de fibronectina concentradas sin tampon.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A SOLUCIONES ACUOSAS NO TAPONADAS QUE CONTIENEN UNAS CONCENTRACIONES ELEVADAS DE FIBRONECTINA Y OTROS ADYUVANTES DE LA CICATRIZACION DE HERIDAS, QUE SE PUEDEN UTILIZAR LUEGO PARA PREPARAR FORMULACIONES DE GELES Y CREMAS TOPICOS QUE CONTIENEN UNAS CONCENTRACIONES ALTAS DE ADYUVANTES DE LA CICATRIZACION DE HERIDAS. SE USAN ESTAS FORMULACIONES PARA LA CICATRIZACION DE HERIDAS CUTANEAS. AL SER DE LIBERACION LENTA, ALARGAN EL TIEMPO DE CONTACTO DE LA FIBRONECTINA Y OTROS ADYUVANTES DE LA CICATRIZACION DE HERIDAS EN EL PROPIO SITIO DE LA HERIDA, LO QUE PERMITE UNA ABSORCION EFECTIVA DE DICHOS ADYUVANTES.
Description
Procedimiento para la preparación de soluciones
de fibronectina concentradas sin tampón.
Esta solicitud es Continuación en Parte de la
Solicitud Estadounidense Nº 08/488.253, presentada el 7 de junio
de 1995 para Formulaciones que Son para la Curación de Heridas y
Contienen Fibronectina Plasmática Humana.
La presente invención se refiere a formas de
dosificación tópica que contienen fibronectina plasmática humana y
están destinadas a ser usadas para suscitar la curación de heridas.
En particular, la invención se refiere a la curación de úlceras
venosas crónicas.
La fibronectina es una gran glucoproteína que
contiene aproximadamente un 5% de carbohidrato. La forma
característica de la fibronectina plasmática es la de un dímero de
440.000 daltons con unión por disulfuro, teniendo cada subunidad un
peso molecular de aproximadamente 220.000 daltons. Encontrándose
normalmente en el plasma a una concentración de aproximadamente 300
\mug/ml, la fibronectina es extraída y purificada usando un
método descrito por Hynes^{1}. La fibronectina plasmática es
también conocida por otros varios nombres, entre los que se
incluyen los de globulina insoluble en frío, factor antigelatina,
proteína de unión intercelular, factor de difusión celular y
\alpha2-glucoproteína opsónica de fijación en
superficie. Estos nombres reflejan actividades biológicas de la
fibronectina tales como el reclutamiento de células, la
opsonización de residuos particulados y el fomento de la contracción
de las heridas. Otros^{2,3} han publicado estudios sobre la
estructura y las actividades de la fibronectina.
La curación de las heridas se divide
habitualmente en tres fases, que son la fase inflamatoria, la fase
proliferativa y la fase de remodelación. Se ha descrito que la
fibronectina interviene en cada estadio del proceso de curación de
las heridas, en particular creando un andamio al cual pueden
adherirse las células invasoras. Inicialmente son liberados al
sitio de la herida muchos mediadores tales como fibronectina y
fibrinógeno. La fibronectina suscita la migración de las células
inflamatorias al interior de la herida y la fagocitosis de los
residuos por parte de los monocitos. A continuación tienen lugar la
angiogénesis y la reepitelización. En este estadio, la
fibronectina ejerce actividad quimiotáctica en las células
endoteliales, y suscita la migración de células epiteliales y
fibroblastos a la membrana basal. La fibronectina parece ser
también un componente esencial de la fase de remodelación, en la
que desempeña un papel importante en la organización de las
fibrillas de colágeno. El colágeno fibrilar forma finalmente haces
fibrosos que incrementan en gran medida la resistencia a la
tracción del tejido, dando lugar al cierre de la herida.
Se ha descrito que la fibronectina plasmática
aplicada tópicamente es útil para incrementar la velocidad de
curación de las heridas en casos tales como los de las heridas
corneales^{4,5} y los de las úlceras de las piernas^{6}. Sin
embargo, nadie ha descrito un adecuado vehículo tópico que esté
destinado a ser usado en el tratamiento de heridas y pueda asegurar
la liberación de una cantidad eficaz de fibronectina. Un
importante factor limitativo para el desarrollo de una forma de
dosificación tópica eficaz de una droga es el consistente en el
hecho de que no tan sólo debe contarse con una droga activa, sino
que también es necesario contar con una formulación que permita el
paso de la droga activa del vehículo (que puede ser una crema, una
pomada, un gel, etc.) al sitio de suministro (que en el caso de la
presente invención es una herida cutánea). Drogas muy activas,
tales como los factores de crecimiento, pueden carecer de valor
terapéutico si la formulación tópica no permite que la droga se
traslade del vehículo semisólido a la herida. Por consiguiente,
sería muy deseable desarrollar una formulación que maximizase el
tiempo de contacto de la fibronectina con la herida y también
controlase la liberación de fibronectina a la herida, dando con
ello lugar a altos valores de absorción. La presente invención
aporta un sistema de liberación de este tipo realizado en forma de
una crema y geles acuosos.
La presente invención aporta formulaciones en
forma de geles acuosos y una formulación en forma de crema que
contienen fibronectina y su uso para el suministro de una cantidad
de fibronectina eficaz para la curación de la herida a un sitio de
una herida. La formulación en forma de gel comprende un polímero
farmacéuticamente aceptable y soluble en agua que es preparado a
partir de una cantidad eficaz de fibronectina. Los ejemplos de tales
compuestos incluyen los siguientes: polímeros vinílicos, como p.
ej. ácido poliacrílico; copolímeros en bloques de
polioxietileno-polioxipropileno, como p. ej.
poloxámeros; y derivados celulósicos, como p. ej.
hidroxipropilcelulosa (HPC). El polímero proporciona valores de
viscosidad de entre 50.000 y 1.000.000 cps a temperatura ambiente.
La formulación en forma de crema es preparada a partir de una base
de crema que está disponible comercialmente, es decir a partir de la
base Schering® (de la Schering Canada Inc., de
Point-Claire, Quebec), que tiene unos valores de
viscosidad de entre 60.000 y 80.000 cps a temperatura ambiente.
Se atribuyen muchas ventajas a estas formas de
dosificación. Las formulaciones en forma de gel y de crema de la
presente invención liberan cantidades eficaces de un promotor de la
curación de heridas. Otras ventajas de las formulaciones en forma
de gel incluyen la de su capacidad para mantener húmeda la herida
(lo cual es resultado del alto contenido de agua de los geles) y
la de la facilidad con la que las mismas pueden ser aplicadas a la
herida y retiradas (por lavado) de la herida. Estas formulaciones
producen también una sensación de frescor al ser aplicadas
tópicamente, lo cual puede incrementar el confort del paciente.
El sistema de liberación lenta de las
formulaciones en forma de gel de la presente invención proporciona
una prolongada liberación de fibronectina al sitio de la herida.
Esta propiedad de estas formulaciones permite una aplicación menos
frecuente a la herida, lo cual redunda en una menor perturbación
del proceso de curación. Tales formulaciones mantienen la
liberación de fibronectina por espacio de hasta 24 horas; pero según
los datos cinéticos obtenidos de los estudios de permeación
efectuados, una realización preferida de la presente invención es
un programa terapéutico según el cual las aplicaciones son
efectuadas "dos veces al día".
En la formulación de formas de dosificación
tópica destinadas a la incorporación de fibronectina deberán
respetarse varios criterios de calidad. Todos los componentes de la
preparación, incluyendo el disolvente, el agente gelificante y el
preservativo, deberán ser atóxicos para la herida y compatibles
con la droga. El producto final deberá suscitar una óptima
liberación de la droga a su sitio de acción, deberá tener una
consistencia adecuada para incrementar el tiempo de contacto de la
droga con la herida, y deberá ser estéril.
Las formulaciones preferidas de esta invención
pueden ser usadas con otros promotores de la curación de heridas
que tengan una composición similar a la de la fibronectina, tal
como es el caso de las proteínas de tamaño similar (proteínas de la
matriz extracelular tales como la trombospondina, la laminina, la
vitronectina y el fibrinógeno) o de menor tamaño (tales como
péptidos entre los que se incluyen factores de crecimiento).
En las formulaciones para aplicaciones
veterinarias pueden usarse promotores de la curación de heridas
humanos o de otros mamíferos.
Las formulaciones preferidas pueden ser
correlacionadas con los resultados de evaluar estas formulaciones
usando un sistema celular de difusión in vitro que consta de
un receptor rígido que contiene una muestra de piel desepitelizada,
estando el lado desepitelizado encarado hacia arriba al interior
de un compartimento dador y estando el lado dérmico encarado hacia
abajo al interior de un compartimento receptor. La muestra de piel
desepitelizada es preparada retirando una sección de 8 \mum de
la superficie epidérmica de la piel usando un dermátomo (escala de
tijera de 1/10.000), y el lado dérmico fue cuidadosamente limpiado
retirándole todos los vasos sanguíneos y/o tejidos subcutáneos
adheridos. El compartimento receptor es conectado a un circuito de
solución tampón circulante, siendo la temperatura de la solución
tampón mantenida al nivel de 37ºC, mientras que la superficie de la
piel está a aproximadamente 32ºC. Las formulaciones preferidas
tendrán un "valor Abs" de más de 7,8, y preferiblemente de al
menos 13,40.
Un método preferido para preparar los geles de la
invención es el de concentrar fibronectina humana en agua
desmineralizada que contiene el promotor de la polimerización
(NaOH) a un pH de aproximadamente 8,0 a aproximadamente 11,0. Para
geles de fibronectina más concentrados (0,5-1,0%),
es preferible liofilizar la fibronectina. En ambos casos, las
soluciones resultantes tienen un pH de aproximadamente 8,0 a
aproximadamente 11,0. Cuando debe prepararse un gel de carbómero,
se prefiere un pH de aproximadamente 9,0. De esta manera es
posible producir soluciones de fibronectina no precipitantes
altamente concentradas sin usar soluciones tampón tales como las
de sacáridos o estabilizadores (como p. ej. albúmina). Usando
estos métodos pueden lograrse con fiabilidad soluciones concentradas
de fibronectina de 2 mg/ml a 10 mg/ml. Puede usarse el mismo
método para producir formulaciones acuosas altamente concentradas
de otros promotores de la curación de heridas y otras proteínas en
general insolubles en agua.
La apropiada solución de fibronectina es mezclada
con una solución concentrada de agente gelificante. Las dos
soluciones son mezcladas mediante múltiples intercambios en
dispositivos que usan presión, tales como jeringas, que no agitan
vigorosamente la mezcla a fin de evitar la precipitación de la
fibronectina. Los dispositivos mezcladores están conectados
mediante un dispositivo adaptador.
La Figura 1 ilustra la absorción acumulativa de
fibronectina radiomarcada referida al tiempo y producida por
varias formulaciones en forma de gel que contienen carbómero
Carbopol® P-934 (0,375%), poloxámero Pluronic® F127
(20,0%), carboximetilcelulosa sódica (CMC 3,0%) y producida por el
control (solución salina tamponada con fosfato).
La Figura 2 ilustra la absorción cutánea de
fibronectina radiomarcada de varias formas de dosificación y del
control (solución salina tamponada con fosfato) a las 12 horas.
La Figura 3 ilustra la electroforesis de
fibronectina plasmática humana incorporada en un gel de carbómero
Carbopol® (carbómero Carbopol® P-934 0,375% +
clorocresol 0,1%) tras haber transcurrido 0, 2, 6 y 8 meses. Parte
A: Recuperación de fibronectina tras un ensayo de fijación sobre
gelatina. Parte B: Integridad de la fibronectina después de 240 días
de almacenamiento en gel a 4ºC. Hay que señalar que en la parte B
la resolución de la tira está afectada por la presencia de
contaminantes tales como carbómero Carbopol® en la muestra.
La Figura 4 muestra un gráfico de la absorción
dérmica referida a la viscosidad de distintas preparaciones
tópicas.
La Figura 5 demuestra los valores de absorción en
piel desepitelizada usando concentraciones crecientes de
fibronectina en gel de carbómero que contiene un 0,28% de
carbómero y del control (solución salina tamponada con fosfato).
La Figura 6 ilustra el efecto de dos distintas
concentraciones de carbómero en los valores de absorción de
fibronectina en piel de desepitelizada. Ambas formulaciones de
carbómero contienen un 0,2% de fibronectina; y el control es
solución tampón de fosfato.
La presente invención aporta formas de
dosificación que están formuladas especialmente para el uso
terapéutico de fibronectina como promotor tópico de la curación de
heridas. Las formas de dosificación seleccionadas para aplicaciones
tópicas deberán idealmente liberar grandes cantidades de
fibronectina y ser estériles y atóxicas para la herida. Al diseñar
estas formulaciones deben considerarse varios factores tales como
las propiedades fisicoquímicas de la glucoproteína, así como
criterios de utilización clínica.
De entre estas limitaciones, la principal está
relacionada con la solubilidad de la fibronectina en agua, que es
escasa y por consiguiente actúa como un factor moderador contra la
preparación de cremas o geles concentrados. La fibronectina es tan
sólo ligeramente soluble en agua y puede precipitar a
concentraciones tan bajas como la de 5 mg/ml en solución acuosa. Su
solubilidad se ve también afectada por las variaciones de pH y las
bajas temperaturas. De la misma manera, no pueden ser preparadas
fácilmente las formulaciones que requieren la dispersión de polvo
de polímero en la solución de fibronectina bajo agitación, puesto
que puede producirse precipitación de la glucoproteína. Bajo
agitación, la fibronectina puede agregarse y formar largas marañas
de material insoluble. La viscosidad debe ser óptima a fin de
permitir una suficiente adherencia a la herida, así como a fin de
proporcionar buenas capacidades de liberación.
Las temperaturas de más de 60ºC, que son
frecuentemente necesarias para lograr preparaciones estériles,
desnaturalizan la fibronectina. Puesto que no puede ser llevado a
cabo en el producto final un proceso de esterilización terminal,
habitualmente es inevitable la preparación de bases concentradas
de vehículos sin fibronectina. Porciones de estas bases estériles
son entonces diluidas con una cantidad definida de una solución de
fibronectina. Para lograr una adecuada dispersión de fibronectina
en formas de dosificación semisólidas, a menudo es necesario un
paso de incorporación que supone agitación y puede dar lugar a la
precipitación de la droga.
Agentes gelificantes tales como poloxámero y
carbómero Carbopol® pueden evitar este problema puesto que los
mismos son esterilizados antes de la gelificación bajo una forma
viscosa del tipo de la de un líquido. Es preparada y autoclaveada
una preparación altamente concentrada de carbómero Carbopol®. Como
se describe más adelante, la solución de fibronectina que contiene
también el promotor de la polimerización (NaOH) es entonces mezclada
en jeringas con la base de carbómero Carbopol®, formando el gel
durante la dispersión de la droga en el mismo. En el caso en el
que se usa poloxámero, el polímero es añadido a la solución de la
droga y se le deja disolverse a 4ºC, que es una temperatura a la
cual mantiene su aspecto del tipo del de un fluido. La
esterilización de esta solución para liberarla de bacterias es
llevada a cabo a 4ºC usando un filtro de 0,22 \mum.
En una realización preferida de la invención es
añadido a la forma de dosificación un preservativo no
sensibilizador atóxico y compatible con los componentes de la
formulación. Todas las condiciones anteriormente descritas son
respetadas en las formas de dosificación preferidas que se
describen en detalle a continuación.
Una cantidad de fibronectina plasmática humana
efectiva para la curación de heridas y destinada a ser usada en la
presente invención está situada dentro de la gama de cantidades que
va desde aproximadamente un 0,5 hasta aproximadamente un 1,0%, y es
preferiblemente de poco más o menos un 1,0%. La fibronectina es
aislada del plasma humano usando un procedimiento de cromatografía
de afinidad en gelatina-Sepharose. En este método,
la gelatina es acoplada en unión covalente a la Sepharose 4B tras
activación con bromuro de cianógeno. La capacidad de fijación de
fibronectina plasmática humana que se logra mediante este sistema es
> 1 mg/ml de gel.
Puede ser usada en la presente invención^{1,7}
fibronectina plasmática humana homóloga autóloga o fibronectina
obtenida mediante la tecnología del DNA recombinante. Si se usase
fibronectina plasmática homóloga, los lotes preparados a partir de
distintos donantes tendrían que ser analizados para detectar la
eventual presencia de anticuerpos atípicos, virus de la hepatitis B
(HBV), virus de la hepatitis C (HCV), virus de la inmunodeficiencia
humana (HIV), virus linfotrópico de células T humano (HTLV),
citomegalovirus (CMV) y sífilis. Los donantes deben ser sometidos
a estas pruebas justo antes de la donación y 6 meses después de la
misma. En el entretanto, el plasma de los donantes deberá
mantenerse congelado a -20ºC. Además deberán tomarse medidas
especiales a fin de inactivar los virus potenciales. Deberá ser
ejecutado en todas las donaciones de plasma^{7,8} un método de
inactivación usando
tri(n-butil)fosfato/Tween-80
(marca de fábrica) o
tri(n-butil)fosfato/Triton
X-100 (marca de fábrica) (método del
disolvente/detergente).
En la formulación en forma de gel para la
curación tópica de heridas, la viscosidad debe estar situada
dentro de la gama de viscosidades que va desde 50 hasta 1.000
Ns/m^{2} (desde 50.000 hasta 1.000.000 cps), siendo la viscosidad
más preferiblemente de entre 100 y 650 Ns/m^{2} (100.000 y
650.000 cps). En la formulación en forma de crema, la viscosidad
puede estar dentro de la gama de viscosidades que va desde 60
hasta 80 Ns/m^{2} (desde 60.000 hasta 80.000 cps). Todos los
valores de viscosidad son en centipoises (cps) según medición
efectuada utilizando un viscosímetro Brookfield. Los análisis
fueron llevados a cabo a 0,5 rpm y a temperatura ambiente.
En una realización de la presente invención, la
formulación en forma de gel puede comprender de un 0,25 a un 1,0%
en peso de ácido poliacrílico que tenga un peso molecular de
aproximadamente 740.000 a 5.000.000. En una realización preferida,
el ácido poliacrílico está presente en una cantidad de un 0,35 a
un 0,75% en peso y tiene una viscosidad de aproximadamente 350
Ns/m^{2} (350.000 cps). El pH del gel con ácido poliacrílico
deberá estar situado dentro de la gama de valores pH que va desde 5
hasta 8, y deberá ser más preferiblemente de entre 6,5 y 7,5. El
polímero de ácido poliacrílico, también conocido como carbómero, es
vendido bajo la marca de fábrica Carbopol®. La calidad del
carbómero Carbopol® preferida es la P-934.
En otra realización, la formulación en forma de
gel puede comprender de un 18 a un 35% en peso de copolímero en
bloques de polioxietileno-polioxipropileno que tenga
un peso molecular de aproximadamente 2.000 a 13.000. En una
realización preferida, el copolímero en bloques de
polioxietileno-polioxipropileno está presente en una
cantidad de un 18 a un 25% en peso y tiene una viscosidad de
aproximadamente 450 Ns/m^{2} (450.000 cps) a temperatura
ambiente. El pH del gel de copolímero en bloques deberá estar
situado dentro de la gama de valores pH que va desde 6 hasta 8, y
deberá ser más preferiblemente de entre 6,5 y 7,5. El copolímero en
bloques de polioxietileno-polioxipropileno, también
conocido como poloxámero, es vendido bajo la marca de fábrica
Pluronic®. La calidad del poloxámero Pluronic® preferida es la
F-127 (poloxámero 407).
En una realización adicional, la formulación en
forma de gel puede comprender de un 1 a un 5% de derivado
celulósico que puede ser hidroxipropilcelulosa (HPC) y tiene una
viscosidad de aproximadamente 25 a 150 Ns/m^{2} (de 25.000 a
150.000 cps). La HPC tiene un peso molecular de aproximadamente
370.000 a 1.150.000. En una realización preferida, el derivado
celulósico está presente en una cantidad de un 2,0 a un 4,0% en
peso y tiene una viscosidad de aproximadamente 150 Ns/m^{2}
(150.000 cps) para la HPC. Los derivados celulósicos que son usados
en la presente invención son comúnmente conocidos como Klucel para
HPC. La calidad preferida es la Klucel-HF.
En una realización adicional, se prepara una
formulación en forma de crema a partir de una base de crema que
está disponible comercialmente, es decir de la base Shering®. Esta
base de crema (emulsión de aceite en agua) contiene
ceteth-20, alcohol cetoestearílico, clorocresol,
aceite mineral, fosfato sódico monobásico, ácido fosfórico,
hidróxido sódico, agua y vaselina líquida. La viscosidad de la
preparación puede ser modificada variando el contenido de agua y
polietilenglicol.
Las formulaciones de la presente invención
contienen una fase acuosa en combinación con una proteína, y por
consiguiente son susceptibles de ser atacadas por bacterias y
hongos. La proliferación microbiana no tan sólo estropea la
formulación, sino que es un potencial riesgo de toxicidad y un
foco de infección para los pacientes. Aunque la proliferación
microbiana es menos probable que sea peligrosa cuando tiene lugar
en una preparación tópica, es especialmente importante preservar
los tópicos que los pacientes deban aplicar a una piel rota o
inflamada. Es también preocupante la degradación de la viscosidad
que ha sido descrita en relación con algunos polímeros al verse
los mismos expuestos a contaminación microbiana. Por consiguiente,
deberá añadirse a la preparación un preservativo para garantizar la
esterilidad y estabilidad a largo plazo. La presente invención
aporta geles que comprenden un preservativo seleccionado de entre
los miembros del grupo que consta de fenol o los compuestos de
parahidroxibenzoato. En una realización, la formulación en forma
de gel puede contener de un 0,1 a un 0,2% en peso de clorocresol,
que es un derivado fenólico, o de un 0,01 a un 0,3% en peso de
parahidroxibenzoato como parahidroxibenzoato de metilo y
parahidroxibenzoato de propilo. En otra realización, la
formulación en forma de crema contiene de un 0,1 a un 0,2% en peso
de clorocresol.
Pueden ser añadidos a la formulación
estabilizadores a fin de lograr composiciones estables de
fibronectina. Dichos estabilizadores pueden ayudar a preservar las
actividades biológicas a largo plazo y pueden mejorar la
solubilidad de la fibronectina en agua. De entre estos agentes, son
estabilizadores preferidos la albúmina, disacáridos tales como la
sucrosa, y oligosacáridos cíclicos tales como la ciclodextrina.
Estos agentes pueden ser usados ya sea en solitario o bien en
combinación. La albúmina humana es preferible en cuanto a la
antigenicidad, y deberá estar exenta de contaminación microbiana.
Son adecuadas las ciclodextrinas del grupo \beta (con 7 unidades
de glucosa), y es preferible la
hidroxipropil-\beta-ciclodextrina.
La formulación puede comprender de un 0,01 a un 0,1% en peso de
albúmina, y preferiblemente de un 0,01 a un 0,05%; y/o de un 0,5 a
un 5,0% en peso de sucrosa, y preferiblemente de un 3,0 a un 5,0%;
y/o de un 1,0 a un 10% en peso de
hidroxipropil-\beta-ciclodextrina,
y preferiblemente de un 2,0 a un 5,0%.
Algunos autores han sugerido que la actividad de
proteasa en algunas heridas crónicas puede ocasionar degradación
de proteínas de adherencia tales como la fibronectina e impedir la
adherencia celular que es necesaria para el cierre normal de las
heridas^{9}. Han sido identificadas en fluido de heridas
crónicas^{9,10} metaloproteasas y serina proteasas, y se ha
descrito que la fibronectina es altamente sensible a la
segmentación por proteasas^{11}. La protección de la integridad
de la fibronectina puede lograrse mediante la adición de
inhibidores de proteasa en la forma de dosificación. La presente
invención aporta también formulaciones que pueden comprender un
inhibidor de metaloproteasa tal como EDTA (EDTA = ácido
etilenodiaminotetraacético) y/o un inhibidor de serina proteasa tal
como aprotinina (Trasylol®, Miles) con la finalidad de alcanzar
este objetivo. En una realización, la forma de dosificación puede
comprender de un 0,01 a un 1,0% en peso de EDTA y/o de 1,5 a 45,0
Inh U% en peso de aprotinina, siendo 1 Inh U = 26 unidades de
inhibidor de la calicreína.
Las formulaciones de la presente invención pueden
ser aplicadas al sitio de la herida mediante cualesquiera medios
adecuados que aseguren que quedará enteramente cubierta la
superficie de la herida. Por ejemplo, la formulación puede ser
aplicada directamente al sitio de la herida, o bien puede ser
usada para recubrir las fibras de un apósito de gasa absorbente
para formar un vendaje para la curación de heridas que puede ser
entonces colocado sobre una herida.
Los ejemplos que se dan a continuación están
destinados a ilustrar adicionales aspectos de la invención y no
deberán ser interpretados como ejemplos que limitan su alcance en
modo alguno.
1) Es obligatorio para todas las donaciones de
plasma homólogo un paso de esterilización. A fin de inactivar los
virus potenciales, es utilizado un procedimiento de esterilización
en el que se utiliza el método del disolvente/detergente. Son
añadidos al plasma por espacio de 6 horas a 24ºC un 1% de
tri(n-butil)fosfato (TNBP) y un 1% de
Triton X-100 (marca de fábrica). Después de eso,
es añadido aceite de soja al plasma y se deja que tenga lugar la
mezcla por espacio de al menos 30 minutos a fin de extraer el
TNBP. El Triton residual será eliminado por diálisis. Se
prescinde de este primer paso si se usa plasma autólogo.
2) Una columna de
gelatina-Sepharose 4B es primeramente prelavada con
una solución de Tris-HCl a fin de equilibrar el
gel.
3) El plasma es diluido (1:1) con una solución de
Tris-HCl y es bombeado a través de la columna en
presencia de fluoruro de fenilmetilsulfonilo 0,001M (PMSF) por
espacio de aproximadamente 15 horas a 4ºC.
4) La columna es entonces lavada tres veces a fin
de eluir del gel las proteínas plasmáticas fijadas
inespecíficamente. Todos los pasos de lavado son llevados a cabo
usando una solución de Tris-HCl a pH 7,5. Es
añadida al segundo paso de lavado una solución de NaCl 1M para
eluir los contaminantes.
5) La elución de fibronectina es llevada a cabo
usando una solución de acetato de Na 0,1M + KBr 1M.
6) Son entonces llevados a cabo dos pasos de
diálisis para eliminar los contaminantes (Triton
X-100 (marca de fábrica), KBr, Acetato de Na). Son
respectivamente efectuadas diálisis contra salina tamponada
con fosfato y agua estéril.
7) Es concentrada la solución mediante
ultrafiltración bajo presión de nitrógeno.
8) Es efectuada filtración esterilizante terminal
usando un filtro de 0,22 \mum para garantizar la
esterilidad.
9) Se forman partes alícuotas de las fracciones y
las mismas se congelan a -20ºC hasta su incorporación en la forma
de dosificación tópica.
Fueron preparados geles de ácido poliacrílico
(carbómero) (carbómero Carbopol®, de la BF Goodrich). El carbómero
es un polímero derivado de ácido acrílico. Se trata de un polímero
de alto peso molecular (de 740.000 a 5.000.000) que se gelifica al
ser neutralizado mediante aminas (trietanolamina) o álcalis
fuertes (NaOH). Dicho polímero forma geles a concentraciones
relativamente bajas, o sea tan bajas como la del orden de un 0,25%,
y su viscosidad se ve marcadamente reducida por la adición de
electrólitos.
La calidad de ácido poliacrílico preferida es la
del carbómero Carbopol® 934-P a concentraciones que
van de un 0,35 a un 0,75% (en peso). Las concentraciones más bajas
son insuficientes para suscitar la adherencia a la herida, y las
concentraciones más altas reducen la liberación de fibronectina
desde el gel. La viscosidad de los geles de ácido poliacrílico es
estable a un pH de 6 a 8, siendo una gama de valores pH preferida
la situada entre 6,5 y 7,5. La viscosidad se ve reducida en
presencia de electrolitos fuertes.
Fue preparado de la manera siguiente un gel de
ácido poliacrílico que contenía (en peso) un 0,2% de fibronectina,
un 0,375% de carbómero Carbopol® 934-P y un 0,1% de
clorocresol: Fue disuelto clorocresol (1,0 g) en agua desionizada
caliente (a 65ºC) (95 ml) bajo agitación lenta. Al estar
completamente disuelto el clorocresol, la solución es enfriada a
temperatura ambiente manteniendo la agitación. Fue entonces añadido
carbómero Carbopol® 934-P
(3,75 g), dispersándolo lentamente sobre la superficie de la solución, y se efectuó mezcla con un agitador del tipo de los de paletas por espacio de aproximadamente 3 horas. Esta dispersión fue entonces autoclaveada para formar una base de gel concentrada estéril (3,75% en peso). Una solución concentrada de fibronectina, de 2,2 mg/ml (90 ml), fue filtrada a través de un filtro de acetato de 0,22 \mum. Fue añadido a la solución de fibronectina un promotor de la polimerización, o sea hidróxido sódico, en una cantidad que neutralizará una porción de 10 g de la dispersión de carbómero Carbopol® al 3,75%, es decir 1250 \mul de NaOH 3M.
(3,75 g), dispersándolo lentamente sobre la superficie de la solución, y se efectuó mezcla con un agitador del tipo de los de paletas por espacio de aproximadamente 3 horas. Esta dispersión fue entonces autoclaveada para formar una base de gel concentrada estéril (3,75% en peso). Una solución concentrada de fibronectina, de 2,2 mg/ml (90 ml), fue filtrada a través de un filtro de acetato de 0,22 \mum. Fue añadido a la solución de fibronectina un promotor de la polimerización, o sea hidróxido sódico, en una cantidad que neutralizará una porción de 10 g de la dispersión de carbómero Carbopol® al 3,75%, es decir 1250 \mul de NaOH 3M.
La solución concentrada de fibronectina y la
dispersión de carbómero Carbopol® fueron mezcladas en jeringas
actuando con precaución para evitar la introducción de burbujas de
aire y para evitar la contaminación trabajando en un ambiente
aséptico, tal como bajo una campana de flujo laminar. Son en
general usadas dos jeringas, y se efectúan múltiples intercambios
bajo presión. Puede ser usado un dispositivo adaptador tal como una
conexión Luer hembra para conectar las jeringas o los otros
aparatos de intercambio. La agitación vigorosa es minimizada a fin
de evitar la precipitación de la fibronectina. Con esta preparación
se obtiene un gel preservado transparente (100 g) de fibronectina
que está exento de microorganismos y tiene una viscosidad de
aproximadamente 350.000 cps.
Esta formulación en forma de gel fue aplicada dos
veces al día a úlceras de las piernas en un estudio piloto en
humanos, y con la misma se observó una velocidad incrementada de
curación de las heridas sin efecto adverso alguno.
En una realización preferida, pueden ser
preparadas soluciones concentradas de fibronectina de hasta al
menos
10 mg/ml. Estas soluciones pueden ser entonces usadas para preparar un gel de fibronectina concentrado. A fin de preparar el gel de fibronectina, deben ser añadidos en secuencia los ingredientes siguientes, y los mismos son necesarios para la preparación de 10 gramos de gel cuya concentración de fibronectina varía desde un 0,5 hasta un 1,0%. Primeramente, el pH de 9,8 gramos de agua desmineralizada es ajustado a un valor de aproximadamente 8,0 a aproximadamente 11,0 con 0,094 gramos de NaOH 3M. A continuación es disuelta fibronectina liofilizada en el agua desmineralizada, a un pH de 8,0-11,0, en cantidades que varían desde 0,05 hasta 0,1 gramos. Cuando debe prepararse un gel de carbómero, se prefiere un pH de 9,0 para el agua desmineralizada. En un paso final del procedimiento, son añadidos a la mezcla 0,028 gramos de carbómero.
10 mg/ml. Estas soluciones pueden ser entonces usadas para preparar un gel de fibronectina concentrado. A fin de preparar el gel de fibronectina, deben ser añadidos en secuencia los ingredientes siguientes, y los mismos son necesarios para la preparación de 10 gramos de gel cuya concentración de fibronectina varía desde un 0,5 hasta un 1,0%. Primeramente, el pH de 9,8 gramos de agua desmineralizada es ajustado a un valor de aproximadamente 8,0 a aproximadamente 11,0 con 0,094 gramos de NaOH 3M. A continuación es disuelta fibronectina liofilizada en el agua desmineralizada, a un pH de 8,0-11,0, en cantidades que varían desde 0,05 hasta 0,1 gramos. Cuando debe prepararse un gel de carbómero, se prefiere un pH de 9,0 para el agua desmineralizada. En un paso final del procedimiento, son añadidos a la mezcla 0,028 gramos de carbómero.
Fueron preparados geles de copolímero en bloques
de polioxietileno- polioxipropileno (poloxámero) (poloxámero
Pluronic®, de la BASF de Wyandotte). La calidad de poloxámero
preferida es la del poloxámero Pluronic® F-127 a
concentraciones que van de un 18 a un 25% (en peso). El poloxámero
Pluronic® F-127 es un polímero de bajo peso
molecular (de 2.000 a 13.000) que presenta características de
gelificación térmica. La gelificación se produce cuando la
concentración llega a ser de un 18% de poloxámero. La viscosidad del
poloxámero es proporcional a la concentración de polímero, al tipo
de polímero usado (al peso molecular del mismo) y a la
temperatura. Siendo fluido a 4ºC, el polímero se gelifica al
aumentar la temperatura, presentando altos valores de viscosidad a
temperatura ambiente. En contraste con el carbómero Carbopol®, la
adición de iones incrementa la viscosidad de la preparación.
Se ha descrito que las soluciones acuosas
concentradas (con una concentración de un 20 a un 30%) presentan
espectaculares incrementos de la viscosidad al ser calentadas desde
4ºC hasta la temperatura corporal. Además, si es incrementada la
concentración iónica de la solución, la viscosidad aumenta más
rápidamente al aumentar la temperatura. Están disponibles varias
calidades, pero la calidad F-127 es la menos tóxica,
y la gelificación puede producirse con la misma a concentraciones
más bajas. Los geles de poloxámero que son preparados en esta
invención son soluciones de baja viscosidad a 4ºC y se gelifican
rápidamente al ser calentados hasta la temperatura corporal.
Fue preparado como se indica a continuación un
gel de poloxámero que contenía (en peso) un 0,2% de fibronectina y
un 20% de poloxámero Pluronic® F-127: Una solución
concentrada de fibronectina de 2,2 mg/ml (80 ml) fue filtrada a
través de un filtro de acetato de 0,22 \mum. Fue añadido
poloxámero Pluronic® F-127 (20 g) a 80 ml de la
solución de fibronectina, y se dejó que la mezcla se disolviese
sin agitación a 4ºC por espacio de unos 3 días. La solución
resultante (100 g) es muy similar a un líquido. La gelificación
tiene lugar instantáneamente cuando la solución entra en contacto
con la herida. Podría ser también aplicado a la solución final un
proceso de filtración esterilizante llevado a cabo a 4ºC si no
puede obtenerse poloxámero en polvo estéril. La viscosidad varía
desde valores no detectables a 4ºC hasta 450.000 cps a temperatura
ambiente.
Fueron preparados geles de hidroxipropilcelulosa
(HPC). A fin de ilustrar este tipo de formulaciones, se describe a
continuación la preparación de un gel de HPC al 3%. La calidad
preferida es la de la hidroxipropilcelulosa
Klucel-HF a concentraciones que van de un 2 a un 4%
(en peso).
Fue preparada de la manera siguiente una
formulación en forma de gel que contenía (en peso) un 0,1% de
fibronectina, un 3% de HPC y parahidroxibenzoatos: Fueron disueltos
en agua desionizada caliente (94 ml) parahidroxibenzoato de metilo
(0,05 g) y parahidroxibenzoato de propilo (0,02 g). Fue
esterilizada HPC en polvo usando un proceso de esterilización por
calor seco. La HPC (6 g) fue entonces dispersada en esta solución y
mezclada con un agitador del tipo de los de paletas por espacio de
aproximadamente 3 horas. Con esto se obtiene una base de gel
concentrada estéril (al 6% en peso). Una solución concentrada de
fibronectina de 2 mg/ml (50 ml) fue filtrada a través de un filtro
de acetato de 0,22 \mum. La solución de fibronectina (50 ml) fue
entonces añadida lentamente a una porción (de 50 g) de esta base
concentrada usando el eje de baja velocidad del agitador. Con esto
se obtiene un gel preservado (100 g) que tiene una viscosidad de
aproximadamente 150.000 cps.
Fue preparada como se indica a continuación una
formulación en forma de crema que contenía (en peso) un 0,1% de
fibronectina, base de crema estéril (base Schering®, de la
Schering) y un 0,1% de clorocresol: Fue filtrada a través de un
filtro de acetato de 0,22 \mum una solución concentrada de
fibronectina de 2 mg/ml (50 ml). La solución de fibronectina (50
ml) fue entonces añadida lentamente a una porción (de 50 g) de la
base de crema usando el eje de baja velocidad de un agitador. Es
así obtenida una crema preservada (100 g) que tiene una viscosidad
de aproximadamente 70.000 cps.
La eficacia de cada formulación tópica para
liberar la fibronectina fue evaluada usando un sistema celular de
difusión in vitro. Los estudios de permeación fueron todos
ellos llevados a cabo sobre muestras de piel desepitelizada
abdominal y de mama humana obtenidas de cirugías de reducción de
mama y de lipectomía abdominal. Fue retirada de la superficie
epidérmica de la piel una sección de 8 \mum usando un dermátomo
(escala de tijera de 1/10.000), y el lado dérmico fue limpiado
cuidadosamente retirándole todos los tejidos subcutáneos adheridos
y/o vasos sanguíneos. La piel humana desepitelizada fue usada a fin
de reproducir el estado patológico que se encuentra en las úlceras
venosas crónicas, en las que está ausente la capa de la
epidermis.
El sistema celular de difusión seleccionado
constaba de un receptor rígido que contenía la muestra de piel,
estando el lado desepitelizado encarado hacia arriba al interior
del compartimento dador, y estando el lado dérmico encarado hacia
abajo al interior del compartimento receptor. El compartimento
receptor estaba conectado a un circuito de solución tampón
circulante. La temperatura de la solución tampón fue mantenida al
nivel de 37ºC, mientras que la superficie de la piel estaba a
aproximadamente 32ºC. Cada análisis fue llevado a cabo sobre una
muestra de piel de 0,64 cm^{2} usando una parte alícuota de 100
\mul de muestra de formulación tópica de
^{125}I-fibronectina. Después del experimento, la
piel fue retirada de la celda de difusión, lavada 10 veces con un
volumen de 8 ml de agua por lavado y analizada para determinar su
contenido de radiactividad en un contador de radiactividad gamma.
La cantidad total absorbida (dermis + compartimento receptor)
dividida por la dosis aplicada dio la absorción porcentual. Este
sistema de la celda de difusión ha proporcionado resultados que son
excelentemente reproducibles tanto intraexperimentalmente como
interexperimentalmente.
Todas las formas de dosificación fueron hechas en
solución exenta de sal puesto que los valores de viscosidad
podrían haber sido influenciados por la presencia de electrólitos.
Por ejemplo, los valores de viscosidad de los geles de carbómero se
ven reducidos en presencia de electrólitos fuertes, en contraste
con los geles de poloxámero, que son más viscosos cuando son
añadidos a la preparación electrólitos.
Varios autores han comparado estudios de
absorción percutánea usando técnicas in vitro e in
vivo para establecer la fiabilidad de los resultados usando
estos métodos^{13,14,15}. Estas comparaciones han demostrado
claramente que los estudios in vitro pueden reflejar con
precisión el estado viviente. El análisis estadístico aplicado a
nuestros experimentos ha demostrado que existe un buen valor de
correlación entre los estudios llevados a cabo con piel obtenida de
distintas fuentes. Estos datos han demostrado que el origen de la
piel no tenía efecto alguno en los resultados.
Los estudios de absorción percutánea son
habitualmente llevados a cabo sobre piel intacta y están
destinados a evaluar la liberación de una sustancia desde un
vehículo tópico y su absorción a través de la principal barrera
cutánea, es decir a través del stratum corneum. En las
úlceras cutáneas está ausente el efecto de barrera del stratum
corneum. Con este estado patológico, tan sólo la difusión
desde el vehículo dermatológico será un determinante importante para
la ulterior penetración de la droga al interior de la dermis. El
sistema celular de difusión anteriormente descrito es un adecuado
modelo in vitro para las úlceras cutáneas.
Los datos cinéticos de la liberación de
fibronectina desde varias formas de dosificación fueron obtenidos
a las 4, 12 y 24 horas. La Tabla 1 resume estos datos para t = 12
horas. El control constaba de
^{126}I-fibronectina en solución salina tamponada
con fosfato a pH 7,4. Los liposomas usados en la formulación
(Lipogel) de carbómero Carbopol® 934 P (1%) + liposomas (15%)
fueron hechos a partir de liposomas Proliposomes
(Pro-lipo 3090 SH^{MF}, de la Lucas Mayer,
Francia). Los derivados celulósicos están identificados como CMC
para carboximetilcelulosa sódica y HPC para hidroxipropilcelulosa.
La base Dermabase® (Borden, Ltee., de Don Mills, Ontario, Canadá)
y la base Schering® son bases de crema que están disponibles en el
mercado, y fueron diluidas a 1:1 para estos experimentos. El
símbolo [ ] se refiere a la concentración de los componentes, y el
"valor Abs" se refiere al porcentaje de fibronectina
radiomarcada encontrado en la dermis tras un tiempo de exposición
de 12 horas.
Formulación | [ ] | Valor Abs |
Control | 24.75% | |
Lipogel | 3.70% | |
Base Dermabase® | (1:1) | 5.80% |
CMC | 3% | 6.70% |
Carbómero Carbopol® 934 P + glicerina (Carbogly) | 0.375%/10% | 7.80% |
Base Schering® | (1:1) | 9.90% |
Poloxámero Pluronic® F-127 | 20% | 12.80% |
Carbómero Carbopol® 934 P | 0.375% | 13.40% |
NPC | 3% | 15.20% |
La Figura 1 es un gráfico de los datos cinéticos
de tres formas de dosificación en forma de gel y de la solución de
control referidos al tiempo. Puede verse por este gráfico que el
proceso de absorción tiende a ser más importante entre la hora 0 y
las 12 horas en comparación con el tiempo que transcurre entre las
12 y las 24 horas, lo cual sugiere que mediante dos aplicaciones al
día podría liberarse más fibronectina que con un programa de una
aplicación al día.
La Figura 2 ilustra la absorción cutánea de
fibronectina radiomarcada desde varias formas de dosificación y
desde el control al haber transcurrido 12 horas. Fue usado para
identificar las diferencias estadísticamente significantes entre
las formulaciones realizadas en forma de gel de carbómero
Carbopol® y otras formulaciones el análisis estadístico de Dunnett.
Este análisis ha demostrado también que existen diferencias
significantes entre los geles de carbómero Lipogel, Carbogly y
Carbopol®, siendo éstos resultados que pueden ser correlacionados
con los del rendimiento obtenidos durante las pruebas clínicas
(véase el Ejemplo 8). La eficacia de la formulación realizada en
forma de gel de carbómero Carbopol® es particularmente sorprendente
dado que el gel de carbómero Carbopol® tiene un grado de viscosidad
más alto que el de muchas de las otras formulaciones estudiadas.
Son también dignas de mención las diferencias entre los valores
Abs de las formulaciones realizadas en forma de gel de carbómero
Carbopol® y de CMC puesto que ambas comparten el mismo grado de
viscosidad.
La Figura 4 muestra que no siempre existe una
clara relación entre la viscosidad y la absorción, cuando se
consideran algunas de las preparaciones para las cuales fueron
determinados los valores de viscosidad. Por ejemplo, la base
Dermabase®, que tiene una viscosidad relativamente baja (119.000
cps) en comparación con el gel de carbómero Carbopol® (411.300
cps), presenta escasas capacidades de liberación (5,80%) en
comparación con el gel de carbómero Carbopol® (13,40%).
La Figura 5 demuestra que pueden ser obtenidos
valores de absorción de más de un 13,40% usando un 0,28% de
carbómero y concentraciones más altas de fibronectina. La Figura 6
compara directamente los valores de absorción obtenidos en el
sistema celular de difusión con piel desepitelizada para geles de
un 0,28% y un 0,375% de carbómero que tienen ambos un 0,2% de
fibronectina.
En las Figuras 5 y 6, la cantidad de fibronectina
fue medida utilizando procedimientos de inmunoanálisis ligado a
enzimas (ELISA). Una placa de cultivo de microtitulación de
poliestireno es incubada con 100 \mul de distintas muestras de
fibronectina en solución tampón de carbonato/bicarbonato 50mM, a
un pH de 9,6 y a 4ºC durante la noche. Una solución de albúmina de
suero bovino (BSA) al 5% en salina tamponada con fosfato Tween, a un
pH de 7,5, es usada como solución tampón de bloqueo por espacio de
30 minutos a 37ºC. La placa de cultivo es lavada cuatro veces con
salina tamponada con fosfato Tween a un pH de 7,5, y son añadidos
100 \mul de anti-FN de conejo, producido por
métodos que son perfectamente conocidos en la técnica, diluidos en
una proporción de 1/100.00 en salina tamponada con fosfato Tween al
0,5% a un pH de 7,4, y la placa de cultivo es incubada a 37ºC por
espacio de 1 hora. Tras haber efectuado cuatro enjuagues con
solución tampón consistente en salina tamponada con acetato, son
añadidos 100 \mul de la peroxidasa del rábano
anti-conejo de cabra conjugada (de la Jackson
Immunoresearch Laboratories, Inc., PA) diluida en una proporción de
1/100.000 en salina tamponada con fosfato Tween (marca de fábrica)
al 0,5% de pH 7,4, y la placa de cultivo es incubada a 37ºC por
espacio de 1 hora. El conjugado sobrante es entonces retirado a
fondo por lavado, y la peroxidasa fijada a las cavidades es
detectada mediante la adición ABTS (ácido
2,2'-azino-bis(3-etilbenz-tiazolina-6-sulfónico))
en solución tampón de citrato de pH 4,6 que contiene un 0,05% de
peróxido de hidrógeno. La reacción es seguida por incrementos de la
absorbancia a 410 nm en comparación con una reacción estándar de la
peroxidasa para la fibronectina.
Fueron evaluadas (Figura 3) la actividad
biológica y la integridad de la macroestructura de fibronectina en
las formulaciones en forma de gel. Los análisis fueron llevados a
cabo sobre una muestra de gel que contenía (en peso) un 0,2% de
fibronectina, un 0,375% de carbómero Carbopol®
P-934 y un 0,1% de clorocresol. La muestra había
sido mantenida a 4ºC por espacio de 32 semanas.
Fueron usadas técnicas de electroforesis a fin de
determinar la integridad de la macroestructura de fibronectina en
el gel. Tras haber sido la muestra de gel disuelta en solución de
NaCl 1M + Tris-HCl de pH 6,8-7,4, se
la dejó migrar sobre un gel de acrilamida al 7,5% según el método
de Laemmli ("Denaturing (SDS) discontinuous gel electrophoresis:
Laemmli gel method", páginas: 10.2.4 - 10.2.9, Current
Protocols in Molecular Biology (1994)). En comparación con una
solución estándar sin usar (columna 0), los resultados demostraron
que podía ser identificada cerca del 100% de la fibronectina en
torno a la banda de 220.000 (columna B), lo cual indica que se
produce muy poca degradación o ninguna.
La actividad biológica fue evaluada usando un
análisis por cromatografía de afinidad. La fijación a la gelatina
es una de estas actividades biológicas que pueden ser evaluadas con
relativa facilidad. Tras haber sido una muestra de gel disuelta en
una solución de NaCl 1M, una cantidad conocida de esta solución
viscosa fue puesta en un tubo Eppendorf en presencia de
gelatina-Sheparose 4B, y fue entonces sometida a
agitación vorticial. El contenido fue enjuagado adicionalmente con
una solución de NaCl 1M sin usar y fue centrifugado, y el
supernatante fue descartado a fin de eliminar contaminantes tales
como carbómero Carbopol® y clorocresol que procedían de la
disolución del gel. La fibronectina fue eluída de la
gelatina-Sepharose 4B usando una solución de KBr
1M. Se dejó que la fracción recogida migrase sobre un gel de
acrilamida al 7,5% según el método Laemmli. La tira fue entonces
evaluada con respecto a su contenido de fibronectina usando un
análisis de exploración densitométrica. La muestra recogida pudo
ser también evaluada espectrofotométricamente usando la densidad
óptica a la longitud de onda \lambda = 280 nm.
En comparación con un gel de fibronectina recién
preparado (columna 0) puede verse que fue recuperada a partir de
la mezcla de formulación en forma de gel (columna de los 8 meses)
una gran cantidad (80%) de fibronectina, lo cual indica que la
actividad de fijación a la gelatina de la glucoproteína puede ser
preservada por espacio de un largo período de tiempo en esta forma
de dosificación.
Hemos llevado a cabo cinco pruebas clínicas
(estudios experimentales) para investigar la utilidad de distintas
formas de dosificación que contenían fibronectina plasmática humana
exógena en el tratamiento de úlceras venosas crónicas de los
miembros inferiores. En estas pruebas fue usada fibronectina
plasmática autóloga, y fueron seleccionados pacientes con úlceras
que eran resistentes a la terapia convencional por espacio de al
menos tres meses.
El objetivo específico del primer experimento era
el de determinar la eficacia de la fibronectina aplicada
tópicamente como promotor de la curación de heridas. Fueron
incluidos en este estudio siete pacientes, y a los mismos se les
indicó que "inundasen" dos veces al día la zona de la herida
con una solución de fibronectina de 1 mg/ml (0,1%) en PBS (salina
tamponada con fosfato). Después de dos meses de aplicación regular
de esa solución, cinco de estos pacientes presentaban una
espectacular reducción del tamaño de sus heridas, y específicamente
al menos una reducción de un 75% del área superficial
integrada.
Un segundo experimento estuvo destinado a evaluar
la eficacia de una forma de dosificación semisólida que contenía un
0,1% en peso de fibronectina encapsulada en liposomas al 15%, que
a su vez estaban incorporados en la formulación de carbómero
Carbopol® (1%) conocida como Lipogel. La hipótesis era la de que si
podía ser incrementado el tiempo de contacto de la glucoproteína
con la herida, podría teóricamente observarse una más rápida
disminución del tiempo de curación. Fueron incluidos en este
estudio seis pacientes, y los mismos tenían que aplicar la
formulación a su herida dos veces al día. Ninguno de los pacientes
presentó una considerable disminución del tamaño de sus heridas
durante los siguientes tres meses de tratamiento regular.
En un intento de mejorar la forma de
dosificación, fue llevado a cabo un experimento para evaluar el
potencial terapéutico de una formulación tópica en forma de gel que
contenía (en peso) un 0,2% de fibronectina incorporada en un 0,375%
de carbómero Carbopol® y un 10% de glicerina (Carbogly). La
glicerina había sido añadida a la formulación a fin de aprovechar
su efecto humectante, que podía ser beneficioso para la herida.
Fueron reclutados para este estudio once pacientes, y los mismos
tenían también que aplicar el gel dos veces al día. De entre estos
pacientes, los que constituían un 27% experimentaron una regresión
de más de un 50% del tamaño de sus heridas tras tres meses de
tratamiento.
Los resultados de los estudios de permeación
pueden explicar, al menos en parte, lo que podría haber ocurrido
en experimentos anteriores. La Figura 2 muestra que preparaciones
tales como las de carbómero Lipogel y Carbopol® + glicerina no dan
lugar a altos valores de absorción. En contraste con ello, el
carbómero Carbopol® al 0,375% sin glicerina proporciona valores de
absorción significativamente más altos (p < 0,001). Este efecto
de la glicerina no fue observado con las formulaciones que
contenían fibronectina en una concentración de más de un 0,2%. La
solución que fue usada en el primer experimento está identificada
como el control en este gráfico. Esta última preparación presenta
las más altas capacidades de liberación, pero no representa una
formulación que pudiese ser útil para los pacientes debido a su
consistencia fluida.
Considerando estos resultados, fue investigada en
ocho pacientes una formulación que contenía un 0,2% (en peso) de
fibronectina en carbómero Carbopol® al 0,375%, sin glicerina. Según
los estudios clínicos y de permeación, esta formulación es el
vehículo preferido usando carbómero Carbopol que está disponible
para el uso de fibronectina en la curación tópica de heridas. Los
datos preliminares pusieron de manifiesto que los de un 50% de los
pacientes estudiados presentaban una regresión de más de un 50% de
los tamaños de sus heridas a los tres meses de tratamiento,
incluyendo dos respuestas totales (curación del 100%) que se
produjeron a las primeras ocho semanas de tratamiento.
Fue llevada a cabo una quinta prueba clínica con
40 pacientes con la formulación que contenía un 0,2% (en peso) de
fibronectina en carbómero Carbopol® sin glicerina. En esta prueba
clínica, los pacientes fueron estratificados según la duración de la
úlcera cutánea (la edad de la úlcera) al comienzo de la prueba. En
los pacientes con úlceras de 6 meses o menos de duración, la
formulación que contenía un 0,2% (en peso) de fibronectina en
carbómero Carbopol® al 0,375% sin glicerina no resultó ser
superior al placebo. El placebo era carbómero Carbopol® sin
glicerina y que no contenía fibronectina. Sin embargo, en los
pacientes con úlceras de 7 meses o más de duración al ser
efectuada la aleatorización, la formulación de fibronectina que
contenía un 0,2% (en peso) de fibronectina en carbómero Carbopol®
al 0,375% sin glicerina resultó ser claramente superior. Tras 20
semanas de tratamiento, los del 58% de los pacientes del grupo
tratado (7/12) presentaban una reducción del tamaño de las heridas
de al menos un 75% después de 20 semanas de tratamiento. Tan sólo
los de un 25% (1/4) de los pacientes del grupo tratado con placebo
presentaban este efecto beneficioso. En conjunto, los pacientes
tratados con placebo (n = 4) presentaban un deterioro, con un
incremento de aproximadamente un 60% del tamaño medio de las
heridas. En el grupo tratado con fibronectina (n = 11), el tamaño
medio de las heridas había disminuido en casi un 30% después de 20
semanas de tratamiento.
La presente invención aporta también otras
formulaciones que son tan útiles como ésta usando el estudio de
permeación descrito en el Ejemplo 5 como sistema modelo para
someter a ensayo las distintas formulaciones.
Para ilustrar la eficacia de la formulación que
contiene fibronectina y carbómero Carbopol® 934-P
al 0,375% (en peso), presentamos dos casos específicos de úlcera
venosa crónica de las piernas. Estos casos son de interés por
cuanto que el primer caso era muy resistente a la terapia
convencional y el segundo caso era una gran úlcera. Varios autores
han identificado factores tales como la duración y el área
superficial como factores que desempeñan un importante papel en la
prognosis de la úlcera venosa.
Caso
1
Una mujer de 37 años de edad se presentó con un
historial de diez años de úlcera venosa crónica del miembro
inferior derecho. Su historial médico no era significativo,
exceptuando cuatro episodios de flebitis. El último episodio tuvo
lugar durante el embarazo, y finalmente redundó en una úlcera. El
estudio de los tratamientos médicos que fueron intentados reveló el
uso de antisépticos tópicos, medias elásticas e injerto cutáneo sin
resultado positivo alguno.
La paciente se presentó en nuestra clínica con
una herida dolorosa de 1,60 cm^{2}. A pesar del hecho de que su
úlcera era relativamente pequeña, la misma parecía ser muy
resistente a la terapia. Seis semanas después de haber iniciado la
aplicación del gel de fibronectina, podía observarse una reducción
de un 92% del tamaño de su herida. Fue observada una
reepitelización total tras un programa de tratamiento de diez
semanas. Una visita de seguimiento programada para un mes después
no reveló deterioro alguno del estado de su herida.
Caso
2
Un hombre de 39 años de edad se presentó con un
historial de siete años de úlcera venosa crónica de la pierna
izquierda. Su historial médico no era significativo, exceptuando
una safenectomía del miembro inferior izquierdo doce años antes. Le
habían sido prescritos al paciente antibióticos tópicos sin efecto
alguno en el tamaño de su herida.
Este paciente se presentó a nuestra clínica con
una herida dolorosa de 10,5 cm^{2} resultante de un trauma
local. El linfedema del miembro inferior izquierdo era importante,
y bordeaba la herida una gran capa necrótica costrosa. La profesión
del paciente le obligaba a permanecer de pie por espacio de largos
períodos de tiempo. A pesar de que esta situación probablemente
empeoraba el estado de su herida, la misma no podía ser
eliminada.
Después de cuatro semanas de aplicación regular
de un gel de placebo y salina normal, el tamaño de la herida había
aumentado hasta llegar a ser de 21,5 cm^{2} como consecuencia del
desbridamiento local. El gel de placebo comprendía un 0,375% de
carbómero Carbopol® 934-P, un 0,1% de clorocresol,
agua purificada y NaOH para ajustar el pH. En este punto fue
iniciado el tratamiento activo con la formulación realizada en
forma de gel de carbómero Carbopol® con contenido de fibronectina.
El máximo tamaño de la herida fue observado seis semanas después
(37,5 cm^{2}), revelando una úlcera mayor que la inicialmente
supuesta. El proceso de curación de la herida tuvo lugar entre las
semanas seis y ocho, y quedó concluido tras 31 semanas de
tratamiento activo. Una visita de seguimiento programada para un mes
después no reveló deterioro alguno del estado de su herida.
A pesar de que la presente invención ha sido
descrita en relación con realizaciones particulares de la misma,
serán obvios para los expertos en la materia muchas otras
variaciones y modificaciones y muchos otros usos.
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identification of fibronectin (chap. 2, page 12), IN:
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Claims (15)
1. Método para preparar una solución acuosa no
tamponada que contiene al menos 2 mg/ml de fibronectina,
comprendiendo dicho método el paso de añadir fibronectina
purificada a agua básica.
2. El método de la reivindicación 1, en el que el
agua es agua desmineralizada.
3. El método de la reivindicación 1, en el que la
fibronectina es fibronectina plasmática humana.
4. El método de la reivindicación 1, en el que la
fibronectina purificada es liofilizada.
5. Método para preparar una solución acuosa no
tamponada que contiene al menos 2 mg/ml de fibronectina,
comprendiendo dicho método los pasos de:
a) ajustar el pH del agua desmineralizada a un
valor de 8,0 a 11,0, y
b) añadir al agua del paso a fibronectina
purificada en cantidad suficiente para alcanzar una concentración
de 2 mg/ml de fibronectina.
6. El método de la reivindicación 5, en el que la
solución acuosa no tamponada contiene de 2 mg/ml a 10 mg/ml de
fibronectina.
7. El método de la reivindicación 5, en el que la
fibronectina es fibronectina plasmática humana.
8. El método de la reivindicación 5, en el que la
fibronectina purificada es liofilizada.
9. Método para preparar una solución acuosa no
tamponada que contiene al menos 2 mg/ml de fibronectina,
comprendiendo dicho método los pasos de:
a) ajustar el pH del agua desmineralizada a 9,0,
y
b) añadir al agua del paso a fibronectina
purificada en cantidad suficiente para alcanzar una concentración
de 2 mg/ml de fibronectina.
10. Solución acuosa no tamponada que tiene un pH
de 8,0 a 11,0 y contiene de 2 mg/ml a 10 mg/ml de
fibronectina.
11. Formulación farmacéutica que comprende al
menos un porcentaje de un 0,5% a un 1,0% en peso de fibronectina
sobre la base del peso total de la formulación farmacéutica, que
comprende:
a) una solución acuosa no tamponada de
fibronectina producida según la reivindicación 5, y
b) un vehículo farmacéuticamente aceptable.
12. La formulación farmacéutica de la
reivindicación 11, en la que el vehículo farmacéuticamente
aceptable es un polímero farmacéutico soluble en agua que tiene una
viscosidad de 5 a aproximadamente 1.000 Ns/m^{2} (de 50.000 a
aproximadamente 1.000.000 cps) a temperatura ambiente.
13. La formulación farmacéutica de la
reivindicación 11, que comprende además al menos una proteína de
la matriz extracelular seleccionada de entre los miembros del grupo
que consta de trombospondina, laminina, vitronectina y
fibrinógeno.
14. La formulación farmacéutica de la
reivindicación 11, que comprende además al menos un factor de
crecimiento.
15. Formulación acuosa en forma de gel que es
para curar heridas crónicas y comprende un 0,28% de carbómero y de
un 0,5% a un 1,0% en peso de fibronectina, sobre la base del peso
total de la formulación en forma de gel.
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