ES2236733T3 - Foromulaciones cicatrizantes que contienen fibronectina de plasma humano. - Google Patents

Foromulaciones cicatrizantes que contienen fibronectina de plasma humano.

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ES2236733T3 ES96917308T ES96917308T ES2236733T3 ES 2236733 T3 ES2236733 T3 ES 2236733T3 ES 96917308 T ES96917308 T ES 96917308T ES 96917308 T ES96917308 T ES 96917308T ES 2236733 T3 ES2236733 T3 ES 2236733T3
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Abstract

SE UTILIZAN FORMULACIONES TOPICAS EN GEL Y EN CREMA QUE CONTIENEN FIBRONECTINA DE PLASMA HUMANO PARA LA CICATRIZACION DE HERIDAS CUTANEAS. LAS FORMULACIONES PROPORCIONAN UNA LIBERACION LENTA Y UN AUMENTO DEL TIEMPO DE CONTACTO DE LA FIBRONECTINA CON EL LUGAR DE LA HERIDA DANDO LUGAR A UNA ABSORCION EFECTIVA DE UNA CANTIDAD EFECTIVA CICATRIZANTE DE HERIDAS DE FIBRONECTINA SOBRE LA PIEL.

Description

Formulaciones cicatrizantes que contienen fibronectina de plasma humano.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a formas de dosificación tópicas que contienen fibronectina plasmática humana, para utilizar en la estimulación de la cicatrización de heridas en el ser humano. De manera particular, la invención se refiere a la cicatrización de úlceras venosas crónicas.
Antecedentes de la invención
La fibronectina es una glicoproteína grande que contiene alrededor de 5% de hidratos de carbono. La forma característica de la fibronectina humana es un dímero unido por disulfuros de 440.000 daltons, en donde cada subunidad tiene un peso molecular de aproximadamente 220.000 daltons. Normalmente presente en plasma a una concentración de aproximadamente 300 \mug/ml, la fibronectina se extrae y purifica utilizando el método descrito por Hynes^{1}. La fibronectina plasmática se conoce también por otros diversos nombres, incluidos globulina insoluble en frío, factor anti-gelatina, proteína de fijación celular, factor difusor celular, y glicoproteína \alpha2 opsónica de fijación a la superficie. Estos nombres reflejan las actividades biológicas de la fibronectina tales como reclutamiento celular, opsonización de los desechos particulados, y estimulación de la contracción de heridas. Se han publicado estudios sobre la estructura y actividades de la fibronectina en la bibliografía^{2,3}.
La cicatrización de heridas se divide habitualmente en tres fases: la fase inflamatoria, la fase proliferativa, y la fase de remodelamiento. Se ha informado de que la fibronectina interviene en cada una de las etapas del proceso de cicatrización, en especial mediante la creación de una estructura a la que se pueden adherir las células invasoras. Inicialmente, se liberan en el sitio de la herida muchos mediadores, tales como fibronectina y fibrinógeno. La fibronectina estimula la migración de células inflamatorias hacia la herida, y la fagocitosis de los desechos por parte de los monocitos. A continuación, tienen lugar la angiogénesis y la reepitelización. En esta etapa, la fibronectina ejerce actividad quimiotáctica sobre las células endoteliales, y estimula la migración de células epiteliales y fibroblastos hacia la membrana basal. La fibronectina parece ser también un componente esencial de la fase de remodelamiento, en la que desempeña una función importante en la organización de las fibrillas de colágeno. El colágeno fibrilar forma, por último, haces de fibras que potencian en gran medida la resistencia a la tensión del tejido, dando lugar al cierre de la herida.
Se ha informado de que la aplicación tópica de fibronectina plasmática resulta útil para aumentar la velocidad de cicatrización tal como en las heridas de la córnea^{4,5,16,17}, úlceras de las piernas y en la piel quemada por el sol^{18}. Sin embargo, no se ha descrito un vehículo tópico adecuado que se pueda utilizar en el tratamiento de heridas y que pueda garantizar el suministro de una cantidad eficaz de fibronectina. Un importante factor que limita el desarrollo de una forma de dosificación tópica eficaz de un fármaco es no sólo disponer de un fármaco activo, sino tener también una formulación que permita el paso del fármaco activo desde el vehículo (crema, ungüento, gel, etc.) al sitio de suministro (que, en el caso de la presente invención, es una herida de la piel). Fármacos altamente activos, tales como los factores de crecimiento, pueden carecer de valor terapéutico si la formulación tópica no permite el desplazamiento del fármaco desde el vehículo semi-sólido hacia la herida. Por lo tanto, sería altamente deseable desarrollar una formulación capaz de ampliar al máximo el tiempo de contacto de la fibronectina con la herida, y controlar también la liberación de fibronectina hacia la herida, dando lugar, de esta forma, a valores de absorción elevados. La presente invención proporciona un sistema de suministro de este tipo en forma de geles acuosos y una crema.
Resumen de la invención
La presente invención proporciona una formulación del gel acuoso para cicatrizar heridas crónicas, que comprende:
(a)
una cantidad cicatrizante eficaz de fibronectina plasmática humana, a una concentración en el intervalo de 0,05 hasta 0,5% en peso, basada en el peso de la formulación completa;
(b)
un polímero hidrosoluble, farmacéuticamente aceptable, que tiene una viscosidad de 50 a 1.000 PaS (50.000 a 1.000.000 cps) a temperatura ambiente; y
(c)
una cantidad eficaz de un conservante.
La presente invención proporciona, igualmente, una formulación en crema para cicatrizar heridas crónicas, que comprende:
(a)
una cantidad cicatrizante eficaz de fibronectina plasmática humana, a una concentración en el intervalo de 0,05 hasta 0,5 en peso, basada en el peso de la formulación completa;
(b)
Una base de crema que tiene una viscosidad de 60 a 80 PaS (60.000 a 80.000 cps) a temperatura ambiente; y
(c)
una cantidad eficaz de un conservante.
La formulación en gel comprende un polímero hidrosoluble, farmacéuticamente aceptable, que se prepara a partir de una cantidad eficaz de fibronectina. Ejemplos de estos compuestos incluyen: polímeros de vinilo, por ejemplo, ácido poliacrílico; copolímero de bloque de polioxietileno-polioxipropileno, por ejemplo, poloxámero; y derivados de celulosa, por ejemplo, hidroxipropilcelulosa (HPC). el polímero proporciona valores de viscosidad entre 50 y 1.000 PaS (50.000 y 1.000.000 cps) a temperatura ambiente. La formulación en crema se prepara a partir de una base de crema disponible en el comercio, es decir, la base Schering® (Schering Canadá Inc., Point-Claire, Québec), que posee valores de viscosidad entre 60 y 80 PaS (60.000 a 80.000 cps) a temperatura ambiente.
Se atribuyen múltiples ventajas a estas formas de dosificación. Las formulaciones en gel y crema de la presente invención liberan cantidades eficaces de un promotor de la cicatrización. Otras ventajas de las formulaciones en gel incluyen: capacidad para mantener la herida húmeda (consecuencia del ligero contenido en agua de los geles), facilidad de aplicación y eliminación (por lavado) de la herida. Asimismo, proporcionan una sensación refrescante cuando se aplican por vía tópica, lo que puede aumentar la comodidad del paciente.
El sistema de liberación lenta de las formulaciones en gel de la presente invención proporciona una liberación prolongada de fibronectina al sitio de la herida. Esta propiedad de las presentes formulaciones permite una aplicación menos frecuente sobre la herida, lo que tiene como consecuencia una menor perturbación del proceso de cicatrización. Estas formulaciones mantienen el suministro de fibronectina durante hasta 24 horas; pero, de acuerdo con los datos cinéticos obtenidos de estudios de permeación, el programa terapéutico de aplicación "dos veces al día", es una realización preferida de la presente invención.
La formulación de formas de dosificación tópicas previstas para la incorporación de fibronectina debe respetar múltiples criterios de calidad. Todos los componentes, incluidos el disolvente, el agente de gelificación y el conservante, deberán ser atóxicos para la herida y compatibles con el fármaco. El producto final deberá estimular la liberación óptima del fármaco hacia su sitio de acción, tener la consistencia adecuada para potenciar el tiempo de contacto del fármaco con la herida, y deberá ser estéril.
Las formulaciones preferidas se pueden correlacionar con los resultados de evaluar las formulaciones utilizando un sistema de celdillas de difusión in vitro, consistente en un receptor rígido que contiene una muestra de piel desepitelizada, en la que la cara desepitelizada está dispuesta hacia arriba en un compartimiento de donante, y la cara dérmica está orientada hacia abajo en un compartimiento de receptor. El compartimiento de receptor está conectado a un circuito de tampón circulante, manteniéndose la temperatura del tampón a 37ºC, en tanto que la superficie de la piel se mantiene a aproximadamente 32ºC.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra la absorción acumulada de fibronectina marcada radiactivamente durante el tiempo, a partir de diversas formulaciones en gel que contienen Carbopol P-934 (al 0,375%), Pluronic P127 (al 20,0%), carboximetilcelulosa sódica (CHC, al 3,0%), y desde el control (solución salina tamponada con fosfato).
La Figura 2 muestra la absorción cutánea de fibronectina marcada radiactivamente a partir de diversas formas de dosificación, y desde el control (solución salina tamponada con fosfato) en un tiempo de 12 horas.
La Figura 3 muestra la electroforesis de plasma humano (FN) incorporado en un gel de Carbopol (Carbopol P-934 al 0,375%, clorocresol al 0,1%) después de 0, 2, 6 y 8 meses. Sección A: Recuperación de FN tras un ensayo de fijación a gelatina. Sección B: Integridad de FN después de 240 días de almacenamiento en gel a 4ºC. Se debe destacar que en la sección B, la resolución de la banda está afectada por la presencia de contaminantes tales como Carbopol en la muestra.
La Figura 4 muestra un trazado de absorción dérmica frente a viscosidad a partir de diferentes preparaciones tópicas.
Descripción detallada de la invención
Como se define en las reivindicaciones, la presente invención proporciona formas de dosificación especialmente formuladas para el uso terapéutico de fibronectina como promotor tópico de la cicatrización. Las formas de dosificación seleccionadas para la aplicación tópica deberán liberar, idealmente, grandes cantidades de fibronectina, ser estériles y atóxicas para la herida. En la preparación de estas formulaciones, se deben tener en consideración diversos factores tales como propiedades físico-químicas de la glicoproteína, así como criterios de utilización clínica.
Entre estas limitaciones, la más importante se refiere a la solubilidad de la fibronectina en agua, que es escasa y, por lo tanto, se opone a la preparación de geles o cremas concentradas. La fibronectina es sólo ligeramente soluble en agua y puede precipitar a concentraciones tan bajas como 5 mg/ml en solución acuosa. Su solubilidad también resulta afectada por variaciones del pH y temperaturas bajas. Del mismo modo, tampoco se pueden preparar fácilmente formulaciones que requieren la dispersión, con agitación, del polvo de polímero en la solución de fibronectina, dado que se puede producir la precipitación de la glicoproteína. Con la agitación, la fibronectina se puede agregar y formar largos enmarañamientos de material insoluble. La viscosidad debe ser óptima para permitir una adherencia suficiente a la herida, así como una buena capacidad de liberación.
Las temperaturas mayores que 60ºC, frecuentemente necesarias para proporcionar preparaciones estériles, desnaturalizan la fibronectina. Puesto que no se puede llevar a cabo un proceso terminal de esterilización en el producto final, habitualmente resulta inevitable la preparación de bases concentradas de vehículos sin fibronectina. A continuación, porciones de estas bases estériles se diluyen con una cantidad definida de una solución de fibronectina. Para lograr una dispersión adecuada de la fibronectina en formas de dosificación semisólidas, se requiere, a menudo, una etapa de incorporación que comprende agitación, y que puede determinar la precipitación del fármaco.
Agentes de gelificación tales como Carbopol y poloxámero pueden salvar este problema, ya que se someten a esterilización antes de la gelificación en forma viscosa, similar a la líquida. Se elabora una preparación altamente concentrada de Carbopol y se esteriliza en autoclave. Como se describe más adelante, la solución de fibronectina, que también contiene el promotor de polimerización (NaOH), se mezcla entonces en jeringuillas con la base de Carbopol, aumentando la concentración del gel durante la dispersión del fármaco en el mismo. En el caso de poloxámero, el polímero se agrega a la solución de fármaco y se deja disolver a 4ºC, una temperatura a la que conserva su aspecto similar al líquido. La esterilización de esta solución contra bacterias se lleva a cabo a 4ºC utilizando un filtro de
0,22 \mum.
En una realización preferida de la invención, se agrega a la forma de dosificación un conservante atóxico y que no provoca sensibilización, compatible con los componentes de la formulación. Todas estas condiciones citadas se respetan en las formas de dosificación preferidas que se describen de manera detallada a continuación.
Una cantidad cicatrizante eficaz de fibronectina plasmática humana, para utilizar en la presente invención, se encuentra dentro del intervalo de 0,05 a 0,5% en peso y, más preferentemente, entre 0,2 y 0,4%. La fibronectina se aísla del plasma humano por medio de un procedimiento de cromatografía de afinidad de gelatina-Sefarosa. En este método, la gelatina se acopla de manera covalente con Sefarosa 4B después de activación con CNBr. La capacidad de fijación de la fibronectina plasmática humana proporcionada por este sistema es > 1 mg/ml de gel.
En la presente invención, se puede utilizar fibronectina plasmática humana autóloga, homóloga, o fibronectina obtenida por tecnología de ADN recombinante^{1,2}. Si se emplea fibronectina plasmática autóloga, en los lotes preparados a partir de diferentes donantes habría que analizar la presencia de anticuerpos atípicos, virus de la hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV), virus de la inmunodeficiencia humana (HIV), virus linfotrópico de células T humano (RTLV), citomegalovirus (CMV) y sífilis. Estos ensayos se deben realizar en los donantes inmediatamente antes de la donación, y 6 meses más tarde. En el intervalo, el plasma de donante se debe mantener congelado a -20ºC. Adicionalmente, se deberían adoptar etapas especiales para inactivar virus potenciales. Se debería llevar a cabo un método de inactivación que utiliza tri (n-butil) fosfato/Tween 80 o tri (n-butil) fosfato/Triton X-100 (método de disolvente/detergente) en todas las donaciones de plasma^{7,8}.
En la formulación en gel para cicatrizantes tópicos, la viscosidad puede encontrarse dentro del intervalo de 50 a 1.000 PaS (50.000 a 1.000.000 cps), más preferentemente, entre 100 y 650 PaS (100.000 y 650.000 cps). En la formulación en crema, la viscosidad puede estar dentro del intervalo de 60 a 80 PaS (60.000 a 80.000 cps). Todos los valores de viscosidad están expresados en centipoises (cps), medidos usando un viscosímetro de Brookfield. Los ensayos se llevaron a cabo a 0,5 rpm y a temperatura ambiente.
En una realización de la presente invención, la formulación en gel puede comprender 0,25 a 1,0% en peso de ácido poliacrílico con un peso molecular de aproximadamente 740.000 a 5.000.000. En una realización preferida, este ácido poliacrílico se encuentra presente en 0,35 a 0,7% en peso y tiene una viscosidad de aproximadamente 350.000 cps. El pH del ácido poliacrílico deberá encontrarse en el intervalo de 5 a 8 y, más preferentemente, entre 6,5 y 7,5.
El ácido poliacrílico se conoce habitualmente como Carbopol, y la categoría preferida es P-934.
En otra realización adicional, la formulación en gel puede comprender 18 a 35% en peso de copolímero de bloque de polioxietileno-polioxipropileno, con un peso molecular de aproximadamente 2.000 a 13.000. En una realización preferida, este copolímero de bloque de polioxietileno-polioxipropileno está presente en 18 a 25% en peso, y tiene una viscosidad de aproximadamente 450 PaS (450.000 cps) a temperatura ambiente. El pH del gel de copolímero en bloque deberá encontrarse en el intervalo de 6 a 8 y, más preferentemente, entre 6,5 y 7,5. Los copolímeros de bloque de polioxietileno-polioxipropileno se conocen habitualmente como Pluronic y la categoría preferida es P-127 (poloxámero 407).
En una realización adicional, la formulación en gel puede comprender 1 a 5% de derivado de celulosa, que puede ser hidroxipropilcelulosa (HPC), y tiene una viscosidad de aproximadamente 25 a 150 PaS (25.000 a 150.000 cps). La HPC tiene un peso molecular de aproximadamente 370.000 a 1.150.000. En una realización preferida, el derivado de celulosa está presente en 2,0 a 4,0% en peso y tiene una viscosidad de aproximadamente 150 PaS (150.000 cps) para HPC. Derivados de celulosa utilizados en la presente invención se conocen, habitualmente, como Klucel para HPC. La categoría preferida es Klucel-HP.
En una realización adicional, se prepara una formulación en crema a partir de una base de crema disponible en el comercio, es decir, base Schering®. Esta base de crema (emulsión de aceite en agua) contiene ceteth-20, alcohol estearílico, clorocresol, aceite mineral, fosfato sódico monobásico, ácido fosfórico, hidróxido sódico, agua y vaselina blanca. La viscosidad de la preparación se puede modificar variando el contenido en agua y polietilenglicol.
Las formulaciones de la presente invención contienen una fase acuosa en combinación con una proteína y, por consiguiente, son susceptibles a ataques por parte de bacterias y hongos. El crecimiento de microorganismos no sólo estropea la formulación, sino que constituye un riesgo potencial de toxicidad y una fuente de infecciones para el paciente. Aun cuando el crecimiento de microorganismos tiene menos probabilidades de ser peligroso cuando se produce en una preparación tópica, resulta especialmente importante preservar las composiciones tópicas que los pacientes se deben aplicar sobre la piel lesionada o inflamada. La degradación de la viscosidad, que se ha comunicado en algunos polímeros cuando están expuestos a contaminación microbiana, también es preocupante. De esta forma, se debe agregar a esta preparación un conservante para garantizar la esterilidad y estabilidad a largo plazo. La presente invención proporciona geles que comprenden un conservante seleccionado de fenol o de los compuestos de para-hidroxibenzoato. En una realización, la formulación en gel puede contener 0,1 a 0,2% en peso de clorocresol, un derivado de fenol, ó 0,01 a 0,3% en peso de p-hidroxibenzoato como metil- y propilparabeno. En otra realización, la formulación en crema contiene 0,1 a 0,2% en peso de clorocresol.
Se pueden agregar estabilizadores a la formulación para proporcionar composiciones estables de fibronectina. Pueden ayudar a conservar las actividades biológicas a largo plazo, y pueden mejorar la solubilidad en agua de fibronectina. Entre estos agentes, estabilizadores de elección son albúmina, disacáridos tales como sacarosa, y oligosacáridos cíclicos tales como ciclodextrinas. Estos agentes se pueden utilizar solos o en combinación. La albúmina humana es preferible en términos de antigenicidad y deberá estar exenta de contaminación microbiana. Las ciclodextrinas del grupo \beta (7 unidades de glucosa) son de elección y se prefiere la hidroxipropil-\beta-ciclodextrina. La formulación puede comprender 0,01 a 0,1% en peso de albúmina, preferentemente 0,01 a 0,05%; y/o 0,5 a 5,0% en peso de sacarosa, preferentemente 3,0 a 5,0%; y/o 1,0 a 10% en peso de hidroxipropil-\beta-ciclodextrina, preferentemente 2,0 a 5,0%.
Algunos autores han señalado que la actividad de las proteasas en determinadas heridas crónicas puede provocar la degradación de las proteínas de adhesión, evitando la adhesión celular necesaria para el cierre normal de la herida^{9}. Se han identificado metalo-proteasas y serin-proteasas en los fluidos de heridas crónicas^{9,10}, habiéndose informado de que la fibronectina es altamente sensible a la escisión por proteasas^{11}. La protección de la integridad de la fibronectina se puede lograr mediante la adición de inhibidores de proteasas a la forma de dosificación. La presente invención proporciona también formulaciones que pueden comprender un inhibidor de metalo-proteasas tales como EDTA y/o un inhibidor de serin-proteasas tal como aprotinina (Trasylol®, Miles), teniendo este objetivo como fin. En una realización, la forma de dosificación puede comprender 0,01 a 1,0% en peso de EDTA y/o 1,5 a 45,0 U Inh % en peso de aprotinina, en donde 1 U Inh = 26 unidades de inhibidor de calicreína.
Las formulaciones de la presente invención se pueden aplicar sobre el sitio de la herida por cualquier medio adecuado que asegure el recubrimiento total de la superficie de la herida. Por ejemplo, se pueden aplicar directamente sobre el sitio de la herida, o usarlas para recubrir las fibras de un vendaje de gasa absorbente, para formar un vendaje cicatrizante que se puede situar, entonces, sobre una herida.
Los siguientes Ejemplos pretenden ilustrar aspectos adicionales de la invención, y no se debe considerar que limitan su alcance en ningún caso.
Ejemplo 1 Aislamiento de fibronectina del plasma humano
1)
Una etapa de esterilización es obligatoria para todas las donaciones de plasma homólogo. Con el fin de inactivar potenciales virus, se utiliza un procedimiento de esterilización que utiliza el método de disolvente/detergente. Se agrega 1% de tri-(n-butil) fosfato (TNBP) y 1% de Triton X-100 al plasma durante 6 horas a 24ºC. Seguidamente, se agrega aceite de habas de soja al plasma y se mezcla durante al menos 30 minutos, para extraer el TNBP. El Triton residual se eliminará por diálisis. Esta primera etapa se obvia si se utiliza plasma autólogo.
2)
Se lava previamente, en primer lugar, una columna de gelatina-Sefarosa 4B con una solución de Tris-HCl, para equilibrar el gel.
3)
El plasma se diluye (1:1) con una solución de Tris-HCl y se bombea a través de la columna en presencia de fluoruro de fenilmetil-sulfonilo 0,001 M (PMSF) durante aproximadamente 15 horas a 4ºC.
4)
A continuación, la columna se lava tres veces para provocar la elución de las proteínas del plasma unidas de forma inespecífica del gel. Todas las etapas de lavado se llevan a cabo usando una solución de Tris-HCl a pH 7,5. Se agrega una solución de NaCl 1M a la segunda etapa de lavado para la elución de los contaminantes.
5)
La elución de fibronectina se lleva a cabo usando una solución de acetato sódico 0,1 M + KBr 1 M.
6)
Seguidamente, se efectúan dos etapas de diálisis para eliminar los contaminantes (Triton X-100, KBr, acetato sódico). Se llevan a cabo diálisis contra PBS y agua estéril, respectivamente.
7)
La solución se concentra por ultrafiltración bajo presión de nitrógeno.
8)
Se lleva a cabo una filtración de esterilización terminal, empleando un filtro de 0,22 \mum, para garantizar la esterilidad.
9)
Se toman muestras alícuotas de las fracciones y se congelan a -20ºC hasta su incorporación a la forma de dosificación tópica.
Ejemplo 2 Geles de ácido poliacrílico
Se prepararon geles de ácido poliacrílico (carbómeros) (Carbopol®, BF Goodrich). El carbómero (Carbopol) es un polímero derivado del ácido acrílico. Se trata de un polímero de alto peso molecular (740.000 a 5.000.000) que gelifica cuando se neutraliza con álcalis fuertes (NaOH) o aminas (trietanolamina). Forma geles a concentraciones relativamente bajas, de hasta 0,25%, y su viscosidad se reduce fuertemente por la adición de electrolitos.
La categoría preferida del ácido poliacrílico es Carbopol 934-P a concentraciones en el intervalo de 0,35 a 0,75% (en peso). Concentraciones menores son insuficientes para estimular la adherencia a la herida, y concentraciones mayores reducen la liberación de fibronectina desde el gel. La viscosidad de los geles de ácido poliacrílico es estable entre los pH 6 a 8, con un intervalo de pH preferido entre 6,5 y 7,5. La viscosidad se reduce en presencia de electrolitos fuertes.
Se preparó de la forma siguiente un gel de ácido poliacrílico que contiene (en peso) 0,2% de fibronectina, 0,375% de Carbopol 934-P, y 0,1% de clorocresol: se disolvió clorocresol (1,0 g) en agua desionizada caliente (65ºC) (95 ml), bajo agitación lenta. Cuando el clorocresol está completamente disuelto, la solución se enfría a temperatura ambiente, manteniendo la agitación. A continuación, se agregó Carbopol 934-P (3,75 g), dispersándolo lentamente sobre la superficie de la solución, y se mezcló con un agitador de tipo paleta durante aproximadamente 3 horas. Entonces, la dispersión se trató en autoclave para proporcionar una base de gel concentrada y estéril (3,75% en peso). Se filtró una solución madre de 2,2 mg/ml de fibronectina (90 ml) a través de un filtro de acetato de 0,22 \mum. Se agregó un promotor de polimerización, hidróxido sódico, a la solución de fibronectina, en una cantidad capaz de neutralizar una porción de 10 g de la dispersión de Carbopol al 3,75%, es decir, 1.250 \mul de NaOH 3 M. La solución madre de fibronectina y la dispersión de Carbopol se mezclaron en jeringuillas, teniendo cuidado para no introducir burbujas de aire y contaminación, en un ambiente aséptico tal como, por ejemplo, una campana de flujo laminar. Esta preparación proporciona un gel transparente y preservado (100 g) de fibronectina libre de microorganismos, con una viscosidad de aproximadamente 350 PaS (350.000 cps).
Esta formulación en gel se aplicó dos veces al día sobre úlceras de las piernas en un estudio piloto con seres humanos, y demostró una velocidad potenciada de cicatrización sin efectos adversos.
Ejemplo 3 Geles de copolímeros de bloque de polioxietileno-polioxipropileno
Se prepararon geles de copolímeros de bloque de polioxietileno-polioxipropileno (poloxámero) (Pluronic®, BASF Wyandotte). La categoría preferida de poloxámero es Pluronic P-127 a concentraciones en el intervalo de 10 a 25% (en peso). El poloxámero P-127 es un polímero de bajo peso molecular (2.000 a 13.000), que exhibe características de gelificación térmica. La gelificación tiene lugar cuando la concentración alcanza 18% de poloxámero. La viscosidad del poloxámero es proporcional a la concentración del polímero, tipo de polímero utilizado (peso molecular) y temperatura. Fluido a 4ºC, el polímero gelifica con el aumento de la temperatura, proporcionando altos valores de viscosidad a temperatura ambiente. En contraste con Carbopol, la adición de iones potencia la viscosidad de la
preparación.
Se ha informado de que la solución acuosa concentrada (20 a 30%) muestra un incremento llamativo de la viscosidad cuando se caliente desde 4ºC hasta la temperatura corporal. Adicionalmente, si se aumenta la potencia iónica de la solución, la viscosidad se incrementa más rápidamente con la elevación de la temperatura. Hay disponibles múltiples categorías, pero la categoría P-127 es la menos tóxica, y la gelificación puede producirse a concentraciones más bajas. Los geles de poloxámero preparados en esta invención son soluciones de baja viscosidad a 4ºC y gelifican rápidamente cuando se calientan a temperatura corporal.
Se preparó de la forma siguiente un gel de poloxámero que contiene (en peso) 0,2% de fibronectina y 20% de Pluronic P-127: se filtró una solución madre de 2,2 mg/ml de fibronectina (80 ml) a través de un filtro de acetato de 0,22 \mum. Se agregó Pluronic P-127 (20 g) a 80 ml de esta solución de fibronectina y se dejó disolver sin agitación, a 4ºC durante aproximadamente 3 días. La solución resultante (100 g) es muy similar a un líquido. La gelificación se produce de manera instantánea cuando la solución entra en contacto con la herida. También fue posible aplicar un proceso de filtración de esterilización, realizado a 4ºC, de la solución final, en caso de no poder obtener polvo de poloxámero estéril. La viscosidad varía desde valores indetectables a 4ºC hasta 450 PaS (450.000 cps) a temperatura ambiente.
Ejemplo 4 Geles de derivados de celulosa
Se prepararon geles de hidroxipropilcelulosa (HPC). Para ilustrar este tipo de formulaciones, se describe a continuación la preparación de un gel de HPC al 3%. La categoría preferida es Klucel-HF, en concentraciones en el intervalo de 3 a 4% (en peso).
Se preparó de la forma siguiente una formulación en gel que contiene (en peso) 0,1% de fibronectina, 3% de HPC y parabenos: se disolvieron metil-parabeno (0,05 g) y propil-parabeno (0,02 g) en agua desionizada caliente (94 ml). Se esterilizó polvo de HPC por medio de un proceso de esterilización con calor seco. Seguidamente, se dispersó la HPC (6 g) en esta solución y se mezcló con un agitador de tipo paleta durante aproximadamente 3 horas. Esto proporciona una base de gel concentrado estéril (6% en peso). Se filtró una solución madre de 2 mg/ml de fibronectina (50 ml) a través de un filtro de acetato de 0,22 \mum. A continuación, se agregó lentamente la solución de fibronectina (50 ml) a una porción (50 g) de esta base concentrada, utilizando el eje de baja velocidad del agitador. Esto proporciona un gel preservado (100 g) con una viscosidad de aproximadamente 150 PaS (150.000 cps).
Ejemplo 5 Formulación en crema
Se preparó de la forma siguiente una formulación en crema que contiene (en peso) 0,1% de fibronectina, base de crema estéril (base Schering®, Schering) y 0,1% de clorocresol: se filtró una solución madre de 2 mg/ml de fibronectina (150 ml) a través de un filtro de acetato de 0,22 \mum. A continuación, se agregó lentamente la solución de fibronectina (50 ml) a una porción (50 g) de la base de crema, usando el eje de baja velocidad de un agitador. Esto proporciona una crema preservada (100 g) con una viscosidad de aproximadamente 70 PaS (70.000 cps).
Ejemplo 6 Cinética de liberación de diferentes formas de dosificación tópicas
Se evaluó la eficacia de cada formulación tópica para liberar fibronectina, utilizando un sistema de celdillas de difusión in vitro. Todos los estudios de permeación se llevaron a cabo en muestras de piel desepitelizada de mama y abdomen, obtenidas de intervenciones quirúrgicas de reducción mamaria y lipectomía abdominal. Se tomó una sección de 8 \mum de la superficie epidérmica de la piel, utilizando un dermatomo (escala de corte 1/10.000) y se limpió cuidadosamente la cara dérmica de cualquier tejido y/o vasos sanguíneos subcutáneos adheridos. Se utilizó piel humana desepitelizada para reproducir las alteraciones patológicas que se dan en las úlceras venosas crónicas, en las que está ausente la capa epidérmica.
El sistema de celdillas de difusión seleccionado consistió en un receptor rígido que contiene la muestra de piel, con la cara desepitelizada orientada hacia arriba, en el compartimiento de donante, y la cara dérmica orientada hacia abajo, en el compartimiento del receptor. El compartimiento del receptor se conectó con un circuito de tampón circulante. La temperatura del tampón se mantuvo a 37ºC, en tanto que la superficie de la piel estuvo a aproximadamente 32ºC. Cada análisis se llevó a cabo sobre una muestra de piel de 0,64 cm^{2}, usando una parte alícuota de 100 \mul de muestra de la formulación tópica de fibronectina-I^{125}. Después del experimento, se retiró la piel de la celdilla de difusión, se lavó 10 veces con un volumen de 9 ml de agua por lavado, y se analizó su contenido en radiactividad en un contador de radiactividad gamma. La cantidad total absorbida (compartimiento del receptor dérmico), dividida por la dosis aplicada, dio como resultado la absorción porcentual.
Todas las formas de dosificación se prepararon en una solución libre de sales, ya que los valores de viscosidad podrían verse influidos por la presencia de electrolitos. Por ejemplo, los valores de viscosidad de los geles de carbómero se reducen en presencia de electrolitos fuertes, en contraste con los geles de poloxámero, que son más viscosos cuando se agregan electrolitos a la preparación.
Diversos autores han comparado estudios de absorción percutánea, utilizando técnicas in vitro e in vivo, para establecer la fiabilidad de los resultados obtenidos con el empleo de estos métodos^{13,14,15}. Estas comparaciones han demostrado claramente que los estudios in vitro son capaces de reflejar con precisión la situación en vivo. Análisis estadísticos aplicados a los experimentos de los presentes inventores han puesto de manifiesto un buen valor de correlación entre los estudios realizados con piel obtenida de diferentes orígenes. Estos datos han demostrado que el origen de la piel carece de efectos sobre los resultados.
Los estudios de absorción percutánea se efectúan, habitualmente, sobre piel intacta y están diseñados para evaluar la liberación de una sustancia desde un vehículo tópico, y su absorción a través de la importante barrera cutánea, es decir, el estrato córneo. En las úlceras cutáneas, el efecto barrera del estrato córneo está ausente. En esta situación patológica, solamente la difusión desde el vehículo dermatológico será un determinante relevante para la ulterior penetración del fármaco en la dermis.
El sistema de celdillas de difusión anteriormente descrito es un modelo in vitro adecuado para úlceras cutáneas.
Se obtuvieron datos cinéticos de la liberación de fibronectina desde distintas formas de dosificación a las 4, 12 y 24 horas. La Tabla 1 resume estos datos para t = 12 horas. El control consistió en fibronectina-I^{125} en solución salina tamponada con fosfato, a pH 7,4. Los liposomas utilizados en la formulación de Carbopol 934-P (1%) + liposomas (15%) (Lipogel) se prepararon a partir de Proliposomas (Prolipo 3090 SH®, Lucas Mayer, Francia). Los derivados de celulosa se identifican como CMC para carboximetilcelulosa sódica, y HPC para hidroxipropilcelulosa. Dermabase® (Borden, Ltee., Don Mills, Ontario, Canadá) y la base Schering® son bases de crema disponibles en el mercado y se diluyeron 1:1 para estos experimentos. El símbolo [ ] hace referencia a la concentración de los componentes, y "valores Abs", al porcentaje de fibronectina marcada radiactivamente hallado en la dermis tras un tiempo de exposición de 12 horas.
TABLA 1
1
La Figura 1 muestra el trazado de los datos cinéticos de tres formas de dosificación en gel y de la solución de control con respecto al tiempo. De este gráfico, se deduce que el proceso de absorción tiende a ser más importante entre los tiempos de 0 y 12 horas que entre los de 12 y 24 horas, lo que sugiere que dos aplicaciones diarias podrían liberar más fibronectina que el programa de una aplicación al día.
La Figura 2 muestra la absorción cutánea de fibronectina marcada radiactivamente a partir de diversas formas de dosificación y desde el control en el tiempo = 12 horas. Se utilizó el ensayo estadístico de Dunnett para identificar diferencias estadísticamente significativas entre Carbopol y otras formulaciones. Este ensayo ha evidenciado, asimismo, diferencias significativas entre Lipogel, Carbogly y Carbopol, resultados que se pueden correlacionar con los de eficacia obtenida durante los ensayos clínicos (véase el Ejemplo 8). La eficacia de la formulación de Carbopol es particularmente sorprendente, dado que Carbopol posee un grado mayor de viscosidad que muchas de las otras formulaciones estudiadas. También son dignas de destacar las diferencias de valor Abs entre las formulaciones de Carbopol y CMC, puesto que ambas comparten el mismo grado de viscosidad.
La Figura 4 demuestra que no siempre existe una relación clara entre viscosidad y absorción, cuando se consideran algunas de las preparaciones para las que se han determinado los valores de viscosidad. Por ejemplo, Dermabase, que tiene una viscosidad relativamente baja (119 PaS) (119.000 cps), en comparación con Carbopol (411 PaS) (411.000 cps), presenta una escasa capacidad de liberación (5,80%) comparada con Carbopol (13,40%).
Ejemplo 7 Estabilidad de la fibronectina en gel
Se evaluaron la actividad e integridad biológicas de la macroestructura de fibronectina en formulaciones en gel (Figura 3). Los ensayos se realizaron sobre una muestra de gel que contuvo (en peso) 0,2% de fibronectina, 0,375% de Carbopol P-934, y 0,1% de clorocresol. La muestra se había mantenido a 4ºC durante 32 semanas.
Se emplearon técnicas de electroforesis para determinar la integridad de la macroestructura de fibronectina en el gel. Después de disolver la muestra de gel en una solución de NaCl + Tris-HCl 1 M, a pH 7,4, se permitió su migración sobre un gel de acrilamida al 7,5%, de acuerdo con el método de Laemmli ("Denaturing (SDS) discontinuous gel electrophoresis: Laemmli gel method", páginas: 10.2.4 - 10.2.9., Current Protocols in Molecular Biology (1994). En comparación con una solución estándar recién preparada (columna 0), los resultados demostraron que cerca de 100% de la fibronectina se puede identificar en torno a la banda de 220.000 (columna B), lo que revela que, si se produce degradación, ésta es mínima.
La actividad biológica se evaluó usando el ensayo de cromatografía de afinidad. La fijación a gelatina es una de estas actividades biológicas que se pueden evaluar de manera relativamente sencilla. Después de disolver una muestra de gel en una solución de NaCl 1 M, se dispuso una cantidad conocida de esta solución viscosa en un tubo de Eppendorf, en presencia de gelatina Sefarosa 4B y, seguidamente, se centrifugó. El contenido se enjuagó, adicionalmente, con una solución recién preparada de NaCl 1 M, se centrifugó y se desechó el sobrenadante para eliminar contaminantes tales como Carbopol y clorocresol, procedentes de la disolución del gel. La fibronectina se eluyó de la gelatina-Sefarosa 4B usando una solución de KBr 1 M. La fracción recogida se dejó migrar sobre un gel de acrilamida al 7,5%, según el método de Laemmli. Seguidamente, se evaluó la banda con respecto a su contenido en fibronectina, utilizando un ensayo de escaneo por densitometría. También fue posible evaluar la muestra recogida por espectrofotometría, usando la densidad óptica a una longitud de onda \lambda = 280 nm.
En comparación con el gel de fibronectina recién preparado (columna 0), se puede ver que se recuperó una gran cantidad (80%) de fibronectina de la muestra de la formulación en gel (columna 8 meses), lo que indica que es posible conservar la actividad de fijación a gelatina de la glicoproteína durante el período prolongado de tiempo en esta forma de dosificación.
Ejemplo 8 Ensayos clínicos: tratamiento de úlceras crónicas de las piernas
Los presentes inventores han llevado a cabo cuatro ensayos clínicos (estudios piloto) para investigar la utilidad de diferentes formas de dosificación que contienen fibronectina plasmática humana exógena, en el tratamiento de úlceras venosas crónicas de las extremidades inferiores. En estos ensayos, se utilizó fibronectina plasmática autóloga, y se seleccionaron pacientes con úlceras resistentes a la terapia convencional durante, por lo menos, tres meses.
El objetivo específico del primer experimento fue determinar la eficacia de la fibronectina aplicada por vía tópica como promotor de la cicatrización. Se incluyeron en este estudio siete pacientes, a los que se solicitó que "inundaran" la zona de la herida con una solución de 1 mg/ml de fibronectina (al 0,1%) en PBS (solución salina tamponada con fosfato), dos veces al día. Después de dos meses de aplicación regular de esta solución, cinco de estos pacientes mostraron una reducción destacada del tamaño de su herida, específicamente una reducción de al menos 75% de la superficie integrada.
Se diseñó un segundo experimento para evaluar la eficacia de una forma de dosificación semisólida que contuvo 0,1% en peso de fibronectina, encapsulada en 15% de liposomas que, a su vez, se incorporaron a una formulación de Carbopol (al 1%) conocida como Lipogel. Se propuso la hipótesis de que si se podía prolongar el tiempo de contacto de la glicoproteína con la herida, se podría observar, en teoría, una disminución más rápida del tiempo de cicatrización. Se incluyeron seis pacientes en este estudio, que debían aplicar la formulación sobre su herida dos veces al día. Ninguno de ellos exhibió un descenso sustancial del tamaño de la herida durante los tres meses siguientes de tratamiento regular.
En un intento de mejorar la forma de dosificación, se emprendió un experimento para evaluar el potencial terapéutico de una formulación en gel tópica que contenía (en peso) 0,2% de fibronectina, incorporada a 0,375% de Carbopol y 10% de glicerol (Carbogly). Se había agregado glicerol a la formulación para aprovechar su efecto humectante, que podría resultar beneficioso para la herida. Se reclutaron once pacientes para este estudio, en el que debían aplicarse el gel dos veces al día. Entre estos pacientes, 27% experimentó una regresión superior a 50% del tamaño de su herida, después de tres meses de tratamiento.
Los resultados de los estudios de permeación pueden explican, al menos en parte, lo que pudo haber ocurrido en experimentos anteriores. La Figura 2 muestra que preparaciones tales como Lipogel y Carbopol + glicerol no dan lugar a valores elevados de absorción. Por el contrario, Carbopol al 0,375%, sin glicerol, proporciona valores de absorción significativamente más elevados (p<0,001). La solución utilizada en el primer experimento se identifica como control en este gráfico. Esta última preparación ofrece la máxima capacidad de liberación, pero no representa una formulación que pueda ser útil para los pacientes debido a su consistencia líquida.
Teniendo en consideración estos resultados, se investigó una formulación que contenía 0,2% (en peso) de fibronectina en 0,375% de Carbopol, sin glicerol. De acuerdo con estudios clínicos y de permeación, esta formulación es el vehículo preferido que utiliza Carbopol, disponible para el uso de fibronectina en la cicatrización tópica. Datos preliminares demostraron que 50% de los pacientes estudiados exhibieron una regresión superior a 50% del tamaño de su herida dentro de los tres meses de tratamiento, incluidas dos respuestas completas (curación de 100%), que se produjeron dentro de las primeras ocho semanas de tratamiento. La presente invención proporciona también otras formulaciones que son útiles como ésta, empleando el estudio de permeación descrito en el Ejemplo 5 como sistema de modelo para estudiar las diferentes formulaciones.
Ejemplo 9 Informes de casos
Para ilustrar la eficacia de la formulación que contiene fibronectina y Carbopol 934-P, 0,375% (en peso), los presentes inventores exponen dos casos específicos de úlceras venosas crónicas de las piernas. Estos casos son interesantes porque el primero de ellos fue extremadamente resistente a la terapia convencional, y el segundo consistió en una úlcera extensa. Varios autores han puesto de manifiesto que factores tales como la duración y el tamaño de la superficie juegan un papel importante en el pronóstico de las úlceras venosas.
Caso 1
Mujer de 37 años de edad, con una historia de diez años de duración de úlceras venosas crónicas en la extremidad inferior derecha. Sus antecedentes clínicos carecieron de relevancia, excepto cuatro episodios de flebitis. El último episodio se produjo durante la gestación y dio como resultado último una úlcera. El análisis de los tratamientos médicos ensayados reveló el uso de antisépticos tópicos, medias elásticas, e injerto de piel, sin resultados positivos.
La paciente se presentó en la clínica de los presentes inventores con una herida dolorosa de 1,60 cm^{2}. Pese al hecho de que la úlcera era relativamente pequeña, parecía ser altamente resistente a la terapia. Seis semanas después de iniciar la aplicación del gel de fibronectina, se pudo observar una reducción de 92% del tamaño de la herida. Se registró una completa reepitelización después de diez semanas de tratamiento. En una visita de seguimiento, programada para un mes más tarde, no se observó deterioro alguno del estado de la herida.
Caso 2
Varón de 39 años de edad, con una historia de siete meses de duración de úlcera venosa crónica en la pierna izquierda. Sus antecedentes clínicos carecieron de importancia, excepto una safenectomía de la pierna inferior izquierda doce años antes. Se prescribieron al paciente antibióticos tópicos sin ningún efecto sobre el tamaño de la herida.
Se presentó en la clínica de los inventores con una úlcera de 10,5 cm^{2}, consecuencia de un traumatismo local. El edema linfático de la pierna inferior izquierda era importante, y la herida estaba rodeada por una extensa capa necrótica con costra. El trabajo del paciente le obligaba a permanecer de pie durante largos períodos de tiempo. Aun cuando es probable que esta situación agravara el estado de la herida, no era posible cambiarla.
Después de cuatro semanas de aplicación regular de un gel de placebo y solución salina normal, el tamaño de la herida aumentó a 21,5 cm^{2} como consecuencia del desbridamiento local. El gel de placebo comprendió 0,375% de Carbopol P-934, 0,1% de clorocresol, agua purificada y NaOH para ajustar el pH. En ese momento, se inició el tratamiento activo con una formulación en gel de Carbopol que contenía fibronectina. Seis semanas más tarde, se registró el tamaño máximo de la herida (37,5 cm^{2}), revelando una úlcera mayor que la inicialmente considerada. El proceso de cicatrización tuvo lugar entre seis y ocho semanas, y se completó después de 31 semanas de tratamiento activo. En una visita de seguimiento, programada para un mes después, no se observó deterioro alguno del estado de su herida.
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16 - Documento EP-A-179.477
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18 - Documento US 4.837.019

Claims (24)

1. Formulación en gel acuoso para la cicatrización de heridas crónicas, que comprende:
(a) una cantidad cicatrizante eficaz de fibronectina plasmática humana, a una concentración en el intervalo de 0,05 a 0,5% en peso, basada en el peso de la formulación completa;
(b) un polímero hidrosoluble, farmacéuticamente aceptable, con una viscosidad de 50 a 1.000 Pa\cdots (50.000 a 1.000.000 cps) a temperatura ambiente; y
(c) una cantidad eficaz de un conservante.
2. La formulación en gel acuoso de la reivindicación 1, en la que el conservante se selecciona del grupo consistente en clorocresol y una combinación de compuestos de p-hidroxibenzoato (parabenos).
3. La formulación en gel acuoso de la reivindicación 2, en la que el clorocresol está presente en una cantidad dentro del intervalo de 0,1 a 0,2% en peso, y el p-hidroxibenzoato está presente en una cantidad dentro del intervalo de 0,01 a 0,3% en peso, basada sobre el peso de la composición completa.
4. La formulación en gel acuoso de la reivindicación 1, en la que la fibronectina plasmática humana se obtiene a partir de sangre humana autóloga, homóloga, o por tecnología de ADN recombinante.
5. La formulación en gel acuoso de la reivindicación 1, en la que el polímero se selecciona del grupo consistente en un polímero de vinilo, un copolímero de bloque de polioxietileno-polioxipropileno, y un derivado de celulosa.
6. La formulación en gel acuoso de la reivindicación 5, en la que el polímero de vinilo es un ácido poliacrílico.
7. La formulación en gel acuoso de la reivindicación 6, en la que el ácido poliacrílico tiene un peso molecular de 740.000 a 5.000.000, y se encuentra presente en una cantidad en el intervalo de 0,25 - 1,0% en peso, basada sobre el peso de la composición completa.
8. La formulación en gel acuoso de la reivindicación 5, en la que el copolímero de bloque de polioxietileno-polioxipropileno tiene un peso molecular de 2.000 a 13.000, y se encuentra presente en una cantidad en el intervalo de 18 a 35% en peso, basada sobre el peso de la composición completa.
9. La formulación en gel acuoso de la reivindicación 5, en la que el derivado de celulosa es hidroxipropilcelulosa (HPC).
10. La formulación en gel acuoso de la reivindicación 5, en la que la hidroxipropilcelulosa tiene un peso molecular de 370.000 a 1.150.000, y se encuentra presente en una cantidad en el intervalo de 1 a 5% en peso, basada sobre el peso de la composición completa.
11. La formulación en gel acuoso de la reivindicación 5, que comprende, opcionalmente, al menos un ingrediente adicional seleccionado del grupo consistente en estabilizadores e inhibidores de proteasa.
12. La formulación en gel acuoso de la reivindicación 11, en la que el estabilizador es albúmina, un disacárido, o un oligosacárido cíclico, o una combinación de los mismos.
13. La formulación en gel acuoso de la reivindicación 12, en la que la albúmina se encuentra presente en una cantidad en el intervalo de 0,01 a 0,1% en peso, el disacárido es sacarosa, que se encuentra presente en una cantidad en el intervalo de 0,5 a 5,0% en peso, y el oligosacárido cíclico es hidroxipropil-beta-ciclodextrina, que se encuentra presente en una cantidad en el intervalo de 1,0 a 10,0% en peso, estando basados todos los porcentajes en peso sobre el peso de la composición completa.
14. La formulación en gel acuoso de la reivindicación 11, en la que el inhibidor de proteasa es un inhibidor de serin-proteasa, o un inhibidor de metalo-proteasa.
15. La formulación en gel acuoso de la reivindicación 14, en la que el inhibidor de serin-proteasa es 1,5 a 45 U inh % en peso de aprotinina, o el inhibidor de metalo-proteasa es 0,01 a 1% en peso de ADTA, o una combinación de los mismos.
16. Una formulación en crema para la cicatrización de heridas crónicas, que comprende:
(a) una cantidad cicatrizante eficaz de fibronectina plasmática humana, a una concentración dentro del intervalo de 0,05 a 0,5% en peso, basada sobre el peso de la formulación completa;
(b) una base de crema con una viscosidad de 60 a 80 PaS (60.000 a 80.000 cps) a temperatura ambiente; y
(c) una cantidad eficaz de un conservante.
17. La formulación en crema de la reivindicación 16, en la que la base de crema comprende ceteth 20, alcohol estearílico, clorocresol, aceite mineral, fosfato sódico monobásico, ácido fosfórico, hidróxido sódico, agua, y vaselina blanca.
18. La formulación en crema de la reivindicación 16, en la que la fibronectina plasmática humana se obtiene a partir de sangre humana autóloga, homóloga, o por tecnología de ADN recombinante.
19. La formulación en crema de la reivindicación 16, en la que el conservante es clorocresol, que se encuentra presente en una cantidad en el intervalo de 0,1 a 0,2% en peso, basada sobre el peso de la composición completa.
20. La formulación en crema de la reivindicación 16, que comprende, opcionalmente, al menos un ingrediente adicional seleccionado del grupo consistente en estabilizadores e inhibidores de proteasa.
21. La formulación en crema de la reivindicación 20, en la que el estabilizador es albúmina, un disacárido, o un oligosacárido cíclico, o una combinación de los mismos.
22. La formulación en crema de la reivindicación 21, en la que la albúmina se encuentra presente en una cantidad en el intervalo de 0,01 a 0,1% en peso, el disacárido es sacarosa, que se encuentra presente en una cantidad en el intervalo de 0,5 a 5,0% en peso, y el oligosacárido cíclico es hidroxipropil-beta-ciclodextrina, que se encuentra presente en una cantidad en el intervalo de 1,0 a 10,0% en peso, estando basados todos los porcentajes en peso sobre el peso de la composición completa.
23. La formulación en crema de la reivindicación 20, en la que el inhibidor de proteasa es un inhibidor de serin-proteasa, o un inhibidor de metalo-proteasa.
24. La formulación en crema de la reivindicación 23, en la que el inhibidor de proteasa es 1,5 a 45 U inh % en peso de aprotinina, 0,01 a 1% en peso de EDTA, o una combinación de los mismos, estando basados todos los porcentajes en peso sobre el peso de la composición completa.
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