DE69634430T2

DE69634430T2 - Formulierung fur die wundheilung mit menschlichem plasma fibronektin

Info

Publication number: DE69634430T2
Application number: DE69634430T
Authority: DE
Inventors: Andre Beaulieu
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-06
Publication date: 2006-01-05
Anticipated expiration: 2016-06-07
Also published as: ES2236733T3; EP0784481A1; WO1996040221A1; EP1563844A2; EP1563844A3; PT784481E; US5641483A; DE69634430D1; CA2197244A1; ATE290397T1; EP0784481B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft topische Dosierungsformen mit einem Gehalt an Humanplasmafibronektin zur Verwendung bei der Förderung der Wundheilung beim Menschen. Insbesondere betrifft die Erfindung die Heilung von chronischen venösen Geschwüren.
Hintergrund der Erfindung
Fibronektin ist ein großes Glycoprotein mit einem Kohlenhydratanteil von etwa 5%. Die charakteristische Form von Plasmafibronektin ist ein disulfidgebundenes Dimeres mit 440 000 Dalton, wobei jede Untereinheit ein Molekulargewicht von etwa 220 000 Dalton aufweist. Fibronektin tritt normalerweise im Plasma in einer Konzentration von etwa 300 μg/ml auf und wird nach einem von Hynes¹ beschriebenen Verfahren extrahiert und gereinigt. Plasmafibronektin ist auch unter verschiedenen anderen Bezeichnungen bekannt, einschließlich in der Kälte unlösliches Globulin, Antigelatinefaktor, Zellhaftprotein, Zellausbreitungsfaktor und opsonisches α2-Oberflächenbindungsglycoprotein. Diese Bezeichnungen spiegeln die biologischen Aktivitäten von Fibronektin wieder, wie eine Zellrekrutierung, Opsonisierung von teilchenförmigen Bruchstücken und Förderung der Wundkontraktion. Übersichtsartikel über die Struktur und die Aktivitäten von Fibronektin wurden veröffentlicht^2,3.
Die Wundheilung ist üblicherweise in drei Phasen unterteilt. Die entzündliche Phase, die proliferative Phase und die Remodellierungsphase. Es wurde berichtet, dass Fibronektin bei jeder Stufe des Wundheilungsvorgangs beteiligt ist, indem es insbesondere ein Gerüst erzeugt, an dem eindringende Zellen haften können. Zunächst werden zahlreiche Mediatoren, wie Fibronektin und Fibrinogen, an die Stelle der Wunde abgegeben. Fibronektin fördert die Wanderung von entzündlichen Zellen in die Wunde und die Phagozytose von Bruchstücken durch die Monozyten. Anschließend finden eine Angiogenese und eine Reepithelisierung statt. In diesem Stadium übt Fibronektin eine chemotaktische Aktivität auf Endothelzellen aus und fördert die Wanderung von Epithelzellen und Fibroblasten zur Basalmembran. Fibronektin stellt offensichtlich auch eine wesentliche Komponente der Remodellierungsphase dar, wo es eine Hauptrolle bei der Organisation von Kollagenfibrillen spielt. Das fibrilläre Kollagen bildet letztlich Faserbündel, die die Zugfestigkeit des Gewebes stark erhöhen und somit zu einem Wundverschluss führen.
Es wurde berichtet, dass topisch aufgebrachtes Plasmafibronektin in wertvoller Weise die Geschwindigkeit der Wundheilung, z. B. bei Hornhautwunden^4,5,16,17, Beingeschwüren⁶ und Haut mit Sonnenbrand¹⁸, steigert. Bisher wurde aber noch kein geeigneter topischer Träger zur Verwendung bei der Behandlung von Wunden beschrieben, der die Abgabe einer wirksamen Menge an Fibronektin gewährleisten kann. Ein wichtiger Faktor, der die Entwicklung einer wirksamen topischen Dosierungsform eines Arzneistoffes beschränkt, besteht nicht nur in der Verfügbarkeit eines Wirkstoffes, sondern auch in der Verfügbarkeit einer Zubereitung, die die Passage des Wirkstoffs aus dem Träger (Creme, Salbe, Gel und dergl.) zur Abgabestelle (wobei es sich im erfindungsgemäßen Fall um eine Hautwunde handelt) ermöglicht. Wirkstoffe von sehr hoher Aktivität, wie Wachstumsfaktoren, können therapeutisch wertlos sein, wenn die topische Zubereitung es nicht ermöglicht, den Arzneistoff aus dem halbfesten Träger zur Wunde zu transportieren. Daher ist es hochgradig erstrebenswert, eine Zubereitung zu entwickeln, die die Kontaktzeit des Fibronektins mit der Wunde auf ein Maximum ausdehnt und auch die Freisetzung des Fibronektins an der Wunde steuert, wodurch sich hohe Resorptionswerte ergeben. Erfindungsgemäß wird ein derartiges Abgabesystem in Form eines wässriges Gels und einer Creme bereitgestellt.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Erfindungsgemäß wird eine wässrige Gelformulierung zum Heilen von chronischen Wunden bereitgestellt, die folgendes enthält:

(a) eine wirksame wundheilende Menge eines Humanplasmafibronektins in einer Konzentration im Bereich von 0,05 bis 0,5 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht der gesamten Formulierung,
(b) ein wasserlösliches, pharmazeutisch annehmbares Polymer mit einer Viskosität von 50 bis 1000 Pa·s (50 000 bis 1 000 000 cP) bei Raumtemperatur und
(c) eine wirksame Menge eines Konservierungsstoffes.

Ferner wird erfindungsgemäß eine Cremeformulierung zum Heilen von chronischen Wunden bereitgestellt, die folgendes enthält:

(a) eine effektive wundheilende Menge von Humanplasmafibronektin in einer Konzentration im Bereich von 0,05 bis 0,5 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht der gesamten Formulierung,
(b) eine Cremebasis mit einer Viskosität von 60 bis 80 Pa·s (60 000 bis 80 000 cP) bei Raumtemperatur und
(c) eine wirksame Menge eines Konservierungsstoffes.

Die Gelformulierung enthält ein wasserlösliches, pharmazeutisch verträgliches Polymer, das unter Verwendung einer wirksamen Menge an Fibronektin zubereitet wird. Zu Beispielen für derartige Verbindungen gehören: Vinylpolymere, z. B. Polyacrylsäure; Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolymere, z. B. Poloxamer; und Cellulosederivate, z. B. Hydroxypropylcellulose (HPC). Das Polymere ergibt Viskositätswerte von 50 bis 1 000 PaS (50 000 bis 1 000 000 cps) bei Raumtemperatur. Die Cremezubereitung wird aus einer handelsüblichen Cremegrundlage, d. h. Schering^R-Grundlage (Schering Canada Inc., Point-Claire, Quebec), die bei Raumtemperatur Viskositätswerte von 60 bis 80 PaS (60 000 bis 80 000 cps) aufweist, hergestellt.
Diesen Dosierungsformen werden zahlreiche Vorteile zugeschrieben. Erfindungsgemäße Gel- und Cremeformulierungen setzen wirksame Mengen eines Wundheilungs-Förderungsmittels frei. Zu weiteren Vorteilen für Gelformulierungen gehören: die Fähigkeit, die Wunde feucht zu halten (was sich aus dem hohen Wassergehalt der Gele ergibt), und die Einfachheit des Auftragens und Entfernens (durch Waschen) von der Wunde. Sie führen auch zu einem Kältegefühl beim topischen Auftragen, was für den Patienten angenehm sein kann.
Das langsame Freisetzungssystem der erfindungsgemäßen Gelformulierungen sorgt für eine verlängerte Freisetzungszeit von Fibronektin an der Wundstelle. Diese Eigenschaft dieser Formulierungen lässt ein weniger häufiges Auftragen auf die Wunde zu, was zu geringeren Störungen beim Heilungsvorgang führt. Derartige Formulierungen halten eine Abgabe von Fibronektin für bis zu 24 Stunden aufrecht. Jedoch stellt gemäß kinetischen Daten, die aus Permeationsstudien gewonnen wurden, ein therapeutisches Verabreichungsschema "2-mal täglich" eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar.
Eine Formulierung von topischen Dosierungsformen, die für die Einverleibung von Fibronektin vorgesehen ist, soll verschiedene Qualitätskriterien erfüllen. Sämtliche Komponenten der Zubereitung, einschließlich Lösungsmittel, gelbildendes Mittel und Konservierungsmittel sollen für die Wunde nicht-toxisch und mit dem Arzneistoff verträglich sein. Das Endprodukt soll eine optimale Freisetzung des Arzneistoffes an seine Wirkungsstelle fördern, von geeigneter Konsistenz sein, um die Kontaktzeit des Arzneistoffes mit der Wunde zu verlängern, sowie von steriler Beschaffenheit sein.
Die bevorzugten Formulierungen können mit den Ergebnissen der Bewertung der Formulierungen unter Verwendung eines in vitro-Diffusionszellensystems korreliert werden, das aus einem starren Rezeptor besteht, der eine deepithelisierte Hautprobe enthält, wobei die deepithelisierte Seite nach oben einem Donator-Abteil zugewandt ist und die dermale Seite nach unten einem Rezeptor-Abteil zugewandt ist. Das Rezeptor-Abteil ist mit einem Zirkulationspuffer-Kreislauf verbunden, wobei die Puffertemperatur auf 37°C gehalten wird, während die Hautoberfläche eine Temperatur von etwa 32°C aufweist.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt die kumulative Absorption von radioaktiv markiertem Fibronektin im zeitlichen Verlauf aus verschiedenen Gelformulierungen mit einem Gehalt an Carbopol P-934 (0,375%), Pluronic F-127 (20,0%), Natriumcarboxymethylcellulose (CMC 3,0%) und aus der Kontrolle (phosphatgepufferte Kochsalzlösung).
2 zeigt die kutane Absorption von radioaktiv markiertem Fibronektin aus verschiedenen Dosierungsformen und aus der Kontrolle (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) nach 12 Stunden.
3 zeigt die Elektrophorese von Humanplasma-FN bei Einverleibung in ein Carbopol-Gel (Carbopol P-934, 0,375% + Chlorcresol 0,1%) nach 0, 2, 6 und 8 Monaten. Abschnitt A: Gewinnung von FN nach einem Gelatine-Bindungstest. Abschnitt B: Integrität von FN nach 240-tägiger Lagerung im Gel bei 4°C. Es ist darauf hinzuweisen, dass im Abschnitt B die Auflösung der Bande durch die Anwesenheit von Verunreinigungen, wie Carbopol, in der Probe beeinträchtigt ist.
4 zeigt ein Diagramm der dermalen Absorption gegen die Viskosität von verschiedenen topischen Zubereitungen.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt gemäß der Definition in den Ansprüchen Dosierungsformen bereit, die speziell für die therapeutische Verwendung von Fibronektin als topisches Wundheilungsförderungsmittel formuliert sind. Die für topische Anwendungen ausgewählten Dosierungsformen sollen idealerweise große Mengen an Fibronektin freisetzen, eine sterile Beschaffenheit aufweisen und für die Wunde nichttoxisch sein. Mehrere Faktoren, wie physikochemische Eigenschaften des Glycoproteins sowie klinische Anwendungskriterien, müssen bei der Zubereitung dieser Formulierungen berücksichtigt werden.
Unter diesen Einschränkungen betrifft die wichtigste Einschränkung die Löslichkeit von Fibronektin in Wasser, die gering ist und somit der Herstellung von konzentrierten Gelen oder Cremes entgegensteht. Fibronektin ist in Wasser nur wenig löslich und kann in Konzentrationen von nur 5 mg/ml in wässriger Lösung ausfallen. Seine Löslichkeit wird auch durch pH-Änderungen und niedrige Temperaturen beeinflusst. Gleichermaßen lassen sich Formulierungen, bei denen eine Verteilung des Polymerpulvers in der Fibronektinlösung unter Bewegen erforderlich ist, nicht leicht herstellen, da es zu einer Ausfällung des Glycoproteins kommen kann. Unter Bewegen kann Fibronektin einer Aggregation unterliegen und lange Matten von unlöslichem Material bilden. Die Viskosität muss optimal sein, um ein ausreichendes Haften an der Wunde sowie gute Freisetzungseigenschaften zu ermöglichen.
Temperaturen über 60°C, die häufig zur Bereitstellung steriler Präparate erforderlich sind, bewirken eine Denaturierung von Fibronektin. Da am Endprodukt kein endgültiger Sterilisationsvorgang vorgenommen werden kann, ist die Herstellung von konzentrierten Trägergrundlagen ohne Fibronektin im allgemeinen unvermeidlich. Portionen dieser sterilen Grundlagen werden sodann mit einer definierten Menge einer Fibronektinlösung verdünnt. Um eine angemessene Verteilung von Fibronektin in halbfesten Dosierungsformen zu erzielen, ist häufig eine Einverleibungsstufe unter Bewegen erforderlich, was zu einer Ausfällung des Arzneistoffes führen kann.
Gelbildende Mittel, wie Carbopol und Poloxamer sind zur Umgehung dieses Problems geeignet, da sie vor der Gelbildung in einer flüssigkeitsähnlichen, viskosen Form sterilisiert werden. Ein hochgradig konzentriertes Präparat von Carbopol wird hergestellt und autoklavisiert. Wie nachstehend beschrieben, wird sodann die Lösung von Fibronektin, die auch den Polymerisationspromotor (NaOH) enthält, in Spritzen mit der Carbopol-Grundlage vermischt, wobei das Gel während der Verteilung des Arzneistoffes im Gel aufgebaut wird. Im Fall von Poloxamer wird das Polymere zu der Arzneistofflösung gegeben und bei 4°C, einer Temperatur, bei der es sein flüssigkeitsähnliches Aussehen behält, in Lösung gebracht. Eine Sterilisation dieser Lösung zur Entfernung von Bakterien wird bei 4°C unter Verwendung eines 0,22 μm-Filters durchgeführt.
Ein nicht-toxisches, nicht-sensibilisierendes Konservierungsmittel, das mit den Formulierungskomponenten verträglich ist, wird in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung der Dosierungsform zugesetzt. Alle vorgenannten Bedingungen werden in den bevorzugten Dosierungsformen, die nachstehend ausführlich beschrieben werden, berücksichtigt.
Eine wirksame, wundheilende Menge von Humanplasmafibronektin zur erfindungsgemäßen Verwendung liegt im Bereich von 0,05 bis 0,5 Gew.-% und insbesondere von 0,3 bis 0,4%. Fibronektin wird aus Humanplasma unter Anwendung eines Gelatine-Sepharose-Affinitätschromatographieverfahrens isoliert. Bei diesem Verfahren wird Gelatine nach CNBr-Aktivierung kovalent an Sepharose 4B gekuppelt. Die von diesem System bereitgestellte Bindungskapazität für Humanplasmafibronektin ist > 1 mg/ml Gel.
Autologes, homologes Humanplasmafibronektin oder Fibronektin, das durch rekombinante DNA-Technik erhalten worden ist, kann erfindungsgemäß verwendet werden^1,7. Bei Verwendung von homologen Plasmafibronektin müssen Chargen, die aus Material von verschiedenen Spendern hergestellt worden sind, auf atypische Antikörper, Hepatitis B (HBV), Hepatitis C (HCV), humanes Immunschwächevirus (HIV), humanes lymphotrophes T-Zellenvirus (HTLV), Zytomegalovirus (CMV) und Syphilis getestet werden. Diese Tests müssen an den Spendern unmittelbar vor der Spende und 6 Monate später vorgenommen werden. In der Zwischenzeit muss das Spenderplasma eingefroren bei –20°C gehalten werden. Ferner sind spezielle Schritte zu ergreifen, um mögliche Viren zu inaktivieren. Ein inaktiviertes Verfahren unter Verwendung von Tri-(n-butyl)-phosphat/Tween-80 oder Tri-(n-butyl)-phosphat/Triton X-100 (Lösungsmittel/Detergens-Verfahren) soll bei allen Plasmaspenden durchgeführt werden^7,8.
In der Gelformulierung für die topische Wundheilung kann die Viskosität im Bereich von 50 bis 1 000 PaS (50 000 bis 1 000 000 cps) und vorzugsweise von 100 bis 650 PaS (100 000 bis 650 000 cps) liegen. In der Cremeformulierung kann die Viskosität im Bereich von 60 bis 80 PaS (60 000 bis 80 000 cps) liegen. Sämtliche Viskositätswerte werden in Centipoises (cps) bei Messung mit einem Brookfield-Viskosimeter angegeben. Die Tests wurden bei 0,5 U/min und Raumtemperatur durchgeführt.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform kann die Gelzubereitung 0,25 bis 1,0 Gew.-% Polyacrylsäure mit einem Molekulargewicht von etwa 740 000 bis 5 000 000 enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Polyacrylsäure in einem Anteil von 0,35 bis 0,75 Gew.-% vorhanden und weist eine Viskosität von etwa 350 000 cps auf. Der pH-Wert des Polyacrylsäuregels soll im Bereich von 5 bis 8 und vorzugsweise von 6,5 bis 7,5 liegen. Polyacrylsäure ist unter der Bezeichnung Carbopol allgemein bekannt. Bei einer bevorzugten Qualität handelt es sich um P-934.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann die Gelformulierung 18 bis 35 Gew.-% eines Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolymeren mit einem Molekulargewicht von etwa 2 000 bis 13 000 enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolymere in einem Anteil von 18 bis 25 Gew.-% vorhanden und weist bei Raumtemperatur eine Viskosität von etwa 450 PaS (450 000 cps) auf. Der pH-Wert des Blockcopolymergels soll im Bereich von 6 bis 8 und vorzugsweise von 6,5 bis 7,5 liegen. Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolymere sind allgemein unter der Bezeichnung Pluronic bekannt. Bei einer bevorzugten Qualität handelt es sich um F-127 (Poloxamer 407).
Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann die Gelformulierung 1 bis 5% eines Cellulosederivats enthalten, bei dem es sich um Hydroxypropylcellulose (HPC) mit einer Viskosität von etwa 25 bis 150 PaS (25 000 bis 150 000 cps) handeln kann. HPC weist ein Molekulargewicht von etwa 370 000 bis 1 150 000 auf. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Cellulosederivat in einem Anteil von 2,0 bis 4,0 Gew.-% vorhanden und weist eine Viskosität von etwa 150 PaS (150 000 cps) für HPC auf. Erfindungsgemäß verwendete Cellulosederivate sind im Fall von HPC als Klucel allgemein bekannt. Bei einer bevorzugten Qualität handelt es sich um Klucel-HF.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird eine Cremeformulierung aus einer handelsüblichen Cremegrundlage, d. h. Schering^R-Grundlage, hergestellt. Diese Cremegrundlage (Öl-in-Wasser-Emulsion) enthält Ceteth-20, Cetostearylalkohol, Chlorcresol, Mineralöl, monobasisches Natriumphosphat, Phosphorsäure, Natriumhydroxid, Wasser und weißes Petrolatum. Die Viskosität der Zubereitung kann modifiziert werden, indem man den Anteil an Wasser und Polyethylenglykol variiert.
Erfindungsgemäße Formulierungen enthalten eine wässrige Phase in Kombination mit einem Protein und sind somit gegenüber einem Befall durch Bakterien und Pilze anfällig. Ein mikrobielles Wachstum führt nicht nur zu einem Verderb der Zubereitung, sondern stellt auch eine mögliche Toxizitätsgefahr und eine Infektionsquelle für Patienten dar. Obgleich ein derartiges mikrobielles Wachstum beim Auftritt in einer topischen Zubereitung wahrscheinlich weniger gefährlich ist, ist es besonders wichtig, topische Produkte zu konservieren, die die Patienten auf zerstörte oder entzündete Haus aufbringen müssen. Der bei einigen Polymeren festgestellte Viskositätsabbau bei Einwirkung einer mikrobiellen Verunreinigung ist ebenfalls zu bedenken. Somit sollte der Zubereitung ein Konservierungsmittel zugesetzt werden, um eine sterile und stabile Beschaffenheit für eine lange Zeitspanne zu garantieren. Die vorliegende Erfindung stellt Gele bereit, die ein Konservierungsmittel enthalten, das unter Phenol- oder p-Hydroxybenzoatverbindungen ausgewählt ist. In einer Ausführungsform kann die Gelformulierung 0,1 bis 0,2 Gew.-% Chlorcresol, ein Phenolderivat, oder 0,01 bis 0,3 Gew.-% p-Hydroxybenzoat in Form von Methyl- und Propylparaben enthalten. Gemäß einer weiteren Ausführungsform enthält die Cremezubereitung 0,1 bis 0,2 Gew.-% Chlorcresol.
Stabilisatoren können der Formulierung zugesetzt werden, um zu stabilen Fibronektin-Zusammensetzungen zu gelangen. Sie können die Konservierung biologischer Aktivitäten auf Langzeitbasis unterstützen und die Wasserlöslichkeit von Fibronektin verbessern. Unter diesen Mitteln stellen Albumin, Disaccharide, wie Saccharose, und cyclische Oligosaccharide, wie Cyclodextrine, die Stabilisatoren der Wahl dar. Diese Mittel können allein oder in Kombination miteinander verwendet werden. Humanes Albumin wird in Bezug auf seine antigene Beschaffenheit bevorzugt und soll frei von mikrobiellen Verunreinigungen sein. Cyclodextrine der β-Gruppe (7 Glucoseeinheiten) stellen ebenfalls Mittel der Wahl dar, wobei Hydroxypropyl-β-cyclodextrin bevorzugt wird. Die Formulierung kann 0,01 bis 0,1 Gew.-% und vorzugsweise 0,01 bis 0,05 Gew.-% Albumin enthalten; und/oder 0,5 bis 5,0 Gew.-% und vorzugsweise 3,0 bis 5,0 Gew.-% Saccharose; und/oder 1,0 bis 10 Gew.-% und vorzugsweise 2,0 bis 5,0% Hydroxypropyl-β-cyclodextrin.
Einige Autoren vertraten die Auffassung, dass eine Protease-Aktivität bei einigen chronischen Wunden einen Abbau von Haftproteinen, wie Fibronektin, verursachen kann und somit die für einen normalen Wundverschluss notwendige Zellhaftung verhindern kann⁹. Metalloproteasen und Serinproteasen wurden in Flüssigkeiten von chronischen Wunden identifiziert^9,10 und von Fibronektin wurde berichtet, dass es gegenüber einer Spaltung durch Proteasen hochgradig empfindlich ist¹¹. Der Schutz der Integrität von Fibronektin kann durch Zugabe von Protease-Inhibitoren zur Dosierungsform erreicht werden. Die vorliegende Erfindung stellt ferner Formulierungen bereit, die einen Metalloprotease-Inhibitor, wie EDTA, und/oder einen Serinprotease-Inhibitor, wie Aprotinin (Trasylol^R, Miles) enthalten können, und zwar im Hinblick auf das genannte Ziel. Gemäß einer Ausführungsform kann die Dosierungsform 0,01 bis 1,0 Gew.-% EDTA und/oder 1,5 bis 45,0 Inh U-Gew.-% Aprotinin enthalten, wobei 1 Inh U = 26 Kallikrein-Inhibitoreinheiten.
Erfindungsgemäße Formulierungen können auf die Wundstelle durch beliebige geeignete Maßnahmen aufgetragen werden, die gewährleisten, dass die Wundoberfläche vollständig bedeckt ist. Beispielsweise können sie direkt auf die Wundstelle aufgetragen werden oder zur Beschichtung von Fasern eines absorbierenden Mullverbands verwendet werden, um einen Wundheilungsverband zu bilden, der dann auf eine Wunde gelegt werden kann.
Nachstehend finden sich Beispiele zur Erläuterung weiterer Aspekte der Erfindung, die jedoch nicht als Beschränkung des Schutzumfangs anzusehen sind.
Beispiel 1
Isolierung von Fibronektin aus Humanplasma

1) Eine Sterilisationsstufe ist für sämtliche homologen Plasmaspenden zwingend erforderlich. Um mögliche Viren zu inaktivieren, wird ein Sterilisationsverfahren unter Verwendung des Lösungsmittel/Detergens-Verfahren eingesetzt. 1% Tri-(n-butyl)-phosphat (TNBP) und 1% Triton X-100 werden 6 Stunden zu Plasma von 24°C gegeben. Anschließend wird das Plasma mit Sojaöl versetzt und mindestens 30 Minuten vermischt, um TNBP zu extrahieren. Restliches Triton wird durch Dialyse entfernt. Diese erste Stufe entfällt bei Verwendung von autologem Plasma.
2) Eine Gelatine-Sepharose 4B-Säule wird zunächst mit einer Tris-HCl-Lösung vorgewaschen, um das Gel zu äquilibrieren.
3) Das Plasma wird 1:1 mit einer Tris-HCl-Lösung verdünnt und in Gegenwart von 0,001 M Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) etwa 15 Stunden bei 4°C durch die Säule gepumpt.
4) Anschließend wird die Säule 3-mal gewaschen, um nicht-spezifisch gebundene Plasmaproteine aus dem Gel zu eluieren. Sämtliche Waschstufen werden unter Verwendung einer Tris-HCl-Lösung vom pH-Wert 7,5 durchgeführt. Eine 1 M NaCl-Lösung wird bei der zweiten Waschstufe zugesetzt, um Verunreinigungen zu eluieren.
5) Die Elution von Fibronektin wird unter Verwendung von 0,1 M Na-Acetat + 1 M KBr-Lösung durchgeführt.
6) Zwei Dialysestufen werden sodann durchgeführt, um Verunreinigungen (Triton X-100, KBr, Na-acetat) zu entfernen. Es wird gegen PBS bzw. steriles Wasser dialysiert.
7) Die Lösung wird durch Ultrafiltration unter Stickstoffdruck eingeengt.
8) Eine endgültige Sterilfiltration unter Verwendung eines 0,22 μm-Filters wird zur Gewährleistung einer sterilen Beschaffenheit vorgenommen.
9) Die Fraktionen werden in Aliquotanteile aufgeteilt und bei –20°C bis zur Verarbeitung in eine topische Dosierungsform eingefroren.

Beispiel 2
Polyacrylsäure-Gele
Polyacrylsäure(Carbomer)-Gele(Carbopol^R, BF Goodrich) wurden hergestellt. Carbomer (Carbopol) ist ein von Acrylsäure abgeleitetes Polymeres. Es handelt sich um ein hochmolekulares Polymeres (740 00 bis 5 000 000), das bei Neutralisation mit starken Alkalien (NaOH) oder Aminen (Triethanolamin) einer Gelbildung unterliegt. Es bildet Gele bei relativ niedrigen Konzentrationen, d. h. bei nur 0,25%. Seine Viskosität wird durch Zugabe von Elektrolyten stark verringert.
Eine bevorzugte Qualität von Polyacrylsäure ist Carbopol 934-P in Konzentrationen von 0,35 bis 0,75% (Gew./Gew.). Geringere Konzentrationen reichen zur Förderung der Haftung an der Wunde nicht aus. Höhere Konzentrationen verringern die Freisetzung von Fibronektin aus dem Gel. Die Viskosität von Polyacrylsäure-Gelen ist vom pH-Wert 6 bis 8 stabil, wobei ein bevorzugter pH-Bereich 6,5 bis 7,5 beträgt. Die Viskosität wird durch die Anwesenheit von starken Elektrolyten verringert.
Ein Polyacrylsäure-Gel mit einem Gehalt an (Gew./Gew.) Fibronektin von 0,2%, Carbopol 934-P von 0,375% und Chlorcresol von 0,1% wurde folgendermaßen hergestellt: Chlorcresol (1,0 g) wurde in warmem (65°C), entionisiertem Wasser (95 ml) unter langsamem Bewegen gelöst. Nachdem sich das Chlorcresol vollständig gelöst hatte, wurde die Lösung unter weiterem Bewegen auf Raumtemperatur abgekühlt. Sodann wurde Carbopol 934-P (3,75 g) zugegeben, das sich langsam auf der Oberfläche der Lösung verteilte. Ein Mischvorgang mit einem Rührer vom Schaufeltyp wurde etwa 3 Stunden vorgenommen. Diese Dispersion wurde sodann autoklavisiert, um eine sterile, konzentrierte Gelgrundlage (3,75% (Gew./Gew.)) bereitzustellen. Eine Vorratslösung von Fibronektin mit einer Konzentration von 2,2 mg/ml (90 ml) wurde durch ein 0,22 μm-Acetatfilter filtriert. Ein Polymerisationspromotor, nämlich Natriumhydroxid, wurde zu der Fibronektinlösung in einer Menge, die 10 g der 3,75%igen Carbopol-Dispersion neutralisierte, d. h. 1250 μl, 3 M NaOH, zugegeben. Die Vorratslösung von Fibronektin und die Carbopol-Dispersion wurden in Spritzen vermischt, wobei die Einführung von Luftblasen und eine Verunreinigung in einer aseptischen Umgebung vermieden wurden, z. B. unter einem Abzug mit laminarer Strömung. Diese Präparation ergab ein klares, konserviertes Gel (100 g) von Fibronektin, das frei von Mikroorganismen war und eine Viskosität von etwa 350 PaS (350 000 cps) aufwies.
Diese Gelformulierung wurde in einer Pilotstudie 2-mal täglich auf Beingeschwüre von humanen Patienten aufgetragen. Es ergab sich eine erhöhte Wundheilungsgeschwindigkeit ohne jegliche nachteilige Wirkung.
Beispiel 3
Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolymer-Gele
Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolymer (Poloxamer)-Gele (Pluronic^R, BASF Wyandotte) wurden hergestellt. Eine bevorzugte Poloxamer-Qualität ist Pluronic F-127 bei Konzentrationen im Bereich von 18 bis 25% (Gew./Gew.). Bei Poloxamer F-127 handelt es sich um ein niedermolekulares Polymeres (2 000 bis 13 000), das thermische Gelbildungseigenschaften aufweist. Die Gelbildung erfolgt, wenn eine Konzentration von 18% Poloxamer erreicht ist. Die Viskosität von Poloxamer ist proportional zur Konzentration des Polymeren, zum Typ des verwendeten Polymeren (Molekulargewicht) und zur Temperatur. Das Polymere ist bei 4°C flüssig und unterliegt bei steigenden Temperaturen einer Gelbildung, wobei sich bei Raumtemperatur Werte von hoher Viskosität ergeben. Im Gegensatz zu Carbopol verstärkt die Zugabe von Ionen die Viskosität des Präparats.
Es wurde berichtet, dass konzentrierte wässrige Lösungen (20 bis 30%) einen drastischen Viskositätsanstieg erleiden, wenn sie von 4°C auf Körpertemperatur erwärmt werden. Wenn ferner die Ionenstärke der Lösung erhöht wird, nimmt die Viskosität mit steigender Temperatur rascher zu. Es sind mehrere Qualitäten erhältlich, wobei aber die Qualität F-127 am wenigsten toxisch ist und bei geringeren Konzentrationen einer Gelbildung unterliegt. Bei erfindungsgemäß hergestellten Gelen von Poloxamer handelt es sich um Lösungen, die bei 4°C eine geringe Viskosität aufweisen und rasch einer Gelbildung unterliegen, wenn sie auf Körpertemperatur erwärmt werden.
Ein Poloxamer-Gel mit einem Gehalt (Gew./Gew.) an Fibronektin von 0,2% und einem Gehalt an Pluronic F-127 von 20% wurde folgendermaßen hergestellt: eine Vorratslösung von Fibronektin mit einer Konzentration von 2,2 mg/ml (80 ml) wurde durch ein 0,22 μm-Acetatfilter filtriert. Pluronic F-127 (20 g) wurde zu 80 ml der Fibronektinlösung gegeben und ohne Bewegen bei etwa 3-tägigem Stehenlassen bei 4°C in Lösung gebracht. Die erhaltene Lösung (100 g) ist stark flüssigkeitsähnlich. Eine Gelbildung erfolgt sofort, wenn die Lösung in Kontakt mit der Wunde gelangt. Wenn steriles Poloxamer-Pulver nicht erhältlich ist, kann auch ein Sterilfiltrationsvorgang bei 4°C mit der endgültigen Lösung durchgeführt werden. Die Viskosität variiert von nicht-nachweisbaren Werten bei 4°C bis 450 PaS (450 000 cps) bei Raumtemperatur.
Beispiel 4
Cellulosederivat-Gele
Hydroxypropylcellulose (HPC)-Gele wurden hergestellt. Um diesen Typ von Formulierungen zu erläutern, wird nachstehend ein Präparat eines 3%igen HPC-Gels beschrieben. Bei einer bevorzugten Qualität handelt es sich um Klucel-HF in einem Konzentrationsbereich von 2 bis 4% (Gew./Gew.).
Eine Gelformulierung mit einem Gehalt an (Gew./Gew.) Fibronektin 0,1%, HPC von 3% und Parabenen wurde folgendermaßen hergestellt: Methylparaben (0,05 g) und Propylparaben (0,02 g) wurden in warmem, entionisiertem Wasser (94 ml) gelöst. HPC-Pulver wurde unter Anwendung eines trockenen Wärmesterilisationsverfahrens sterilisiert. Sodann wurde HPC (6 g) in dieser Lösung dispergiert und etwa 3 Stunden mit einem Rührer vom Schaufeltyp vermischt. Man erhielt eine sterile konzentrierte Gelgrundlage (6% (Gew./Gew.)). Eine Vorratslösung von Fibronektin mit einer Konzentration von 2 mg/ml (50 ml) wurde durch ein 0,22 μm-Acetatfilter filtriert. Die Fibronektinlösung (50 ml) wurde sodann langsam zu einer Portion (50 g) dieser konzentrierten Grundlage unter Verwendung der Rührerwelle mit niedriger Drehzahl zugegeben. Dadurch erhielt man ein konserviertes Gel (100 g) mit einer Viskosität von etwa 150 PaS (150 000 cps).
Beispiel 5
Cremeformulierung
Eine Cremeformulierung mit einem Gehalt (Gew./Gew.) an Fibronektin von 0,1%, steriler Cremegrundlage (Schering^R-Grundlage, Schering) und Chlorcresol von 0,1% wurde folgendermaßen hergestellt: Eine Vorratslösung von Fibronektin in einer Konzentration von 2 mg/ml (50 ml) wurde durch ein 0,22 μm Acetatfilter filtriert. Die Fibronektinlösung (50 ml) wurde sodann langsam zu einem Teil (50 g) der Cremegrundlage unter Verwendung einer Rührwelle mit geringer Drehzahl zugegeben. Auf diese Weise erhielt man eine konservierte Creme (100 g) mit einer Viskosität von etwa 70 PaS (70 000 cps).
Beispiel 6
Kinetik der Freisetzung aus verschiedenen topischen Dosierungsformen
Der Wirkungsgrad der Freisetzung von Fibronektin aus den einzelnen topischen Formulierungen wurde in einem in vitro-Diffusionszellsystem bewertet. Alle Permeationsuntersuchungen wurden an deepithelisierten Hautproben von menschlicher Brust und Bauch, die bei operativen Brustverkleinerungen und abdominalen Lipektomie-Operationen erhalten wurden, durchgeführt. Ein 8 μm-Schnitt wurde von der epidermalen Oberfläche der Haut unter Verwendung eines Dermatoms (1/10 000, Scherenskala) entnommen. Die dermale Seite wurde sorgfältig von anhaftendem subkutanem Gewebe und/oder Blutgefäßen gereinigt. Deepithelisierte humane Haut wurde dazu verwendet, den pathologischen Zustand bei chronischen venösen Geschwüren, bei denen die Epidermisschicht fehlt, zu reproduzieren.
Das gewählte Diffusionszellsystem bestand aus einem starren Rezeptor, der die Hautprobe enthielt, wobei die deepithelisierte Seite nach oben dem Donatoranteil zugewandt war und die dermale Seite nach unten dem Rezeptor-Abteil zugewandt war. Das Rezeptor-Abteil war mit einem zirkulierenden Pufferkreislauf verbunden. Die Puffertemperatur wurde auf 37°C gehalten, während die Hautoberfläche eine Temperatur von etwa 32°C aufwies. Die einzelnen Analysen wurden an einer Hautprobe von 0,64 cm² unter Verwendung von 100 μl Aliquotanteil einer topischen ¹²⁵I-Fibronektin-Formulierungsprobe durchgeführt. Nach dem Experiment wurde die Haut aus der Diffusionszelle entnommen, 10-mal mit einem Volumen von jeweils 8 ml Wasser gewaschen und auf ihren Radioaktivitätsgehalt in einem gamma-Radioaktivitätszählgerät analysiert. Die absorbierte Gesamtmenge (Dermis-Rezeptor-Abteil), dividiert durch die aufgetragene Dosis, ergab die prozentuale Absorption. Sämtliche Dosierungsformen wurden in einer salzfreien Lösung hergestellt, da die Viskositätswerte durch die Anwesenheit von Elektrolyten beeinflusst werden könnten. Beispielsweise verringern sich die Viskositätswerte von Carbomer-Gelen in Gegenwart von starken Elektrolyten im Gegensatz zu Poloxamer-Gelen, die bei Zugabe von Elektrolyten zum Präparat viskoser sind.
Mehrere Autoren haben perkutane Absorptionsuntersuchungen unter Verwendung von in vitro- und in vivo-Techniken verglichen, um die Zuverlässigkeit der mit diesen Methoden erzielten Ergebnisse zu bestätigen^13,14,15. Diese Vergleiche haben klar gezeigt, dass in vitro-Untersuchungen genau den in vivo-Zustand wiedergeben. Eine auf unsere Experimente angewandte statistische Analyse hat eine gute Korrelation der Werte von Untersuchungen, die an Haut aus verschiedenen Quellen durchgeführt worden sind, ergeben. Diese Daten zeigen, dass der Ursprung der Haut keinen Einfluss auf die Ergebnisse ausübt.
Perkutane Absorptionsstudien werden üblicherweise an intakter Haut durchgeführt und sind so konzipiert, dass die Freisetzung einer Substanz aus einem topischen Vehikel und seine Absorption durch die Haupthautbarriere, d. h. das Stratum corneum, bewertet wird. Bei Hautgeschwüren fehlt jedoch die Barrierewirkung des Stratum corneum. Bei diesem pathologischen Zustand stellt nur die Diffusion aus dem dermatologischen Vehikel einen Hauptbestimmungsfaktor für das spätere Eindringen des Arzneistoffes in die Dermis dar.
Das vorstehend beschriebene Diffusionszellsystem eignet sich als in vitro-Modell für Hautgeschwüre.
Kinetische Daten über die Freisetzung von Fibronektin aus verschiedenen Dosierungsformen wurden nach 4, 12 und 24 Stunden erhalten. In Tabelle 1 sind diese Daten für den Zeitpunkt t = 12 Stunden zusammengestellt. Die Kontrolle bestand aus ¹²⁵I-Fibronektin in phosphatgepufferter Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,4. Liposomen, die in der Carbopol 934-P (1%) + Liposomen (15%)-Formulierung (Lipogel) verwendet wurden, wurden aus Proliposomen (Prolipo 3090 SH^R, Lucas Mayer, Frankreich) hergestellt. Cellulosederivate werden als CMC (Natriumcarboxymethylcellulose) und HPC (Hydroxypropylcellulose) bezeichnet. Dermabase^R (Borden, Ltd., Don Mills, Ontario, Kanada) und Schering^R-Grundlage sind handelsübliche Cremegrundlagen. Sie wurden für diese Experimente 1:1 verdünnt. Das Symbol [] bezieht sich auf die Konzentration der Komponenten und der "Abs. Wert" bezieht sich auf den prozentualen Anteil des radioaktiv markierten Fibronektins, das nach einer Expositionszeit von 12 Stunden in der Dermis gefunden wird.
Tabelle 1
1 ist ein Diagramm der kinetischen Daten von drei Geldosierungsformen und einer Kontrolllösung im Laufe der Zeit. Aus diesem Diagramm ist ersichtlich, dass der Absorptionsvorgang tendenziell im Zeitraum von 0 bis 12 Stunden wichtiger als im Zeitraum von 12 bis 24 Stunden ist, was darauf schließen lässt, dass zwei Anwendungen pro Tag mehr Fibronektin als bei einer einmaligen Anwendung pro Tag freisetzen können.
In 2 ist die kutane Absorption von radioaktiv markiertem Fibronektin aus verschiedenen Dosierungsformen und aus der Kontrolle nach 12 Stunden dargestellt. Der Dunnett-Statistiktest wurde zur Identifizierung statistisch signifikanter Differenzen zwischen Carbopol und anderen Formulierungen verwendet. Dieser Test hat ferner signifikante Unterschiede zwischen Lipogel, Carbogly und Carbopol dargelegt. Diese Ergebnisse korrelieren mit den bei klinischen Studien erhaltenen Wirksamkeitsdaten (vergl. Beispiel 8). Die Wirksamkeit der Carbopol-Formulierung ist besonders überraschend, da Carbopol einen höheren Viskositätsgrad als zahlreiche andere untersuchte Formulierungen aufweist. Bemerkenswert ist ferner der Unterschied im Abs. Wert zwischen den Carbopol- und CMC-Formulierungen, da beide den gleichen Viskositätsgrad aufweisen.
4 zeigt, dass nicht immer eine klare Beziehung zwischen der Viskosität und der Absorption besteht, wobei die Präparate, für die Viskositätswerte bestimmt wurden, berücksichtigt werden. Beispielsweise zeigt Dermabase, das eine relativ niedrige Viskosität von 119 PaS (119 000 cps) im Vergleich zu Carbopol von 411,3 PaS (411 300 cps) aufweist, ein relativ schlechtes Freisetzungsvermögen (5,80%) im Vergleich zu Carbopol (13,40%).
Beispiel 7
Stabilität von Fibronektin im Gel
Die biologische Aktivität und Integrität der Makrostruktur von Fibronektin in Gelformulierungen wurde bewertet (3). Tests wurden an einer Gelprobe mit einem Gehalt an (Gew./Gew.) Fibronektin von 0,2%, Carbopol P-934 von 0,375% und Chlorcresol von 0,1% durchgeführt. Die Probe war 32 Wochen bei 4°C aufbewahrt worden.
Elektrophoresetechniken wurden herangezogen, um die Integrität der Makrostruktur von Fibronektin im Gel zu bestimmen. Nach Auflösen der Gelprobe in einer 1 M NaCl + Tris-HCl-Lösung vom pH-Wert 7,4 ließ man die Probe auf einem 7,5%-Acrylamidgel gemäß dem Verfahren von Laemmli wandern ("Denaturing (SDS) discontinuous gel electro phoresis; Laemmli gel method", Current Protocols in Molecular Biology (1994), S. 10.2.4–10.2.9). Ein Vergleich der Ergebnisse mit einer frischen Standardlösung (Spalte 0) zeigte, dass nahezu 100% des Fibronektins um die Bande von 220 000 (Spalte B) identifiziert werden konnte, was belegt, dass allenfalls ein sehr geringer Abbau erfolgte.
Die biologische Aktivität wurde durch einen Affinitätschromatographietest bewertet. Die Bindung an Gelatine ist einer der biologischen Eigenschaften, die relativ einfach bestimmt werden kann. Nach Auflösen einer Gelprobe in einer 1 M NaCl-Lösung wurde eine bekannte Menge dieser viskosen Lösung in ein Eppendorf-Röhrchen in Gegenwart von Gelatine-Sepharose 4B gebracht und sodann aufgewirbelt. Der Inhalt wurde ferner mit einer frischen 1 M NaCl-Lösung gespült und zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, um Verunreinigungen, wie Carbopol und Chlorcresol, die sich durch Auflösen des Gels ergaben, zu beseitigen. Fibronektin wurde von der Gelatine-Sepharose 4B unter Verwendung einer 1 M KBr-Lösung eluiert. Man lieb die gewonnene Fraktion an einem 7,5%-Acrylamidgel gemäß dem Verfahren von Laemmli wandern. Die Bande wurde sodann in Bezug auf ihren Gehalt an Fibronektin durch einen densitometrischen Abtasttest bewertet. Die gewonnene Probe konnte ferner spektrophotometrisch aufgrund der optischen Dichte bei der Wellenlänge λ = 280 nm bewertet werden.
Aus einem Vergleich mit einem frisch hergestellten Gel von Fibronektin (Spalte 0) ist ersichtlich, dass eine große Menge (80%) an Fibronektin aus der Probe der Gelzubereitung (Spalte 8 Monate) gewonnen wurde, was zeigt, dass die Gelatine-Bindungsaktivität des Glycoproteins in dieser Dosierungsform für eine lange Zeitspanne aufrechterhalten werden kann.
Beispiel 8
Klinische Versuche: Behandlung von chronischen Beingeschwüren
Wir haben vier klinische Versuche (Pilotstudien) durchgeführt, um die Eignung der verschiedenen Dosierungsformen mit einem Gehalt an exogenem Humanplasmafibronektin bei der Behandlung von chronischen venösen Geschwüren der unteren Gliedmaßen zu untersuchen. Bei diesen Versuchen wurde autologes Plasmafibronektin verwendet. Patienten mit Geschwüren, die mindestens 3 Monate gegenüber der herkömmlichen Therapie resistent waren, wurden ausgewählt.
Das spezielle Ziel des ersten Experiments bestand darin, die Wirksamkeit von topisch aufgebrachtem Fibronektin als Wundheilungspromotor zu bestimmen. Sieben Patienten wurden in diese Studie aufgenommen. Sie wurden angewiesen, den Wundbereich mit einer Lösung von Fibronektin (1 mg/ml, 0,1%) in PBS (phosphatgepufferter Kochsalzlösung) (2-mal täglich) zu "fluten". Nach 2 Monaten regelmäßiger Anwendung dieser Lösung ergab sich bei 5 dieser Patienten eine drastische Abnahme der Wundgröße, und zwar speziell eine mindestens 75%ige Verringerung der integrierten Oberfläche.
Ein zweites Experiment war dazu bestimmt, die Wirksamkeit einer halbfesten Dosierungsform, die (in Gew.-%) 0,1% Fibronektin enthielt, das in 15%-Liposomen eingekapselt waren, die wiederum einer Carbopol (1%)-Formulierung, bekannt als Lipogel, einverleibt waren. Eine Hypothese bestand darin, dass dann, wenn die Kontaktzeit des Glycoproteins mit der Wunde verlängert werden konnte, theoretisch eine raschere Abnahme der Heilungszeit erwartet werden konnte. Sechs Patienten wurden in diese Studie aufgenommen. Sie wurden veranlasst, die Formulierung 2-mal täglich auf ihre Wunde aufzutragen. Bei keinem der Patienten ergab sich während der anschließenden 3-monatigen regelmäßigen Behandlung eine wesentliche Verringerung der Wundgröße.
In einem Versuch zur Verbesserung der Dosierungsform wurde ein Experiment durchgeführt, um das therapeutische Potential einer topischen Gelformulierung mit einem Gehalt (Gew./Gew.) an Fibronektin von 0,2%, das in 0,375% Carbopol und 10% Glycerin einverleibt war (Carbogly), zu bewerten. Die Formulierung wurde mit Glycerin versetzt, um die Feuchthaltewirkung, die für die Wunde günstig sein kann, auszunützen. Elf Patienten wurden für diese Studie herangezogen. Sie wurden veranlasst, das Gel 2-mal täglich aufzutragen. Unter diesen Patienten ergab sich bei 27% eine Regression von mehr als 50% der Wundgröße nach einer 3-monatigen Behandlung.
Die Ergebnisse der Permeationsstudien können mindestens teilweise die Ergebnisse früherer Experimente erklären. 2 zeigt, dass Präparationen, wie Lipogel und Carbopol + Glycerin zu keinen hohen Absorptionswerten führen. Im Gegensatz dazu ergibt 0,375% Carbopol ohne Glycerin erheblich höhere Absorptionswerte (p < 0,001). Die beim ersten Versuch verwendete Lösung ist in diesem Diagramm als Kontrolle bezeichnet. Diese letztgenannte Präparation ergibt das höchste Freisetzungsvermögen, stellt aber aufgrund ihrer flüssigen Konsistenz keine für die Patienten geeignete Formulierung dar.
Unter Berücksichtigung dieser Ergebnisse wurde eine Formulierung mit einem Gehalt an 0,2% (Gew./Gew.) Fibronektin in 0,375% Carbopol ohne Glycerin an acht Patienten untersucht. Gemäß klinischen Studien und Permeationsstudien stellt diese Formulierung den bevorzugten Träger unter Verwendung von Carbopol dar, der zur Verwendung von Fibronektin bei der topischen Wundheilung verfügbar ist. Vorläufige Daten ergaben, dass 50% der untersuchten Patienten eine Regression von mehr als 50% ihrer Wundgröße innerhalb einer 3-monatigen Behandlung zeigten, wobei zwei vollständige Reaktionen (100%ige Heilung), die innerhalb der ersten 8 Behandlungswochen auftraten, enthalten sind. Die vorliegende Erfindung stellt auch weitere Formulierungen bereit, die so wertvoll wie diese Formulierung sind, die bei der in Beispiel 5 beschriebenen Permeationsstudie als Modellsystem zum Testen verschiedener Formulierungen verwendet wurde.
Beispiel 9
Fallstudien
Zur Erläuterung der Wirksamkeit der Formulierung mit einem Gehalt an Fibronektin und Carbopol 934-P (0,375% (Gew./Gew.) präsentieren wir zwei spezifische Fälle von chronischen venösen Beingeschwüren. Diese Fälle sind insofern von Interesse, als beim ersten Fall eine hochgradige Resistenz gegenüber einer herkömmlichen Therapie gegeben war und es sich beim zweiten Fall um ein großes Geschwür handelte. Verschiedene Autoren berichten darüber, dass Faktoren, wie Dauer und Oberfläche, eine Hauptrolle bei der Prognose von venösen Geschwüren spielen.
Fall 1
Eine 37-jährige Frau wies eine 10-jährige Krankengeschichte mit einem venösen Geschwür an der rechten unteren Gliedmaße auf. Ihre medizinische Anamnese war mit Ausnahme von 4 Episoden von Phlebitis nicht signifikant. Die letzte Episode trat während der Schwangerschaft auf und führte letztlich zu einem Geschwür. Ein Überblick über medizinische Behandlungen, die versucht wurden, ergab die Verwendung von topischen Antiseptika, elastischen Strümpfen und Hauttransplantationen ohne jegliche positiven Ergebnisse.
Die Patientin stellte sich in unserem Krankenhaus mit einer schmerzenden Wunde von 1,60 cm² vor. Trotz der Tatsache, dass das Geschwür relativ klein war, erwies es sich gegenüber einer Therapie als hochgradig resistent. 6 Wochen nach Beginn des Auftragens des Fibronektin-Gels konnte eine 92%ige Verringerung der Wundgröße festgestellt werden. Eine vollständige Reepithelisierung wurde nach einem 10-wöchigen Behandlungsverlauf beobachtet. Eine 1 Monat später angesetzte Nachuntersuchung ergab keine Verschlechterung des Zustands ihrer Wunde.
Fall 2
Ein 39-jähriger Mann stellte sich mit einem chronischen venösen Geschwür des linken Beins bei einer 7-monatigen Krankengeschichte vor. Seine medizinische Anamnese war nicht signifikant, ausgenommen eine Varizenektomie an der linken unteren Gliedmaße vor 12 Jahren. Dem Patienten wurden topische Antibiotika verschrieben, die aber keinerlei Wirkung auf die Wundgröße hatten.
Er stellte sich in unserem Krankenhaus mit einem Geschwür von 10,5 cm² aufgrund eines lokalen Traumas vor. Es bestand ein bedeutendes Lymphödem der linken unteren Gliedmaße und eine grobe verkrustete nekrotische Schicht umgab die Wunde. Beruflich war der Patient gezwungen, über längere Zeiträume hinweg zu stehen. Diese Situation konnte nicht abgestellt werden, obgleich sie vermutlich den Zustand seiner Wunde verschlechterte.
Nach 4-wöchiger regelmäßiger Anwendung eines Placebo-Gels und von normaler Kochsalzlösung nahm die Wundgröße als Folge einer lokalen Wundausschneidung auf 21,5 cm² zu. Das Placebo-Gel enthielt 0,375% Carbopol 934-P, 0,1% Chlorcresol, gereinigtes Wasser und NaOH zur Einstellung des pH-Werts. Zu diesem Zeitpunkt wurde eine aktive Behandlung mit der Fibronektin enthaltenden Carbopol-Gelformulierung eingeleitet. 6 Wochen später wurde eine maximale Größe (37,5 cm²) der Wunde festgestellt, was zeigte, dass das Geschwür größer als ursprünglich angenommen war. Der Wundheilungsvorgang dauerte 6 bis 8 Wochen und war nach einer 31-wöchigen aktiven Behandlung beendet. Eine 1 Monat später angesetzte Nachuntersuchung ergab keine Verschlechterung des Zustands seiner Wunde.
Literatur

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16 – EP-A-179 477
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18 – US- 4 837 019

Claims

Wässrige Gelformulierung zum Heilen von chronischen Wunden, enthaltend (a) eine wirksame wundheilende Menge eines Humanplasmafibronektins in einer Konzentration im Bereich von 0,05 bis 0,5 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht der gesamten Formulierung, (b) ein wasserlösliches, pharmazeutisch annehmbares Polymer mit einer Viskosität von 50 bis 1000 Pa·s (50.000 bis 1.000.000 cP) bei Raumtemperatur und (c) eine wirksame Menge eines Konservierungsstoffes.
Wässrige Gelformulierung nach Anspruch 1, worin der Konservierungsstoff aus Chlorkresol und einer Kombination aus p-Hydroxybenzoaten (Parabenen) ausgewählt ist.
Wässrige Gelformulierung nach Anspruch 2, worin das Chlorkresol in einer Menge im Bereich von 0,1 bis 0,2 Gew.-% und das p-Hydroxybenzoat in einer Menge im Bereich von 0,01 bis 0,3 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht der gesamten Zusammensetzung, vorliegen.
Wässrige Gelformulierung nach Anspruch 1, worin das Humanplasmafibronektin aus autologem, homologen Humanblut oder durch rekombinante DNA-Technogie erhalten worden ist.
Wässrige Gelformulierung nach Anspruch 1, worin das Polymer aus einem Vinylpolymer, einem Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolymer und einem Cellulosederivat ausgewählt ist.
Wässrige Gelformulierung nach Anspruch 5, worin das Vinylpolymer eine Polyacrylsäure ist.
Wässrige Gelformulierung nach Anspruch 6, worin die Polyacrylsäure ein Molekulargewicht von 740.000 bis 5.000.000 aufweist und in einer Menge im Bereich von 0,25–1,0 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht der gesamten Zusammensetzung, vorliegt.
Wässrige Gelformulierung nach Anspruch 5, worin das Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolymer ein Molekulargewicht von 2.000 bis 13.000 aufweist und in einer Menge im Bereich von 18 bis 35 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht der gesamten Zusammensetzung, vorliegt.
Wässrige Gelformulierung nach Anspruch 5, worin das Cellulosederivat Hydroxypropylcellulose (HPC) ist.
Wässrige Gelformulierung nach Anspruch 5, worin die Hydroxypropylcellulose ein Molekulargewicht von 370.000 bis 1.150.000 aufweist und in einer Menge im Bereich 1 bis 5 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht der gesamten Zusammensetzung, vorliegt.
Wässrige Gelformulierung nach Anspruch 5, die gegebenenfalls mindestens einen zusätzlichen Bestandteil aufweist, der aus Stabilisatoren und Proteaseinhibitoren ausgewählt ist.
Wässrige Gelformulierung nach Anspruch 11, worin der Stabilisator Albumin, ein Disaccharid, ein cyclisches Oligosaccharid oder eine Kombination aus diesen Stoffen ist.
Wässrige Gelformulierung nach Anspruch 12, worin das Albumin in einer Menge im Bereich von 0,01 bis 0,1 Gew.-%, das Disaccharid Saccharose ist und in einer Menge im Bereich von 0,5 bis 5,0 Gew.-% vorliegt sowie das cyclische Oligosaccharid Hydroxypropylbetacyclodextrin ist und in einer Menge im Bereich von 1,0 bis 10,0 Gew.-% vorliegt, wobei alle Gewichtsprozentangaben auf das Gewicht der gesamten Zusammensetzung bezogen sind.
Wässrige Gelformulierung nach Anspruch 11, worin der Proteaseinhibitor ein Serinproteaseinhibitor oder ein Metallproteaseinhibitor ist.
Wässrige Gelformulierung nach Anspruch 14, worin der Serinproteaseinhibitor 1,5 bis 45 Inh U Gew.-% Aprotinin oder der Metallproteaseinhibitor 0,01 bis 1 Gew.-% EDTA oder eine Kombination hiervon ist.
Cremeformulierung zum Heilen von chronischen Wunden, enthaltend (a) eine effektive wundheilende Menge von Humanplasmafibronektin in einer Konzentration im Bereich von 0,05 bis 0,5 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht der gesamten Formulierung, (b) eine Cremebasis mit einer Viskosität von 60 bis 80 Pa·s (60.000 bis 80.000 cP) bei Raumtemperatur und (c) eine wirksame Menge eines Konservierungsstoffes.
Cremeformulierung nach Anspruch 16, worin die Cremebasis Ceteth-20, Cetostearylalkohol, Chlorkresol, Mineralöl, basisches Mononatriumphosphat, Phosphorsäure, Natriumhydroxid, Wasser und weißes Petrolatum enthält.
Cremeformulierung nach Anspruch 16, worin das Humanplasmafibronektin aus autologem, homologen Humanblut oder durch rekombinante DNA-Technologie erhalten worden ist.
Cremeformulierung nach Anspruch 16, worin der Konservierungsstoff Chlorkresol ist, der in einer Menge im Bereich von 0,1 bis 0,2 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht der gesamten Zusammensetzung, vorliegt.
Cremeformulierung nach Anspruch 16, die gegebenenfalls mindestens einen zusätzlichen Bestandteil enthält, der aus Stabilisatoren und Proteaseinhibitoren ausgewählt ist.
Cremeformulierung nach Anspruch 20, worin der Stabilisator Albumin, ein Disaccharid, ein cyclisches Oligosaccharid oder eine Kombination aus diesen Stoffen ist.
Cremeformulierung nach Anspruch 21, worin das Albumin in einer Menge im Bereich von 0,01 bis 0,1 Gew.-% vorliegt, das Disaccharid Saccharose ist und in einer Menge im Bereich von 0,5 bis 5,0 Gew.-% vorliegt sowie das cyclische Oligosaccharid Hydroxypropylbetacyclodextrin ist und in einer Menge im Bereich von 1,0 bis 10,0 Gew.-% vorliegt, wobei alle Gewichtsprozentsätze auf das Gewicht der gesamten Zusammensetzung bezogen sind.
Cremeformulierung nach Anspruch 20, worin der Proteaseinhibitor ein Serinproteaseinhibitor oder ein Metallproteaseinhibitor ist.
Cremeformulierung nach Anspruch 23, worin der Proteaseinhibitor 1,5 bis 45 Inh U Gew.-% Aprotinin, 0,01 bis 1 Gew.-% EDTA oder eine Kombination hiervon ist, wobei alle Gewichtsprozentsätze auf das Gewicht der gesamten Zusammensetzung bezogen sind.