KR100469661B1 - 이식용 무세포 진피층 및 이의 제조방법 - Google Patents

이식용 무세포 진피층 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 공여자로부터 적출된 피부조직에서 진피층을 분리하고, 분리된 진피층으로부터 세포를 제거하여, 면역거부반응 유발물질이 제거된 이식용 무세포 진피층을 제조하는 방법 및 전기 방법으로 제조된 이식용 무세포 진피층에 관한 것이다. 본 발명의 이식용 무세포 진피층의 제조방법은 공여자로부터 표피층과 진피층이 포함된 피부조직을 적출하여, 2 내지 10℃에서 항생제, 항균제 및 단백질 분해 효소 억제제를 포함하고, 260 내지 320m0sm/kg의 삼투압을 유지하는 용액에 침지하는 단계; 침지된 피부조직을 세척하고, 중성 단백질 분해효소 또는 이온용액을 처리하여 표피층을 제거한 다음, 진피층을 수득하는 단계; 및, 수득한 진피층에 계면활성제 처리, 초음파 처리 또는 이들을 조합한 방법을 사용하여 세포를 제거하는 단계를 포함한다. 본 발명에 의하면, 면역반응을 유발시키는 원인물질이 제거되므로, 이식후에 면역거부반응으로 인한 조직의 이탈이 발생하지 않기 때문에, 이식용 피부의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

이식용 무세포 진피층 및 이의 제조방법{Acellular Dermal Matrix for Transplantation and Process for Preparing the Same}
본 발명은 이식용 무세포 진피층 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 공여자로부터 적출된 피부조직에서 진피층을 분리하고, 분리된 진피층으로부터 세포를 제거하여, 면역거부반응 유발물질이 제거된 이식용 무세포 진피층을 제조하는 방법 및 전기 방법으로 제조된 이식용 무세포 진피층에 관한 것이다.
생체에 존재하는 자가치유 기능은 일정수준 이상의 손상이 발생할 경우, 그 기능을 상실하므로, 추가적인 치료과정이 필요하다. 특히, 피부의 경우, 화상, 외상이나 수술 또는 만성적인 궤양 등의 원인으로 손상된 경우 피부이식 과정이 요구된다.
피부가 손상되는 가장 대표적인 요인인 화상을 살펴본다면, 표피층이 손상된 1도 화상의 경우에는 피부에 넓게 퍼져있는 아포크린선, 에크린선, 피지선, 모근 주위에 있는 표피세포 등이 빠르게 증식하여 손상부위를 회복시키고, 표피층과 진피층의 일부분이 손상된 2도 화상의 경우에는 1도 화상과 유사한 방식으로 상처부위가 회복되지만, 아포크린선, 에크린선, 피지선, 모근의 많은 부분이 손상되고 일부만이 남아있기 때문에, 회복속도가 느려 감염 등의 위험이 증가한다. 표피층, 진피층 및 피하층까지 손상되는 3도화상의 경우에는 아포크린선, 에크린선, 피지선, 모근의 모든 부분이 손상되어, 건강한 피부와의 경계선에서만 표피세포가 증식되어 회복속도가 현저히 감소하므로, 피부이식 치료가 필수적으로 요구된다. 현재 주로 사용되고 있는 피부이식 치료는 자기 신체의 건강한 피부조직을 떼어 외상부위에 이식하는 자가이식 방법을 이용하는데, 피부를 떼어낸 건강한 부위에 새로운 외상이 발생되어 환자의 고통이 증가하고, 완치되는데 시간이 많이 소요되며, 경제적 부담 또한 매우 크다. 또한, 심한 화상환자와 같이 건강한 신체부위가 충분히 남아있지 않는 경우에는 자가이식 방법을 적용할 수 없거나 또는 여러 차례에 걸쳐 이식수술을 시행하여야 한다는 문제점이 있다. 근래에는 건강한 피부를 망상으로 가공하여 더 넓은 부위에 이식하는 망상이식 방법이 시행되고 있지만, 이식부위에 흉터나 수축현상 등이 발생하는 문제점이 있다.
상기 문제점을 해결하기 위하여, 다른 사람의 피부를 이용하는 타가이식, 돼지 등과 같은 다른 동물의 피부를 이용하는 이종이식 등이 시도되고 있으나, 면역거부반응이 빈번히 발생하여 결국에는 이식된 피부조직이 이탈되므로 일시적인 효과만을 얻을 수 있고, 면역거부반응으로 인한 추가적인 장애가 발생하기도 하여, 현재까지는 크게 이용되지 못하고 있는 실정이다.
이러한 문제점으로 인하여, 자가이식 방법을 변형시켜서 적용하려는 노력이 진행되고 있는데, 1975년 레인월드(Rheinwald) 등에 의하여 표피를 배양하는 방법이 개발된 이래, 여러가지 방법으로 자가 표피세포를 배양하여 환자에게 이식하는 방법이 시도되고, 상당한 수준의 효과를 나타내어 환자의 생존율을 증가시킬 수 있었으나, 이러한 효과는 일시적으로 유지되었으므로, 장기적인 관점에서는 타가이식 또는 이종이식과 동일한 단점을 나타내었고, 일부 생착되기도 하였으나 흉터가 남거나 또는 수축현상(contracture)이 발생하는 문제점이 있었다(참조: Rennekampff, H. O., Kiessing, V., and Hansbrough, J. F., 62:288, 1996; Navsaria, H. A., Myers, S. R., Leigh, I. M., and Mckay I. A., 13:91, 1995).
일부 연구그룹에서는 신생아의 표피에서 유래한 피부세포로부터 3차원 배양방법을 통해 형성한 피부 유사구조를 이식하고자 하는 시도가 진행되었고, 상업적인 제품이 출시되기도 하였지만, 생착되지 않는다는 점에서는 상술한 바와 같이 동일한 문제점을 내포하고 있다(참조: Wilkins, L. M., Watson, S. R., Prosky, J., Meuniner, S. F., and Parenteau, N. L., 43:747, 1994; Sabolinski, M. L., Alvarez, O., Auletta, M., Mulder, G., and Parenteau, N. L., 17:311, 1996).따라서, 장기적인 이식효과를 얻을 수 있도록, 이식된 피부조직에서 면역거부반응을 억제하는 기술을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.
이에, 본 발명자들은 이식된 피부조직에서 면역거부반응을 억제하는 기술을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 피부조직으로부터 표피층이 제거된 진피층을 수득하고, 수득한 진피층에서 세포를 제거하여 무세포 진피층을 제조한 다음, 이를 이식할 경우, 이식된 피부조직에서 면역거부반응이 유도되지 않는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.결국, 본 발명의 주된 목적은 면역거부반응이 발생하지 않는 이식용 무세포 진피층의 제조방법을 제공하는 것이다.본 발명의 다른 목적은 전기 방법으로 제조된 이식용 무세포 진피층을 제공하는 것이다.
본 발명의 이식용 무세포 진피층의 제조방법은 공여자로부터 표피층과 진피층이 포함된 피부조직을 적출하여, 2 내지 10℃에서 항생제, 항균제 및 단백질 분해효소 억제제를 포함하고, 260 내지 320mOsm/kg의 삼투압을 유지하는 용액에 침지하는 단계; 침지된 피부조직을 세척하고, 중성 단백질 분해효소 또는 이온용액을 처리하여 표피층을 제거한 다음, 진피층을 수득하는 단계; 및, 수득한 진피층에 계면활성제 처리, 초음파 처리 또는 이들을 조합한 방법을 사용하여 세포를 제거하는 단계를 포함한다.
이하, 본 발명의 이식용 무세포 진피층의 제조방법을 단계별로 나누어 보다 구체적으로 설명하기로 한다.
제 1단계: 피부조직의 적출
공여자로부터 표피층과 진피층이 포함된 피부조직을 적출하여, 2 내지 10℃에서 항생제, 항균제 및 단백질 분해효소 억제제를 포함하고, 260 내지 320mOsm/kg의 삼투압을 유지하는 배양용 배지에 침지한다: 이때, 공여자는 살아있는 사람, 시신, 동물 등을 대상으로 한다. 적출된 조직은 물리적, 생물학적 요인에 의하여 손상될 수 있으므로, 이러한 손상을 방지하기 위하여, 2 내지 10℃에서 항생제, 항균제 및 단백질 분해효소 억제제를 포함하고, 260 내지 320mOsm/kg의 삼투압을 유지하는 용액에 침지하여, 적출된 조직을 안정화시키는데, 2℃ 이하에서는 용액이 결정화되어 조직이 물리적으로 손상될 수 있고, 10℃이상에서는 각종 단백질 분해효소의 활성으로 인하여 조직이 손상될 수 있다. 또한, 260/kg 이하의 삼투압을 유지하면 조직의 수축되어 손상되고, 320mOsm/kg 이상의 삼투압을 유지하면 조직이 용혈되는 현상이 발생한다. 아울러, 사용되는 항생제로는 페니실린, 스트렙토마이신, 카나마이신, 네오마이신, 바시트라신, 젠타마이신 및 반코마이신으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상을 사용하고, 항균제로는 암포테리신-비, 니스타틴 및 폴리믹신으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상을 사용하며, 단백질 분해효소 억제제로는 엔-에틸말레이미드(NEM), 불화 페닐메틸술포닐(PMSF), 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA), 루펩틴 및 아포프로티닌으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상을 사용한다.
제 2단계: 표피층의 제거
침지된 피부조직을 세척하고, 중성 단백질 분해효소 또는 이온용액을 처리하여 표피층을 제거한 다음, 진피층을 수득한다: 이때, 중성 단백질 분해효소로는 디스파아제, 터몰리신 또는 트립신을 사용하고, 각 종류를 사용할 때, 농도와 처리시간을 적절히 조절하여야 하는데, 예를 들면, 디스파아제를 1.0units/㎖농도로 37℃에서 60 내지 120분간 처리하고, 터몰리신을 200㎍/㎖농도로 37℃에서 30분간 처리하면 표피층과 진피층을 분리시킬 수 있다. 또한 이온용액으로는 1M 이상의 농도를 가지는 염화나트륨 수용액, 20mM의 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 수용액 또는 1 내지 5mM EDTA를 포함하는 1M 염화나트륨 수용액을 37℃에서 14 내지 32시간동안 처리하여 사용함이 바람직한데, 이온용액을 사용하면, 미생물의 오염이나 효소에 의한 조직손상을 최소화할 수 있다.
제 3단계: 진피층 세포의 제거
수득한 진피층에 계면활성제 처리, 초음파 처리 또는 이들을 조합한 방법을 사용하여 세포를 제거한다: 이때, 계면활성제로는 소듐도데실 설페이트(SDS) 같은 이온성 계면활성제와 트리톤 엑스-100, 트위 20, 트윈 40, 트위 60, 트위 80, 노니데트 피-10(NP-10), 노니데트 피-40(NP-40) 등의 비이온성 계면활성제를 사용할 수 있으며, 이들의 처리농도 및 처리시간은 각 계면활성제에 따라 달라진다. 예를 들어, SDS의 경우에는 실온에서 0.2 내지 1%(w/v)의 농도로 30 내지 120분간 처리하고, 트윈 20의 경우에는 0.1 내지 2.0%(w/v)의 농도로 실온에서 30∼180분간 처리하며, 트리톤 엑스-100 또는 노니데트피-40 용액의 경우에는 0.2 내지 2%(w/v)의 농도로 22 내지 37℃에서 30 내지 180분간 처리하여 세포를 제거할 수 있다. 아울러, 초음파를 사용할 경우에는 10 내지 100kHz의 초음파를 5 내지 60분 동안 조사하여 세포를 제거할 수 있다. 이처럼 제조된 이식용 무세포 진피층을 동결보호제 및 건조보호제를 포함하는 동결용액에 침지하고, -70℃이하에서 동결시켜 보존하는 단계를 추가로 포함할 수도 있는데, 동결보호제로는 디메틸설폭시드(DMSO), 덱스트란, 설탕, 프로필렌글리콜, 글리세롤, 마니톨, 솔비톨, 과당, 트레할로스, 라피노스, 2.3-부탄디올, 수산화에틸전분(HES), 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈(PVP), 프롤린, 베타스타치, 혈청알부민 또는 전기 1개 이상의 성분을 조합하여 사용한다.
상기 방법으로 제조된 이식용 무세포 진피층은 이식환자 자신에 의한 재구성과 치료가 가능한 세포의 단백질/콜라겐 형틀을 제공하고, 살아있는 내피세포 또는 상피세포의 재부착을 보장하는 온전한 기저막을 제공하며, 이식환자의 면역거부반응을 일으키지 않고, 조직경화 현상을 발생시키지 않으며, 동결시킬 경우 실온에서 쉽게 보관, 운반이 가능하다는 특징을 갖는다.
대부분의 면역반응은 세포막에 존재하는 막 단백질에 의하여 유발되므로, 상기 방법에 의하여 진피층의 세포를 제거할 경우에는, 면역반응을 유발시키는 원인이 제거되어, 이식후에 면역거부반응으로 인한 조직의 이탈이 발생하지 않는다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 이식용 무세포 진피층의 제조
대한민국 서울특별시 서대문구 충정로 3가에 소재한 한국조직은행(Korea Tissue Bank, KTB)으로부터 입수한 시체의 피부조직을 네오마이신과 2mM의 EDTA가 첨가된 RPMI 1640 배지(Life Technology, USA)에 침지하고, 4℃이하의 온도를 유지할 수 있도록 얼음을 채운 아이스박스를 이용하여 운반하였다. 운반된 피부 조직을 꺼내어 진피층이 아래로 가도록 하여 24.5 ×24.5㎠크기의 분석접시위에 올려놓고, 직사각형이 되도록 4 ×4㎠ 내지 6 ×10㎠의 크기로 절단하였다. 이어, 진피층이 아래로 가도록 하여 1.0unit/㎖농도의 디스파아제(Life Technology, USA) 40㎖이 들어있는 페트리접시에 옮기고, 37℃에 90분간 방치한 다음, 무균작업상자로 옮겨 0.1M의 EDTA용액을 첨가하여 디스파아제의 활성을 정지시켰다. 핀셋을 이용하여 표피층을 가볍게 잡은 다음, 진피층으로부터 벗겨내 표피층을 제거하고, 세척하여 남아있는 효소용액을 제거하였다. 그런 다음, 40㎖의 둘베코의 인산완충용액(Dullbecco's phosphate buffered saline, Sigma Chem. Co., USA)을 가하고, 상온에서 30±5rpm의 속도로 5분간 서서히 진탕시켰다. 이어, 전기 인산 완충용액을 제거하고, 1%(w/v)의 트위 20이 첨가된 둘베코의 인산완충용액 40㎖을 다시 가한 후, 상온에서 30±5rpm의 속도로 120분간 서서히 진탕시켰다. 그런 다음, 완충용액을 제거하고, 다시 40㎖의 둘베코의 인산완충용액을 가한 후, 상온에서 30±5rpm의 속도로 5분간 서서히 진탕시켰다. 다시, 완충용액을 제거하고, 6%(w/v)의 설탕, 3.5%(w/v)의 솔비톨, 1.5%(w/v)의 마니톨 및 5%(w/v)의 글리세롤을 포함하는 둘베코의 인산 완충용액 40㎖을 다시 가한 후, 상온에서 30±5rpm의 속도로 15분간 서서히 진탕시켰다. 이어, 액상성분을 제거하여, 이식용 무세포 진피층을 제조하였으며, 이를 -70℃의 초저온 냉동고에 동결보관하였다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 공여자로부터 적출된 피부조직에서 진피층을 분리하고, 분리된 진피층으로부터 세포를 제거하여, 면역거부반응 유발물질을 제거된 이식용 무세포 진피층을 제조하는 방법 및 전기 방법으로 제조된 이식용 무세포 진피층을 제공한다. 본 발명의 이식용 무세포 진피층의 제조방법은 공여자로부터 표피층과 진피층이 포함된 피부조직을 적출하여, 2 내지 10℃에서 항생제, 항균제 및 단백질 분해효소 억제제를 포함하고, 260 내지 320m0sm/kg의 삼투압을 유지하는 용액에 침지하는 단계; 침지된 피부조직을 세척하고, 중성 단백질 분해효소 또는 이온용액을 처리하여 표피층을 제거한 다음, 진피층을 수득하는 단계; 및, 수득한 진피층에 계면활성제 처리, 초음파 처리 또는 이들을 조합한 방법을 사용하여 세포를 제거하는 단계를 포함한다. 본 발명에 의하면, 면역반응을 유발시키는 원인물질이 제거되므로, 이식후에 면역거부반응으로 인한 조직의 이탈이 발생하지 않기 때문에, 이식용 피부의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Claims (14)

  1. (ⅰ) 2 내지 10℃에서 항생제, 항균제 및 단백질 분해효소 억제제를 포함하고, 260 내지 320mOsm/kg의 삼투압을 유지하는 용액에, 표피층과 진피층이 포함된 피부조직을 침지하는 단계;
    (ⅱ) 침지된 피부조직을 세척하고, 중성 단백질 분해효소 또는 이온용액을 처리하여 표피층을 제거한 다음, 진피층을 수득하는 단계; 및,
    (ⅲ) 수득한 진피층에 계면활성제 처리, 초음파 처리 또는 이들을 조합한 방법을 사용하여 세포를 제거하는 단계를 포함하는, 이식용 무세포 진피층의 제조방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    항생제는 페니실린, 스트렙토마이신, 카나마이신, 네오마이신, 바시트라신, 젠타마이신 및 반코마이신으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 이식용 무세포 진피층의 제조방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    항균제는 암포테리신-비, 니스타틴 및 폴리믹신으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 이식용 무세포 진피층의 제조방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    단백질 분해효소 억제제는 엔-에틸말레이미드(NEM), 불화 페닐메틸술포닐(PMSF), 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA), 루펩틴 및 아포프로티닌으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 이식용 무세포 진피층의 제조방법.
  5. 제 1항에 있어서
    중성 단백질 분해효소는 디스파아제, 터몰리신 또는 트립신인 것을 특징으로 하는 이식용 무세포 진피층의 제조방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    이온용액은 1M 이상의 농도를 가지는 염화나트륨 수용액, 20mM의 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 수용액 또는 1 내지 5mM EDTA를 포함하는 1M 염화나트륨 수용액인 것을 특징으로 하는 이식용 무세포 진피층의 제조방법.
  7. 제 1항에 있어서,
    계면활성제는 이온성 계면활성제 또는 비이온성 계면활성제인 것을 특징으로 하는 이식용 무세포 진피층의 제조방법.
  8. 제 7항에 있어서,
    이온성 계면활성제는 소듐도데실 설페이트(SDS)인 것을 특징으로 하는 이식용 무세포 진피층의 제조방법.
  9. 제 7항에 있어서,
    비이온성 계면활성제는 트리톤 엑스-100, 트위 20, 트윈 40, 트위 60, 트위 80, 노니데트 피-10(NP-10) 또는 노니데트 피-40(NP-40)인것을 특징으로 하는 이식용 무세포 진피층의 제조방법.
  10. 제 1항에 있어서,
    초음파 처리는 10 내지 100kHz의 초음파를 5 내지 60분 동안 조사하는 것을 특징으로 하는 이식용 무세포 진피층의 제조방법.
  11. 제 1항의 방법으로 제조된 이식용 무세포 진피층.
  12. (ⅰ) 2 내지 10℃에서 항생제, 항균제 및 단백질 분해효소 억제제를 포함하고, 260 내지 320mOsm/kg의 삼투압을 유지하는 용액에, 표피층과 진피층이 포함된 피부조직을 침지하는 단계;
    (ⅱ) 침지된 피부조직을 세척하고, 중성 단백질 분해효소 또는 이온용액을 처리하여 표피층을 제거한 다음, 진피층을 수득하는 단계;
    (ⅲ) 수득한 진피층에 계면활성제 처리, 초음파 처리 또는 이들을 조합한 방법을 사용하여 세포를 제거하는 단계; 및,
    (ⅳ) 세포가 제거된 진피층을 동결보호제 및 건조보호제를 포함하는 동결용액에 침지하고, -70℃이하에서 동결시켜 보존하는 단계를 포함하는, 이식용 무세포 진피층의 제조방법.
  13. 제 12항에 있어서,
    동결보호제는 디메틸설폭시드(DMSO), 덱스트란, 설탕, 프로필렌글리콜, 글리세롤, 마니톨, 솔비톨, 과당, 트레할로스, 라피노스, 2.3-부탄디올, 수산화에틸전분(HES), 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈(PVP), 프롤린, 베타스타치, 혈청알부민 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 이식용 무세포 진피층의 제조방법.
  14. 삭제
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