KR101362403B1

KR101362403B1 - 다중 관통이 형성된 무세포 진피조직 이식체

Info

Publication number: KR101362403B1
Application number: KR1020120064024A
Authority: KR
Inventors: 황용섭; 김준용; 김병무; 서수정; 이주희; 김형구; 이환철
Original assignee: 김준용; 김병무; 주식회사 엘앤씨바이오
Priority date: 2012-03-15
Filing date: 2012-06-15
Publication date: 2014-02-14
Also published as: KR20130105226A

Abstract

본 발명은 다중 관통이 형성된 무세포 진피조직 이식체에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 무세포 진피조직에 다중 관통을 형성시켜 신생혈관 형성과 자가조직 증식에 유리한 환경을 제공하고 조직의 신장력 및 유연성을 증대시켜 이식 시간이 빠르고 이식이 안정적으로 이루어지게 되므로 이식 후 부작용 발생을 최소화할 수 있다.

Description

다중 관통이 형성된 무세포 진피조직 이식체{ACELLULAR DERMAL MATRIX USED MULTI PENETRATION}

본 발명은 다중 관통이 형성된 무세포 진피조직 이식체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

인체의 피부조직은 크게 세 부분으로 나뉘어지는데, 피부의 가장 바깥쪽을 이루는 표피층과 그 아래층의 진피층, 그리고 피하조직으로 이루어진다. 이 중 표피층은 표피층과 진피층이 단단하게 결합할 수 있도록 하는 기저막(basement membrane)으로부터 여러 층으로 분화된 상피세포와 그 밖에 멜라닌세포, 면역세포로 이루어지며, 표피층 아래의 진피층은 주로 섬유아세포와 이 세포가 분비한 여러 세포외간물질(extracellular matrix)로 이루어진다.

피부조직 또는 내부 장기조직은 화상, 외상, 궤양 등으로 인해 조직의 일부가 손상될 수 있는데, 이 경우 손상된 조직의 치유를 목적으로 하거나 또는 재건성형을 목적으로 본인 피부조직 또는 내부 장기조직으로부터 이식하는 방법을 사용한다. 이러한 경우에는 이식받는 자가 자신의 피부조직 혹은 장기조직을 추가적으로 적출하는 수술적 부담이 있어 이식받는 사람의 건강상태가 양호하지 않은 경우에는 위험할 수가 있다. 그 외에 이종조직(Xenograft)이나 합성물질(Synthetic biomaterial)을 사용하여 이식하는 방법이 있는데, 이 경우에는 면역거부 반응이 발생하여 장기간 이식 시 염증반응을 초래하여 재수술하는 결과를 초래할 수도 있다. 상기 문제점을 해결하기 위해 공여자로부터 적출된 피부조직으로부터 이식용 무세포 진피층을 제조[특허문헌 1: 국내 특허 공개 제2001-0092985호, 특허문헌 2: 국내 특허 등록 제791502호]하여 시술하는 방법은 상기의 어려움을 해결하는 방법으로 사용된다.

국내 특허 공개 제2001-0092985호 국내 특허 등록 제791502호

이에, 본 발명자들은 기존 이식용 무세포 진피조직에 다중 관통(multi-penetration)을 형성시켜 조직의 신장력 및 유연성을 증대시켜 이식이 안정적으로 이루어지게 하였다.

따라서, 본 발명은 무세포 진피조직에 다중 관통을 형성시킴으로써 신생혈관 형성과 자가조직 증식에 유리한 환경을 제공하여 데드 스페이스(dead space)를 예방할 수 있으며, 조직의 신장력 및 유연성을 증대시켜 이식 시간이 빠르고 이식이 안정적으로 이루어지게 되므로 이식 후 부작용 발생을 최소화할 수 있는 무세포 진피조직 이식체를 제공하는데 그 목적이 있다.

상기 과제를 해결하기 위한 수단으로서, 본 발명은

무세포 진피조직 이식체에 있어서,

다중 관통(multi-penetration)이 형성된 무세포 진피조직 이식체를 제공한다.

또한, 상기 과제를 해결하기 위한 다른 수단으로서, 본 발명은

무세포 진피조직 이식체의 제조방법에 있어서,

다중 관통을 형성하는 단계를 포함하는 다중 관통이 형성된 무세포 진피조직 이식체의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 무세포 진피조직에 다중 관통(multi-penetration)을 형성시켜 신생혈관 형성과 자가조직 증식에 유리한 환경을 제공하고 조직의 신장력 및 유연성을 증대시켜 이식 시간이 빠르고 이식이 안정적으로 이루어지게 되므로 이식 후 부작용 발생을 최소화할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 무세포 진피조직 이식체와 기존 무세포 진피조직 이식체[Alloderm, LifeCell Corporation, Branchburg, NJ]를 비교한 것이다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 무세포 진피조직 이식체와 기존 무세포 진피조직 이식체[Alloderm, LifeCell Corporation, Branchburg, NJ]를 비교한 것이다.
도 3은 여러 가지 형태의 다중 슬릿 형태와 다공성 구조를 갖는 다중 관통이 형성된 이식체의 평면도를 나타낸 것이다.
도 4는 최적의 다중 슬릿 형태 가진 이식체의 평면도이다.
도 5는 다방향, 다중 관통 형태를 갖는 이식체를 나타낸 도면이다.
도 6은 도 5의 이식체 내 관통 구조만을 나타낸 것이다.
도 7은 여러 가지 형태의 다중 슬릿 처리된 무세포 진피조직 이식체 사진이다.
도 8은 무세포 진피조직의 섬유아 세포 배양 후 3일 후의 Hematoxylin & Eosin 염색한 사진이다[좌측: 다중 슬릿 처리된 무세포 진피조직 이식체, 다중 관통이 형성되지 않은 무세포 진피조직, 검정 화살표: Hematoxylin에 의해 염색된 섬유아 세포].

본 발명은 무세포 진피조직 이식체에 있어서, 다중 관통(multi-penetration)이 형성된 무세포 진피조직 이식체에 관한 것이다.

상기 무세포 진피조직 이식체는 뼈, 인대, 건 또는 피부인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.

상기 다중 관통(multi-penetration)이라 함은 1) 상단부에서 하단부까지 여러 개가 뚫린 형태이거나, 2) 한 층은 좌우 일렬로 여러 개 관통되고 다른 한 층은 전후 일렬로 여러 개 관통되어 교대로 적층된 구조(다방향, 다중 관통)를 의미한다.

특히, 상기 1)의 다중 관통 형태는 다중 슬릿(Multi-slit) 형태이거나, 다공성 형태를 포함할 수 있다[도 3]. 상기 다중 슬릿의 형태는 단면, 횡단면, V 형태, Z 형태 및 이들의 혼합 형태 등이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하기로는 슬릿 간의 간격은 좌우 측면 방향으로 2-3mm, 상하 종단면 방향으로 3-5mm으로 처리할 수 있다. 슬릿 생성 시 종단면 방향의 슬릿인 경우 그 길이는 3-5mm로 실시하고, 횡단면 슬릿의 경우에는 5mm 크기로 처리하고, 가장자리부터는 5mm 정도의 사이를 두어 시술 후 이식 이식체의 봉합 시 단절되지 않도록 한다[도 4]. 또한, 상기 다공성 형태는 원형으로 관통시킨 형태로서 일정 간격을 두고 뚫린 형태라면 모두 가능하다. 보다 바람직하게는 관통된 원형(기공)의 직경은 0.2 내지 0.5 mm이 세포의 침투를 용이하게 하여 이식 후 생착이 용이하게 한 이유로 바람직하며, 원형(기공) 간의 간격은 이식체의 물성을 최대한 유지하게 하는 이유로 0.5 내지 1.0 mm이 바람직하다.

이러한 관통으로 형성된 이식체의 경우에는 이식체의 유연성을 제공하여 신장 효과를 얻으며, 유연성으로 인해 이식 후에도 통증 및 불편감을 줄여 준다. 또한, 데드 스페이스(dead space)의 발생을 줄여주어 체액의 저류 현상을 예방하고 이식 후 염증, 감염을 예방할 수 있다. 특히, 슬릿의 미세한 공간들은 이식과정에서 섬유모세포 등의 증식, 신생혈관의 발생 등에 유리한 환경을 제공하므로, 수술 후 빠른 회복과, 부작용 발생 감소, 이물감 저하 및 자연스러운 이식을 가능케 한다. 더불어, 다공성 구조의 경우에는 슬릿 형태에서 얻어진 장점과 함께 이식체의 관통(구멍) 부위가 이식 후 빠른 자가 조직의 침투와 증식을 유도하여 지지 역할을 하게 한다. 이로 인하여 물리적 자극으로 인한 이식 조직의 이동 현상을 막아주는 장점이 있다. 예를 들어, 비뇨기과에서 음경 확대 수술이 이를 적용시키면 관통 부위에 이식체 양면의 Dartos fascia와 Buck's fascia로부터 빠른 자가 조직 침투와 증식을 유도하여 기둥 역할을 함으로써 성관계 등의 물리적 자극으로 인한 이식 조직의 이동 현상을 막아주게 된다.

또한, 상기 2)의 다중 관통 형태는 한 층은 좌우 일렬로 여러 개 관통되고 다른 한 층은 전후 일렬로 여러 개 관통되어 교대로 적층된 구조(다방향, 다중 관통)를 포함할 수 있다. 도 5와 같이 전후로 관통된 구조로 나열된 층 상에 좌우로 관통된 구조로 나열된 또 다른 층이 적층되고, 이를 교대로 적층시킨 형태이다. 이와 같은 형태는 가로 세포의 각 방향으로 이식체의 유연성을 갖게 되어 조직을 인체 조직에 이식 시 고정할 때 신장력이 좋게 되어 이식이 편하게 되고, 이물감이 감소되어 수술 후 통증을 감소시키게 된다. 또한, 이식 후 숙주 조직에서 신생혈관의 증식과 침투를 용이하게 하여 섬유모세포의 증식을 도와 내인성 교원질 조직 증식을 돕게 되어 보다 완전한 이식 환경이 제공되며 성공적인 이식을 유도할 수 있다. 또한, 이식체의 이식 준비 시 필요한 이식체 수화과정을 보다 빠르고 이식체 전체에 고르게 이루어질 수 있게 한다. 또한 이식체 이식 후 환자들이 호소하는 이물감은 일반적으로 이식체 자체가 숙주 조직과 생체 적합한 이식 반응을 얻지 못하여 이루어지는 경우가 많으나, 상기와 같은 형태의 다중 방향, 다중 관통 형태를 통해 이식 환경을 최대한 최적화한 구조로 만들어 이식 후 이물감을 현저히 떨어뜨릴 수 있다. 이때, 관통된 원형(기공)의 직경은 0.2 내지 0.5 mm이 바람직하다. 관통된 원형(기공)의 간격은 0.3 ~ 1.0 mm가 바람직하다.

본 발명의 일 구현예로서, 다중 슬릿 처리된 이식체를 첨부도면 도 1에 나타내었다. 본 발명의 이식체의 경우에는 이식용 무세포 진피조직에 다중 슬릿(multi-slit)을 처리하여 이식 후 슬릿 처리된 조직 부위의 표면적이 늘어나 섬유아세포의 유입 증대 및 신생혈관 형성과 자가조직 증식에 유리한 환경을 제공하고 조직의 신장력 및 유연성을 증대시켜 이식 시간이 빠르고 이식이 안정적으로 이루어지게 되므로 이식 후 부작용 발생을 최소화할 수 있다. 기존의 무세포 진피조직 이식체[Alloderm, Life Cell Corporation, Branchburg, NJ]의 경우에는 진피 조직에 슬릿 처리를 하지 않아 이식 후 이식 내 섬유아세포 유입 향상을 기대할 수 없다.

또한, 상기와 같이 다중 관통이 형성된 이식체에 추가적으로 모서리 부분을 경사 처리할 수 있다.

상기 "모서리 부분이 경사 처리" 라는 표현은 사각형 형태의 이식체 상부 말단의 면을 완만하게 처리하여 경사면을 형성시키는 것을 의미한다. 이때, 이식체 상부 말단은 한쪽 또는 양쪽 모두 일 수 있다. 또한, 경사면의 길이는 5 내지 10 mm가 바람직하며, 경사 처리된 부분의 높이는 1 내지 2 mm가 바람직하다. 특히, 경사 처리된 후의 이식체 높이는 경사 처리된 전의 이식체 높이의 60% 이상(바람직하게는 65 ~ 85%)가 적합한데, 60% 미만일 경우에는 이식 후 단면이 얇아 봉합 시 이식부분에 고정하는데 문제가 있다.

첨부도면 도 2에 나타낸 바와 같이, 기존의 무세포 진피조직 이식체[Alloderm, LifeCell Corporation, Branchburg, NJ]의 경우에는 이식체의 모서리 부분을 경사 처리하지 않아 그대로 이식함으로써 이식 후 이식 부위의 피부가 돌출되어 외과상 자연스럽지 못한 문제점이 있는 반면에, 본 발명의 이식체의 경우에는 사각형 형태의 이식용 무세포 진피조직의 모서리 부분에 경사 처리하여 이식 후 이식 부위의 피부가 돌출되는 현상이 줄어들어 외관 상 자연스러움을 유지할 수 있는 장점이 있다.

또한, 본 발명은

다중 관통을 형성시키는 단계를 포함하는 다중 관통이 형성된 무세포 진피조직 이식체의 제조방법을 포함한다.

구체적으로, 본 발명은

표피층을 제거하는 단계;

진피층의 세포를 제거하는 단계;

다중 관통을 형성시키는 단계; 및

동결 보존 단계

를 포함할 수 있다.

상기 다중 관통이 형성된 무세포 진피조직 이식체의 제조방법을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

우선, 이식체로 제조할 조직을 준비하는 단계를 추가로 실시할 수 있다.

기증된 시신의 조직을 신체에서 분리하여 운반할 때, 저산소증에 의한 조직 손상, 자가 분해 효소에 의한 분해, 단백질 분해 효소에 의한 세포외 간질의 손상 등의 위험이 있다. 또한, 운반용액의 삼투압에 따라 물리적인 손상을 입을 수도 있다. 그 뿐 아니라 세균이나 곰팡이와 같은 미생물에 의한 오염 위험이 항상 존재한다. 따라서 조직의 운반에 이용되는 용액에는 저산소증에 의한 분해, 자가분해효소에 의한 분해, 단백질, 분해효소에 의한 분해를 막을 수 있는 물질을 첨가하여야 하고, 미생물의 오염을 막을 수 있는 항생제와 항균제를 첨가하여야 한다. 삼투압에 의한 조직의 손상을 막기 위해 적절한 완충용액이 포함되어야 한다. 조직운반용액의 삼투압은 혈장의 삼투압인 260 ~ 320 mOsm/kg 정도의 삼투압을 가져야 한다. 동물세포 배양 등에 많이 이용되는 상업적인 배지의 경우 삼투압이 260 ~ 320 mOsm/kg 정도로 혈장의 삼투압과 비슷한 수준을 갖는다. 따라서, 상업적인 배지를 기본 용액으로 이용하고 거기에 여러 가지 역할을 하는 성분을 첨가하여 이용한다.

세균이나 곰팡이의 오염을 막기 위해 페니실린, 스트렙토마이신, 가나마이신, 네오마이신, 바시트라신, 젠타마이신, 반코마이신 등과 같은 항생제를 단독 또는 조합으로 첨가하여, 암포테리신-비, 니스타틴, 폴리믹신 등과 같은 항균제를 단독 또는 조합으로 첨가한다. 또 여러 가지 분해효소에 의한 조직의 손상을 막기 위해 효소억제제를 첨가하여야 한다.

효소억제제로는 엔-에틸말레이미드(NEM), 불화 페닐메틸술포닐(PMSF), 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸르)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA) 등과 같은 킬레이트화물질, 루펩틴, 아포프로티닌 등과 같은 단백질 분해효소 억제제 등을 이용한다.

또한, 물리적인 손상을 최소화할 수 있는 방법에 따라 조직을 운반하여야 한다.

대부분의 효소반응은 온도에 따라 많은 영향을 받으며 인간의 체온인 37℃ 주변에서 가장 활성이 강하게 된다, 따라서 조직을 4℃ 정도의 저온상태로 운반한다.

일반적으로 아이스박스에 얼음을 채워 운반하는 방법을 이용한다. 운반 용액이 얼 정도로 낮은 온도로 조직을 운반하면 얼음 결정이 조직을 손상시킬 수 있으므로 피해야 한다.

제 1 단계는 상기와 같이 준비된 조직으로부터 표피층을 제거하는 단계로서, 표피층과 진피층을 분리한다.

일반적으로 진피층과 표피층을 분리하는데 여러 가지 단백질 분해 효소를 사용하게 된다. 효소를 사용하는 경우 사용농도가 낮거나 처리 시간이 너무 짧으면 분리가 잘 이루어지지 않고, 농도가 높거나 처리시간이 너무 길면 세포나 조직에 손상을 일으키게 된다. 따라서 적절한 농도와 시간에 따라 처리하여야 한다. 진피층과 표피층을 분리하는데 이용되는 효소로는 중성 단백질 분해효소인 디스파아제, 터몰리신, 트립신 등이 있다. 1.0 units/㎖ 농도의 디스파아제로 37℃에서 60∼120분간 처리하면 진피층과 표피층을 분리할 수 있다. 또는 200㎍/㎖ 농도의 터몰리신을 37℃에서 30분간 처리하면 진피층과 표피층을 분리할 수 있다. 터몰리신을 이용하면 디스파아제를 이용하는 경우보다 기저막의 손상 위험이 낮아진다. 또 다른 방법으로는 용액의 이온 강도를 변화시켜 조직의 두 층을 분리하기도 하는데 이 방법도 역시 이온 강도와 처리시간, 처리온도 등의 조건에 따라 효율이 달라진다. 1몰 이상의 염화나트륨 용액으로 37℃에서 14∼32시간 동안 처리하면 진피층과 표피층을 분리할 수 있다. 1몰 이상의 염화나트룸 용액에서는 세균이나 곰팡이 등이 증식할 수 없기 때문에 미생물의 오염 위험을 낮출 수 있다. 또는 20mM의 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 용액으로 37℃에서 14∼32시간 동안 처리하여도 역시 진피층과 표피층을 분리할 수 있다. EDTA를 이용하면 EDTA가 단백질분해효소 억제제의 역할을 하기 때문에 단백질분해효소에 의한 조직의 손상을 줄일 수 있다. 따라서, 1몰의 염화나트륨 용액에 1∼5mM의 EDTA를 첨가하여 처리하면 미생물의 오염이나 효소에 의한 조직 손상을 최소화하며 진피층과 표피층을 분리할 수 있다.

제 2 단계는 상기와 같이 표피층을 제거한 다음, 진피층의 세포를 제거한다.

면역반응은 주로 세포막에 존재하는 막 단백질에 의해 야기된다. 따라서 세포를 제거하면 면역반응을 최소화 할 수 있다. 세포와 세포외간질과의 물리, 화학적 성질의 차이를 이용하여 조직의 손상 없이 세포만 선별적으로 제거하는 방법을 이용한다. 세포막의 주 성분은 인지질로 여러 가지 계면활성제를 이용하면 조직의 손상 없이 세포를 제거할 수 있다.

이를 위하여 소듐도데실 설페이트(SDS)와 같은 이온성 계면활성제, 또는 트리톤 엑스-100, 트윈20, 트윈 40, 트윈60, 트윈80, 노니데트 피-10(NP-10), 노니데트 피-40(NP-40) 등과 같은 비이온성 계면활성제 등이 이용된다.

진피층을 실온에서 0.2∼1% 농도의 SDS 용액으로 실온에서 30∼120분간 처리하면 조직의 손상 없이 세포를 제거할 수 있다. 또는 0.1∼2.0% 농도의 트윈 20 용액으로 실온에서 30∼180분간 처리하거나, 0.2∼2% 농도의 트리톤 엑스-100 또는 노니데트피-40 용액으로 22-37℃에서 30∼180분간 처리하면 역시 조직의 손상 없이 세포를 제거할 수 있다.

상기 화학적인 방법 외에 물리적인 방법으로도 세포를 제거할 수 있는데, 진피층에 5∼60분간 10∼100 ㎑의 초음파를 처리하면 세포를 제거할 수 있다.

또는 계면활성제와 초음파를 조합하여 사용하여도 역시 조직의 손상 없이 세포를 제거할 수 있다.

또한, 용매(TNBP)와 계면활성제를 사용하여 세포 제거와 바이러스 제거를 동시에 할 수 있다.

추가로, 진피층에서 세포를 제거한 다음, 기저막층을 제거할 수 있다. 기저막을 제거할 경우에는 섬유아세포의 유입을 증대시키고 신혈관 생성작용을 촉진시킴으로써 피부로의 생착률을 높여 이식이 더욱 안정적으로 이루어질 수 있다.

기저막층을 진피조직으로부터 분리하는 방법은 물리적 방법과 인체에 무해한 화학물질을 이용한 화학적 방법 등이 있다. 물리적인 방법으로는 표피층이 제거된 진피층 윗면을 육절기를 사용하여 0.01 내지 0.5 mm(바람직하게는 0.05 내지 0.2 mm) 두께로 얇게 잘라주는 방법이 있다. 이 경우 육절기 칼날은 열 발생을 최소화하여 진피조직의 변성을 막을 수 있도록 탄소강 소재를 사용할 수 있다. 화학적 처리방법은 미세침이 부착된 롤러를 이용하여 기저막층의 상단 표면에 작은 구멍을 낸 후 기저막층을 진피층으로 분리하기 위해 0.3% 과산화수소수 용액을 1시간에서 3시간 가량 처리하면 진피조직의 파괴 없이 기저막을 제거할 수 있다. 기저막층을 제거함으로써 기존 이식 부위의 섬유아세포 등의 유입이 기존 진피조직 이식체에 비하여 월등히 증대되고 신혈관 생성 작용을 촉진시켜 피부로의 생착률을 향상시킬 수 있다.

제 3 단계는 진피층의 세포를 제거한 후, 다중 관통을 형성시킨다.

상기 다중 관통은 상기에서 설명한 바와 같이, 여러 가지 형태로 형성시킬 수 있다.

상기 다중 관통을 형성시키는 구체적인 방법으로 상기 1)의 다중 슬릿 형태는 Blade를 사용하여 수작업으로 실시하거나 다중 슬릿을 처리할 수 있는 기기(예를 들면, 다중 절단 칼날기, 피부확장기(Skin mesher) 등)를 사용하는 방법으로 실시할 수 있으며, 다공성 구조 관통의 경우에는 multiple needle layer를 사용하여 진피층을 모서리 부분을 고정 후 한쪽 방향으로 관통을 실시할 수 있다. 또한, 상기 2)의 다방향, 다중 관통 형태의 경우에는 수평의 각도를 유지한 채, 한쪽 방향으로 관통을 실시한 후 바로 옆면의 측면에서 관통을 추가하여 다중관통을 실시할 수 있다. 이때, 측면의 수평의 각도를 유지하여 아래층의 관통방향을 침해하여 조직의 물성이 유지되지 못하면 제품의 성상이 동결건조 후에 뒤틀릴 수 있으므로 이를 주의해야 한다.

제 4 단계는 다중 관통을 형성시킨 후 동결용액 처리 및 동결 건조하여 보존한다.

동결용액은 용액의 이온강도나 삼투압을 유지하는 완충용액, 얼릴 때 진피층 조직의 물리, 화학적인 손상을 막는 동결보호제, 건조할 때 진피층 조직의 구조 변화를 방지하는 건조보호제 등으로 구성된다. 동결보호제는 유리전이온도를 높여 얼어 있는 조직의 안정성을 높인다. 유리전이온도가 높아지면 조직 중에 육각형얼음 보다 덜 안정한 유리질의 얼음이나 정방형의 얼음의 비중을 높여 건조속도를 더 높일 수 있다. 또 유리질의 얼음과 정방형의 얼음은 얼음의 크기가 작아 조직을 덜 손상시킨다. 따라서 동결용액에는 반드시 동결보호제가 포함되어야 한다. 현재 많이 사용되는 동결보호제로는 디메틸설폭시드(DMSO), 덱스트란, 설탕, 프로필렌글리콜, 글리세롤, 마니톨, 솔비톨, 과당, 트레할로스, 라피노스, 2.3-부탄디올, 수산화에틸전분(HES), 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈(PVP), 프롤린, 헤타스타치, 혈청알부민 등이 있다. 이러한 성분들과 여러 가지 염기성분을 조합하여 동결용액을 제조하여 이용한다. 그 중 덱스트란, 글리세롤, 헤타스타치, 마니톨, 수산화에틸전분 등은 혈청대체물로도 이용되고 있으며, 또 폴리에틸렌글리콜의 경우 단백성 주사제의 안정제로도 이용되고 있어 안정성이 어느 정도 검증되어 있다. 이처럼 이미 인체에 해가 거의 없다고 알려진 물질들을 주성분으로 동결용액을 제조한다. 이렇게 제조한 동결용액에 진피층을 담그고 적절한 방법을 이용하여 동결용액이 잘 침투할 수 있도록 한다. 동결용액이 침투된 진피층을 -70 ℃ 이하(바람직하게는 - 40 ℃ 내지 -70 ℃)의 초저온 냉동고에 보관한다. 12시간 내지 48시간 동결 실시 후 동결건조기에 이동하여 동결건조시간을 24시간 내지 50시간 동안 시행하는 것이 바람직하다.

추가적으로, 동결 보존 후, 진피조직의 모서리 부분을 경사 처리할 수 있다. 구체적으로, 사각형 형태의 이식체 상부 말단의 면을 완만하게 처리하여 경사면을 형성시킨다. 이때, 이식체 상부 말단은 한쪽 또는 양쪽 모두일 수 있다. 또한, 경사면의 길이는 5 내지 10 mm가 바람직하며, 경사 처리된 부분의 높이는 1 내지 2 mm가 바람직하다. 특히, 경사 처리된 후의 이식체 높이는 경사 처리된 전의 이식체 높이의 60% 이상(바람직하게는 65 ~ 85%)가 적합하다.

이때, 기저막이 보존된 무세포 진피조직 이식체일 경우 경사처리되지 않은 면이 기저막이 있는 부위여야 한다. 경사처리 과정은 진피조직의 열을 발생시키지 않는 초음파 커터를 사용하여 무세포 진피조직 이식체를 지그에 고정한 상태에서 옆면을 잘라준다. 또한, 모서리 부분 경사 처리 시 물결 무늬, 쐐기(wedge) 무늬, 판상(flat) 무늬 등의 다양한 패턴으로 컷팅할 수 있다.

이렇게 제조된 다중 관통이 형성된 무세포 진피조직 이식체를 피부손상 치료제로 사용한다.

즉, 상기 다중 관통이 형성된 무세포 진피 이식체는 화상, 교통사고, 궤양 등에 의한 피부 복원제, 전층 피부 재건제, 비중격 재건제, 뇌척수 경막결손창의 재건제, 함몰교정제, 반흔교정제, 반안면 위축 교정제 등 피부과, 성형외과, 부인과, 외과, 신경외과, 비뇨기과, 이비인후과 영역에서 사용할 수 있다.

이하, 본 발명에 따르는 실시예 및 본 발명에 따르지 않는 비교예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 다중 슬릿 처리된 무세포 진피조직 이식체 제조

피부조직(조직은행으로부터 비영리 목적의 환자의 치료를 위해 기증받은 시신으로부터 채취)을 중성 단백질 분해효소인 디스파아제 1.0 units/㎖ 농도로 처리하고, 교반배양기에서 37 ℃의 온도로 60분 내지 120분 동안 교반 후 멸균 증류수로 3회 세척하여 진피층과 표피층을 분리하여 표피층을 제거하였다.

표피층을 제거한 조직을 1% 농도의 트리톤 엑스-100 용액으로 30 ℃에서 100분간 처리하여 진피층의 세포를 제거하였다.

표피층이 제거된 진피층을 다중 슬릿 형태로 만들어 주기 위해 블레이드(Blade)를 사용하여 수직 혹은 수평으로 슬릿을 만드는 작업을 수작업으로 실시하였다[도 4 및 도 7 참조].

동결용액으로 10%의 덱스트란 용액을 사용하고, 이 동결용액에 상기 기저막층이 제거된 진피조직을 -4 ℃에서 12시간 동안 담궈 동결용액이 잘 침투되도록 한 후, -70 ℃ 이하의 초저온 냉동고에 12시간 보관하고 동결건조기에 48시간 동결건조 하였다.

이 후 5 mm인 이식체(진피조직)의 모서리 부분을 경사 처리하는 과정은 다음과 같이 추가적으로 실시할 수 있다. 진피조직의 열을 발생시키지 않는 초음파 커터를 사용하여 경사면의 길이는 10 mm, 경사 처리된 부분의 높이는 2 mm가 되게 경사 처리한다.

실시예 2: 다공성 구조의 다중 관통 처리된 무세포 진피조직 이식체 제조

표피층이 제거된 진피층을 다공성 구조의 다중 관통 형태로 만들어 주기 위해 multiple needle layer를 사용하여 진피층을 모서리 부분을 고정 후 한쪽 방향으로 관통을 실시하여 다공성 구조의 다중 관통을 만드는 작업을 실시하였다.

실시예 3: 다방향 다중 관통 처리된 무세포 진피조직 이식체 제조

표피층이 제거된 다방향 다중 관통 처리된 형태로 만들어 주기 위해 수평의 각도를 유지한 채, 한쪽 방향으로 관통을 실시한 후 바로 옆면의 측면에서 관통을 추가하여 다중 관통 형성시켰다[도 5 및 도 6 참조].

비교예 1: 다중 관통이 형성되지 않은 무세포 진피조직 이식체 제조

상기 실시예 1에서 다중 슬릿 처리하는 단계를 생략한 것을 제외하고 상기 실시에 1과 동일하게 실시하여 무세포 진피조직 이식체를 제조하였다.

실험예 1: 자가조직 증식 확인

상기 실시예 1의 다중 슬릿 처리된 무세포 진피조직 이식체를 1X1 ㎠으로 잘라 DMEM 배지(Dulbeco's Modified Eagle's Medium)에 20분 동안 담가 놓은 후,준비한 섬유아세포 1 X 10⁶/30㎕를 다중 슬릿 처리된 무세포 진피조직 이식체에 접종하여, 37℃ 배양기에 5시간 동안 유착시킨 후, 세포가 떨어지지 않도록 주의해서 배양액이 세포를 접종한 다중 슬릿 처리된 무세포 진피조직 이식체를 충분히 잠기도록 넣어준 뒤, 3일간 서브머즈 배양(submerged state)하였다.

배양한 3일간의 다중 슬릿 처리된 무세포 진피조직 이식체를 10% 포르말린으로 고정한 후, 3차원 배양이 전체적으로 잘 되었는가를 보기 위해 Hematoxylin & Eosin 염색을 실시하여 관찰하였다.

다중 관통이 형성되지 않은 무세포 진피조직 이식체(비교예 1)를 동일한 방법으로 실험하여 비교하였다.

그 결과, 도 8과 같이 다중 슬릿 처리된 무세포 진피조직(실시예 1) 주변에 섬유아 조직이 많이 침투되어 생착이 되었음을 확인할 수가 있다[도 8 좌측의 검정 화살표]. 그에 반해 다중 관통이 형성되지 않은 무세포 진피조직(비교예 1)의 경우 침투된 섬유아 세포가 다중 슬릿 처리된 무세포 진피 조직에 비해 적음을 확인할 수가 있다[도 8 우측의 검정 화살표].

Claims

무세포 진피조직 이식체에 있어서,
다공성 구조의 다중 관통(multi-penetration)이 형성된 것을 특징으로 하는 무세포 진피조직 이식체.
제 1 항에 있어서,
상기 무세포 진피조직 이식체는 뼈, 인대, 건 또는 피부인 것을 특징으로 하는 무세포 진피조직 이식체.
제 1 항에 있어서,
추가로 모서리 부분이 경사 처리된 것을 특징으로 하는 무세포 진피조직 이식체.
제 1 항에 있어서,
상기 관통은 상단부에서 하단부까지 뚫린 형태이거나, 한 층은 좌우 일렬로 관통되고 다른 한 층은 전후 일렬로 관통되어 교대로 적층된 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 무세포 진피조직 이식체.
무세포 진피조직 이식체의 제조방법에 있어서,
다공성 구조의 다중 관통(multi-penetration)을 형성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 무세포 진피조직 이식체의 제조방법.
제 5 항에 있어서,
상기 무세포 진피조직 이식체는 뼈, 인대, 건 또는 피부인 것을 특징으로 하는 무세포 진피조직 이식체의 제조방법.
제 5 항에 있어서,
상기 무세포 진피조직 이식체의 제조방법은
표피층을 제거하는 단계;
진피층의 세포를 제거하는 단계;
다공성 구조의 다중 관통을 형성하는 단계; 및
동결 보존 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는 무세포 진피조직 이식체의 제조방법.
제 7 항에 있어서,
상기 동결 보존 단계 이후에 모서리 부분을 경사 처리하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 무세포 진피조직 이식체의 제조방법.
제 7 항에 있어서,
상기 표피층은 단백질 분해 효소를 이용하여 진피층과 분리시켜 제거하는 것을 특징으로 하는 무세포 진피조직 이식체의 제조방법.
제 7 항에 있어서,
상기 진피층의 세포는 계면활성제 또는 초음파 처리하여 제거하는 것을 특징으로 하는 무세포 진피조직 이식체의 제조방법.
제 7 항에 있어서,
상기 동결 보존은 동결보존제가 포함된 동결 용액에 진피층을 담궈 -70 ℃ 이하에서 보관하는 것을 특징으로 하는 무세포 진피조직 이식체의 제조방법.
제 5 항의 방법으로 제조된 무세포 진피조직 이식체.
제 1 항 또는 제 12 항에 따른 무세포 진피조직 이식체를 포함하는 피부손상 치료제.