KR20110027880A

KR20110027880A - 동결보존 무세포 진피 기질의 제조 방법 및 그로부터 제조된 동결보존 무세포 진피 기질

Info

Publication number: KR20110027880A
Application number: KR1020090085666A
Authority: KR
Inventors: 전욱; 최원익; 박만성; 김근형; 정재득
Original assignee: 한림대학교 산학협력단
Priority date: 2009-09-11
Filing date: 2009-09-11
Publication date: 2011-03-17
Also published as: KR101107022B1; WO2011031077A2; US20120189707A1; WO2011031077A3; CN102573945B; CN102573945A

Abstract

본 발명은 동결보존 무세포 진피 기질의 제조 방법 및 그로부터 제조된 동결보존 무세포 진피 기질에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 글리세롤 및 기본 용액을 기본 성분으로 하여 이에 수크로스를 첨가하여 동결 보호제를 만들고, 이 용액을 이용하여 표피 및 진피 내 세포가 제거된 피부 조직을 동결보존 처리하는 방법 및 그로부터 제조된 동결보존 무세포 진피 기질에 관한 것이다.

동종 피부, 동결 보존, 수크로스, 무세포 진피 기질

Description

동결보존 무세포 진피 기질의 제조 방법 및 그로부터 제조된 동결보존 무세포 진피 기질{METHOD FOR PREPARING CRYOPRESERVED ACELLULAR DERMAL MATRIX AND CRYOPRESERVED ACELLULAR DERMAL MATRIX PREPARED THEREFROM}

본 발명은 동결보존 무세포 진피 기질(acellualr dermal matrix, ADM)의 제조 방법 및 그로부터 제조된 동결보존 무세포 진피 기질에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 글리세롤 및 기본 용액을 기본 성분으로 하여 이에 수크로스를 첨가하여 동결 보호제를 만들고, 이 용액을 이용하여 표피 및 진피 내 세포가 제거된 피부 조직을 동결보존 처리하는 방법 및 그로부터 제조된 동결보존 무세포 진피 기질에 관한 것이다.

피부는 인체 표면 전체를 덮고 있는 가장 큰 장기로서 체액의 유실 및 외부로부터 유해물질과 미생물의 유입을 막고, 물리적, 화학적 자극 등으로부터 우리 몸을 보호하는 기능을 수행하고 있다. 심한 화상, 외상, 상피암 절제 및 피부 질환 등으로 피부가 심각하게 손실된 환자의 경우, 손실 부위의 감염 및 체액의 손실을 막아주는 보호막의 기능과 함께 환자의 상처 부위에 흉터가 남지 않고, 자연치유과정에서 발생될 수 있는 심각한 수축을 막아 주어야 한다. 손상된 피부 조직을 재생 시키기 위한 방법으로는 환자 자신의 피부를 이식하는 자가 이식(autograft), 다른 사람의 피부를 이식하는 동종이식(allograft), 동물의 피부를 이식하는 이종이식(xenograft)의 세가지 방법이 있다. 이들 방법 중 자가이식이 가장 이상적이지만, 화상부위가 광범위한 경우 조직을 확보할 수 있는 부위에 제한이 따르며, 채취 부위가 새로운 상처 부위로 남게 되는 어려움이 있다. 동종이식은 영구적인 생착 보다는 상처 주변부의 세포의 이동과 치유를 돕는 역할을 한다.

특별히 표피층, 진피층 및 피하층까지 손상되는 3도 화상의 경우에는 피부이식 치료가 필수적으로 요구된다. 현재 주로 사용되고 있는 피부이식 치료는 자가이식 방법을 이용하는데, 피부를 떼어낸 건강한 부위에 새로운 외상이 발생되어 환자의 고통이 증가하고, 완치되는데 시간이 많이 소요되며, 경제적 부담 또한 크다. 또한 심한 화상환자와 같이 건강한 신체부위가 충분히 남아있지 않는 경우에는 자가 이식방법을 적용할 수 없거나 또는 여러 차례에 걸쳐 이식수술을 시행하여야 한다는 문제점이 있다. 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 다른 사람의 피부를 이용하는 동종이식, 돼지 등과 같은 다른 동물의 피부를 이용하는 이종이식 등이 시도되고 있으나, 면역거부 반응뿐만 아니라 다른 부작용을 종종 초래하고 있다.

따라서, 가장 일반적으로 국내외 병원에서 시행하는 화상수술의 경우 먼저 죽은 표피층과 진피층을 제거하고 면역거부반응을 없애기 위해 기증된 사체의 피부에서 표피를 제거한 후 진피 내 세포들을 제거한 무세포 진피를 이용하여 피부 이식을 수행한다. 이 후 배양된 각질 세포가 그 위에 온전한 피부를 완성하게 된다. 이렇게 완성된 피부는 기저막층을 포함하고 있어 실제 피부와 같이 외부 유해 물질 로부터 우리 몸을 보호하는 역할을 수행할 수 있다. 하지만 이러한 이식용 피부는 워낙 고가인데다 대부분 수입산이기 때문에 수급이 원활하지 않다는 문제가 있다. 면역거부반응을 없애기 위해 기증된 사체의 피부에서 표피를 제거한 후 진피 내 세포들을 제거한 무세포 진피 기질은 보관의 편의성을 위해 동결 후 주로 많이 사용되는데 동결 중 무세포 진피 내 콜라겐 조직들이 파괴되어 이식 후 빨리 분해되는 문제점이 있다.

따라서, 본 발명은 이식용 피부를 가공 시 종래의 방법 보다 효과적으로 조직의 안전성을 높이고 세포외 기질(extracellular matrix) 구조가 손상 없이 유지될 수 있는 새로운 동결보존 무세포 진피 기질의 제조 방법을 제공하는 것을 그 기술적인 과제로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은

i) 동종 피부의 표피를 제거하고;

ⅱ) 진피 내 세포를 제거하며;

ⅲ) 글리세롤; 및 완충용액 및 동물세포배양배지로부터 선택되는 기본용액을 혼합하고;

ⅳ) 상기 용액에 수크로스를 최종 농도가 20 내지 40 중량%가 되도록 용해하여 동결 보호제를 제조하며;

ⅴ) 상기 동결 보호제를 상기 표피 및 진피 내 세포가 제거된 피부에 침투시키고;

ⅵ) 동결 보호제가 침투된 피부를 controlled rate freezer에서 동결하는 것을 포함하는 동결보존 무세포 진피 기질의 제조 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 방법에 의하여 제조된 동결보존 무세포 진피 기질을 포함하는 자가이식 대체물을 제공한다.

이하에서 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명에서 동종피부는 면역거부반응을 없애기 위하여 표피가 제거된 후 진피 내 세포가 제거된다. 표피 및 진피 내 세포의 제거는 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 수행될 수 있고 이에 특별한 제한은 없다. 표피를 제거하는 것은, 예를 들면 트립신(trypsin), 콜라게나제(collagenase) 또는 디스파제(dispase) 등의 효소나 NaCl 용액으로 처리함으로써 수행될 수 있다. 진피 내 세포를 제거하는 것은, 예를 들면 Triton X100, Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80 또는 SDS(sodium dodecylsulfate) 등으로 처리함으로써 수행될 수 있다.

본 발명에서 동결 보호제의 기본 성분으로는 글리세롤 및 기본용액이 사용된다. 본 발명에서 기본용액은 동결 보호제를 제조 시 기본(base)이 되는 용액을 의미하고, 동물세포 처리시 사용되는 완충용액 또는 동물세포배양배지가 사용될 수 있다. 본 발명에서 완충용액은 당업계에서 동물세포의 처리 시 사용되는 것인 한 특별한 제한 없이 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 완충용액은 예를 들면 인산완충용액(phosphate buffered saline, PBS), TBS(Tris-buffered saline), 시트르산 완충용액(citric acid buffer) 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 동물세포배양배지는 당업계에 공지된 임의의 배지가 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 동물세포배양배지는, 예를 들면 MEM(Minimum Essential Media), DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Media), RPMI 1640, IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Media), Defined Keratinocyte-SFM(without BPE), Keratinocyte-SFN(with BPE), KnockOut D-MEM, AmnioMAX-II Complete Medium, AmnioMAX-C100 Complete Medium 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 글리세롤 및 기본용액은 바람직하게는 중량 기준으로 0.5~3.5 : 9, 더 바람직하게는 0.8~2 : 9, 가장 바람직하게는 1 : 9의 혼합비로 사용된다. 본 발명에서 글리세롤 혼합비가 0.5 미만이면 동결 시 냉해로 인한 문제가 있을 수 있고, 3.5를 초과하면 동결 후 조직의 변성이 유도될 수 있다.

본 발명에서 동결 보호제는 상기 글리세롤 및 기본용액이 혼합된 용액에 수크로스(sucrose)를 최종 농도가 20 내지 40 중량%가 되도록 용해함으로써 제조된다. 본 발명에서 동결 보호제에 수크로스가 첨가되면 세포막과 세포막 단백질을 동결 시 나타나는 얼음결정으로부터 보호하고 안정화시키는 역할을 한다. 따라서 본 발명에 따라 제조된 동결보존 무세포 진피 기질의 조직의 안전성이 향상될 수 있고, 글리세롤, 기본용액 및 수크로스의 이상적인 혼합비로 더욱 진피조직의 안전성을 향상되고 세포외 기질의 구조가 손상 없이 유지될 수 있다. 본 발명에서 동결 보호제에 수크로스가 20 중량% 미만으로 포함되면 동결 시 얼음 결정으로 인해 조직의 안전성 등이 미약해질 수 있고, 40 중량%를 초과하여 포함되면 고농도의 당 성분으로 인하여 동결건조 후 조직에 당 결정이 생성되어 조직의 안전성에 영향을 미칠 수 있다. 본 발명에서 동결 보호제는 바람직하게는 상기 기본 성분이 혼합된 용액에 수크로스를 최종 농도가 25 내지 35 중량%, 가장 바람직하게는 30 중량%가 되도록 용해함으로써 제조된다.

본 발명에서 피부 조직에 동결 보호제를 침투시키는 것은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 이루어질 수 있고, 바람직하게는 저온 반응기에서 피부에 동결 보호제를 침투시킨다. 침투에 걸리는 시간은 피부 조직의 크기 등에 따라 다양할 수 있고, 예를 들면 4℃의 저온 반응기에서 약 6 시간 내지 24 시간 동안 침투시킬 수 있다.

본 발명에서 동결 보호제가 침투된 피부는 온도 조절이 가능한 controlled rate freezer를 사용하여 동결한다. 동결 시 온도 조절이 가능한 동결건조기를 사용하면 원하는 속도로 피부를 동결할 수 있다. 본 발명에서 온도 조절이 가능한 controlled rate freezer를 사용하여 피부를 동결하는 속도는 바람직하게는 분당 -0.1℃ 내지 -7℃, 더 바람직하게는 -0.5℃ 내지 -5℃, 더 바람직하게는 -0.8℃ 내지 -3℃, 가장 바람직하게는 분당 -1℃이다. 본 발명에서 동결을 시킬 경우 동결속도가 분당 -0.1℃ 미만이어서 너무 천천히 동결이 될 경우 조직 내의 용질이 조직 외보다 많기 때문에 동결속도가 낮아져 냉동 온도가 천천히 내려가 조직 바깥에 먼저 큰 얼음결정들이 생기면서 조직을 파괴시키는 문제가 있을 수 있다, 또한 동결보호제가 침투된 피부의 온도와 controlled rate freezer 챔버의 온도는 같을 수가 없기 때문에 냉동 시 잠재용융열이 발생하는 구간에서부터 물분자의 움직임 없는 온도인 -80℃까지 급속한 동결로 속도가 분당 -7℃를 초과하여 잠재용융열을 조절하지 못하면 얼음결정현상으로 인한 조직의 파괴 문제가 있을 수 있다.

본 발명의 방법에 따라 제조된 동결보존 무세포진피 기질은 조직의 안전성이 높고 세포외 기질(extracellular matrix) 구조 및 기저막(basement membrane)이 손상 없이 유지되어 자가이식의 대체물로서 효과적으로 사용될 수 있다.

이하에서 본 발명을 실시예로 보다 상세하게 설명한다. 다만, 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 이에 의하여 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

기증자(시체)로부터의 인체 피부조직의 용도가 제한됨에 따라 인체 피부에 가까운 돼지 피부를 사용하여 하기 실시예 및 비교예의 방법에 따라 각각 10개씩 제작하였다.

실시예

돼지 피부를 사용하여 다음의 단계에 따라 동결보존 피부를 준비하였다.

(1) 돼지 피부를 생리식염수로 깨끗이 세척하였다.

(2) 돼지 피부를 각각 5 × 10 cm²의 크기로 절단하였다.

(3) 1M NaCl(Sigma, 미국) 용액에 돼지피부를 각각 넣었다.

(4) 38℃ 반응기(P-039, 코아테크)를 준비하였다

(5) 1M NaCl(Sigma, 미국) 용액에 담긴 돼지피부를 38℃ 반응기에서

교반하며 약 6 시간 내지 24 시간 동안 반응시켰다.

(6) 포셉을 이용해 표피를 제거하였다.

(7) 인산완충용액(pH 7.2, GIBCO, 미국)으로 표피가 제거된 진피를 세척하였다.

(8) 세척된 진피를 0.1% SDS에 넣고 상온에서 1시간 동안 교반하며 반응시켜 진피 내 세포를 제거하였다.

(9) 인산완충용액으로 세포가 제거된 진피를 세척하였다.

(10) 글리세롤(Sigma, 미국) 및 인산완충용액을 1 : 9의 중량비로 혼합하였다.

(11) (10)의 용액에 최종 농도가 30%가 되도록 수크로스(Sigma, 미국)를 넣고 용해시켜 동결 보호제를 만들었다.

(12) 4℃ 저온 반응기(P-039, 코아테크)를 준비하였다.

(13) 4℃ 저온 반응기에 (9)의 돼지 피부를 넣은 다음 동결 보호제를 12시간 동안 침투시켰다.

(14) 침투가 완료된 돼지피부를 폴리아마이드 백(CryoBag, Origen, 미국)에 넣었다.

(15) Controlled rate freezer(14S-A, SY Lab, 미국)를 준비하였다.

(16) (14)의 폴리아마이드 백을 controlled rate freezer 안으로 넣고 분당 -1℃의 속도로 -150℃까지 동결하였다.

(17) 동결이 끝나고 난 후 폴리아마이드 백을 분석 실험 전까지 드라이 쉬퍼에 냉동 보관하였다.

비교예

돼지 피부를 사용하여 다음의 단계에 따라 동결건조 피부를 준비하였다.

(1) 돼지 피부를 생리식염수로 깨끗이 세척하였다.

(2) 돼지 피부를 각각 5 × 10 cm²의 크기로 절단하였다.

(3) 1M NaCl(Sigma, 미국) 용액에 돼지피부를 각각 넣는다.

(4) 38℃ 반응기(P-039, 코아테크)를 준비하였다.

(5) 1M NaCl 용액에 담긴 돼지피부를 38℃ 반응기에서 교반하며 약 6 시간 내지 24 시간 동안 반응시켰다.

(6) 포셉을 이용해 표피를 제거하였다.

(7) 인산완충용액으로 표피가 제거된 진피를 세척하였다.

(9) 인산완충용액(pH 7.2, GIBCO, 미국)으로 세포가 제거된 진피를 세척하였다.

(10) 글리세롤(Sigma, 미국) 및 인산완충용액을 1 : 9의 중량비로 혼합하여 동결보존용액을 만들었다.

(11) 4℃ 저온 반응기(P-039, 코아테크)를 준비하였다.

(12) 4℃ 저온 반응기에 (9)의 돼지 피부를 넣은 다음 동결 보호제를 12시간 동안 침투시켰다.

(13) 침투가 완료된 돼지피부를 Tyvek 백(Tyvek bag, 고려신소재, 한국)에 넣었다.

(14) 동결건조기를(Genesis 25XL, VirTis, 미국)를 준비하였다.

(15) (13)의 Tyvek 백을 동결건조기에 넣고 분당 -1℃의 속도로 -70℃까지 동결하였고, 진공 5 torr인 동결건조기에 넣어 24시간 동안 건조시켜 동결건조된 무세포 진피 기질을 만들었다.

(16) 동결 건조가 끝나고 난 후 E.O. 가스 멸균기(HS-4313EO, 한신메디칼, 한국)에 넣어 멸균시켰다.

(17) 멸균된 동결건조 무세포 진피 기질을 알루미늄 백에 넣어 밀봉 후 실험 전까지 상온 보관하였다.

실험예 1: 조직학적 검사

상기 실시예 및 비교예에 따라 준비된 돼지 피부를 H&E 염색법을 아래와 같이 실행하였다.

(1) 파라핀 블록을 4㎛ 두께로 박절한 후 건조시켜 파라핀 절편을 제작하였 다.

(2) 탈파라핀 과정을 위해 자일렌에서 5분간 3번, 100% 에탄올에서 2분간 3번, 90% 에탄올에서 1분간 1번, 80% 에탄올에서 1분간 1번, 70% 에탄올에서 1분간 1번 반응시킨 후, 흐르는 물에 10분간 세척하였다.

(3) 헤마토자일린(Hematoxylin) 염색액에 10분간 반응시킨 후 흐르는 물에 3분간 세척하고, 에오신(Eosin) 염색액에 10분간 반응시킨 후 흐르는 물에 에오신 염색액이 나오지 않을 때까지 세척하였다. 70% 에탄올에 1초간 10번, 80% 에탄올에 1초간 10번, 90% 에탄올에 1초간 10번, 100% 에탄올에 1분간 2번, 자일렌에 3분간 3번 반응시킨 후, 마운팅 용액으로 마운팅 하였다.

상기 실시예 및 비교예에 따라 준비된 돼지 피부를 주사전자현미경 관찰을 위하여 아래와 같이 실행하였다.

(1) 시료를 2.5% glutaraldehyde 용액(Fixative solution)에서 2시간 동안 전고정하고, 0.1M 인산 완충용액으로 세척 후 1% OsO₄ 용액으로 후고정을 하였다.

(2) 에탄올 농도 상승 순으로 탈수/치환하여 -190℃의 액체질소 내에서 동결할단하여 시료의 단면을 노출시킨 후, 임계점 건조기(HCP-2)를 이용하여 완전히 건조시켰다.

(3) 노출된 시료의 단면이 위쪽을 향하도록 하여 알루미늄 Stub(시료고정대)에 부착하여, 금속이온코팅장비(E-1030 Ion sputter)에서 Pt-Pd로 약 10nm 두께로 금속코팅 하였다.

(4) 주사전자현미경(Hitachi S-4700, 일본)으로 관찰 및 촬영을 하였다.

실시예 및 비교예의 피부를 광학 현미경(Olympus BX51, H&E staining) 및 주사 전자현미경(Hitachi S-4700, 일본)으로 촬영하여 도 1 및 도 2에 나타내었다.

도 1 및 도 2의 결과로부터, 비교예에 비하여 실시예의 경우가 조직 내의 진피를 구성하는 콜라겐 구조적 안전성이 훨씬 더 뛰어남을 알 수 있었다.

또한 도 1 및 도 2의 현미경 사진으로부터 비교예에 비해 실시예에서 동결 과정 중에 일어나는 조직의 파괴가 확연히 적음을 알 수 있었다.

즉, 본 발명의 처리 방법이 종래의 동결건조 처리 방법에 비해 높은 조직의 안전성을 보임으로서 본 발명의 처리 방법에 의해 만들어진 무세포진피의 이식율을 높이고 치료시간을 단축시킬 수 있다.

실험예 2: 콜라겐 분해효소에 의한 분해성 측정

수크로스 농도 차이에 따른 무세포 진피 기질의 안정성을 살펴보기 위하여 콜라겐 분해효소에 의한 분해성을 다음과 같이 측정하였다.

(1) 25㎎의 시료를 5㎖의 0.36mM 염화칼슘(calcium chloride)이 첨가된 5mM TES buffer에 넣고 잘 섞었다.

(2) 0.1㎎/㎖의 콜라겐 분해효소(collagenase) 0.1㎖을 (1)의 시료에 넣고 잘 섞어 주면서 37℃에서 하루 동안 반응시켰다.

(3) 4.0mM의 L-leucine standard solution을 연속적으로 희석(serial dilution)한 후, ninhydrin color reagent를 처리하여 570nm에서 흡광도(VERSA max, Molecular Device, 미국)를 측정하여 표준곡선을 작성하였다.

(4) (2)의 시료를 ninhydrin color reagent를 처리하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다.

(5) (3)의 L-leucine의 표준곡선을 이용하여 각각 시료의 방출된 L-leucine의 양을 계산하였다.

상기에서 계산된 L-leucine 방출량을 도 3에 나타내었다. 도 3에서 볼 수 있듯이, 수크로스를 최종농도 20 내지 40 중량%로 포함하는 동결 보호제로 처리한 동결보존 무세포 진피 기질은 조직의 안정성이 높아서 콜라겐 분해효소에 의한 분해 속도가 현저하게 감소됨을 알 수 있었다.

도 1은 실시예 및 비교예의 무세포 진피 기질을 주사전자현미경으로 60 배 및 150배 확대하여 촬영한 사진이다. (A: 비교예, 60X; B: 비교예, 150X; C: 3 실시예, 60X; D: 실시예, 150X)

도 2는 실시예 및 비교예의 무세포 진피 기질을 H&E 염색 후 광학 현미경으로 100배 및 200배 확대하여 촬영한 사진이다. (A: 비교예, 100X; B: 비교예, 200X; C: 실시예, 100X; D: 실시예, 200X)

도 3은 수크로스를 최종 농도 10, 15, 20, 25, 30, 35 및 40 중량%로 포함하는 동결 보호제로 처리한 동결보존 무세포 진피 기질에 대하여 콜라겐 분해효소에 의한 분해성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. (P.C.(positive control): 콜라겐 분말을 콜라겐 분해효소 처리; N.C.(negative control): 콜라겐 분해효소 처리 안 함; D.W.: 증류수)

Claims

i) 동종 피부의 표피를 제거하고;

ⅱ) 진피 내 세포를 제거하며;

ⅲ) 글리세롤; 및 완충용액 및 동물세포배양배지로부터 선택되는 기본용액을 혼합하고;

ⅳ) 상기 용액에 수크로스를 최종 농도가 20 내지 40 중량%가 되도록 용해하여 동결 보호제를 제조하며;

ⅴ) 상기 동결 보호제를 상기 표피 및 진피 내 세포가 제거된 피부에 침투시키고;

ⅵ) 동결 보호제가 침투된 피부를 controlled rate freezer에서 동결하는 것을 포함하는 동결보존 무세포 진피 기질의 제조 방법.
제1항에 있어서, 글리세롤 및 기본용액의 혼합비가 중량 기준으로 0.5~3 : 9인 것을 특징으로 하는 동결보존 무세포 진피 기질의 제조 방법.
제1항에 있어서, 완충용액이 인산완충용액(PBS), TBS(Tris-buffered saline) 및 시트르산 완충용액(citric acid buffer)으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 동결보존 무세포 진피 기질의 제조 방법.
제1항에 있어서, 동물세포배양배지가 MEM(Minimum Essential Media), DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Media), RPMI 1640, IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Media), Defined Keratinocyte-SFM(without BPE), Keratinocyte-SFN(with BPE), KnockOut D-MEM, AmnioMAX-II Complete Medium 및 AmnioMAX-C100 Complete Medium 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 동결보존 무세포 진피 기질의 제조 방법.
제1항에 있어서, 수크로스의 최종 농도가 30 중량%인 것을 특징으로 하는 동결보존 무세포 진피 기질의 제조 방법.
제1항에 있어서, 동결 보호제를 분리된 피부에 침투시키는 것이 4℃의 저온 반응기에서 6 시간 내지 24 시간 동안 침투시키는 것을 특징으로 하는 동결보존 무세포 진피 기질의 제조 방법.
제1항에 있어서, 동결 보호제가 침투된 피부를 controlled rate freezer에서 분당 -1℃의 속도로 동결하는 것을 특징으로 하는 동결보존 무세포 진피 기질의 제조 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 제조된 동결보존 무세포 진피 기질을 포함하는 자가이식 대체물.