CN106310384A - 一种脱细胞异种真皮及其制取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脱细胞异种真皮及其制备方法，其制备方法包括猪真皮片获取保存以及脱细胞处理，猪真皮片保存时添加有冷冻防护剂，脱细胞处理采用温和洗涤剂打破细胞。本发明无需反复冻融，冷冻的过程中添加有冷冻防护剂，减少了对胶原蛋白的生物活性的破坏，有利于创面的尽快恢复；通过核糖核酸酶溶液有效去除残留核糖核酸，避免了残留核糖核酸引起不良的反应；通过alpha-半乳糖苷酶溶液有效的去除alpha-半乳糖，减轻甚至避免了alpha-半乳糖引起人体的急性免疫反应；通过在防辐射保护剂里进行电子束端灭菌或者在干冰条件下的γ辐照，灭菌的同时降低了辐射对猪真皮片的损害；通过采用铝箔里外双层袋包装，便于医生打开使用。
Description
技术领域
本发明涉及医学烧伤及整形专科临床应用医用材料领域，具体是指一种脱细胞异种真皮及其制取方法。
背景技术
众所周知，在医学烧伤及整形专科临床中，严重创伤及大面积烧伤患者存在皮肤缺失的巨大创面，在治疗中消灭创面需要进行皮肤移植，使用的皮源可以为同种真皮和异种真皮。由于同种真皮来源不足，目前，皮肤移植主要采用异种真皮。
使用异种真皮进行皮肤移植存在一个关键的技术要点：要在脱细胞时最小限度的损坏真皮基质的三维结构，同时保障胶原蛋白具有充分的生物活性，以提供必要的环境和生长因子促进创面的修复。
以公开号为CN 103520773 A和CN
103520772 A的专利申请为例，目前对于异种真皮脱细胞处理通常采用的反复冻融达到破坏细胞的目的。反复冻融技术虽然能够有效的破坏细胞，但是在每次冻融的过程中均会导致胶原蛋白损伤，不利于创面的恢复。
发明内容
本发明的目的在于：克服现有技术上述缺陷，提供一种脱细胞异种真皮及其制备方法。该种脱细胞异种真皮，在实现脱细胞的同时，避免了反复冻融，能够最大限度的保障胶原蛋白的生物活性，利于创面的恢复。
本发明通过下述技术方案实现：
一种脱细胞异种真皮制备方法，依次包括以下步骤，
步骤A：制取猪真皮片；
步骤B：对猪真皮片进行消毒处理；
步骤C：使用磷酸盐缓冲盐水充分清洗消毒后的猪真皮片；
步骤D：将猪真皮片与冷冻防护剂充分混合后保存在冻箱中备用；
步骤E：取出冷冻猪真皮片在室温下融化，然后加入磷酸盐缓冲盐水充分清洗猪真皮片；
步骤F：加入脱细胞液，将猪真皮片与脱细胞液充分混合以及反应，所述脱细胞液含有温和洗涤剂；
步骤G：吸出脱细胞液，然后加入磷酸盐缓冲盐水充分清洗猪真皮片。
作为一种优选的方式，所述冷冻防护剂为甘油水溶液或多糖，当冷冻防护剂为甘油水溶液时，甘油的体积百分比浓度为20%或大于等于30%；当冷冻防护剂为多糖时，所述冷冻防护剂为葡聚糖凝胶、蔗糖和天然蜂蜜中的一种或者几种。
作为一种优选的方式，所述步骤D中还添加有乙二胺四乙酸。
作为一种优选的方式，所述脱细胞液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液，其PH值为8，每升4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液含20毫摩尔4-羟乙基哌嗪乙磺酸，所述温和洗涤剂为十二烷基聚乙二醇醚、乙基苯基聚乙二醇和脱氧胆酸钠中的一种或者几种，当所述温和洗涤剂为脱氧胆酸钠时，脱氧胆酸钠的质量体积百分比溶度为2%。
作为一种优选的方式，所述脱细胞液中还添加有乙二胺四乙酸。
作为一种优选的方式，所述脱细胞液体积与猪真皮片体积之比为30:1。
作为一种优选的方式，步骤G之后还依次具有下列步骤，
步骤H：加入核糖核酸酶溶液，并进行充分混合以及反应，所述核糖核酸酶溶液内的核糖核酸酶通过人工重组合成或直接从动物组织提取，所述核糖核酸酶溶液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液，每升4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液含20毫摩尔4-羟乙基哌嗪乙磺酸、2.5毫摩尔氯化镁、0.5毫摩尔氯化钙以及0.5克核糖核酸酶，其PH值为8，核糖核酸酶溶液体积与猪真皮片体积之比为20:1；
步骤I：吸出核糖核酸酶溶液，然后加入磷酸盐缓冲盐水充分清洗猪真皮片。
作为一种优选的方式，步骤I之后还依次具有下列步骤，
步骤J：加入alpha-半乳糖苷酶溶液进行充分混合以及反应，所述alpha-半乳糖苷酶溶液通过柠檬酸盐缓冲液添加alpha-半乳糖苷酶制得；
步骤K：吸出alpha-半乳糖苷酶溶液，然后加入磷酸盐缓冲盐水充分清洗猪真皮片。
作为一种优选的方式，步骤K之后还依次具有下列步骤，
步骤M：加入保存液进行充分混合，保存液为磷酸盐缓冲盐水，其内含乙二胺四乙酸以及体积百分比溶度为20%的甘油；
步骤N：取出猪真皮片，包装在铝箔里外双层袋中；
步骤O：对步骤N中包装好的铝箔里外双层袋进行灭菌处理，所述灭菌处理为在防辐射保护剂里进行电子束灭菌、在干冰条件下的γ辐照灭菌、超临界二氧化碳处理和环氧乙烷灭菌中的一种。
一种脱细胞异种真皮，采用上述方法制得。
本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：
（1）本发明与反复冻融技术相比，采用温和洗涤剂打破细胞，无需反复冻融，且在冷冻的过程中添加有冷冻防护剂，有效的阻止了冰晶的生产，减少了对胶原蛋白的生物活性的破坏，有利于创面的尽快恢复；
（2）本发明通过核糖核酸酶溶液能够有效的去除残留的核糖核酸，避免残留的核糖核酸引起烧伤创面的不良反应；
（3）本发明通过alpha-半乳糖苷酶溶液能够有效的去除alpha-半乳糖，减轻甚至避免了alpha-半乳糖引起的人体急性免疫反应，减少了alpha-半乳糖对烧伤创面的负面影响，有利于尽快恢复；
（4）本发明通过在防辐射保护剂里进行的电子束端灭菌或者在干冰条件下的γ辐照，能够在灭菌的同时降低了辐射对猪真皮片的损害；
（5）本发明通过采用铝箔里外双层袋包装猪真皮片，便于医生在手术台上打开内袋使用。
附图说明
图1为猪真皮片获取保存流程图；
图2为脱细胞处理流程图；
图3为残留核糖核酸去除流程图；
图4为alpha-半乳糖去除流程图；
图5为脱细胞异种真皮的保存流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了相互排斥的特质和/或步骤以外，均可以以任何方式组合，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换，即，除非特别叙述，每个特征之一系列等效或类似特征中的一个实施例而已。
实施例1：
参见图1和图2，一种脱细胞异种真皮制备方法，依次包括以下步骤，
步骤A：制取猪真皮片。具体操作为清洗成熟大白猪（约克夏猪种）猪背部皮，去毛刀去毛后，以取皮鼓切取厚度为0.25毫米厚的皮片抛弃不用（作用：除去表皮，毛发及毛囊），再用取皮鼓取厚度为0.50-0.75 毫米厚真皮片备用。本领域内的技术人员应知，原料不受猪种、猪龄限制，成熟大白猪猪背部皮仅为一种优选方式，优选原因为其取材方便，可取原料多。
步骤B：对猪真皮片进行消毒处理。具体操作为将猪真皮片放入无菌瓶中，加入质量分数为0.5%的过氧乙酸消毒液里浸泡40分钟。
步骤C：使用磷酸盐缓冲盐水充分清洗消毒后的猪真皮片。具体操作为使用磷酸盐缓冲盐水清洗3次，每次均在摇床上摇30分钟。
步骤D：将猪真皮片与冷冻防护剂充分混合后保存在冻箱中备用。冷冻防护剂为甘油水溶液或多糖，当冷冻防护剂为甘油水溶液时，甘油的体积百分比浓度为20%或大于等于30%；当冷冻防护剂为多糖时，所述冷冻防护剂为葡聚糖凝胶、蔗糖和天然蜂蜜中的一种或者几种。冷冻防护剂的主要作用在于阻止冰晶的生成，避免冰晶生成损害猪真皮内的胶原蛋白。作为优选，步骤D中还可加入乙二胺四乙酸，乙二胺四乙酸的添加可抑制细菌的生长，乙二胺四乙酸与冷冻防护剂的配比优选为每升冷冻防护剂含20毫摩尔乙二胺四乙酸。
步骤E：取出冷冻猪真皮片在室温下融化，然后加入磷酸盐缓冲盐水充分清洗猪真皮片。具体操作为使用磷酸盐缓冲盐水清洗3次，每次均在摇床上摇30分钟。
步骤F：加入脱细胞液，将猪真皮片与脱细胞液充分混合以及反应，具体操作为在摇床上混合10小时，所述脱细胞液含有温和洗涤剂。作为一种优选的方式，所述脱细胞液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液，其PH值为8，每升4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液含20毫摩尔4-羟乙基哌嗪乙磺酸，所述温和洗涤剂为十二烷基聚乙二醇醚、乙基苯基聚乙二醇和脱氧胆酸钠中的一种或者几种，当温和洗涤剂为脱氧胆酸钠时，脱氧胆酸钠的质量体积百分比溶度为2%，脱细胞液的体积与猪真皮片体积之比为30：1。作为优选，步骤F中还可加入乙二胺四乙酸，乙二胺四乙酸的添加可抑制细菌的生长，乙二胺四乙酸与冷冻防护剂的配比优选为每升脱细胞液含20毫摩尔乙二胺四乙酸。
步骤G：吸出脱细胞液，然后加入磷酸盐缓冲盐水充分清洗猪真皮片。具体操作为使用磷酸盐缓冲盐水清洗3次，每次均在摇床上摇30分钟。
本实施例中，步骤A~D为猪真皮片的获取保存方法，步骤E~G为脱细胞处理方法。
实施例2：
参见图1、图2和图3，本实施例在实施例1的基础上，步骤G之后还依次具有下列步骤，
步骤H：加入核糖核酸酶溶液，并进行充分混合以及反应，所述核糖核酸酶溶液内的核糖核酸酶通过人工重组合成或直接从动物组织提取，所述核糖核酸酶溶液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液，每升4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液含20毫摩尔4-羟乙基哌嗪乙磺酸、2.5毫摩尔氯化镁、0.5毫摩尔氯化钙以及0.5克核糖核酸酶，其PH值为8，核糖核酸酶溶液体积与猪真皮片体积之比为20:1。
步骤I：吸出核糖核酸酶溶液，然后加入磷酸盐缓冲盐水充分清洗猪真皮片。具体操作为吸出核糖核酸酶溶液，使用磷酸盐缓冲盐水清洗3次，每次均在摇床上摇30分钟。
本实施例中，步骤H~I为残留核糖核酸去除方法。通过步骤H~I能够有效的去除细胞残留的核糖核酸，避免异种真皮移植后产生不良反应。本实施例的其他部分与实施例1相同，这里就不再赘述。
实施例3：
参见图1、图2、图3和图4，本实施例在实施例2的基础上，步骤I之后还依次具有下列步骤，
步骤J：加入alpha-半乳糖苷酶溶液进行充分混合以及反应，所述alpha-半乳糖苷酶溶液通过柠檬酸盐缓冲液添加alpha-半乳糖苷酶制得。具体操作为在摇床上摇10小时。
步骤K：吸出alpha-半乳糖苷酶溶液，然后加入磷酸盐缓冲盐水充分清洗猪真皮片。具体操作为吸出alpha-半乳糖苷酶溶液，使用磷酸盐缓冲盐水清洗3次，每次均在摇床上摇30分钟。
本实施例中，步骤J~K为alpha-半乳糖去除方法。本实施例中所指的alpha-半乳糖为Galactose-alpha-1,3-galactose，所指的alpha-半乳糖苷酶为galactose-alpha-1，3-galactosidase。Galactose-alpha-1,3-galactose是一种糖水化合物，存在于除了灵长类（包括人类）之外的动物细胞膜上，它会引起人体急性排异免疫反应导致异种组织移植的排斥。目前的脱细胞异种真皮制备技术均不能够有效地去除Galactose-alpha-1,3-galactose，通过步骤J~K能够有效的降低甚至避免galactose-alpha-1，3-galactosidase引起的排异反应。本实施例的其他部分与实施例2相同，这里就不再赘述。
实施例4：
参见图1、图2、图3、图4和图5，本实施例在实施例3的基础上，步骤K之后还依次具有下列步骤，
步骤M：加入保存液进行充分混合，保存液为磷酸盐缓冲盐水，其内含乙二胺四乙酸以及体积百分比溶度为20%的甘油；
步骤N：取出猪真皮片，包装在铝箔里外双层袋中；
步骤O：对步骤N中包装好的铝箔里外双层袋进行灭菌处理，所述灭菌处理为在防辐射保护剂里进行电子束灭菌、在干冰条件下的γ辐照灭菌、超临界二氧化碳处理和环氧乙烷灭菌中的一种。
本实施例中，步骤M~O为脱细胞异种真皮的保存方法。通过在防辐射保护剂里进行的电子束端灭菌或者在干冰条件下的γ辐照灭菌、超临界二氧化碳处理、环氧乙烷灭菌，能够在灭菌的同时降低了辐射对猪真皮片的损害；通过采用铝箔里外双层袋包装猪真皮片，便于医生在手术台上打开内袋使用。本实施例的其他部分与实施例3相同，这里就不再赘述。
实施例5：
参见图1、图2、图3、图4和图5，本实施例在上述实施例的基础上，一种脱细胞异种真皮，采用上述方法制得。本实施例的其他部分与上述实施例相同，这里就不再赘述。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种脱细胞异种真皮制备方法，其特征在于：依次包括以下步骤，
步骤A：制取猪真皮片；
步骤B：对猪真皮片进行消毒处理；
步骤C：使用磷酸盐缓冲盐水充分清洗消毒后的猪真皮片；
步骤D：将猪真皮片与冷冻防护剂充分混合后保存在冻箱中备用；
步骤E：取出冷冻猪真皮片在室温下融化，然后加入磷酸盐缓冲盐水充分清洗猪真皮片；
步骤F：加入脱细胞液，将猪真皮片与脱细胞液充分混合以及反应，所述脱细胞液含有温和洗涤剂；
步骤G：吸出脱细胞液，然后加入磷酸盐缓冲盐水充分清洗猪真皮片。
2.根据权利要求1所述的一种脱细胞异种真皮制备方法，其特征在于：所述冷冻防护剂为甘油水溶液或多糖，当冷冻防护剂为甘油水溶液时，甘油的体积百分比浓度为20%或大于等于30%；当冷冻防护剂为多糖时，所述冷冻防护剂为葡聚糖凝胶、蔗糖和天然蜂蜜中的一种或者几种。
3.根据权利要求2所述的一种脱细胞异种真皮制备方法，其特征在于：所述步骤D中还添加有乙二胺四乙酸。
4.根据权利要求1所述的一种脱细胞异种真皮制备方法，其特征在于：所述脱细胞液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液，其PH值为8，每升4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液含20毫摩尔4-羟乙基哌嗪乙磺酸，所述温和洗涤剂为十二烷基聚乙二醇醚、乙基苯基聚乙二醇和脱氧胆酸钠中的一种或者几种，当所述温和洗涤剂为脱氧胆酸钠时，脱氧胆酸钠的质量体积百分比溶度为2%。
5.根据权利要求4所述的一种脱细胞异种真皮制备方法，其特征在于：所述脱细胞液中还添加有乙二胺四乙酸。
6.根据权利要求1所述的一种脱细胞异种真皮制备方法，其特征在于：所述脱细胞液体积与猪真皮片体积之比为30:1。
7.根据权利要求1所述的一种脱细胞异种真皮制备方法，其特征在于：步骤G之后还依次具有下列步骤，
步骤H：加入核糖核酸酶溶液，并进行充分混合以及反应，所述核糖核酸酶溶液内的核糖核酸酶通过人工重组合成或直接从动物组织提取，所述核糖核酸酶溶液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液，每升4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液含20毫摩尔4-羟乙基哌嗪乙磺酸、2.5毫摩尔氯化镁、0.5毫摩尔氯化钙以及0.5克核糖核酸酶，其PH值为8，核糖核酸酶溶液体积与猪真皮片体积之比为20:1；
步骤I：吸出核糖核酸酶溶液，然后加入磷酸盐缓冲盐水充分清洗猪真皮片。
8.根据权利要求7所述的一种脱细胞异种真皮制备方法，其特征在于：步骤I之后还依次具有下列步骤，
步骤J：加入alpha-半乳糖苷酶溶液进行充分混合以及反应，所述alpha-半乳糖苷酶溶液通过柠檬酸盐缓冲液添加alpha-半乳糖苷酶制得；
步骤K：吸出alpha-半乳糖苷酶溶液，然后加入磷酸盐缓冲盐水充分清洗猪真皮片。
9.根据权利要求8所述的一种脱细胞异种真皮制备方法，其特征在于：步骤K之后还依次具有下列步骤，
步骤M：加入保存液进行充分混合，保存液为磷酸盐缓冲盐水，其内含乙二胺四乙酸以及体积百分比溶度为20%的甘油；
步骤N：取出猪真皮片，包装在铝箔里外双层袋中；
步骤O：对步骤N中包装好的铝箔里外双层袋进行灭菌处理，所述灭菌处理为在防辐射保护剂里进行电子束灭菌、在干冰条件下的γ辐照灭菌、超临界二氧化碳处理和环氧乙烷灭菌中的一种。
10.一种脱细胞异种真皮，其特征在于：采用权利要求1~9任一项所述的方法制得。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20170111 |