CN101468213A

CN101468213A - 辐照交联异种皮脱细胞基质制备方法及其产品

Info

Publication number: CN101468213A
Application number: CNA2007100605199A
Authority: CN
Inventors: 郭翔
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2007-12-28
Filing date: 2007-12-28
Publication date: 2009-07-01

Abstract

本发明属于医学用生物皮制品领域。辐照无菌异种皮脱细胞基质制备方法，主要包括：取皮；上机切皮，真皮、表皮分离，脱细胞：一脱：用10～20％的胰蛋白酶在36～40℃下，浸泡30～50分钟后用纯净水清洗；二脱：将上述沥水后含水量在10～30％的皮片，再用10～20％的脱氧核糖核酸酶、10～30％的核糖核酸酶先后交替地在36～40℃下，各浸泡2～4次后，再用脱氧核糖核酸酶或核糖核酸酶0.5～1.5％，36～40℃下再次浸泡5～30分钟，除去真皮内可诱发宿主细胞识别反应的物质；将前述处理后的材料采用常规固定剂，浸泡50～120分钟；辐照灭菌：经过电子加速器或Co－60进行γ射线辐照灭菌。

Description

辐照交联异种皮脱细胞基质制备方法及其产品

技术领域

本发明属于医学用生物皮制品领域，具体地说属于生物皮脱细胞网状支架领域。

背景技术

生物材料在治疗大面积烧烫伤患者中具有重要作用。近年来，国内外皮肤专家一直在寻求良好的创面修复覆盖材料，以消除抗原性和排异反应为目的，制作异种皮冷冻保存，永久性皮肤创面替代材料是当前急需的新技术。为提高抢救大面积烧伤病人的疗效，具有广阔的前景。

在中国专利CN1266716A中公开了一种交联型猪脱细胞皮片。采用0.25％的胰蛋白酶在4℃下，浸泡16～24小时脱细胞，然后揭去表皮。之所以要这么长时间是因为在4℃下胰蛋白酶脱细胞水平极低，即使是这么长时间，也达不到完全脱除的目的。另外，表皮覆盖在真皮上，阻止了胰蛋白酶对真皮细胞的浸入，也对脱细胞不利。

在中国专利CN1522766A中公开了一种脱细胞真皮基质的制备方法，采用0.04～0.06％的胰蛋白酶在2～4℃下，浸泡16～20小时脱细胞，然后揭去表皮；再次浸入0.04～0.06％的胰蛋白酶在36.8～37.2℃下消化30~60分钟，之后预冷，在-70~-80冷冻和37~39℃融化的冻融，反复冻融3次，治如含抗生素的磷酸盐缓冲液中保存。该方法的缺点是：一、如此低浓度的胰蛋白酶在此温度下脱细胞不完全；二、反复冻融会损伤支架结构的柔软性和随意性。

在中国专利CN1268401C中公开了一种脱细胞真皮基质材料的制备方法，也是将带有表皮的皮片加酶涂覆剂后放置长达18～50小时，脱细胞后再将表皮与真皮分离。最后采用剂量为6～30KGry/h⁶⁰Co所产生的γ射线辐照灭菌。由于表皮覆盖在真皮上，阻止了胰蛋白酶对真皮细胞的浸入，对脱细胞不利。另外，采用⁶⁰Co为放射源，即使装源50万居里，要想以6～30KGry/h的放射剂量满足对生物皮制剂的灭菌要求，需时长达15小时以上，在实际生产中会造成极大的不便。

在中国专利CN1732867A中公开了一种真皮面脱细胞、去抗原的敷料皮，是指对真皮部分进行脱细胞、去抗原的处理，而完整地保留了表皮的结构。严格地说，这不能算作猪皮脱细胞网状支架。

在中国专利CN1775189A中公开了一种脱细胞真皮基质及其制备方法，提出的用氢氧化钠和去污剂脱细胞的方案；该方案脱细胞的机理不明。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明旨在提供一种辐照无菌异种皮基质制备方法及其产品。

辐照无菌异种皮脱细胞基质制备方法，主要包括

1、取皮，用5％碘伏浸泡10～30分钟灭菌，脱毛，去脂，裁剪，用纯净水清洗，甩干至含水量15～25％之间；

2、上机切皮，真皮、表皮分离，取保留基底膜的真皮部分，厚度0.3～0.8mm，(0.5mm±0.04mm最佳)

3、脱细胞：

一脱：上述真皮部分首先用1~15％的氯化钠水溶液浸泡30分钟后用纯净水清洗；然后用10～20％的胰蛋白酶在36～40℃下，浸泡30～50分钟后用纯净水清洗；使细胞核与细胞壁分离后，用36～40℃生理盐水清洗2~4次甩干，再用纯净水清洗2~4次甩干，沥水30分。

一脱后脱去80％以上组织细胞，只留残余细胞核与细胞碎片；

二脱：将上述沥水后含水量在10～30％(25％最佳)的皮片，再用10～20％的脱氧核糖核酸酶(DNA酶)、10～30％的核糖核酸酶(RNA酶)先后交替地在36～40℃下，每次浸泡20～40分钟；各浸泡2～4次后，使细胞核与细胞碎片与细胞床完全分离；再用脱氧核糖核酸酶或核糖核酸酶0.5～1.5％，36～40℃下再次浸泡5～30分钟，使成纤维细胞与细胞床壁分离。

4、除去真皮内可诱发宿主细胞识别反应的物质：将前述处理后的材料用PH值7.5~8.5的纯水清洗甩干；采用常规固定剂，如福尔马林20％，25～36℃下，浸泡50～120分钟；

5、中间体检验：(显微镜下看)

物理性能——乳白色、有弹性、弯曲不断裂、微网状；

组织学结构：与正常人体真皮内的细胞外基质结构相同的真皮结构组织；

细菌和异菌检验：无菌

6、辐照灭菌：经过电子加速器或Co-60进行γ射线辐照灭菌。辐照剂量150万～400万拉德。照射时间60～180秒，(120秒最佳)，使产品成细网结构。放置皮片的吊具与放射源以20～60度角接触，距离10公分。

附图说明

图1是本发明制备方法制得的产品；

图2是实施例1患者术后半年愈合效果图；

图3是实施例2患者术后半年愈合效果图。

具体实施方式

1、取皮，引用标准GB16548-1996，猪皮表面无瘢痕，无硬皮，柔软有弹性。取2～4个月白皮白毛猪皮背部，用5％碘伏浸泡10～30分钟灭菌，脱毛，去脂，裁剪；用纯净水清洗，甩干至含水量15～25％之间；放置手术台上进行裁剪与机器刀架相适合(大小在350～600m之间)后进入下道工序；

去脂脱脂，先将手工去脂的全皮放入36～37℃温水中加入5％洗涤剂(如白猫洗洁精)浸泡10～20分钟，手工轻揉，将真皮底层油脂去掉后再用同温度清水冲洗10分钟，手感皮片涩感。

手工拔毛，将上述浸泡后的皮片上的毛连同毛囊一起拔出后，放入36～37℃温水中，加入10％洗涤剂(如白猫洗洁精)浸泡10～20分钟，手工轻揉，将真皮底层油脂去掉后再用同温度清水冲洗10分钟，手感皮片涩感。使皮片囊孔中的皮屑一起清除掉。

2、上机切皮，真皮、表皮分离，取保留基底膜的真皮部分，厚度0.3～0.8mm，(最佳厚度0.5mm±0.04mm)，注意保留基底膜的完整性。将去脂去毛后的猪皮固定在鼓式切皮机的鼓轮上，将皮片完全贴敷在鼓轮上，并用力加压至使皮片绷紧。用切皮机切皮，分离表皮，留下真皮厚度0.3mm～0.8mm。用机器切皮比通常用手工撕皮的好处是：可以更加彻底地准确地清除干净表皮上层细胞和胶原蛋白质。

3、脱细胞：

二脱：将上述沥水后含水量在10～30％(25％)的皮片，再用10～20％的脱氧核糖核酸酶(DNA酶)、10～30％的核糖核酸酶(RNA酶)先后交替地在36～40℃下，每次浸泡20～40分钟；各浸泡2～4次后，使细胞核与细胞碎片与细胞床完全分离；再用脱氧核糖核酸酶或核糖核酸酶0.5～1.5％，36～40℃下再次浸泡5～30分钟，使成纤维细胞与细胞床壁分离。

4、除去真皮内可诱发宿主细胞识别反应的物质：将前述处理后的材料用PH值7.5~8.5的注射用水清洗甩干；采用常规固定剂，如碘伏0.1％，在36℃下，浸泡50～120分钟；将脱细胞后的皮片定型。

定尺：在无菌室内操作，将已甩干的脱细胞真皮用无菌刀裁剪成临床应用尺寸。压平、进行测量中间体检验、包装、封口、速冻。

5、中间体检验内容：(肉眼或显微镜下)

物理性能——乳白色、有弹性、弯曲不断裂、微网状；

无菌检验；细菌数为零

产品质量符合国家质量标准。

参见附图1，依上述方法制得的辐照交联异种皮脱细胞基质，在高倍显微镜下观察，其大体形态及组织学变化结果：该异种皮脱细胞基质无细胞成分，胶原纤维排列有序，基底膜结构完整。

参见附图2，实施例1

患者为男性，49岁，火焰烧伤，烧伤总面积79％，左腿部深度烧伤；采用托细胞猪真皮移植，网状爬皮均匀，3~4周后愈合；治疗半年后伤口凭证无疤痕。

参见附图3，实施例2

患者为女性，67岁，糖尿病史10年；烧伤发生3个月后，创面被葡萄球菌感染。移植自体微粒皮后覆盖猪皮真皮脱细胞支架后，创面4周愈合。

临床试验：

采用去细胞异体真皮或以本发明所述方法制得的辐照交联异种皮脱细胞基质加自体刃厚皮移植的方法，修复各种创面119例，比较各种创面的植皮成活率，观察应用不同部位的皮肤覆盖、去细胞异体真皮或以本发明所述方法制得的辐照交联异种皮脱细胞基质与植皮成活的关系，并对部分病例进行了组织学观察和随访。结果：削痂、切痂和切瘢创面植皮成活率分别为(93.4±4.8)％，(92.1±4.6)％和(94.5±3.8)％，三者间差异无显著意义。结论：以本发明所述方法制得的辐照交联异种皮脱细胞基质加自体刃厚皮移植修复深度烧伤创面或切瘢后创面不失为一种较为理想的材料。

Claims

1、辐照无菌异种皮脱细胞基质制备方法，主要包括以下步骤：

a、取皮，用5％碘伏浸泡10～30分钟灭菌，脱毛，去脂，裁剪，用纯净水清洗，甩干至含水量15～25％之间；其特征在于：

b、上机切皮，真皮、表皮分离，取保留基底膜的真皮部分，厚度0.3～0.8±0.04mm；

c、.脱细胞：一脱：上述真皮部分首先用1~15％的氯化钠水溶液浸泡30分钟后用纯净水清洗；然后用10～20％的胰蛋白酶在36～40℃下，浸泡30～50分钟后用纯净水清洗；使细胞核与细胞壁分离后，用36～40℃生理盐水清洗2~4次甩干，再用纯净水清洗2~4次甩干，沥水30分；二脱：将上述沥水后含水量在10～30％的皮片，最佳含水量25％，再用10～20％的脱氧核糖核酸酶、10～30％的核糖核酸酶先后交替地在36～40℃下，每次浸泡20～40分钟；各浸泡2～4次后，再用脱氧核糖核酸酶或核糖核酸酶0.5～1.5％，36～40℃下再次浸泡5～30分钟；

d、.除去真皮内可诱发宿主细胞识别反应的物质：将前述处理后的材料用PH值7.5~8.5的纯水清洗甩干；采用常规固定剂在25～36℃下，浸泡50～120分钟；

e、辐照灭菌：经过电子加速器或Co-60进行γ射线辐照灭菌；辐照剂量150万～400万拉德；照射时间60～180秒。

2、根据权利要求1所述的辐照无菌异种皮脱细胞基质制备方法，其特征在于：所述的保留基底膜的真皮部分厚度为0.5mm±0.04mm最佳。

3、根据权利要求1所述的辐照无菌异种皮脱细胞基质制备方法，其特征在于：所述的辐照灭菌放置皮片的吊具与放射源以20～60度角接触，距离10公分。

4、一种辐照无菌异种皮脱细胞基质，其特征在于：所述的辐照无菌异种皮脱细胞基质是采用权利要求1～3的方法制得。