CN104399122A - 一种脱细胞基质及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新的脱细胞基质及其制备方法，该制备方法包括以下步骤：将待用组织器官预处理；所述的待用组织器官为异种或同种异体或自体组织器官；在培养环境中，对待用组织器官施加细胞凋亡诱导因素，促使活细胞自发形成凋亡小体；清除待用组织器官中的凋亡小体；洗涤制备的脱细胞基质。本发明的方法采取主动凋亡的脱细胞方式，减少了外界施加过多理化因素对细胞外基质成分的破坏性副反应；还可有效地实现细胞成分的自发分割和降解，为后续细胞成分的清除带来极大便利。

Description

一种脱细胞基质及其制备方法

技术领域

本发明属于组织工程领域，具体地说是涉及一种脱细胞基质及其制备方法。

背景技术

来源于脱细胞基质的各种生物支架材料，已广泛用于组织工程与再生医学研究，并已在人类疾病的临床应用中展示了发展潜力。通过去除各种组织器官中异种或同种异体细胞，保留其中复杂成分和精密结构，即可得到相应组织器官的脱细胞基质。理论上，任何脱细胞方法都会不同程度的影响天然组织的基质的成分和结构，最终影响移植后宿主对脱细胞基质的反应。如何优化脱细胞方法、改善脱细胞过程仍是本领域研究的一个重要部分。

现行脱细胞基质的制备方法主要包括：1物理法；2化学法；3酶法。物理法指的是通过冷冻，高压，超声波，渗透压改变、电流等物理方式破坏细胞，其优点在于得到的脱细胞基质没有其他外加成分的残留，但这类方法的最大缺点是：在破坏细胞的同时也不同程度的破坏了细胞外基质的超微结构，通常需要联合其他脱细胞方法。化学法包括使用某些酸、碱、表面活性剂等化学方法裂解细胞。这类方法其优点在于脱细胞过程短，速度快，但这类方法同样会破坏细胞外基质的超微结构，并且还会造成各种可溶性性基质成分(如蛋白多糖)的丢失。酶法主要使用各种蛋白酶(如胰蛋白酶，中性蛋白酶)核酸酶(核酸外切酶，核酸内切酶)，通过水解细胞蛋白成分和核酸成分达到破坏细胞的目的。蛋白酶可以有效地去除细胞成分，但由于胰蛋白酶和中性蛋白酶的作用底物比较广泛，造成细胞外基质中的结构和功能蛋白大量降解。核酸酶选择性的降解核酸，不会造成细胞外基质成分的破坏，但其分子量过大，极易引起免疫反应。磷脂酶法虽可特异性的水解细胞膜磷脂，但其代谢产物—溶血卵磷脂具有极强的溶血性，如果清洗不彻底会产生一定溶血毒性。依据组织器官的结构特点，通常的脱细胞方案是选取物理法，化学法和酶法中的一种或几种组合使用。

现行的脱细胞方法制备脱细胞基质的思路在于：新鲜组织器官在理化因素的作用下，直接去除所有细胞成分，得到脱细胞基质产品。从活细胞所经历的变化来看，可进一步细化为两步。第一步，完整的活细胞被杀死：在各种物理，化学和酶的作用下，完整的活细胞在原位被破坏，发生被动性的细胞坏死。第二步：细胞残骸被清除：在各种物理，化学和酶作用下，细胞碎片被进一步清除。现行方法的共同特点是：利用物理，化学和生物因素，直接导致有活性完整细胞裂解，然后清洗去除细胞碎片。仅从脱细胞程度上说，各种方法均可制备出脱细胞程度较高的产品。但从临床应用效果来看，产品的力学强度或生物学活性仍不令人满意。究其原因在于：理论上，现有的脱细胞方案均不可避免的导致细胞外基质成分的丢失，尤其是可溶性的蛋白多糖和糖蛋白成分，丢失率可达80％。为了提高产品性能，满足临床治疗效果，必须克服现有技术的缺陷，降低细胞外基质成分的丢失率。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是提供一种制备脱细胞基质的方法，该方法可制备出具有较好物理学性状和生物学功能的脱细胞基质。

解决上述技术问题的技术方案如下：

一种制备脱细胞基质的方法，包括以下步骤：

a.将待用组织器官预处理；

b.在培养环境中，对待用组织器官施加细胞凋亡诱导因素，促使活细胞自发形成凋亡小体；

c.清除待用组织器官中的凋亡小体；

d.洗涤制备的脱细胞基质。

在其中一个实施例中，所述的待用组织器官包含有异种或同种异体或自体组织器官。可为心包膜、肠系膜、皮肤，心瓣膜、血管、或膀胱，也可以为角膜、巩膜、或结膜或其结合体。

在其中一个实施例中，所述的预处理指的是使用包含抗生素的生理缓冲液对待用组织器官进行常规清洗、消毒分离。

本发明所述的培养环境是指能为组织器官中细胞凋亡反应提供所需能量的环境。细胞凋亡反应是需要消耗ATP的细胞自发反应，提供细胞培养环境的目的在于保证活细胞的能量供应，可通过调节培养温度和培养环境的营养物质成分，提高被诱导细胞的凋亡效率。

所述的诱导因素指的是能够诱发活细胞发生凋亡反应的物理性诱导因素、生物化学性诱导因素、基因工程方法诱导因素或其任意组合。

所述的物理性诱导因素包括：紫外线，γ射线，温度,pH值。

所述的生物化学性诱导因素包括：生长因子，细胞因子，激素，胞内信号分子调节剂。所述细胞因子指的是白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子中的一种或多种；生长因子指的是是上皮生长因子、成纤维细胞生长因子、转化生长因子、神经生长因子中的一种或多种；激素指的是：糖皮质激素、盐皮质激素、性激素。胞内信号分子调节剂指的是放线菌、PKC激活剂、DNA拓扑异构酶抑制剂中的一种或多种。

所述的基因工程学诱导因素包括对待用组织器官中细胞实施自杀基因转染，通过启动自杀基因的方式诱导细胞凋亡。所述的自杀基因指的胸苷激酶基因、胞嘧啶脱氨酶基因、E.coli-gpt、细胞色素P450基因、硝基还原酶基因、羧肽酶基因、E.coli-DeoD基因、白喉毒素基因或FAS基因中的一种或多种。

所述的清除指的是利用物理学清除法，化学性清除法或酶学清除法去除待用组织器官中的凋亡小体。

所述的物理学清除法指的震荡清洗、超声处理，高渗液、低渗液、酸性液、碱性液清除法。所述的化学性清除法指的是表面活性剂清除法。

所述的酶学清洗指的是利用含脂肪酶、蛋白酶或核酸酶溶液清除法。

本发明的另一目的还在于提供一种脱细胞基质。

具体技术方案为：根据以上制备方法得到的脱细胞基质。

现有技术与本发明选用诱导凋亡的方法对待用组织器官进行脱细胞处理的区别在于：

现有技术是，组织器官中细胞成分被脱去的过程，可被细化为两个过程，第一步灭活完整的活细胞：在各种物理，化学和酶的作用下，提供细胞破裂溶液条件(未提供细胞培养所需的葡萄糖，氧气供应)，细胞受被动作用在原位坏死破裂，细胞无法形成完整脂质外膜包被的规则结构。第二步：继续使用各种物理，化学和酶，进一步清除各种不规则型态的细胞碎片。现行的各类方法并未区分以上两个过程，但从细胞脱去的过程上来说,均无法避免以上两个过程。

本发明提供的方法是，诱导凋亡的脱细胞方法：在第一步：诱导完整的活细胞自发形成凋亡小体。在各种射线，药物，细胞因子，生长因子等诱导下，在可维持细胞营养供应的培养条件下(提供细胞培养所需的葡萄糖，氧气供应)，细胞主动发生自杀性死亡(细胞凋亡)，最终形成具有完整胞膜包被的凋亡小体结构。新鲜组织中凋亡小体的形成率在90％～100％之间。第二步：使用各种物理，化学和酶，进一步清除形态结构规则的细胞凋亡小体。

对照现行方法的特征可以看出，诱导凋亡的脱细胞方法将会产生以下明显优势：

1.主动凋亡的脱细胞方式，理论上减少了脱细胞反应的外加能耗。减少了外界施加过多理化因素对细胞外基质成分的破坏性副反应。

本发明采用的方法是，细胞凋亡为活细胞的主动性裂解过程，细胞自发完成完整细胞向凋亡小体的转换。仅针对细胞施加一定特异性诱导因素外(射线，特异性药物，生长因子，细胞因子等)，这些诱导因素不会导致细胞外基质成分的流失，也无直接的细胞裂解作用，只是特异性的诱导活细胞自发挛缩，变小，分裂为规则的凋亡小体。相对于传统脱细胞方法(直接施加过量的物理，化学和裂解酶的作用，细胞被动破裂或细胞直接凝固性死亡)，诱导凋亡的脱细胞方法可以极低的代价产生完整活细胞有效分解的效应。

2.本发明主动凋亡的脱细胞方式，还可有效地实现细胞成分的自发分割和降解，为后续细胞成分的清除带来极大便利。

传统的脱细胞方法，活细胞被瞬间破坏裂解，细胞浆内蛋白和核酸并未实现有效分割，将被固定在原位，粘稠的胞浆蛋白和核酸成分清除较为困难。而诱导凋亡的脱细胞方法，由于活细胞的自发凋亡反应发生在接受诱导刺激的3～5小时出现，细胞有充足的时间，自发启动凋亡程序，自发产生特异性的降解酶，有效分割各类膜蛋白、胞浆蛋白以及粘稠的核酸成分。细胞凋亡后形成的凋亡小体,虽然也是闭合双分子层结构,但其通透性已显著增加,细胞核裂解，粘稠的染色质和胞浆蛋白被均匀分散在形态和结构均较为均一的凋亡小体中，在清除细胞碎片第二阶段，相对于传统方法脱细胞时产生的大小不一的细胞残片而言，则会产生极大便利，也更容易实现生产工艺的标准化。

具体实施方式

本发明的制备脱细胞基质方法，主要包括：

a.待用组织器官预处理：

室温下，按常规无菌操作原则，取待用组织器官，依据所取组织器官的不同，其预处理方式可以不同。基本包括：使用包含抗生素的生理缓冲液对待用组织器官进行常规清洗、消毒、分离。本步操作的目的是为了清除微生物，满足后续组织培养时的无菌原则，同时预处理过程需保证新鲜组织中较高的细胞存活状态(活细胞>99％)。

b.在培养环境中，对待用组织器官施加细胞凋亡诱导因素，促使活细胞自发形成凋亡小体；

将新鲜待用组织器官置入组织培养环境，该培养环境中，可为组织器官中细胞凋亡反应提供足够的氧气和能量供应的环境，包括适宜的pH值，缓冲体系，电解质，氧气，葡萄糖，必需氨基酸等维持细胞生命反应的必需物质，对于厚度小于200μm的组织可采取静态培养体系，大于200μm的组织可以使用动态培养体系。在组织器官培养环境加入诱导细胞凋亡的因素，包括物理性诱导因素、生物化学性诱导因素、基因工程方法诱导因素，根据组织器官结构和细胞成分的不同，可以选择性使用单一诱导因素，也可以联合各类诱导因素同时使用，或顺序使用。优选的诱导凋亡因素是紫外线，γ射线，温度,pH值等物理学因素，来源于生理的生长因子，细胞因子，激素，胞内信号分子调节剂等生物化学因素。根据组织器官细胞数量和种类的不同，在设定诱导凋亡因素的作用下，调整所需的培养时间，确保组织器官中大于95％的活细胞发生凋亡反应，形成凋亡小体。

c.清除待用组织器官中的凋亡小体；

细胞凋亡后形成的凋亡小体,虽然也是闭合双分子层结构,但其通透性已显著增加,细胞核裂解，粘稠的染色质和胞浆蛋白被均匀分散在形态和结构均较为均一的凋亡小体中，在清除凋亡小体阶段，依据组织器官结构成分的不同，利用物理学清除法，化学性清除法或酶学清除法去除待用组织器官中的凋亡小体。对于内脏粘膜组织，厚度较薄的疏松结缔组织，优选物理学清除法，包括使用震荡清洗、超声处理，高渗液、低渗液、酸性液、碱性液清除法。对于致密结缔组织优选使用表面活性剂清除法处理凋亡小体。对于细胞含量较多的实体组织器官，可联合表面活性剂和磷脂酶、蛋白酶或核酸酶法处理凋亡小体。相对于传统方法脱细胞时产生的大小不一的细胞残片而言，清除凋亡小体技术难度显著降低，容易实现生产工艺的标准化，清除所用的试剂使用量也显著下降。

d.洗涤制备的脱细胞基质：

是使用可以包含有抗生素的生理缓冲液对所得脱细胞基质进行常规清洗。因制备的脱细胞基质的不同，洗涤方式，次数，时间可以不同。但其目的都是为了最大限度的减少脱细胞试剂的残留量。由于本发明使用的诱导凋亡的脱细胞方法，优选的诱导凋亡因素和凋亡小体清除因素均来源于生理物质，该类物质在微量时对人体无害，因此本步骤的技术要求可以大幅度降低。

为能更好的理解本发明，以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步的阐述，但不用于限制本发明的保护范围。

实施例1制备脱细胞猪肠系膜基质

一、产品制备

以下处理过程均为无菌操作，所用的试剂均通过除菌处理。本实施例所述的制备脱细胞猪肠系膜基质的方法，包括以下步骤：

a.将待用组织器官预处理；

在室温，常规无菌操作下，取下新鲜猪肠系膜组织(5cm×5cm)。将所取的猪肠系膜组织使用含抗生素(100U/ml青霉素G，100μg/ml硫酸链霉素)的碳酸盐缓冲液浸泡3～5次，每次5～10分钟。

b.对待用组织器官施加促使细胞凋亡的的诱导因素，置于培养环境中，促使活细胞自发凋亡形成凋亡小体；(细胞因子诱导)

将新鲜猪肠系膜置入50mlDMEM基础培养液中，置于CO₂培养箱中培养37℃下培养4小时后，依据肠系膜厚度的不同,向DMEM基础培养液中加入肿瘤坏死因子α(500～5000U/ml)和白介素-2(50～500U/ml)，置于CO₂培养箱中培养37℃下培养24～48小时。检测细胞凋亡小体形成情况(常规酶联免疫吸附法核小体测定，DNA凝胶电泳和丫啶橙染色计数方法),凋亡小体形成率大于95％时,停止培养过程。

c.对待用组织器官中形成的凋亡小体进行清除(物理和化学清洗)

将猪肠系膜组织取出，使用包含0.05％脱氧胆酸钠的碳酸盐缓冲液2000ml(pH 10-12)在37℃水浴中，超声震荡洗涤6次，每次6小时。

d.洗涤制备的脱细胞基质

将猪肠系膜组织置入500ml含抗生素(100U/ml青霉素G，100μg/ml硫酸链霉素)的磷酸盐缓冲液中，震荡洗涤6次，每次3小时。将制成的脱细胞猪肠系膜基质片在4℃无菌条件下保存。

制备对照组：未施加诱导组织细胞凋亡步骤下，需将使用的脱氧胆酸钠提高10倍浓度，才能达到类似脱细胞效率。

在室温，常规无菌操作下，取下新鲜猪肠系膜组织(5cm×5cm)。将所取的猪肠系膜组织使用含抗生素(100U/ml青霉素G，100μg/ml硫酸链霉素)的碳酸盐缓冲液浸泡3～5次，每次5～10分钟。将猪肠系膜组织取出，使用包含0.05％脱氧胆酸钠的碳酸盐缓冲液2000ml(pH 10-12)在37℃水浴中，超声震荡洗涤6次，每次6小时。将猪肠系膜组织置入500ml含抗生素(100U/ml青霉素G，100μg/ml硫酸链霉素)的磷酸盐缓冲液中，震荡洗涤6次，每次3小时。将制成的脱细胞猪肠系膜基质片在4℃无菌条件下保存，得对照品。

二、产品性质检测

按文献“Wu Zheng et al.The use of phospholipase A2to prepare acellular porcine cornealstroma as a tissue engineering scaffold.Biomaterials.2009July；30(21):3513-3522.”所述方法检测样品脱细胞效率含量，羟脯氨酸保留率，氨基葡聚糖保留率，生物力学保留率，MTT细胞增殖实验和皮下移植实验。层粘连蛋白(Bioleaf公司)和纤维粘连蛋白定量(KAMIYA公司)使用ELISA试剂盒，按试剂盒说明书执行。简述如下：

1)脱细胞效率：对样品进行DNA分析，使用木瓜蛋白酶(5Mm L-cysteine，100MmNa₂HPO₄，5Mm EDTA，125μg/mlⅢ型木瓜蛋白酶，pH 7.5)在60℃消化24小时，0.1mg/mlHoechst 33258对DNA成分进行染色后，使用荧光光度计检测荧光强度，激发光波长为365nm，发射光波长为458nm，根据小牛胸腺DNA标准品所绘制的标准曲线。计算样本的DNA含量。脱细胞效率＝(脱细胞样品DNA含量/新鲜样品DNA含量)×100％。

2)羟脯氨酸保留率，对样品进行羟脯氨酸分析：使用木瓜蛋白酶在60℃消化24小时后，加入6N HCl 115℃消化16h。得到的羟脯氨酸与二甲氨基苯甲醛反应呈现紫红色，使用酶标仪在550nm处，检测样本吸光度，并根据反式-L-羟脯氨酸标准品绘制的标准曲线计算样本的羟脯氨酸含量。羟脯氨酸保留率＝(脱细胞样品羟脯氨酸量/新鲜样品羟脯氨酸量)×100％。

3)氨基葡聚糖保留率：对样品进行氨基葡聚糖分析：根据氨基葡聚糖检测试剂盒

(Biocolor，Northern Ireland)说明书进行，使用木瓜蛋白酶在60℃消化24小时，12000×g离心10min，弃上清，二甲基亚甲兰染色后，使用酶标仪在520nm处检测样本吸光度，根据氨基葡聚糖标准品绘制的标准曲线计算样本中氨基葡聚糖含量。氨基葡聚糖保留率＝(脱细胞样品氨基葡聚糖含量/新鲜样品氨基葡聚糖含量)×100％。

4)生物力学保留率为评价样本精密生物力学特点，对样品进行应力—应变分析。将人工前房的一条注气管连接于压力表，另一条连于自动注射器，待检样本固定于人工前房，检测样本在10，40，70，100mmHg范围内的力学性质。10mmHg基础压强下，使用2mm直径的环钻沾取阿尔辛兰染液后，在样本中央表面做一环形标记，作为基础面积(S₀)，使用照相机拍摄该环形面积S₀。向人工前房中继续注气，拍摄并记录其后各压强测量点(40，70，100mmHg)时标记环的面积(S_t)。使用Image-Pro Plus Version 6.0软件测量S₀和S_t的大小，计算各压强检测点与基础压强的压强差P’(即30，60，90mmHg)。最后，按以下公式计算面应变和面膜量。面应变γ＝(St-S₀)/S₀，面模量E＝P’/γ。生物力学保留率＝氨基葡聚糖保留率＝(脱细胞样品面模量/新鲜样品面模量)×100％。

5)皮下移植：常规全麻下，使用手术刀在新西兰大白兔背部皮肤上做2cm长度的切口，并分离皮下结缔组织，制作皮下囊袋。分别将各实施例制备的产品和对照品植入该皮下囊袋中，作为实验组和对照组。移植1周后，将包括周围结缔组织的皮下移植物取出，进行组织学评价。

三、检测结果

1)脱细胞效率：实验组：98～100％，对照组：85％～88％。

2)氨基葡聚糖保留率：实验组：90～98％，对照组：20％～26％。

3)羟脯氨酸保留率：实验组：100％，对照组：20％～26％。

4)层粘连蛋白保留率：实验组：90～95％，对照组：23％～30％。

5)纤维粘连蛋白保留率：实验组：92～97％，对照组：15％～21％。

6)生物力学保留率如下：

压力差	实验组	对照组
			30mmHg	98～100％	35～40％
60mmHg	95～98％	27～30％
			90mmHg	90～96％	15～20％

7)皮下移植实验：皮下移植1周：实验组样品结构完整，均未观察到免疫排斥现象，仅见植片周围被纤维细胞形成的结缔组织包裹，两者之间存在明显的间隙，植片内未观察到中性粒细胞或淋巴细胞浸润现象。对照组样品完全降解，降解部位存在大量中性粒细胞浸润。

实施例2制备脱细胞猪心包膜基质

一、产品制备

以下处理过程均为无菌操作，所用的试剂均通过除菌处理。本实施例所述的制备脱细胞猪心包膜基质的方法，包括以下步骤：

制备实验组

a.将待用组织器官预处理；

在室温，常规无菌操作下，取下新鲜猪心包膜组织(5cm×5cm)。将所取的猪心包膜组织使用含抗生素(100U/ml青霉素G，100μg/ml硫酸链霉素)的碳酸盐缓冲液浸泡3～5次，每次5～10分钟。

b.对待用组织器官施加促使细胞凋亡的的诱导因素，置于培养环境中，促使活细胞自发凋亡形成凋亡小体；(射线+生长因子+细胞因子诱导)

对新鲜猪心包膜进行紫外照射(依据心包膜厚度的不同,紫外光波长为260～365nm,光照强度为10～500mW/cm2)后，置入50mlDMEM基础培养液中，置于CO₂培养箱中培养37℃下培养6小时后，依据心胞膜厚度的不同,向DMEM基础培养液中加入转化生长因子Β(5～100ng/ml)和白介素-2(200～2000U/ml)，置于CO₂培养箱中培养37℃下培养48～72小时,检测细胞凋亡小体形成情况(常规酶联免疫吸附法核小体测定，DNA凝胶电泳和丫啶橙染色计数方法),凋亡小体形成率大于95％时,停止培养过程。

c.对待用组织器官中形成的凋亡小体进行清除(酶法+物理法清除)

将猪心包膜组织取出加入包含核酸酶(50U/ml)的100ml PBS缓冲液中，在37℃水浴中震荡反应24小时后，将猪心包膜组织取出，使用的碳酸盐缓冲液2000ml(pH 10-12)在37℃水浴中震荡冲洗洗涤6次，每次3小时。

d.洗涤制备的脱细胞基质

将猪心包膜组织置入500ml含抗生素(100U/ml青霉素G，100μg/ml硫酸链霉素)的磷酸盐缓冲液中，震荡洗涤6次，每次3小时。将制成的脱细胞猪肠系膜基质片在4℃无菌条件下保存。

制备对照组：未施加诱导组织细胞凋亡步骤下，需额外加入1％的十二烷基磺酸钠处理12小时，其后使用的核酸酶需提高5倍浓度，才能达到类似脱细胞效率。简述如下：

在室温，常规无菌操作下，取下新鲜猪心包膜组织(5cm×5cm)。将所取的猪心包膜组织使用含抗生素(100U/ml青霉素G，100μg/ml硫酸链霉素)的碳酸盐缓冲液浸泡3～5次，每次5～10分钟。将猪心包膜组织取出加入包含1％的十二烷基磺酸钠的100ml PBS缓冲液中，在37℃水浴中震荡反应12小时后，再移入包含核酸酶(依据心包膜厚度的不同,500U/ml)的100ml PBS缓冲液中，在37℃水浴中震荡反应24小时。将猪心包膜组织取出，使用的碳酸盐缓冲液2000ml(pH 10-12)在37℃水浴中震荡冲洗洗涤6次，每次3小时。

二、产品性质检测

与实施例1所提供的方法有没有区别。

三、检测结果

1)脱细胞效率：实验组：98～100％，对照组：90％～93％。

2)氨基葡聚糖保留率：实验组：95～98％，对照组：25％～30％。

3)羟脯氨酸保留率：实验组：100％，对照组：89％～92％。

4)层粘连蛋白保留率：实验组：92～96％，对照组：18％～22％。

5)纤维粘连蛋白保留率：实验组：90～94％，对照组：16％～23％。

6)生物力学保留率如下：

压力差	实验组	对照组
			30mmHg	98～100％	85～92％
60mmHg	98～100％	85～89％
			90mmHg	95～98％	80～83％

7)皮下移植实验：皮下移植1周：实验组样品结构完整，均未观察到免疫排斥现象，仅见植片周围被纤维细胞形成的结缔组织包裹，两者之间存在明显的间隙，植片内未观察到中性粒细胞或淋巴细胞浸润现象。对照组样品边缘部分降解，降解部位存在大量中性粒细胞和淋巴细胞浸润。

实施例3制备脱细胞猪真皮基质

一、产品制备

以下处理过程均为无菌操作，所用的试剂均通过除菌处理。本实施例制备脱细胞猪真皮基质的方法，包括以下步骤：

制备实验组

a.将待用组织器官预处理；

在室温，常规无菌操作下，取下新鲜猪真皮组织(10cm×10cm)。将所取的猪真皮组织使用含抗生素(100U/ml青霉素G，100μg/ml硫酸链霉素)的碳酸盐缓冲液浸泡3～5次，每次5～10分钟。

b.对待用组织器官施加促使细胞凋亡的的诱导因素，置于培养环境中，促使活细胞自发凋亡形成凋亡小体；(射线+激素+PKC激活剂诱导)

对新鲜猪真皮组织进行γ射线照射(5～100Gy)后，置入50mlDMEM基础培养液中，置于CO₂培养箱中培养37℃下培养6小时后，向DMEM基础培养液中加入糖皮质激素(地塞米松10^-6～10^--4mol/L)，PKC激活剂(10～100nmol/L蟾蜍灵)置于CO₂培养箱中培养37℃下培养24～48小时。检测细胞凋亡小体形成情况(常规酶联免疫吸附法核小体测定，DNA凝胶电泳和丫啶橙染色计数方法),凋亡小体形成率大于95％时,停止培养过程。

c.对待用组织器官中形成的凋亡小体进行清除(化学法+酶法+物理法清除)

将猪真皮组织取出加入包含Triton-x100(0.01％)的100ml PBS缓冲液中，在37℃水浴中震荡反应24小时后，将猪真皮组织取出，加入包含核酸酶(50U/ml)的100ml PBS缓冲液中，在37℃水浴中震荡反应24小时后，将真皮基质组织取出，使用的碳酸盐缓冲液2000ml(pH 10-12)在37℃水浴中震荡冲洗洗涤6次，每次3小时。

d.洗涤制备的脱细胞基质

将猪真皮组织置入500ml含抗生素(100U/ml青霉素G，100μg/ml硫酸链霉素)的碳酸盐缓冲液(pH 6.5～7.5)中，震荡洗涤6次，每次3小时。将制成的脱细胞猪真皮基质片在4℃和无菌条件下保存。

制备对照组：未施加诱导组织细胞凋亡步骤下，加入Triton-x100的浓度需提高100倍，核酸酶的浓度需提高10倍浓度，才能达到类似脱细胞效率。简述如下：

在室温，常规无菌操作下，取下新鲜猪真皮组织(10cm×10cm)。将所取的猪真皮组织使用含抗生素(100U/ml青霉素G，100μg/ml硫酸链霉素)的碳酸盐缓冲液浸泡3～5次，每次5～10分钟。将猪真皮组织取出加入包含Triton-x100(1％)的100ml PBS缓冲液中，在37℃水浴中震荡反应24小时后，将猪真皮组织取出，加入包含核酸酶(500U/ml)的100ml PBS缓冲液中，在37℃水浴中震荡反应24小时后，将真皮基质组织取出，使用的碳酸盐缓冲液2000ml(pH 10-12)在37℃水浴中震荡冲洗洗涤6次，每次3小时。将猪真皮组织置入500ml含抗生素(100U/ml青霉素G，100μg/ml硫酸链霉素)的碳酸盐缓冲液(pH 6.5～7.5)中，震荡洗涤6次，每次3小时。将制成的脱细胞猪真皮基质片在4℃和无菌条件下保存。

二、产品性质检测

与实施例1所提供的方法有没有区别。

三、检测结果：

1)脱细胞效率：实验组：99～100％，对照组：95％～97％。

2)氨基葡聚糖保留率：实验组：91～93％，对照组：18％～21％。

3)羟脯氨酸保留率：实验组：100％，对照组：92％～96％。

4)层粘连蛋白保留率：实验组：95～97％，对照组：14％～18％。

5)纤维粘连蛋白保留率：实验组：92～96％，对照组：19％～25％。

6)生物力学保留率如下：

压力差	实验组	对照组
			30mmHg	95～100％	65～70％
60mmHg	94～98％	55～61％
			90mmHg	90～95％	40～45％

7)皮下移植实验：皮下移植1周：实验组样品结构完整，均未观察到免疫排斥现象，与移植宿主皮下组织良好融合，植片内未观察到中性粒细胞或淋巴细胞浸润现象。对照组样品降解明显，降解部位存在大量中性粒细胞和淋巴细胞浸润。

实施例4制备脱细胞猪二尖瓣基质

一、产品制备

以下处理过程均为无菌操作，所用的试剂均通过除菌处理。本实施例所述制备脱细胞猪二尖瓣基质的方法，包括以下步骤：

a.将待用组织器官预处理；

在室温，常规无菌操作下，取下新鲜猪二尖瓣,使用含抗生素(100U/ml青霉素G，100μg/ml硫酸链霉素)的碳酸盐缓冲液浸泡3～5次，每次5～10分钟。

b.对待用组织器官施加促使细胞凋亡的的诱导因素，置于培养环境中，促使活细胞自发凋亡形成凋亡小体；(射线+生长因子+细胞因子+激素诱导)

对新鲜二尖瓣组织进行X射线照射(剂量1.0～10.0Gy)后，置入50mlDMEM基础培养液中，置于CO₂培养箱中培养37℃下培养6小时后，向DMEM基础培养液中加入糖皮质激素(地塞米松10^-6～10^--4mol/L)，肿瘤坏死因子α(5～100ng/mL),转化生长因子Β(5～50ng/ml)，白介素-2(10～100U/ml)，白介素-6(10～100U/ml)置于CO₂培养箱中培养37℃下培养48～72小时。检测细胞凋亡小体形成情况(常规酶联免疫吸附法核小体测定，DNA凝胶电泳和丫啶橙染色计数方法),凋亡小体形成率大于95％时,停止培养过程。

c.对待用组织器官中形成的凋亡小体进行清除(化学法+酶法+物理法清除)

将二尖瓣组织取出加入包含脱氧胆酸钠(0.05％)的100ml PBS缓冲液中，在37℃水浴中震荡反应24小时后，将组织取出，加入包含核酸酶(50U/ml)和的100ml PBS缓冲液中，在37℃水浴中震荡反应24小时后，将组织取出，使用的碳酸盐缓冲液2000ml(pH10-12)在37℃水浴中震荡冲洗洗涤6次，每次3小时。

d.洗涤制备的脱细胞基质

将脱细胞组织置入500ml含抗生素(100U/ml青霉素G，100μg/ml硫酸链霉素)的碳酸盐缓冲液(pH 6.5～7.5)中，震荡洗涤6次，每次3小时。制成的脱细胞猪二尖瓣基质在4℃和无菌条件下保存。

制备对照组：未施加诱导组织细胞凋亡步骤下，需额外加入5％的Triton-x100处理12小时，此外加入脱氧胆酸钠浓度需提高20倍，核酸酶的浓度需提高10倍浓度，才能达到类似脱细胞效率。简述如下：

在室温，常规无菌操作下，取下新鲜猪二尖瓣,使用含抗生素(100U/ml青霉素G，100μg/ml硫酸链霉素)的碳酸盐缓冲液浸泡3～5次，每次5～10分钟。将二尖瓣组织取出加入包含Triton-x100(5％)的100ml PBS缓冲液中，在37℃水浴中震荡反应12小时。将组织取出，加入包含脱氧胆酸钠(1％)的100ml PBS缓冲液中，在37℃水浴中震荡反应24小时后，将组织取出，加入包含核酸酶(500U/ml)和的100ml PBS缓冲液中，在37℃水浴中震荡反应24小时后，将组织取出，使用的碳酸盐缓冲液2000ml(pH 10-12)在37℃水浴中震荡冲洗洗涤6次，每次3小时。将脱细胞组织置入500ml含抗生素(100U/ml青霉素G，100μg/ml硫酸链霉素)的碳酸盐缓冲液(pH 6.5～7.5)中，震荡洗涤6次，每次3小时。制成的脱细胞猪二尖瓣基质在4℃和无菌条件下保存。

二、产品性质检测

与实施例1所提供的方法有没有区别。

三、检测结果：

1)脱细胞效率：实验组：99～100％，对照组：95％～98％。

2)氨基葡聚糖保留率：实验组：93～97％，对照组：12％～16％。

3)羟脯氨酸保留率：实验组：100％，对照组：89％～92％。

4)层粘连蛋白保留率：实验组：92～96％，对照组：15％～17％。

5)纤维粘连蛋白保留率：实验组：94～97％，对照组：12％～15％。

6)生物力学保留率如下：

压力差	实验组	对照组
			30mmHg	97～100％	80～85％

60mmHg	92～96％	49～52％
			90mmHg	89～93％	31～34％

7)皮下移植1周：实验组样品结构完整，均未观察到免疫排斥现象，仅见植片周围被纤维细胞形成的结缔组织包裹，两者之间存在明显的间隙，植片内未观察到中性粒细胞或淋巴细胞浸润现象。对照组样品出现明显降解，周边结缔组织包裹明显，降解部位存在大量中性粒细胞和淋巴细胞浸润。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种制备脱细胞基质的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a.将待用组织器官预处理；所述的待用组织器官为异种或同种异体或自体组织器官；

b.在培养环境中，对待用组织器官施加细胞凋亡诱导因素，促使活细胞自发形成凋亡小体；

c.清除待用组织器官中的凋亡小体；

d.洗涤制备的脱细胞基质。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：所述待用组织器官为心包膜、肠系膜、皮肤，心瓣膜、血管、或膀胱，或所述待用组织器官为角膜、巩膜、结膜或其中一种以上的结合体。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

步骤a所述预处理为使用包含或不包含抗生素的生理缓冲液对待用组织器官进行常规清洗、消毒、分离；

步骤b所述培养环境为能为组织器官中细胞凋亡反应提供所需氧气和能量供应的环境；

步骤b所述的诱导因素指的是能够诱发活细胞发生凋亡反应的物理性诱导因素、生物化学性诱导因素、基因工程方法诱导因素或其任意组合；

步骤c所述的清除指的是利用物理学清除法，化学性清除法或酶学清除法去除待用组织器官中的凋亡小体；

步骤d中所述的洗涤为使用包含有或不包含有抗生素的生理缓冲液对所得脱细胞基质进行常规清洗。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述物理性诱导因素包括：紫外线、γ射线、温度、pH值。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述生物化学性诱导因素包括：生长因子，细胞因子，激素，和胞内信号分子调节剂中的一种或多种。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述细胞因子为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子中的一种或多种；所述生长因子为上皮生长因子、成纤维细胞生长因子、转化生长因子、神经生长因子中的一种或多种；所述激素指为糖皮质激素、盐皮质激素、性激素中的一种或多种；所述胞内信号分子调节剂指为放线菌、PKC激活剂、DNA拓扑异构酶抑制剂中的一种或多种。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的基因工程学诱导因素为对待用组织器官中细胞实施自杀基因转染，通过启动自杀基因的方式诱导细胞凋亡。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的自杀基因为胸苷激酶基因、胞嘧啶脱氨酶基因、E.coli-gpt、细胞色素P450基因、硝基还原酶基因、羧肽酶基因、E.coli-DeoD基因、白喉毒素基因和FAS基因中的一种或多种。

9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤c所述的物理学清除法为震荡清洗、超声处理，高渗液、低渗液、酸性液、碱性液清除法；所述化学性清除法为表面活性剂清除法；步骤c所述的酶学清洗为利用含磷脂酶、蛋白酶或核酸酶溶液清除法。

10.根据权利要求1-10所述制备方法得到的脱细胞基质。