CN104399125B - 表皮干细胞向汗腺样上皮细胞分化的方法 - Google Patents

Abstract

一种表皮干细胞向汗腺样上皮细胞分化的方法，包括如下步骤：鼠尾胶原的制备、人成纤维细胞的培养、表皮干细胞的培养、复方壳多糖组织工程皮肤的制备与观察、复方壳多糖组织工程凝胶的制备与观察。本发明证实了在体外利用复方壳多糖组织工程皮肤和凝胶三维培养，一定浓度的表皮生长因子(EGF)诱导、垂直振荡培养，能形成管腔样结构，且所形成的管腔样结构，在形态学、组织学及功能上与在体汗腺分泌部细胞相似，具有与正常汗腺分泌部细胞相似的生理结构及生理作用基础。

Description

表皮干细胞向汗腺样上皮细胞分化的方法

技术领域

本发明涉及一种细胞的分离和培养方法，特别涉及一种表皮干细胞向汗腺样上皮细胞分化的方法。

背景技术

严重的皮肤缺损，如大面积的深度烧伤等，伤及皮肤全层及其附属器，仅靠创面自身难以实现皮肤再生，需要足够的皮肤替代物进行修复。目前构建的表真皮双层组织工程皮肤虽已应用于临床，基本解决了创面覆盖的问题，但未达到真正的皮肤组织结构和功能的完全重建，其最大的问题是缺乏皮肤附件，如皮脂腺、汗腺等附属器。表皮干细胞(Epidermalstemcell,ESC)是皮肤组织特异性干细胞，位于表皮基底层，在维持表皮更新，保持细胞恒定等方面起着重要作用。表皮干细胞具有多向分化潜能，体内证实能够向皮肤附属器及表皮分化。若能在体外诱导表皮干细胞向汗腺分化，将为研究带汗腺的组织工程皮肤提供重要实验依据。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种表皮干细胞向汗腺样上皮细胞分化的方法。

为了实现上述发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种表皮干细胞向汗腺样上皮细胞分化的方法，包括如下步骤：

1)鼠尾胶原的制备

将冻存的大白鼠鼠尾在酒精溶液中解冻后，去皮，采用D-Hanks液冲洗，抽出尾腱，剪碎成泥，溶于无菌的冰醋酸中保存一段时间，其间反复振荡，然后进行离心处理，提取上清溶液，得到乳白色半透明粘稠液体，即为所得物鼠尾胶原，将其贮存备用；

2)人成纤维细胞(FB)的培养

将健康成人包皮环切术的包皮标本用酒精浸浴并擦拭，用PBS液反复冲洗；去除皮下组织和真皮网状层，将表真皮部分剪成长方形条状后进行消化；然后将表皮从真皮上揭下，刮真皮表面，将所得真皮剪成糊状，加胶原酶，再加盖，移至孵箱中并不时摇动；接着取出液体，筛网过滤，加PBS液，离心弃上清，加DMEM混匀成细胞悬液，移入孵箱中培养，待原代培养的FB接近或达到融合后，用0.25％胰蛋白酶进行消化，当细胞体积增大，出现收缩裂隙时，用含10％FBS的DMEM培养接终止消化，最后分析细胞体积及增殖情况，并按照1:3传代，建立FB细胞库，提供来源统一的FB。

3)表皮干细胞的培养

先将人表皮干细胞的原代分离培养，包括下列步骤：

a)将取下的人包皮标本用酒精浸泡并擦拭后，再用PBS平衡盐液冲洗，直至标本发白发涨；

b)将上述步骤a)中的人包皮标本在培养皿中剪去皮下组织后剪成长方形的条状，然后进行分离消化；

c)将步骤b)中的人包皮标本用PBS平衡盐液漂洗，然后对人包皮标本的表皮和真皮进行分离，再将分离后所得的表皮进行消化，消化后进行离心、筛网过滤，弃去上清液，再放入K-SFM培养液中，制成细胞混悬液，计算细胞活力及细胞数，细胞按5×10⁴/孔接种在预先铺满IV型胶原的培养板中，30min后吸尽未贴壁的细胞，计算吸出液中的细胞数和贴壁率，并每天更换K-SFM培养液；

再进行人表皮干细胞的传代培养，包括下列步骤：

d)待原代表皮干细胞融合约70％后，弃去细胞培养液，用PBS进行洗涤；

e)每孔加入0.25％胰蛋白酶后放入冰箱，保持在4℃；

f)待4-6h后将培养板取出，轻轻拍打细胞脱落，加入含10％FBS的DMEM中和；

g)将液体吸入离心管中，用PBS轻轻冲洗培养板后移入离心管中进行离心；

h)弃去上清液，加入K-SFM培养基重悬细胞后，计算细胞数后备用；

4)复方壳多糖组织工程皮肤的制备

按比例混匀醋酸鼠尾胶原、壳多糖、硫酸软骨素、透明质酸、弹性蛋白及浓缩DMEM；再用氢氧化钠调节pH值至7.2-7.4；在凝胶中加入FB细胞，细胞量达到10⁵/ml；吸入多孔培养板中，放入孵箱内待形成凝胶后，每孔轻轻加入浓度为8×10⁵/ml的1代表皮干细胞，最后再加入KGM培养基，置孵箱培养，每天进行换液；待培养3天后，进行行气液界面培养，将组织工程皮肤分为两组：一组仅用KGM培养，一组在KGM中添加20ng/mlEGF；两组均每日垂直振荡；待培养16天后，用4％多聚甲醛固定后行HE染色，观察皮肤生长情况；

5)复方壳多糖组织工程凝胶的制备

按比例混匀醋酸鼠尾胶原、壳多糖、硫酸软骨素、透明质酸、弹性蛋白及浓缩DMEM；再用氢氧化钠调节pH值至7.2-7.4；在凝胶中加入1代表皮干细胞，细胞量为8×10⁵/ml；吸入多孔培养板中，放入孵箱内待形成凝胶后，再加入KGM，置孵箱中培养，每天进行换液；每日垂直振荡；待培养3天后，在KGM中添加浓度为20ng/ml的EGF；待培养16天后行组织学及形态学检查；

6)组织工程凝胶的观察

步骤包括组织学观察、免疫荧光观察、透射电镜下观察以及激光共聚焦显微镜观察钙通道。

进一步地，所述步骤1)中尾腱保存条件为4℃，保存48h，所得物鼠尾胶原的贮存条件为4℃。

进一步地，所述各步骤中酒精的浓度均为75％，所述孵箱的条件为37℃、5％CO₂/95％空气、90％以上湿度，所述筛网规格为200目。

进一步地，所述步骤1)中离心条件为3000rpm，离心1h；所述步骤2)中离心条件为1500rpm，离心5min；所述步骤3)中离心条件为1000rpm，离心5min。

进一步地，所述步骤2)和3)b)中人包皮标本剪成长方形条状的尺寸为0.3cm×2cm。

进一步地，所述步骤3)c)中分离采用0.25％分离酶进行，其中所述分离酶与样本的比例为5:1，消化采用0.25％胰蛋白酶进行，其中表皮与所述胰蛋白酶体积比为3:1。

进一步地，所述步骤2)中采用且镊子将表皮从真皮上揭下，弯头镊子刮真皮表面；所述步骤3)c)中表皮和真皮进行分离采用眼科镊轻轻揭下表皮即完成表皮和真皮的分离。

进一步地，所述步骤2)中所述FB为第4-10代；所述步骤3)、4)和5)中培养板为24孔培养板。

进一步地，所述步骤2)中采用系统分析细胞体积及增殖情况，所述步骤3)c)中利用系统来分析计算细胞活力及细胞数。

进一步地，所述步骤4)和步骤5)中所述的混匀在冰浴条件下进行和所述的垂直振荡条件为振荡频率为75次/分，振幅为2cm。

由于采用以上技术方案，本发明的有益效果至少包括：

本发明证实了在体外利用复方壳多糖组织工程皮肤和凝胶三维培养，一定浓度的EGF(如，20ng/ml)在诱导条件下，垂直振荡培养，能形成管腔样结构，且所形成的管腔样结构，在形态学、组织学及功能上与在体汗腺分泌部细胞相似，具有与正常汗腺分泌部细胞相似的生理结构及生理作用基础。

三维细胞培养(Threediamensionscellculture,TDCC)是将细胞培植在一定的细胞外基质(Extracellularmatrix,ECM)中，细胞外基质蛋白充当生长支架，使得细胞能够分化产生一定的三维组织特异性结构，所创建的细胞生长环境能最大程度地模拟体内环境。这种培养方式一方面能够为体外培养细胞提供近似体内的微环境，从而有利于细胞增殖、迁移和分化；另一方面可在体外构建各类组织、器官相应的细胞三维生长类似物或等同物，是基础研究和体外构建组织工程广泛应用的培养方法。TDCC作为体外无细胞系统及单层细胞系统的研究与组织器官及整体研究的桥梁，显示了它既能保留体内细胞微环境的物质及结构基础，又能展现细胞培养的直观性及条件可控性的优势。

用于细胞三维培养的支架材料需要满足以下要求：①具有良好的组织相容性和生物相容性；②无免疫排斥反应；③具有可塑性，能为细胞生长提供三维立体支架；④无毒、无污染性；⑤生物可降解性。申请人研制的复方壳多糖胶原凝胶是一种良好的三维培养细胞的模型，在此基础上研制复方壳多糖真皮基质和人工双层皮肤接近天然真皮和皮肤的生物学特性(专利号：ZL01107099.4，ZL200610095122.9)，组织相容性及生物安全性高，无毒副作用及免疫排斥反应，同时可根据不同的需要进行随意的塑形。

细胞的体外三维培养有表面培养、“三明治”培养、混合培养、微载体培养等多种方法。采用不同的三维细胞培养方法所获结果是存在差异性的，对于本发明来说，为了更好的接近体内汗腺的生长发育过程，发明人采用了表面培养和混合培养的方法在体外构建组织工程皮肤。表面培养法就是将细胞接种在一定厚度的基质材料表面上，使其向下生长，有研究表明，运用表面培养法将分离纯化后的牛主动脉内皮细胞接种于胶原表面，发现内皮细胞能向胶原层内迁移，形成三维细胞网络和封闭的管腔样腔隙。混合培养法就是将细胞和基质材料充分混合后培养，另有研究表明，使用混合法，将胶原溶液与毛细血管内皮细胞混合后灌注在培养皿中，待胶原凝固后，加入培养基培养，微血管内皮细胞可以形成复杂的血管样结构。

附图说明

图1A为本发明人成纤维细胞的分离与培养中FB(×100)的原代培养生长显示图；

图1B为本发明人成纤维细胞的分离与培养中FB(×100)的传代培养生长显示图；

图2为本发明复方壳多糖组织工程皮肤的制备中加入8×10⁵/ml的ESC，仅用KGM培养行气液界面培养(×200)的表皮结构分化显示图；

图3为本发明复方壳多糖组织工程皮肤的制备中加入8×10⁵/ml的ESC，在KGM中添加浓度为20ng/ml的EGF(×100)的表皮结构分化显示图；

图4为本发明复方壳多糖组织工程皮肤的制备中加入8×10⁵/ml的ESC，在KGM中添加浓度为20ng/ml的EGF(×200)的表皮结构分化显示图；

图5A为本发明复方壳多糖组织工程凝胶中组织学观察实验中观察的60μm冰冻切片HE染色(×100)显示图；

图5B为本发明图5A的放大显示图；

图6为本发明复方壳多糖组织工程凝胶中免疫荧光观察实验中采用CLSM扫描，利用抗CK19抗体观察细胞团的形态结构的显示图；

图7为本发明复方壳多糖组织工程凝胶中免疫荧光观察实验中采用CLSM扫描，抗-CK18免疫荧光染色表达阳性的显示图；

图8为本发明复方壳多糖组织工程凝胶中免疫荧光观察实验中采用CLSM扫描，抗-CEA免疫荧光染色表达阳性的显示图；

图9为本发明复方壳多糖组织工程凝胶中透射电镜下观察实验中观察的细胞内的类似分泌样颗粒的高电子致密度物质(箭头所示)、内质网和核糖体的显示图；

图10为本发明复方壳多糖组织工程凝胶中透射电镜下观察实验中观察的细胞内的线粒体的显示图；

图11为本发明复方壳多糖组织工程凝胶中透射电镜下观察实验中观察的细胞内指状突起的显示图；

图12为本发明复方壳多糖组织工程凝胶中透射电镜下观察实验中观察的细胞之间可见连接(箭头1)和类似分泌小管的腔隙(箭头2)的显示图；

图13为本发明复方壳多糖组织工程凝胶中激光共聚焦显微镜观察钙通道实验中在细胞外液高钙时，氯化乙酰胆碱对管腺样结构钙通道的作用曲线图；

图14为本发明复方壳多糖组织工程凝胶中激光共聚焦显微镜观察钙通道实验中在细胞外液高钙时，阿托品对管腺样结构钙通道的作用曲线图；

图15为本发明复方壳多糖组织工程凝胶中激光共聚焦显微镜观察钙通道实验中在细胞外液高钙时，超纯水对管腺样结构钙通道的作用曲线图；

图16为本发明复方壳多糖组织工程凝胶中激光共聚焦显微镜观察钙通道实验中在细胞外液无钙时，氯化乙酰胆碱对管腺样结构钙通道的作用曲线图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面通过具体的实验来对本发明进行解释。

一.材料和仪器

1.主要仪器

二.实施例

实施例1：鼠尾胶原的制备

具体操作步骤如下：

1)解冻：冻存300g左右大白鼠鼠尾3根，于75％酒精溶液中解冻1小时；

2)取腱：去皮，D-Hanks液冲洗3遍，抽出尾腱，剪碎成泥，溶于无菌的1％冰醋酸250ml中，4℃保存48小时以上，其间反复振荡；

3)离心：3000rpm离心1小时，取上清；

4)贮存：所得物位乳白色半透明粘稠液体，4℃贮存备用，测得浓度为20mg/ml(湿重)。

实施例2人成纤维细胞的培养

具体步骤如下：

1)标本系健康成人包皮环切术之包皮(健康包皮，由中国人民解放军第三军医大学第一附属医院泌尿外科和中国人民解放军第三军医大学第三附属医院医学美容中心提供，患者均知情并同意。下同)，用75％酒精在净化工作台中浸浴并擦拭5min后，用PBS液反复冲洗3遍，每遍3-5min；

2)尽量去除皮下组织和真皮网状层，在另一清洁培养皿中将表真皮部分剪成2cm×0.3cm大小，移入装有0.25％分离酶10-20ml的玻璃小瓶中，加盖后置于4℃消化18-20小时；

3)取出皮片至清洁培养皿，用且镊子将表皮从真皮上揭下，弯头镊子刮真皮表面，所得真皮尽量剪成糊状，转移至另一培养皿，加0.2％胶原酶，所加量以浸没全部真皮碎泥为度，加盖，移至37℃孵箱2-3小时，并不时摇动；

4)取出，成液体，用200目筛网过滤，加PBS液，1500rpm离心5min，弃上清，反复5次。加DMEM至离心管，混匀成细胞悬液，移入培养瓶中，置37℃、5％CO₂/95％空气、90％以上湿度孵箱培养，每2-3天换液1次；

5)待原代培养的FB接近或达到融合，用0.25％胰蛋白酶消化，在倒置显微镜下观察，细胞体积增大，出现收缩裂隙时，用含10％FBS的DMEM培养接终止消化，系统分析细胞体积及增殖情况，并按照1:3传代，建立FB细胞库，为本实验提供来源统一的FB。本实验所用FB为第4-10代。

6)系统分析细胞体积及增殖情况：

取CASY测量杯，每杯加入10ml的CASYton；

取实验组细胞吹打均匀后，取50ul滴加于CASY测量杯中；

将CASY测量杯置于测量毛细管；

将铂电极浸没其中测量各标本的细胞数量与细胞活力；

每标本测量3次。

实施例3表皮干细胞的培养

1.人表皮干细胞的原代分离培养

标本取自健康包皮。

标本取下后浸泡于PBS平衡盐液中，4℃冰箱中保存，按下列步骤操作：

1)酒精浸泡5min后，置超净工作台上，用酒精棉球将标本轻轻擦拭三遍；

2)标本移至培养皿中，用PBS平衡盐液反复冲洗标本3遍，每个角落均要冲洗到，每遍不少于5min，直至标本发白发胀；

3)在培养皿中用手术剪剪去皮下组织，并将标本剪成0.3cm×2cm大小的皮条；

4)将皮条置于培养皿中，加0.25％分离酶浸没组织(分离酶与标本之比为5：1)；

5)4℃冰箱中消化过夜；

6)取出消化后的标本置于另一洁净培养皿中，PBS平衡盐液漂洗两遍；

7)用眼科镊轻轻揭下表皮，真皮部分置于另一培养皿中(可用于分离培养成纤维细胞)，揭下的表皮置于培养皿中，加0.25％胰蛋白酶2-3ml(一般表皮与胰蛋白酶体积比为3：1)，在37℃孵箱中消化30min；

8)消化时间满30min后取出置于另一培养皿中，加含10％FBS的DMEM终止胰蛋白酶消化，用吸管小心反复吹打，尽量使表皮分散；

9)200目筛网过滤，1000rpm离心5min；

10)弃上清，加K-SFM于其中，制成细胞混悬液，利用计算细胞活力及细胞数；

11)细胞按5×10⁴/孔接种在预先铺满IV型胶原的24孔板中，30min后吸尽未贴壁的细胞，利用计算吸出液中的细胞数，计算贴壁率＝(接种的细胞总数-悬浮的细胞数)/接种的细胞总数；

12)以后每天更换K-SFM培养液。

2.人表皮干细胞的传代培养

1)待原代表皮干细胞融合约70％后，弃去细胞培养液，PBS洗涤2-3遍；

2)每孔加入0.25％胰蛋白酶1ml后放入4℃冰箱；

3)待4h后将培养板取出，轻轻拍打细胞脱落，加入含10％FBS的DMEM中和；

4)将液体吸入15ml离心管中，用PBS轻轻冲洗培养板后移入离心管中，1000rpm/s,离心5min；

5)弃去上清液，加入K-SFM培养基重悬细胞后，计数后备用。

在上述实施例中，采用胶原酶消化法消化健康成人包皮真皮获得FB，进行原代培养。

如图1A所示，刚移入培养瓶的FB，在倒置显微镜下表现为各层面的大量的悬浮圆形细胞，30min后即可见部分细胞贴壁并伸展，12小时后绝大部分细胞贴壁，并伸出较钝细胞突出，并随着培养天数的增加，表现为突起变长，呈长梭形，基本平行，在接种的7-10天培养的FB可融合，且排列紧密呈漩涡状生长。如图1B所示，传代培养的FB生长旺盛，呈梭形，排列紧密有序，在不断通过胰蛋白酶消化提供种子细胞用于组织工程皮肤制备的同时，细胞库的FB一直保持正常的生长活性，未发生污染现象。

实施例4复方壳多糖组织工程皮肤制备

具体步骤如下：

1)在冰浴条件下按比例混匀醋酸鼠尾胶原、壳多糖、硫酸软骨素、透明质酸、弹性蛋白及浓缩DMEM；

2)用1N氢氧化钠调节pH值至7.2-7.4；

3)在凝胶中加入FB细胞，细胞量达到10⁵/ml；

4)吸入24孔板培养板中，每孔1ml，放入孵箱内待形成凝胶后，每孔轻轻加入1代表皮干细胞1ml(浓度分别为8×10⁵/ml)，最后再加入KGM培养基，置37℃、5％CO₂/95％空气、90％以上湿度孵箱培养，每天换液1次；

5)培养3天后，用不锈钢筛网支架抬高3mm，行气液界面培养，并将组织工程皮肤分为两组：一组仅用KGM培养，一组在KGM中添加EGF(浓度为20ng/ml)；两组均每日垂直振荡，振荡频率为75次/分，振幅为2cm；

6)培养16天后，用4％多聚甲醛固定后行HE染色，观察皮肤生长情况。

7)HE染色

脱水：组织工程皮肤的各个标本按照30％酒精30min---50％酒精30min---75％酒精30min---80％酒精30min---95％酒精30min(两次)---无水酒精30min(两次)，梯度脱水，

浸蜡，石蜡包埋，5μm厚连续切片；

脱蜡水洗：烤片---二甲苯Ⅰ、Ⅱ各5min----水洗(无水酒精、95％酒精、80％酒精各1min----蒸馏水)；

HE染色按常规进行。

在上述实施例中，如图2所示，加入8×10⁵/ml的ESC，仅用KGM培养行气液界面培养，可见表皮结构分化良好，并大致可分为基底层，棘层和角质层，角质层较厚，基底层排列规则，各层均有层数不等的扁平梭形细胞，但未见细胞向真皮内生长分化；如图3和图4所示，加入8×10⁵/ml的ESC，在KGM中添加浓度为20ng/ml的EGF，可见皮肤熟化程度较高，表皮分化良好，表真皮结合较好，见表皮细胞向真皮基质凝胶内生长，并出现管腺样结构。

实施例5复方壳多糖组织工程凝胶的制备

具体操作步骤如下：

1)在冰浴条件下按比例混匀醋酸鼠尾胶原、壳多糖、硫酸软骨素、透明质酸、弹性蛋白及浓缩DMEM；

2)用1N氢氧化钠调节pH值至7.2-7.4；

3)在凝胶中加入1代表皮干细胞，细胞量为8×10⁵/ml；

4)吸入24孔板培养板中，每孔1ml，放入孵箱内待形成凝胶后，再加入KGM，置37℃、5％CO₂/95％空气、90％以上湿度孵箱培养，每天换液1次；

5)每日垂直振荡，振荡频率为75次/分，振幅为2cm；

6)培养3天后，在KGM中添加EGF(浓度为20ng/ml)；

7)培养16天后行组织学及形态学检查。

实施例6组织工程凝胶的观察

1.组织学观察

1)将长有细胞团的组织工程凝胶置于特制的小盒中，加入适量OTC包埋剂浸没凝胶，液氮下速冻5-10sec，使OTC固化呈乳白色后取出；

2)冰冻切片机开始切片，切片厚度为60um；

3)将切片贴附在涂有多聚赖氨酸的载玻片上，室温下风干后，置于无水乙醇和甲醛液各半配制的溶液中固定30min，PBS漂洗5min×3次；

4)按常规进行HE染色。

在上述实验中，如图5A和图5B所示，组织切片HE染色可见凝胶内的细胞成团生长形成管腔样结构，管腔结构的管壁由单层细胞构成，中间可见较大腔隙，细胞胞浆红染，部分细胞核位于基底部，颜色较深，部分细胞形态可见腔面窄、基底部大，排列有一定的极性，与汗腺分泌部管状结构相似。

2、免疫荧光观察

1)将凝胶置于4％多聚甲醛中固定2h，PBS漂洗5min×3次；

2)加一抗工作液(CK19、CK18、CEA)，湿盒内37℃孵箱内放置30min，PBS漂洗5min×3次；

3)加入荧光标记的抗体羊抗鼠IgG-FITC1:100，湿盒内37℃孵箱内放置30min，PBS漂洗5min×3次；

4)缓冲甘油封片；

5)将制备的样品放在激光扫描共聚焦显微镜的载物台上，在倒置显微镜下寻找细胞后转到激光光源进行扫描。

在上述实验中，ESC和汗腺细胞均表达的CK19，在CLSM扫描下，利用抗-CK19抗体观察凝胶中细胞的形态。如图6所示，可以发现有细胞聚集成团，形成管腔样结构，管腔结构由单层细胞构成的管壁和中央空腔组成，与汗腺分泌部的管状结构相似。如图7和图8所示，管腔样结构抗-CK18和抗-CEA免疫荧光染色均表达阳性。

3.透射电镜下观察

1)2.5％的戊二醛固定胶原凝胶中的细胞团2h；

2)PBS漂洗1h；

3)1％锇酸固定1h；

4)PBS漂洗3次，每次5min；

5)50％、70％、80％、90％、无水丙酮Ⅰ、无水丙酮Ⅱ，分别脱水15min；

6)1:1丙酮和环氧树脂的混合剂室温中浸透3h；

7)1:2丙酮和环氧树脂的混合剂室温中浸透1h；

8)纯丙酮37℃浸透2h。；

9)环氧树脂包埋液注入干燥的塑料模板中；

10)细胞团移至塑料模板的液面上，使其自然沉落；

11)贴标签，包埋后的模板依次置于37℃(12h)、45℃(12h)、60℃(24h)；

12)行半薄切片定位，光学显微镜观察，确定检测范围；

13)制备超薄切片；

14)捞片：镊子夹持铜网，蘸取液面上的切片；

15)滤纸吸干铜网；

16)醋酸铀乙醇液染色20min；

17)双蒸水冲洗；

18)柠檬酸铅液染色10min；

19)双蒸水冲洗；

20)透射电镜下观察。

在上述实验中，透射电镜观察结果显示，如图9所示，电镜下可见细胞内有成束的张力细丝，含有类似分泌样颗粒的高电子致密度物质，内质网合成分泌增多，较多核糖体，如图10所示，细胞中则含有较多线粒体；如图11所述，细胞有指状突起，如图12所示，细胞之间可见紧密连接和缝隙连接，有以及类似分泌小管的腔隙。

4、激光共聚焦显微镜观察钙通道

1)实验分组：取24孔培养板中生长良好的汗腺腺上皮管腔样细胞团20孔，随机分为4组。具体见下表1：

表1激光共聚焦显微镜观察钙通道的实验分组

上述表1中：

实验组

A组：细胞外液为高钙K-SFM培养基(钙浓度为2mM)，刺激因素为氯化乙酰胆碱(5×10^－5M)；

B组：细胞外液为含有阿托品((5×10^－5M)的高钙K-SFM培养基(钙浓度为2mM)，刺激因素为氯化乙酰胆碱(5×10^－5M)；

对照组

A组：细胞外液为高钙K-SFM培养基(钙浓度为2mM)，刺激因素为超纯水；

B组：细胞外液为无钙K-SFM培养基，刺激因素为氯化乙酰胆碱(5×10^{－ 5}M)。

2)细胞负载：弃去培养孔中K-SFM培养基，加PBS液洗2遍，每孔加入负载液0.2ml，PluronicF-1271ul，37℃负载30min，室温再负载10min，激光共聚焦显微镜下观察，细胞被Fluo-3标记后，弃去负载液，在各组细胞中加入约0.4ml/孔各组细胞外液，立即上机测试。

3)观察记录：执行Leicaconfocalsoftware激光共聚焦软件，激发波长为488nm，发射波长为533nm(Fluo-3)。观察每孔时，适时加入氯化乙酰胆碱，终作用浓度为5×10^－5M，观察管腔样结构内荧光变化，即管腔样结构内钙离子浓度变化。

在上述实验中，培养在24孔板中的管腔样结构负载后，结构内均可见绿色荧光表达。负载成功后，按预先设定的分组进行试验：

1)实验组A：当细胞外液高钙时，予以氯化乙酰胆碱刺激，可见结构内荧光强度先明显增强，说明结构内游离钙增加，达到一定峰值后，约15-20sec后其强度随即略有下降，但其最终荧光强度明显高于刺激前，每个视野取五个结构，作荧光强度变化曲线，均观察到相同变化，如图13所示。

2)实验组B：当细胞外液高钙时，管腔样结构先用阿托品预处理，然后再予氯化乙酰胆碱刺激，可见管腔样结构内荧光强度较刺激前无明显变化，始终处于较恒定的状态，说明管腔样结构内游离钙无明显变化，每个视野取五个结构，作荧光强度变化曲线，均较刺激前无明显变化，如图14所示。

3)对照组A：当细胞外液高钙时，予以超纯水刺激，可见管腔样结构内荧光强度无明显变化，说明细胞结构内游离钙无明显变化，每个视野取五个结构，作荧光强度变化曲线，均较刺激前无明显变化，如图15所示。说明细胞外液高钙时，无适宜的刺激，细胞内游离钙浓度不会发生变化。

4)对照组B：当细胞外液无钙时，予以氯化乙酰胆碱刺激，可见结构内荧光强度稍有下降后即维持在相对恒定的状态，如图16所示，可能是氯化乙酰胆碱刺激后，钙通道开放，胞内游离钙在细胞内、外钙浓度差的促使下仅少量外流所致。

综上，上述的实验结果显示，在细胞外液高钙时，加入氯化乙酰胆碱后，管腔样结构内荧光强度明显增强，提示细胞内游离钙明显增加。而细胞内游离钙增加的情况可以被阿托品阻断。阿托品是细胞膜钙通道阻止剂，它能竞争性的与细胞膜上的乙酰胆碱受体结合，从而能有效的阻止乙酰胆碱与其受体的结合。结合实验A组和B组结果，可以得出：细胞内游离钙的增加是由细胞外钙内流所导致的而并非是由细胞中钙库中的钙释放所导致的。同时，在细胞外液高钙时，加入超纯水，管腔样结构内荧光强度无明显变化，细胞外游离钙不能内流；在细胞外无钙时，加入氯化乙酰胆碱，细胞内少量钙外流，说明管腔样结构钙通道为化学门控型而非浓度依赖性。从以上钙通道实验结果，我们可以认为，在诱导的管腔样结构的细胞上存在有乙酰胆碱受体调控的钙通道，并具有活性。

综上所述，本发明证实在体外利用复方壳多糖组织工程皮肤和凝胶三维培养，一定浓度的EGF(20ng/ml)诱导、垂直振荡培养，能形成管腔样结构，所形成的管腔样结构，在形态学、组织学及功能上与在体汗腺分泌部细胞相似，具有与正常汗腺分泌部细胞相似的生理结构及生理作用基础。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围；如果不脱离本发明的精神和范围，对本发明进行修改或者等同替换，均应涵盖在本发明权利要求的保护范围当中。

Claims (10)

1.一种表皮干细胞向汗腺样上皮细胞分化的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)鼠尾胶原的制备

将冻存的大白鼠鼠尾在酒精溶液中解冻后，去皮，采用D-Hanks液冲洗，抽出尾腱，剪碎成泥，溶于无菌的冰醋酸中保存一段时间，其间反复振荡，然后进行离心处理，提取上清溶液，得到乳白色半透明粘稠液体，即为所得物鼠尾胶原，将其贮存备用；

2)人成纤维细胞的培养

将健康成人包皮环切术的包皮标本用酒精浸浴并擦拭，再用PBS液反复冲洗；去除皮下组织和真皮网状层，将表真皮部分剪成长方形条状后进行消化；然后将表皮从真皮上揭下，刮真皮表面，将所得真皮剪成糊状，加胶原酶，加盖，移至孵箱中并不时摇动；接着取出液体，筛网过滤，加PBS液，离心弃上清，加DMEM混匀成细胞悬液，移入孵箱中培养，待原代培养的FB接近或达到融合后，用0.25％胰蛋白酶进行消化，当细胞体积增大，出现收缩裂隙时，用含10％FBS的DMEM培养接终止消化，最后分析细胞体积及增殖情况，并按照1:3传代，建立FB细胞库，提供来源统一的FB。

3)表皮干细胞的培养

先将人表皮干细胞的原代分离培养，包括下列步骤：

a)将取下的人包皮标本用酒精浸泡并擦拭后，再用PBS平衡盐液冲洗，直至标本发白发涨；

b)将上述步骤a)中的人包皮标本剪去皮下组织后剪成长方形的条状，然后进行分离消化；

c)将步骤b)中的人包皮标本用PBS平衡盐液漂洗，对人包皮标本的表皮和真皮进行分离，将分离后所得的表皮进行消化，消化后进行离心、筛网过滤，弃去上清液，再放入K-SFM培养液中，制成细胞混悬液，计算细胞活力及细胞数，细胞按5×10⁴/孔接种在预先铺满IV型胶原的培养板中，30min后吸尽未贴壁的细胞，计算吸出液中的细胞数和贴壁率，并每天更换K-SFM培养液；

再进行人表皮干细胞的传代培养，包括下列步骤：

d)待原代表皮干细胞融合约70％后，弃去细胞培养液，用PBS进行洗涤；

e)每孔加入0.25％胰蛋白酶后放入冰箱，保持在4℃；

f)待4h后将培养板取出，轻轻拍打细胞脱落，加入含10％FBS的DMEM中和；

g)将液体吸入离心管中，用PBS轻轻冲洗培养板后移入离心管中进行离心；

h)弃去上清液，加入K-SFM培养基重悬细胞后，计算细胞数后备用；

4)复方壳多糖组织工程皮肤的制备

按比例混匀醋酸鼠尾胶原、壳多糖、硫酸软骨素、透明质酸、弹性蛋白及浓缩DMEM；再用氢氧化钠调节pH值至7.2-7.4；在凝胶中加入FB细胞，细胞量达到10⁵/ml；吸入多孔培养板中，放入孵箱内待形成凝胶后，每孔轻轻加入浓度为8×10⁵/ml的1代表皮干细胞，最后再加入KGM培养基，置孵箱培养，每天进行换液；待培养3天后，进行行气液界面培养，将组织工程皮肤分为两组：一组仅用KGM培养，一组在KGM中添加EGF；两组均每日垂直振荡；待培养16天后，用4％多聚甲醛固定后行HE染色，观察皮肤生长情况；

5)复方壳多糖组织工程凝胶的制备

按比例混匀醋酸鼠尾胶原、壳多糖、硫酸软骨素、透明质酸、弹性蛋白及浓缩DMEM；再用氢氧化钠调节pH值至7.2-7.4；在凝胶中加入1代表皮干细胞，细胞量为8×10⁵/ml；吸入多孔培养板中，放入孵箱内待形成凝胶后，再加入KGM，置孵箱中培养，每天进行换液；每日垂直振荡；待培养3天后，在KGM中添加浓度为20ng/ml的EGF；待培养16天后行组织学及形态学检查；

6)组织工程凝胶的观察

步骤包括组织学观察、免疫荧光观察、透射电镜下观察以及激光共聚焦显微镜观察钙通道。

2.根据权利要求1所述的表皮干细胞向汗腺样上皮细胞分化的方法，其特征在于，所述步骤1)中尾腱保存条件为4℃，保存48h，所得物鼠尾胶原的贮存条件为4℃。

3.根据权利要求1所述的表皮干细胞向汗腺样上皮细胞分化的方法，其特征在于，所述各步骤中酒精的浓度均为75％，所述孵箱的条件为37℃、5％CO₂/95％空气、90％以上湿度，所述筛网规格为200目。

4.根据权利要求1所述的表皮干细胞向汗腺样上皮细胞分化的方法，其特征在于，所述步骤1)中离心条件为3000rpm，离心1h；所述步骤2)中离心条件为1500rpm，离心5min；所述步骤3)中离心条件为1000rpm，离心5min。

5.根据权利要求1所述的表皮干细胞向汗腺样上皮细胞分化的方法，其特征在于，所述步骤2)和3)b)中人包皮标本剪成长方形条状的尺寸为0.3cm×2cm。

6.根据权利要求1所述的表皮干细胞向汗腺样上皮细胞分化的方法，其特征在于，所述步骤3)c)中分离采用0.25％分离酶进行，其中所述分离酶与样本的比例为5:1，消化采用0.25％胰蛋白酶进行，其中表皮与所述胰蛋白酶体积比为3:1。

7.根据权利要求1所述的表皮干细胞向汗腺样上皮细胞分化的方法，其特征在于，所述步骤2)中采用且镊子将表皮从真皮上揭下，弯头镊子刮真皮表面；所述步骤3)c)中表皮和真皮进行分离采用眼科镊轻轻揭下表皮即完成表皮和真皮的分离。

8.根据权利要求1所述的表皮干细胞向汗腺样上皮细胞分化的方法，其特征在于，所述步骤2)中所述FB为第4-10代；所述步骤3)、4)和5)中培养板为24孔培养板。

9.根据权利要求1所述的表皮干细胞向汗腺样上皮细胞分化的方法，其特征在于，所述步骤2)中采用系统分析细胞体积及增殖情况，所述步骤3)c)中利用系统来分析计算细胞活力及细胞数。

10.根据权利要求1所述的表皮干细胞向汗腺样上皮细胞分化的方法，其特征在于，所述步骤4)和步骤5)中所述的混匀在冰浴条件下进行和所述的垂直振荡条件为振荡频率为75次/分，振幅为2cm。