CN1563365A - 一种分离纯化皮肤表皮干细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分离纯化皮肤表皮干细胞的方法，在皮肤组织块培养过程中采用自行设计的培养基能有效抑制成纤维细胞的生长，从组织块四周生长出均一的上皮样细胞，诱发表皮干细胞迁移出原来的微环境，在新生成的上皮样细胞层上重新聚集生长。这类克隆性生长的细胞与其依赖的滋养层细胞有明显形态学上的差别。借助解剖镜和玻璃针就能将其挑选出来，进行单独扩增培养。对所获得细胞进行当前同行公认的表皮干细胞分子标志的检测：CK19，integrin－β1，p63，integrin－α6均为阳性，即证明所分选的是纯化的表皮干细胞。本发明克服了传统酶消化法的缺点，直接利用干细胞的生物学行为获得纯化的表皮干细胞，可用于人类和哺乳动物表皮干细胞的分离纯化。
Description
技术领域
本发明属人类和哺乳动物成体干细胞分离纯化技术领域，具体涉及一种人类和哺乳动物皮肤表皮干细胞的分离纯化、扩增等方法。
背景技术
表皮干细胞(Epidermal stem cells，ESCs)是具有自我增殖和多向分化潜能的干细胞，它的正常增殖和分化是维持皮肤及其附属器(汗腺、毛发、皮脂腺)结构和功能完整性的基本要求。在生理条件下，表皮干细胞通过不对称分裂方式分化为一个干细胞和一个短暂扩充细胞(transitamplifying cells TA细胞)，TA细胞再经过多次分裂后分化为有丝分裂后细胞(Post-mitotic cells)及终末分化细胞(terminally-differentiatedcells)。以补充表皮细胞的不断更新需要。研究表明表皮干细胞不仅能在体外长期传代培养，并保持其增殖分化潜能(Dunnwald et al，Exp能[Liang et al，stem cells，2002：20：21-31]。因此，获得纯化的表皮干细胞不仅可为构建有生理功能的人工皮肤提供种子细胞，而且可用于基因治疗和转基因动物的生产。然而，分离纯化表皮干细胞至今仍是一个难题。国内外学者普遍采用酶消化法，获得含有表皮干细胞的混合细胞群。根据表皮干细胞对特异底物的粘附性[Jones.et al.cell.1993，73(4)：713-724；Bickenbach et al，Exp cellRes.1998.224(1)：184-185]，或用一些表皮干细胞的相关标志物或特殊染色剂对表皮干细胞进行标记，用流式细胞仪进行分选[Li et al，PNAS，1998，95(7)，3902-3907，Taniet al，PNAS，2000，97(20)：10960-10965。Dunnwald et al，Exp Dermatol2001，10：45-54]，由于还没有找到一种能精确反映表皮干细胞的特异性分子标记，上述分离方法很难将表皮干细胞与TA细胞完全分开。探索一种有效安全的分离纯化表皮干细胞的方法仍是我们面临的一大难题[Alonso L and Fuchs E，www.PNAS.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1734203100]。
发明内容
本发明的目的在于，克服目前酶消化法获得的是混合细胞群的缺点，根据表皮干细胞克隆性生长的特性，提供一种采用组织块培养法与克隆筛选法相结合，不借助任何化学试剂及复杂仪器而达到安全有效分离纯化表皮干细胞的方法。
本发明实现上述目的采取的技术方案包括以下步骤：
1)首先取一块皮肤，置于含青链霉素的生理盐水中，用含青链霉素的PBS(一)冲洗，去血污及毛发；
2)在解剖镜下将皮肤与皮下组织分开，将皮肤切成0.1～0.2×0.1～0.2cm2大小的小块，按表皮面朝上贴于玻璃平皿(直径为50mm)中，每皿3-4块，加培养基；培养基的配方为：Medium199(Gibco，LotNo.1129880)+15～20％NBS(新生牛血清，郑州市佰安生物工程有限公司，Lot1120193)+5～8μg/ml insulin(胰岛素，购自北京鼎国生物技术有限责任公司，http//www.digguo.com，Sigma分装，原产品编号为15500)+0.5μg/ml氢化可的松+青链霉素(青霉素购自哈药集团制药总厂，批号B01124412；硫酸连霉素购自华北制药股份有限公司，批号010724)100u/ml；
3)置于CO2培养箱(WTB CO2培养箱，美国)中培养，培养箱内的条件为5％CO2，饱和湿度，37℃；，每两天换液一次。
4)经3天～4天后，从组织块边缘长出上皮样细胞铺路石样生长，7天～12天后，在上皮样细胞层上有小圆形细胞聚集呈克隆样生长，待这些克隆直径达100μm～150μm时，在解剖镜下挑取这些克隆，用0.25％Trypsin(胰蛋白酶1∶250，华美生物工程公司)+0.02％EDTA(乙二胺四乙酸，Invitrogen，LOT1120193)进行适当处理，用玻璃针将这些细胞吸入铺有明胶(Sigma，Lot50K02505)的3.5cm塑料皿(CELLSTAR Lot02030151)中，用无血清培养基培养；
无血清培养基的配方为：F12(Initrogen CorporationLot1116568)+1～1.2％BSA(牛血清白蛋白Sigma，LOT 716H9310)+20～25％GSFCM(goat skin fibroblast conditional medium，GSFCM，山羊成纤维细胞条件培养基)+20～25ng/ml EGF(表皮细胞生长因子，Sigma，E-mail：techserv@sial.com，Product Number E 9644)+5ug/mlinsulin(胰岛素)+15～20ng/ml IGF-1胰岛素类生长因子-1，SigmaE-mail：techserv@sial.com，product Number I3769)+0.4～0.6μg/ml氢化可的松+青链霉素100u/ml；
5)待细胞增殖达75％0.5μg/ml融合时，用0.25％Trypsin(胰蛋白酶1∶250，华美生物工程公司)+0.02％EDTA(乙二胺四乙酸，Invitrogen，LOT1120193)进行消化，传代培养。本发明用无血清培养基将关中奶山羊表皮干细胞传25代冻存；
6)对所获得细胞进行当前同行公认的表皮干细胞分子标志的检测：CK19(角蛋白19，Sigma，sigma-aldrich.com，Product Number C 6930)，integrin-β1(整合素-β1 Product Number I 8638)，p63(Santa CruzBiotechnology，Inc.4A4：sc-8431)，integrin-α6(整合素-α6Sigma，CD49f，VLA-6a，Product Number I6653)均为阳性，证明所分选的是纯化的表皮干细胞。
本发明在皮肤组织块培养过程中采用自行设计的培养基能有效抑制成纤维细胞的生长，从组织块四周生长出均一的上皮样细胞，诱发表皮干细胞迁移出原来的微环境，在新生成的上皮样细胞层上重新聚集生长。这类克隆性生长的细胞与其依赖的饲养层细胞有明显形态学上的差别。借助解剖镜和玻璃针就能将其挑选出来，进行单独扩增培养，达到纯化表皮干细胞的目的。
本发明克服了传统酶消化法的缺点，直接利用干细胞的生物学行为获得纯化的表皮干细胞，是一种有效安全的分离纯化表皮干细胞的方法，可用于人类和哺乳动物表皮干细胞的分离纯化。
附图说明
图1是组织块培养获得关中奶山羊原代表皮干细胞克隆，X200；
图2是第二代关中奶山羊表皮干细胞integrin-α6阳性，x100；
图3是第二代关中奶山羊表皮干细胞β1-integrin阳性，X200；
图4是第二代关中奶山羊表皮干细胞CK-19阳性，X100；
图5是第二代关中奶山羊表皮干细胞P63阳性X400。
具体实施方式
以下结合发明人给出的实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1：关中奶山羊表皮干细胞的分离纯化扩增
参见附图，图1是采用本发明的方法中组织块培养获得关中奶山羊原代表皮干细胞克隆，X200；图2是原代关中奶山羊表皮干细胞integrin-α6阳性，X100；图3是第一代关中奶山羊表皮干细胞β1-integrin阳性，X200；图4是第二代关中奶山羊表皮干细胞CK-19阳性，X100；图5是第二代关中奶山羊表皮干细胞p63阳性X400。
在关中奶山羊(2.5-3.5岁母羊)耳中部血管相对较少处，刮毛消毒，用耳号钳剪下一块大小约0.5×0.5cm2的皮肤，置于含青链霉素(1000/ml)的生理盐水中带回无菌间，用含青链霉素的PBS(一)冲洗数遍，去血污及毛发。在解剖镜下将皮肤与软骨分开，将皮肤切成0.2×0.2cm2大小的小块，按表皮面朝上贴于玻璃平皿(φ＝5.5cm)中，每皿3-4块，加适宜量培养基(Medium199+15～20％NBS+5～8μg/ml insulin+0.5μg/ml氢化可的松+青链霉素100u/ml)，置于CO2培养箱(5％CO2，饱和湿度，37℃)中培养，每两天换液一次。3-4天后，从组织块边缘长出上皮样细胞铺路石样生长，7-12天后，在上皮样细胞层上有小圆形细胞聚集呈克隆样生长(图1)，待这些克隆直径达100-150μm时，在解剖镜下挑取这些克隆，用0.20％ Trypsin和0.02％EDTA适当处理，用玻璃针(自制)将这些细胞吸入铺有明胶的3.5cm塑料皿中，用自行设计的无血清培养基培养。
无血清培养基的配方为：F12+1～1.2％BSA(牛血清白蛋白)+20～25％GSFCM+20～25ng/ml EGF+5ug/ml insulin+15～20ng/ml IGF-1+0.4～0.6μg/ml氢化可的松+青链霉素100u/ml；待细胞增殖达75％融合时，用0.25％Trypsin+0.02％EDTA进行消化，传代培养。
本发明用无血清培养基将关中奶山羊表皮干细胞传25代冻存。干细胞鉴定采用免疫组织化学法检测β1-integrin(整合素β1)，CK-19(角蛋白19)，p63，integrin-α6，具体操作按北京中山生物试剂有限公司免疫组化染色试剂盒(SP-9000/9001/9002)说明书进行；结果表明本发明所得到的干细胞β1-integrin，CK-19，p63，integrin-α6均为阳性(图2-5)。
实施例2：人类表皮干细胞的分离纯化扩增
取医院包皮环切术后废弃的一块大小约0.5×0.5cm2的皮肤，置于含青链霉素(1000μ/ml)的生理盐水中带回无菌间，用含青链霉素的PBS(一)冲洗数遍，去血污。在解剖镜下将皮肤与皮下组织分开，将皮肤切成0.1～0.2×0.1～0.2cm2大小的小块，按表皮面朝上贴于玻璃平皿(φ＝5.0cm)中，每皿3-4块，加适宜量培养基(Medium199+15～20％NBS+5～8μg/ml insulin+0.5μg/ml氢化可的松+青链霉素100u/ml)，置于CO2培养箱(5％CO2，饱和湿度，37℃)中培养，每两天换液一次。3-4天后，从组织块边缘长出上皮样细胞铺路石样生长，7-12天后，在上皮样细胞层上有小圆形细胞聚集呈克隆样生长，待这些克隆直径达100-150μm时，在解剖镜下挑取这些克隆，用0.20％Trypsin适当处理，用玻璃针(自制)将这些细胞吸入铺有明胶的3.5cm塑料皿中，用自行设计的无血清培养基培养，无血清培养基的配方为：F12+1～1.2％BSA(牛血清白蛋白)+20～25％GSFCM+20～25ng/ml EGF+5ug/ml insulin+15～20ng/ml IGF-1+0.4～0.6μg/ml 氢化可的松+青链霉素100u/ml；待细胞增殖达75％融合时，用0.25％Trypsin+0.02％EDTA进行消化，传代培养，用无血清培养基将成人包皮来源的表皮干细胞传5代冻存，干细胞鉴定采用免疫组织化学法检测β1-integrin(整合素β1)，CK-19(角蛋白19)，p63，ntegrin-α6具体操作按北京中山生物试剂有限公司免疫组化染色试剂盒(SP-9000/9001/9002)说明书进行，结果表明本发明所得到的人类表皮干细胞β1-integrin，CK-19，p63，integrin-α6均为阳性。
Claims (1)
1.一种分离纯化皮肤表皮干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)首先取一块皮肤，置于含青链霉素的生理盐水中，用含青链霉素的PBS(一)冲洗，去血污及毛发；
2)在解剖镜下将皮肤与皮下组织分开，将皮肤切成0.1～0.2×0.1～0.2cm2大小的小块，按表皮面朝上贴于玻璃平皿中，每皿3-4块，加培养基；培养基的配方为：Medium199+15～20％NBS即新生牛血清+5～8μg/mlinsulin(胰岛素)+0.5μg/ml氢化可的松+青链霉素100u/ml；
3)置于CO2培养箱中培养，培养箱内的条件为5％CO2，饱和湿度，37℃，每两天换液一次；
4)经3天-4天后，从组织块边缘长出上皮样细胞铺路石样生长，7天-12天后，在上皮样细胞层上有小圆形细胞聚集呈克隆样生长，待这些克隆直径达100-150μm时，在解剖镜下挑取这些克隆，用0.20％Trypsin即胰蛋白酶和0.02％EDTA适当处理，用玻璃针将这些细胞吸入铺有明胶的3.5cm塑料皿中，用无血清培养基培养；
无血清培养基的配方为：F12+1～1.2％BSA(牛血清白蛋白)+20～25％GSFCM+20～25ng/mlEGF+5ug/mlinsulin+20ng/mlIGF-1+0.4～0.6ug/ml氢化可的松+青链霉素100u/ml。
5)待细胞增殖达75％融合时，用0.25％Trypsin+0.02％EDTA进行消化，传代培养，用无血清培养基将关中奶山羊表皮干细胞传25代冻存，将人类表皮干细胞传5代冻存；
6)对所获得细胞进行当前同行公认的表皮干细胞分子标志的检测：CK19，integrin-β1P63，integrin-α6均为阳性，即证明所分选的是纯化的表皮干细胞。
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