CN103114075B - 一种牛滋养层干细胞建系方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种牛滋养层干细胞建系方法，其是在体外条件下，将经过链霉蛋白酶处理去透明带后的牛囊胚接种于经丝裂霉素处理后的小鼠胎儿成纤维细胞和Wnt-3A小鼠皮下结缔组织细胞的饲养层中，加入2i小分子抑制剂培养液进行细胞的传代培养，从而构建牛滋养层干细胞系。该法可用于获得和在体外条件下长期培养牛滋养层干细胞。本发明的牛滋养层干细胞建系方法可以在大动物转基因和体细胞克隆中应用，并可进一步用于牛胚胎着床和胎盘分化的研究。

Description

一种牛滋养层干细胞建系方法

技术领域

本发明涉及细胞生物学和分子生物学领域，具体地说，涉及一种牛滋养层干细胞建系方法。

背景技术

滋养层干细胞（Trophoblast stem cells，TSC）是胚胎发育过程中分化为胎盘部分的前体细胞。在小鼠中，TSC可经囊胚一端的滋养外胚层（Trophectoderm，TE）贴壁后获得。与来自于囊胚的内细胞团（Inner cell mass，ICM）的胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ESC）的多能性相比，TSC的分化发育能力是有限的。目前在一些物种中获得的TSC已经用于研究细胞的分化现象（Flechon.J.E.1995;Talbot,2000;Miyazaki,2002;Hashizume K,2006）。

2i体系主要包含了CHIR99021和PD0325901。CHIR99021是一种针对于GSK3(glycogen synthase kinase3)且特性明确的、高效选择性的小分子抑制剂(Murray等，2004)。PD0325901是一种MEK（mitogen-activated protein kinase kinase）的小分子抑制剂。已有研究显示在MEF细胞和3i（CHIR99021,PD184352,SU5402）的培养条件下，可从Rat囊胚获得有生殖嵌合能力的大鼠ES细胞（Ping Li,2008）。同时该研究显示以L细胞和2i（CHIR99021，PD0325901）的培养条件下获得的Rat ES贴壁生长更稳定且该ES细胞可用于遗传操作。

目前，在家畜TSC研究方面，国外有相关培养体系的研究报道并获得了一些TSC细胞，但未见关于牛TSC体外长期传代并建系的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种牛滋养层干细胞建系方法，为转基因克隆牛的研究与生产提供可用于基因转染和体外长期筛选的干细胞，获得的细胞可用于进一步牛胚胎着床和胎盘分化的研究。

为了实现本发明目的，本发明的一种牛滋养层干细胞建系方法，其是在体外条件下，将经过链霉蛋白酶处理去透明带后的牛囊胚接种于经丝裂霉素处理后的小鼠胎儿成纤维细胞和Wnt-3A小鼠皮下结缔组织细胞的饲养层中，加入2i小分子抑制剂培养液进行细胞的传代培养，从而构建牛滋养层干细胞系。

所述2i小分子抑制剂培养液配方以1L计为：

其中，PD0325901为非ATP竞争性的MAPK激酶MEK抑制剂，分子式C₁₆H₁₄F₃IN₂O，分子结构如式（I）所示：

CHIR99021为GSK3β选择性抑制剂，分子式C₂₂H₁₈Cl₂N₈，分子结构如式（II）所示：

前述的牛滋养层干细胞建系方法中，所述囊胚优选为发育到第7天的牛囊胚。

前述的牛滋养层干细胞建系方法中，小鼠胎儿成纤维细胞和L细胞按1:1比例混合。

前述的牛滋养层干细胞建系方法中，待小鼠胎儿成纤维细胞和L细胞汇合度达60%-80%时，用丝裂霉素处理，即得饲养层。

前述的牛滋养层干细胞建系方法中，丝裂霉素的使用浓度为16-18μg/ml，处理时间为2-3h。优选丝裂霉素的使用浓度为17μg/ml，处理时间为3h。

前述的牛滋养层干细胞建系方法中，细胞的培养条件为：38.5℃，5%CO₂。

前述的牛滋养层干细胞建系方法中，细胞传代包括以下步骤：

1）在显微镜下，用注射器的针头将4孔板内贴壁生长的牛滋胚层干细胞剥离，并用移液枪将滋胚层干细胞转移到60mm细胞培养皿中；

2）用注射器针头的斜面将大片的滋胚层干细胞切成2-3个小片。同时将泡状的滋胚层干细胞切成小片，将切好的小片滋胚层干细胞接种于4孔板内新鲜的饲养层中，进行细胞的传代培养，传代后第3d按300μl/孔更换新鲜的2i小分子抑制剂培养液。

本发明进一步提供一种用于牛滋养层干细胞体外建系的培养液，其配方以1L计为：

其中，PD0325901为非ATP竞争性的MAPK激酶MEK抑制剂，分子式C₁₆H₁₄F₃IN₂O，分子结构如式（I）所示：

CHIR99021为GSK3β选择性抑制剂，分子式C₂₂H₁₈Cl₂N₈，分子结构如式（II）所示：

本发明是通过体外采集牛卵母细胞并与精子在体外受精得到囊胚，将第7天的囊胚经链霉蛋白酶去透明带后接种于17μg/ml丝裂霉素处理3h的小鼠胎儿成纤维细胞/Wnt-3A小鼠皮下结缔组织细胞（1:1）（2×10⁵个/孔（四孔板）），用2i小分子抑制剂培养液于38.5℃，5%CO₂条件下培养5-7d，待囊胚贴壁后，每日半量换液，第10d进行机械传代。当TSC传代到一定程度时，对滋胚层干细胞进行常规冻存和解冻。在传代培养的同时，对滋胚层干细胞进行鉴定。

本建系方法采用2i小分子抑制剂和全胚接种法，建立了牛滋养层干细胞的培养方法。该方法效果稳定，重复性好，利用该方法建立了牛滋养层干细胞系3个，建立的滋胚层干细胞生长旺盛，可在体外长期传代，目前已传至97代，冻存复苏后可保持干细胞特性并继续生长。这些建立起来的干细胞系为正常二倍体核型，碱性磷酸酶染色阳性，表达OCT4、Nanog、SSEA-1、TRA-1-60和TRA-1-81干细胞多能因子及CDX2、CK18、IFNτ、Acrogranin和ERR2滋胚层干细胞特异因子和滋养外胚层特异因子，NOD-SCID小鼠注射后可形成畸胎瘤，见神经组织和中胚层分化。本发明所建立的牛滋养层干细胞建系方法在实现酶消化传代后有望在大动物转基因和体细胞克隆中得到应用。

附图说明

图1为本发明实施例4中第44代的牛滋养层干细胞在显微镜下观察的结果（40×）。

图2为本发明实施例4中解冻后为第49代的牛滋养层干细胞在显微镜下观察的结果（100×）。

图3为本发明本发明实施例5中第22代牛滋养层干细胞的碱性磷酸酶染色结果（显微镜下，100×）。

图4为本发明本发明实施例5中第94代牛滋养层干细胞OCT4和DAPI的染色结果（显微镜下，400×）。

图5为本发明本发明实施例5中第94代牛滋养层干细胞Nanog和DAPI的染色结果（显微镜下，400×）。

图6为本发明本发明实施例5中第94代牛滋养层干细胞SSEA-1和DAPI的染色结果（显微镜下，400×）。

图7为本发明本发明实施例5中第94代牛滋养层干细胞TRA-1-60和DAPI的染色结果（显微镜下，400×）。

图8为本发明本发明实施例5中第94代牛滋养层干细胞TRA-1-81和DAPI的染色结果（显微镜下，400×）。

图9为本发明本发明实施例5中第94代牛滋养层干细胞CDX2和DAPI的染色结果（显微镜下，400×）。

图10为本发明本发明实施例5中第94代牛滋养层干细胞CK18和DAPI的染色结果（显微镜下，400×）。

图11为本发明本发明实施例5中第81代牛滋养层干细胞的RT-PCR结果，以牛胎儿成纤维细胞、牛体外受精囊胚以及Wnt-3A小鼠皮下结缔组织细胞（L细胞）和小鼠胎儿成纤维细胞（MEF）等比混合的饲养层细胞为对照。

图12为本发明本发明实施例5中畸胎瘤小鼠和畸胎瘤切片结果，图示外胚层（神经丛）和中胚层分化（骨）。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1  体外受精获得牛的囊胚

从屠宰场取新鲜的牛卵巢用灭菌的生理盐水清洗，用注射器从卵泡中抽取卵泡液，加到无菌的10cm培养皿中，用口吸管在体视显微镜下挑选卵子放入牛的卵成熟液中清洗3次，转移至覆盖300μl石蜡油的成熟液中，置于38.5℃,5%CO₂的培养箱中培养22h后，进行体外受精。在体外受精前，新鲜配制受精液A液（BO液+咖啡因）和B液（BSA+肝素）（A:B=1:1）（37℃），受精滴（20μl/滴），发育滴（40μl/滴）。取无菌的玻璃管（加封口膜）加入A液8ml。从液氮中取冷冻细管精液迅速放入37℃水浴中融化，取出细管，用酒精棉擦拭并剪去两端，使精液流入装有受精A液（BO液+咖啡因）的玻璃管中，轻搓，4000rpm离心5min后，轻轻洗去上清液，再加入A液8ml，3600r/min离心5min后，轻轻吸去上清，沿管壁缓缓加入300μl受精A液，轻轻放入37℃水浴，静置2min，取上层精子悬液200μl和200μl受精B液（BSA+肝素）混匀，镜检精子活力，当视野中的精子活力较好的占60%-80%时，按80μl/滴加入到已经准备好的含有卵子的20μl受精滴中，38.5℃,5%CO₂的培养箱中培养。受精6h后，将受精卵放入发育液中，轻轻吹去颗粒细胞后用发育液洗2次，放入发育液小滴中，20个/100μl滴。受精48h后对发育滴半量换液，同时弃掉未卵裂和异常卵裂的胚胎，将发育至2细胞、4细胞、8细胞的受精卵继续培养。

实施例2  饲养层小鼠胎儿成纤维细胞+Wnt-3A小鼠皮下结缔组织细胞的制备

将第2代的小鼠胎儿成纤维细胞和Wnt-3A小鼠皮下结缔组织细胞按1：1混合，接种到10cm的细胞培养皿中，38.5℃，5%CO₂传代培养至第4代，冻存。解冻后按1.1×10⁵个/孔接种于0.2%明胶处理过的四孔板中，待细胞汇合度达60%-80%时，用17μg/ml的丝裂霉素处理3h。

实施例3  接种囊胚

取第7d的囊胚于4mg/ml的蛋白酶液中，待透明带变薄时，迅速将囊胚放入2i小分子抑制剂培养液中洗2次，再移入2i小分子抑制剂培养液中用口吸管轻吹，当透明带脱落后，迅速将囊胚放入丝裂霉素新鲜处理过的饲养层中，置于38.5℃，5%CO₂的培养箱中培养。第5d观察贴壁情况。

所述2i小分子抑制剂培养液配方以1L计为：

其中，PD0325901为非ATP竞争性的MAPK激酶MEK抑制剂，分子式C₁₆H₁₄F₃IN₂O，分子结构如式（I）所示：

CHIR99021为GSK3β选择性抑制剂，分子式C₂₂H₁₈Cl₂N₈，分子结构如式（II）所示：

实施例4  牛滋养层干细胞的传代培养、冻存和解冻

传代使用机械传代法。在超净台中的显微镜下操作。用1ml注射器的针头将四孔板内贴壁生长的TSC剥离，用1ml移液枪将滋胚层干细胞转移到60mm细胞培养皿中，用1ml注射器针头的斜面轻轻将大片的滋胚层干细胞切成2-3个小片。同时将泡状的滋胚层干细胞切成小片。将切好的小片滋胚层干细胞接种到新鲜的饲养层中，38.5℃，5%CO₂培养，传代后第3d按照300μl/孔换液。滋胚层干细胞生长旺盛，有泡状结构出现，见图1。

冻存时，将大片的滋胚层干细胞切成小片，1200rpm离心5min后去上清液，加冻存液（10%DMSO+90%FBS）300μl，移至冻存管中，放入程序冷冻盒，-80℃放24h后移到液氮中保存。

解冻时，在37℃水浴中快速晃动装有滋胚层干细胞的冻存管，待冻存液全部融化，迅速向冻存管中加37℃的2i小分子抑制剂培养液1ml，轻吹3下，吸出液体至盛有5ml2i小分子抑制剂培养液的离心管中，1500rpm离心5min，缓缓吸净上清液，向沉淀中加2i小分子抑制剂培养液1ml，轻轻吹匀，转移至盛有1ml2i小分子抑制剂培养液的35mm培养皿中，用1ml移液枪将滋胚层干细胞放入新鲜处理的饲养层中，38.5℃，5%CO₂培养，解冻后第3d按照1ml/皿换液，见图2。

实施例5  牛滋养层干细胞的鉴定

1  碱性磷酸酶染色

采用BCIP/NBT Color Development Substrate Kit(Promega，S3771)，按照染色步骤进行，滋胚层干细胞染色呈紫红色，表明碱性磷酸酶有表达，见图3。

2  干细胞多能因子和滋胚层干细胞特异因子的免疫荧光鉴定

对不同代次的滋胚层干细胞的干细胞多能因子的表达情况进行了鉴定。结果显示所获得的滋胚层干细胞表达OCT4（SANTA CRUZ，SC-9081）、Nanog（Abcam,Ab21624）、SSEA-1（Millipore，MAB4301）、TRA-1-60（Millipore，MAB4360）和TRA-1-81（Millipore，MAB4381），见图4-图8。

滋胚层干细胞表达滋胚层干细胞特异因子的鉴定结果显示：所获得的滋胚层干细胞表达CDX2和CK18，见图9和图10。

3  干细胞多能因子和滋胚层干细胞特异因子的RT-PCR鉴定

分别提取滋胚层干细胞、饲养层（小鼠胎儿成纤维细胞+Wnt-3A小鼠皮下结缔组织细胞）、牛胎儿成纤维细胞和囊胚的RNA，反转录为cDNA后进行PCR鉴定，RT-PCR结果显示，所建立的滋胚层干细胞系表达OCT-4、Nanog等干细胞多能因子和滋胚层干细胞特异因子CDX2，同时表达IFNT、Acrogranin和ERR2滋养外胚层特异因子，见图11，所用引物序列如下：

OCT4上游引物：5’-GGTTCTCTTTGGAAAGGTGTTC-3’

    下游引物：5’-ACACTCGGACCACGTCTTTC-3’

Nanog上游引物：5’-TTCCCTCCTCCATGGATCTG-3’

     下游引物：5’-ATTTGCTGGAGACTGAGGTA-3’

CDX2上游引物：5’-CCTGTGCGAGTGGATGCGGAAG-3’

    下游引物：5’-CCTTTGCTCTGCGGTTCT-3’

IFNτ上游引物：5’-CATCTTCCCCATGGCCTTCG-3’

     下游引物：5’-TCATCTCAAAGTGAGTTCAG-3’

Acrogranin上游引物：5’-CACTGGAAAGTATGGCTGCT-3’

          下游引物：5’-GCTCACCTCCATGTCGCACTT-3’

ERR2上游引物：5’-CCAACGGTCTGGACTCGCC-3’

    下游引物：5’-GCACACCTTCCTTCAGCAT-3’

β-Actin上游引物：5’-CGGTGCCCATCTATGAGG-3’

        下游引物：5’-GATGGTGATGACCTGCCC-3’

4  滋胚层干细胞体内分化-畸胎瘤实验

将约10⁷个牛滋养层干细胞皮下注射至3只NOD-SCID小鼠，注射后45天观察到3只小鼠均长瘤，目测瘤直径约10mm，60天时，处死小鼠，取出畸胎瘤（瘤直径15mm），经包因氏液（Bouin’s：苦味酸+冰醋酸+福尔马林）固定后，进行石蜡包埋、切片和HE染色。显微镜下观察切片，见外胚层（神经）和中胚层（骨）分化，见图12。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种牛滋养层干细胞建系方法，其特征在于，在体外条件下，将经过链霉蛋白酶处理去透明带后的牛囊胚接种于经丝裂霉素处理后的小鼠胎儿成纤维细胞和Wnt-3A小鼠皮下结缔组织细胞的饲养层中，加入2i小分子抑制剂培养液进行细胞的传代培养，从而构建牛滋养层干细胞系；

所述2i小分子抑制剂培养液配方以1L计为：

其中，PD0325901为非ATP竞争性的MAPK激酶MEK抑制剂，分子式C₁₆H₁₄F₃IN₂O，分子结构如式(I)所示：

CHIR99021为GSK3β选择性抑制剂，分子式C₂₂H₁₈Cl₂N₈，分子结构如式(II)所示：

所述囊胚为发育到第7天的牛囊胚；

细胞传代包括以下步骤：

1)在显微镜下，用注射器的针头将4孔板内贴壁生长的牛滋胚层干细胞剥离，并用移液枪将滋胚层干细胞转移到60mm细胞培养皿中；

2)用注射器针头的斜面将大片的滋胚层干细胞切成2-3个小片，同时将泡状的滋胚层干细胞切成小片，将切好的小片滋胚层干细胞接种于4孔板内新鲜的饲养层中，进行细胞的传代培养，传代后第3d按300μl/孔更换新鲜的2i小分子抑制剂培养液。

2.根据权利要求1所述的建系方法，其特征在于，小鼠胎儿成纤维细胞和Wnt-3A小鼠皮下结缔组织细胞按1:1比例混合。

3.根据权利要求2所述的建系方法，其特征在于，待小鼠胎儿成纤维细胞和Wnt-3A小鼠皮下结缔组织细胞汇合度达60％-80％时，用丝裂霉素处理，即得饲养层。

4.根据权利要求3所述的建系方法，其特征在于，丝裂霉素的使用浓度为16-18μg/ml，处理时间为2-3h。

5.根据权利要求4所述的建系方法，其特征在于，丝裂霉素的使用浓度为17μg/ml，处理时间为3h。

6.根据权利要求1-5任一项所述的建系方法，其特征在于，细胞的培养条件为：38.5℃，5％CO₂。

7.一种用于牛滋养层干细胞体外建系的培养液，其配方以1L计为：

其中，PD0325901为非ATP竞争性的MAPK激酶MEK抑制剂，分子式C₁₆H₁₄F₃IN₂O，分子结构如式(I)所示：

CHIR99021为GSK3β选择性抑制剂，分子式C₂₂H₁₈Cl₂N₈，分子结构如式(II)所示：