CN101880649A - 一种干细胞培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种干细胞的培养方法。本发明公开了一种干细胞培养方法，包括下列步骤：制备未经丧失分裂能力处理的羊膜上皮细胞滋养层；接种干细胞于羊膜上皮细胞滋养层上，在培养液中培养。本发明所述干细胞的培养方法不需对滋养层细胞进行丧失分裂能力处理，步骤简捷、安全，有效地解缺了目前人干细胞培养中动物源性污染的问题，并极大地降低了干细胞的培养成本，为今后干细胞的产业化提供了一种安全的有效的廉价的干细胞培养方法。

Description

一种干细胞培养方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种干细胞培养方法。
背景技术
干细胞(stem cells)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。干细胞有两种分类方法，一是根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES细胞)和成体干细胞(somatic stem cell)。第二种分类方法是根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞(totipotent stem cell，TSC)、多能干细胞(pluripotent stem cell)和单能干细胞(unipotent stem cell)
胚胎干细胞(embryonic stem cells，ES细胞)主要来自囊胚内细胞团及受精卵发育至桑椹胚之前的早期胚胎细胞。人ES细胞具有2个显著特征：一是它具有体外高度自我更新的能力，二是它可被定向诱导分化为体内各种细胞类型。
诱导性多潜能干细胞(又称iPS细胞)是通过基因转染技术将某些因子导入动物或人的体细胞，可将体细胞直接重构成为ES细胞样的多潜能细胞，该类细胞在细胞形态、生长特性、表面标志物和形成畸胎瘤等方面与ES细胞非常相似。(Okita K，Ichisaka T，Yamanaka S..Nature 2007；448：313-317；Wernig M，Meissner A，et al.Nature 2007；448：318-324；Takahashi K，Tanabe K，Ohnuki M，et al.Cell 2007；131：861-872；Yu J，Vodyanik MA，Smuga-Otto K，et al.Science 2007；318：1917-1920)
成体干细胞(somatic stem cell)包括骨髓或脐带或外周造血干细胞、骨髓或脐带间充质干细胞、表皮干细胞、脂肪干细胞、胰腺干细胞、神经干细胞等成体组织中存在的干细胞，理论上在特定条件下可分化为特定的组织器官，是修复和再生的基础。
干细胞有着巨大的医学应用前景，但要将其成功地用于临床实践，必须解决的首要课题是如何保持干细胞在体外不断增殖的同时又维持着不分化状态，即自我更新。干细胞体外培养必须满足2个基本条件，即促进细胞的分裂增殖的同时抑制细胞的分化。现有的干细胞培养技术中常采用饲养层细胞和/或细胞因子来满足上述条件。如ES细胞，常用的饲养层细胞有小鼠胚胎成纤维细胞(murine embryonic fibroblasts，MEF)和STO细胞等，经丧失分裂能力处理，如γ射线照射或丝裂霉素C等处理，这些细胞虽失去分裂能力，但仍可生存并有同化培养液的能力。使用MEF作为饲养层培养ES细胞是最早和最常用的方法[Takahama Y，Ochiya T，Sasaki H，et al.J.Oncogene，1998，16(24)：3189-3196]；同时培养液加入白血病抑制因子(leukemiainhibitory factor，LIF)等细胞分化抑制因子[Horak V，Flechon JE.ReprodNutr Dev，1998，38(6)：683-695]。然而，使用MEF培养ES细胞有以下几方面的不足：①培养和扩增人ES细胞时，MEF可能将动物病原通过培养系统传播给人ES细胞；②需要制备大量的MEF。因为MEF生命期有限，不能在体外长期传代，且其产生促增生因子和抑制分化因子的能力会随着传代时间的延长而减弱甚至丧失；③不易获得纯的ES细胞作为生化和分子生物学方面的分析；④死亡的MEF的染色体的释放可能会引起ES细胞的突变及影响正常核型的保持。为了将来临床使用因MEF带来的问题，多位学者建立了以人来源的胚胎或成体细胞作为饲养层的无动物来源成分的培养系统。分别用人胚胎成纤维细胞或成体输卵管上皮细胞、人的骨髓基质细胞、人包皮细胞等代替MEF作为饲养层，均可以维持人ES细胞长期未分化的增殖状态[Richards M，Fong CY，Chan WK，et al.Nat Biotechnol，2002，20(9)：933-936；ChengL，Hammond H，Ye Z，et al.Stem Cells，2003，21(2)：131-142；Meng G，Liu S，Krawetz R，et al.Stem Cells Dev.2008，17(3)：413-22]。然而，以人饲养层为基础的培养系统仍然需要饲养层细胞和ES细胞的同时生长，人体组织由于来源困难，无法满足ES细胞体外培养和扩增的需要。为解决人体组织来源困难的问题，人们开始采用人胎盘组织并分离其细胞来培养胚胎干细胞。Genbacev[Genbacev O.，Krtolica A.，Zdravkovic T.，et al.FertilSteril 2005，83，1517-1529.]等从6-9周流产的妊娠物中分离人胎盘成纤维细胞，并发现它们可以支持人胚胎干细胞的生长并保持未分化状态。而滋养层细胞丧失分裂能力处理，如γ射线照射或丝裂霉素C等处理，不仅增加了操作步骤，而且增加了潜在风险，其中丝裂霉素C是一种DNA抑制剂，可能导致ES细胞的染色体畸变。
为此，克服了动物源性污染的问题，人们尝试采用无血清无饲养层体系来培养干细胞，通过添加各种生长因子来保障干细胞在体外不断增殖的同时又维持着不分化状态，但这些生长因子及含其的培养基及其昂贵，大大增加了研究和应用成本。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为提供一种安全的有效的廉价的干细胞的培养方法，以克服现有干细胞培养方法的缺陷。
为此，本发明一种干细胞培养方法，包括下列步骤：
a)制备未经丧失分裂能力处理的羊膜上皮细胞滋养层；
b)接种干细胞于羊膜上皮细胞滋养层上，在培养液中培养。
本发明所述制备未经丧失分裂能力处理的羊膜上皮细胞滋养层的步骤为选取剖宫产分娩的胎盘并剥离羊膜，分离羊膜上皮细胞，接种在细胞培养容器中，置于37℃，5％ CO2细胞培养箱中培养。
在一优选实施例中，所述羊膜上皮细胞为人羊膜上皮细胞，以避免人源干细胞培养中动物源性的污染。
在一优选实施例中，所述羊膜上皮细胞为P0-P3代的羊膜上皮细胞，其中优选P0代的羊膜上皮细胞。
在一优选实施例中，所述干细胞可为胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、iPS细胞或成体干细胞，其中优选为胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或iPS细胞。
在一优选实施例中，所述干细胞为胚胎干细胞和/或iPS细胞时，所述培养液中LIF的浓度为0-12ng/ml，其中优选为0ng/ml，这既可避免LIF加入导致的潜在风险，也可减少培养的成本。
在一优选实施例中，所述培养液可为无血清培养液或含血清培养液；所述血清优选为人全血清或脐带血清。
本发明所述干细胞的培养方法不需对滋养层细胞进行丧失分裂能力处理，步骤简捷、安全，有效地解决了目前人干细胞培养中动物源性污染的问题，并极大地降低了干细胞的培养成本，为今后干细胞的产业化提供了一种安全的有效的廉价的干细胞培养方法。
附图说明
图1人胚胎干细胞株hHES1在HAEC和MEF滋养层的生长情况。
图2.HES细胞DNA含量流式细胞仪分析。
图3.在不同滋养层细胞生长的人胚胎干细胞株hHES1的干细胞因子表达。
图4.畸胎瘤HE染色。
图5.hHES1的Oct-4的免疫荧光染色。
图6.Western blotting检测两种滋养层细胞LIF的表达情况。
具体实施方式
为进一步详细描述在本发明的实践中所使用的常规技术，实践者可参看有关细胞生物学、组织结构学以及胚胎学的标准的教科书及评论。包括Teratocarcinomas and embryonic stem cell：A practical approach[E.J.Robertson编，IRL出版有限公司，1987]；Guide to techniques in MouseDevelopment[P.M.Wasserman等编，学术出版社，1993]；Embryonic StemCell Differentiation in Vitro[M.V.Wiles，Meth.Enzymol.225：900，1993]；Properties and uses of Embryonic Stem Cells：Prospects forApplication to Human Biology and Gene Therapy[P.D.Rathjen等，Reprod.Fertil.Dev.10：31，1998]。
细胞生物学、蛋白质化学、和抗体技术可以在“蛋白科学中的当前方案”[J.E.Colligan等编辑，Wiley & Sons]、“细胞生物学中的当前方案”[J.S.Bonifacino等，Wiley & Sons]和“兔疫学功时当亦方案”[J.E.Colligan等编辑，Wiley & Sons]中找到。与本发明相关的试剂、克隆载体、和基因操作试剂盒可从商业供应商那得到，例如BioRad、Stratagene、Invitrogen、ClonTech以及sigma-Aldrich公司。
细胞培养方法通常在“动物细胞培养：基本技术手册”最新版本(R.I.Freshney编辑，Wiley & Sons)；“细胞培养一般技术”(M.A.Harrison和I.F.Rae，剑桥大学出版)；和“胚胎干细胞：方法和操作规定”(K.Turksen编辑，Humana出版)中有描述。组织培养基供应和试剂可从商业供应商那得到，例如Gibco/BRL、Nalgene-Nunc International、SigmaChemical Co.、以及ICN Biomedicals。
本发明术语“丧失分裂能力处理”是指通过物理或化学手段，如γ射线照射或丝裂霉素C等处理，使细胞虽失去分裂能力，但仍可生存并有同化培养液的能力的过程。
羊膜组织样品处理。
从离体的哺乳动物胎盘分离羊膜，采用生理缓冲液冲洗除去血细胞，机械剔除残留绒毛膜和血管。
如本文所用，术语“哺乳动物”是脊椎动物中最高等的一个类群，由爬行动物进化而来，主要特征是：身体表面有毛，一般分头、颈、躯干、四肢和尾五个部分；用肺呼吸；体温恒定，是恒温动物；脑较大而发达；哺乳；胎生。哺乳和胎生是哺乳动物最显著的特征。
如本文所用，术语“羊膜”(Amnion)，也可称作胎膜，是母体与胎儿间进行物质交换的重要组织。羊膜主要可分为上皮层、基底层、致密层、纤维母细胞层和海绵层五部分。人羊膜细胞(Amniotic cells)主要由上皮层的羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cells，hAEC)和基底层的间充质细胞构成，是与发育中的胎儿的联系紧密的胚胎发育早期产物。羊膜上皮细胞可表达胚胎干细胞及一些早期干细胞的一些不同分子标记如：Oct4、Nanog、SOX-2、SSEA-3、SSEA-4等；神经细胞特异的胶质纤维相关蛋白、神经元特异性标记(MAP2)、神经干细胞特异性标记(Nestin)等；肝薄壁组织细胞蛋白、甲胎蛋白等。这说明既然羊膜保留胚胎样未成熟低分化的细胞特征，具有多能分化潜能。[Knezevic V，Anat 1996；189(Pt 1)：1-7；Yugel，Transplantation 2004；77(9)：1452-4；Takashima S，Cell StructFunct 2004；29(3)：73-84；Sakuragawa N，Neurosci Lett 1996；209(1)：9-12；Wei J.P，Cell Transplant 2003；12(5)：545-52]。同时，羊膜细胞本身自身缺乏I、II类抗原如HLA-A、-B、-C和-R抗原以及β2免疫球蛋白[Akle CA，Lance 1981；2(8254)：1003-5；M.Adinolfi，Nature 295：28]移植后不会产生免疫原性，此外羊膜细胞同时存在HLA-E、G抗原，它们具有免疫抑制活性[Ueta M et al Clin Exp Imunol 2002；129(3)：464-70]。
羊膜上皮细胞分离和培养。
“分离”指的是从组织样品中移出细胞且与另外的非组织干细胞分开。使用任何常规技术或方法将完整的组织分离为单细胞，这些技术或方法包括机械力(切碎力或剪切力)，用一种或组合的蛋白酶例如胶原酶、胰蛋白酶、脂肪酶、如US专利5,952,215中公开的释放酶(liberase)H1和胃蛋白酶进行酶消化或机械和酶方法的组合。例如，可通过以下方法将完整组织片段的消化：使用胶原酶介导的组织消化的方法；或参考用于本发明的使用胶原酶的其它方法公开在US专利5,830,714和5,952,215中。类似地，可使用中性蛋白酶来代替胶原酶，如在Twentyman，P.R.和J.M.Yuhas(Cancer Lett 1980：9(3)：225-228)中公开的方法。此外，方法可采用酶的组合，例如胶原酶与胰蛋白酶的组合，如在Russell，S.W.F.Doc等人(Int J Cancer 1976：18(3)：322-30)中公开的方法；或酶如胰蛋白酶与机械离解的组合，如在Engelholm.S.A，M.Spang.Thomsen等人(BrJ Cancer 1985：51(1)：93-98)中公开的方法。
本领域技术人员已知的其它方法将活性细胞群体浓缩.这些加工后洗涤/浓缩步骤可单独或同时施行。在一个实施方案中，通过让细胞群体连续流过旋转膜系统或类似系统例如在US专利034,135和5,234,608中公开的系统来将细胞浓缩和除去酶。
除了上述方法以外，还可在细胞洗涤后或培养后，进一步纯化或富集活性细胞群体，减少杂细胞和死细胞。分离悬浮液中的细胞可通过以下技术来实现：浮力密度沉降离心、有差别的与固相的粘着和从固相上洗脱、免疫磁性珠、荧光激光细胞分选(FACS)或其它技术。这些不同技术以及进行这些技术的装置的实例可参见现有技术和上市商品。如免疫磁珠法，针对WO03042405中所公开的羊膜上皮细胞抗原，采用SSEA-4、Nanog、CK-3等特异性抗体，通过免疫磁珠法进一步纯化或富集SSEA-4(+)、Nanog(+)、CK-3(+)的羊膜上皮细胞。
对本发明使用的基础培养基的类型没有限制，只要可用于细胞培养的培养基即可。优选的培养基包括DMEM培养基和NPBM培养基。对上面提到的基础培养基中可能含有的其他组份类型没有限制，优选的成分包括F-12、FCS和神经存活因子。在这类培养基中，例如，F-12和FCS的浓度分别是50％和10％。在这类培养基中CO2的浓度优选是5％，但本发明不限于此。
而且，在本发明的另一个优选实施方案中，向上面提到的基础培养基中添加bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)或EGF(表皮生长因子)。在这种情况下，可以加入一种或者两者都加入。上面提到的bFGF或EGF的举例浓度是1ng/ml至100ng/ml，优选的浓度为10ng/ml。对添加的时间和方法没有限制。优选地，在将上面提到的羊膜上皮细胞在基础培养基中培养时每天加入试剂。
按照本发明，向上面提到的基础培养基或含有其它成分的基础培养基中还可添加人全血清、脐带血清或人工脑脊液。
干细胞的来源和培养
本发明可用各种类型的干细胞进行操作，除非另有说明，本发明可用任何脊椎动物的干细胞进行操作。其中包括但不限于胚胎干细胞(embryonic stemcells，ES细胞)、诱导性多潜能干细胞(又称iPS细胞)、胚胎生殖(EG)细胞、成体干细胞(somatic stem cell)等。
ES细胞可以从灵长类动物的胚泡中获得[Thomson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：7844，1995]。如采用Thomson等所描述的技术[美国专利5,843,780，Science 282：1145，1998]或Reubinoff等描述的技术[NatureBiotech.18：399，2000]，可从人胚泡细胞中制备人胚胎干(hES)细胞。
胚胎生殖(EG)细胞如人胚胎生殖(hEG)细胞可由原始的生殖细胞(存在于最后一次经期后约8-11周的胎儿材料中)中制得。合适的制备方法描述可参见Shamblott等，Prco.Natl.Acad.Sci.USA 95：13726，1998以及美国专利6,090,622。
诱导性多潜能干细胞(又称iPS细胞)是通过基因转染技术将某些因子导入动物或人的体细胞，可将体细胞直接重构成为ES细胞样的多潜能细胞，其制备和培养可参见Okita K，Ichisaka T，Yamanaka S.Nature 2007；448：313-317；Wernig M，Meissner A，et al.Nature 2007；448：318-324；Takahashi K，Tanabe K，Ohnuki M，et al.Cell 2007；131：861-872；YuJ，Vodyanik MA，Smuga-Otto K，et al.Science 2007；318：1917-1920。
成体干细胞(somatic stem cell)包括骨髓或脐带间充质干细胞、胰腺干细胞、神经干细胞、表皮干细胞、脂肪干细胞、骨髓或脐带或外周造血干细胞等成体组织中存在的干细胞，包括以下非限制性的实施例。美国专利5,851,832中报道了从脑组织中获得的多能神经干细胞；美国专利5,766,948中报道了从新生儿大脑半球制造成神经细胞；美国专利5,654,183和5,849,553号报道了哺乳类神经峭干细胞的应用；WO2009040458公开了血液多能间充质干细胞的制备方法；
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1.人羊膜上皮细胞滋养层的制备
人羊膜上皮细胞(Human amniotic epithelia cell，HAEC)的分离、培养：选取剖宫产分娩的胎盘(各项病毒指标阴性者，包括甲肝，乙肝，丙肝，戊肝，HIV，梅毒等)并剥离羊膜，分离羊膜上皮细胞，PBS冲洗除去血细胞，0.25％胰蛋白酶37℃消化30min，吹打，加入含10％人脐带血血清的RPMI1640终止消化，100目筛子过滤，1,500rpm离心，弃上清，以1×104/cm2接种在10cm平皿，置于37℃，5％ CO2细胞培养箱中培养至80％密度。
实施例2.小鼠胚胎成纤维细胞滋养层的制备
小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonicfibroblast，MEF)的分离、培养：取妊娠12.5天的小鼠胚胎，清除内脏、头、尾，PBS清洗两次，剪碎组织，0.25％的胰蛋白酶消化30min，用滴管打匀组织，离心1000rpm×5min，去上清，打匀细胞团，加入DMEM培养液(含10％FBS)，置37℃，5％CO2培养箱培养，传至2-3代后经丝裂霉素C处理。
实施例3.人胚胎干细胞的培养
采用实施例1、2两种细胞滋养层，分别培养人胚胎干细胞株hHES1[Wu CF，Tsung HC，Zhang WJ，et al.Reprod Biomed Online.2005 Dec；11(6)：733-9]。以KO-DMEM培养基，添加10ng/mlbFGF、5％人脐血清以及12ng/ml hLIF，取培养第3天的HES细胞克隆作分子生物学实验，采用qRealtime-PCR、免疫荧光IF、Western blotting检测Nanog，Oct4等基因表达差异；采用流式细胞技术FCM检测HES细胞周期的差异。hHES1在传代20代时采用G显代法进行染色体核型分析；分别收集1×106HES细胞注射至4-8周龄SCID小鼠后腿肌间隙，约7-8周后触摸有肿瘤形成，处死小鼠，作石蜡切片HE染色及病理检查。
结果：发现hHES1生长及增殖速度在两种滋养层上无显著性差异，但是在人羊膜上皮细胞滋养层上生长的克隆规则，像个小山丘，层层隆起，采用机械法进行显微分割时不易碎裂，传代后形成的克隆较均一；而MEF上的克隆易出现分化，表现为不规则椭圆形克隆，进行显微分割时容易碎裂(图1：人胚胎干细胞株hHES1在HAEC和MEF滋养层的生长情况。A：培养的人羊膜上皮细胞HAEC B：hHES1在HAEC上生长 C：培养的MEF细胞 D：hHES1在MEF上生长)。同时我们还采用流式细胞仪分析了不同滋养层上hHES1的细胞周期DNA含量的差异，发现两者的G1，S，G2期分布相似(图2hHES1细胞DNA含量流式细胞仪分析，人羊膜上皮细胞上hHES1(A)及MEF上hHES1(B))。为排除HAEC可能影响hHES1的染色体畸变，我们还分析了人羊膜上皮细胞滋养层培养的hHES1在传代20代时染色体的变化，结果显示为正常的46XY核型。
实时定量PCR结果表明，HAEC上的hHES1细胞高表达FGF，Nanog，Rex，TERT，OCT-4 and Sox-2，明显高于MEF上的hHES1细胞(图3，18sRNA为内对照，P＜0.05).同时我们采用免疫荧光法对不同滋养层上的hHES1作了IF分析，羊膜上培养的Hhes1克隆Oct-4的荧光染色(A)强于MEF上克隆(B)(图4)。
肿瘤组织石蜡切片HE染色及病理检查发现由人羊膜上皮细胞滋养层培养的hHES1细胞形成的畸胎瘤能形成三个胚层，包括不成熟的腺体组织，肌纤维，骨骼及毛发(图5不成熟的腺体组织A，肌纤维B，骨骼及毛发C)。
实施例4.LIF对胚胎干细胞培养的影响
采用实施例1人羊膜上皮细胞滋养层，接种小鼠胚胎干细胞株129，小鼠胚胎干细胞株129分别采用DMEM培养液A(含10％FBS、10ng/mlbFGF、12ng/mlLIF)和DMEM培养液B(含10％FBS、10ng/mlbFGF)培养，传代30代。分别收集1×106 129细胞注射至4-8周龄SCID小鼠后腿肌间隙，约7-8周后触摸有肿瘤形成，处死小鼠，作石蜡切片HE染色及病理检查。
结果：发现在培养液中有无LIF的情况下，小鼠胚胎干细胞株129均表现生长的克隆规则，采用机械法进行显微分割时不易碎裂，传代30代后形成的克隆较均一；且均能在SCID小鼠体内致瘤，肿瘤组织石蜡切片HE染色及病理检查发现的畸胎瘤能形成三个胚层，包括不成熟的腺体组织，肌纤维，骨骼及毛发。
实施例5.滋养层细胞的LIF表达检测
采用Western blotting检测了实施例1、2滋养层细胞上LIF的表达情况，其具体步骤为收集MEF及hAEC细胞，进行匀浆，采用BCA试剂盒进行蛋白质浓度测定，分别取20mg蛋白进行SDS-PAGE电泳并转膜。与LIF抗体(兔抗人或鼠，1∶200，武汉博士德)及β-actin抗体(兔抗人或鼠，1∶1000，Cellsignaling，USA)孵育1小时，再用二抗(1∶1000，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)孵育1小时，采用Westen lightning ECL kit(PerkinElmerlife science，USA)显色，成像系统(G：BOX SYNGENE，Gene company limited，Hongkong)扫描分析。
结果：HAEC表达的LIF显著高于MEF上LIF的表达(图6)。
人体胎盘由三层结构组成：羊膜，绒毛膜和蜕膜。其中，羊膜(Amnion)，也可称作胎膜，位于胎盘的最内层，构成胚胎羊水腔的内壁，为半透明的薄膜，主要由表面外胚层的羊膜上皮细胞和基质中少量的中胚层细胞构成，是与发育中的胎儿的联系紧密的胚胎发育早期产物，提供胚胎生长发育的环境。采用人羊膜上皮细胞作为滋养层具有其合理性，在胚胎发育过程中，未分化的胚胎被胎盘包饶，不论从解剖学还是从组织学上看是来自于胎盘人羊膜上皮细胞可能含有早期外胚层的多能性。据报道人羊膜上皮细胞还分泌多种生长因子，如GF、KGF、HGF、bFGF、TGF-α、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3以及表达EGF、KGF、HGF、TGF-α、TGF-β1、TGF-β2等受体[Koizumi NJ，Inatomi TJ，Sotozono CJ et al.Curr Eye Res 2000，20：173-177]。
在发明中我们报道了人羊膜上皮细胞能支持胚胎干细胞的生长，并保持未分化的状态，保持自我更新，多向分化的干细胞特征，与MEF滋养层系统比较，人羊膜上皮细胞上培养的ES克隆不易分化，生长状态优于MEF上的ES细胞，高表达Oct-4，Nanog，Sox-2，Rex，bFGF，and TERT等干细胞因子，这可能与HAEC比MEF表达更多的LIF有关，而LIF是一种能促进ES细胞自我更新且抑制细胞分化的因子[Ying，Q.L.，Stavridis，M.，Griffiths，D.，et al.Nat Biotech 2003，21，183-186.]。
本发明所述干细胞的培养方法采用未经丧失分裂能力处理的人羊膜上皮细胞作为滋养层具有很重要的意义，它可能解决目前人体组织来源困难或由于伦理方面的原因而受限，人羊膜上皮细胞来源于废弃的胎盘组织，不存在伦理的问题，每张羊膜可获得1×108HAEC，且人羊膜上皮细胞不表达端粒酶，仅可扩增3-4代，增殖缓慢，不需丝裂霉素C处理，因此，人羊膜上皮细胞作为滋养层培养人胚胎干细胞是一个良好的来源，可能解决动物源性污染的问题。
本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只欲作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。

Claims (10)

1.一种干细胞培养方法，包括下列步骤：
a)制备未经丧失分裂能力处理的羊膜上皮细胞滋养层；
b)接种干细胞于羊膜上皮细胞滋养层上，在培养液中培养。
2.如权利要求1所述的干细胞培养方法，其特征在于所述步骤a为选取剖宫产分娩的胎盘并剥离羊膜，分离羊膜上皮细胞，接种在细胞培养容器中，置于37℃，5％ CO2细胞培养箱中培养。
3.如权利要求1所述的干细胞培养方法，其特征在于所述羊膜上皮细胞为人羊膜上皮细胞。
4.如权利要求1所述的干细胞培养方法，其特征在于所述羊膜上皮细胞为P0-P3代的羊膜上皮细胞。
5.如权利要求1所述的干细胞培养方法，其特征在于所述羊膜上皮细胞为P0代的羊膜上皮细胞。
6.如权利要求1所述的干细胞培养方法，其特征在于所述干细胞可为胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、诱导性多潜能干细胞(iPS)细胞或成体干细胞。
7.如权利要求1所述的干细胞培养方法，其特征在于所述干细胞为胚胎干细胞或iPS细胞。
8.如权利要求1所述的干细胞培养方法，其特征在于所述干细胞为胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或iPS细胞时，所述培养液中LIF的浓度为0-12ng/ml。
9.如权利要求1所述的干细胞培养方法，其特征在于所述培养液可为无血清培养液或含血清培养液。
10.如权利要求9所述的干细胞培养方法，其特征在于所述血清为人全血清或脐带血清。
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